Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie ¹³C aminokwasów proteinogennych

Celem niniejszego protokołu jest badanie metabolizmu bakteryjnego z wykorzystaniem analizy metabolicznej wspomaganej węglem 13. W pierwszej kolejności mikroorganizmy są hodowane w obecności znakowanych substratów węglowych, które zostają włączone do białek mikrobialnych. Następnie mikroorganizmy są zbierane, a aminokwasy ekstrahowane, hydrolizowane i poddawane derywatyzacji.

Próbki nanosi się na chromatograf gazowy i spektrometr mas (GCMS). Poprzez śledzenie dróg przejścia atomów między metabolitami w sieci biochemicznej można określić funkcjonalne szlaki metaboliczne wykorzystywane przez drobnoustrój. Jestem Bert Burla.

Przedstawiona tutaj metoda może służyć jako uzupełnienie transkryptomiki i proteomiki w określaniu szlaków metabolicznych u mikroorganizmów. Wykorzystaliśmy tę technikę do badania mikroorganizmów fotosyntetyzujących, takich jak sinice, pod kątem myotroficznego lub heterotroficznego wykorzystania węgla. W tym filmie wykorzystamy szczep modelowy ANOTHE 5 1 1 42, aby zademonstrować zastosowanie znakowanych substratów węglowych w odkrywaniu nowych funkcji enzymatycznych.

Procedurę zaprezentują li Yu oraz Chu Yang Fang i ja. Procedurę rozpoczynamy od hodowli bakterii cyana thesei w nieoznaczonym medium. Gdy bakterie osiągną środkową fazę logarytmicznego wzrostu, zaszczepiamy 3% objętościowo do medium znakowanego węglem 13.

Następnie, aby uniknąć wprowadzenia nieznakowanego węgla z początkowej subkultury szczepionki do tego samego znakowanego medium w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego, gdy bakterie Cy Thesei znakowane węglem 13 osiągną środkową fazę wzrostu logarytmicznego, należy zebrać 10 mililitrów poprzez wirowanie. Osad należy zawiesić ponownie w 1,5 mililitrach sześciomolarnego kwasu solnowodorowego i przenieść do przezroczystej szklanej fiolki do chromatografii gazowej (GC) z zakrętką.

Zakręć fiolki i umieść je w piekarniku w temperaturze 100 °C przez 24 godziny, aby zhydrolizować białka biomasy do aminokwasów. Hydroliza granulek biomasy pozwala na uzyskanie 16 z 20 powszechnie występujących aminokwasów. Po hydrolizie przenieś roztwór aminokwasów do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, a następnie wiruj z prędkością 20 000 G przez pięć minut. Po hydrolizie przenieś roztwór aminokwasów do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, a następnie wiruj z prędkością 20 000 G przez pięć minut, aby osadzić cząstki stałe.

Po wirowaniu przenieś nadsącz do nowych fiolek do GC, aby usunąć cząstki stałe z roztworu hydrolizy, tak aby nie przedostały się one do kolumny GC. Następnie aminokwasy są poddawane procesowi w celu ich utrwalenia. Próbki są czynione lotnymi dla rozdzielenia metodą chromatografii gazowej; rozpuść wysuszone próbki w 150 µL tetrahydrofuranu (THF) oraz 150 µL N,O-bis(trimetylosilil)trifluoroacetamidu (BSTFA).

Odczynnik do derywatyzacji acetamid, T-B-D-M-S; inkubować wszystkie próbki w inkubatorze w temperaturze od 65 do 80 °C przez jedną godzinę. Od czasu do czasu mieszać próbki w vorteksie, aby upewnić się, że metabolity w fiolce są rozpuszczone. Odwirować próbki przy 20 000 ×g przez 10 minut, a następnie przenieść nadfiltr do nowych fiolek do GC.

Nadfiltr powinien być przejrzystym, żółtawym roztworem. Temperatury GC ustawiono w następujący sposób: utrzymywać 150 °C przez dwie minuty, następnie zwiększać temperaturę w tempie 3 °C na minutę do 280 °C.

Zwiększ temperaturę w tempie 20 °C na minutę do 300 °C, a następnie utrzymuj ją przez pięć minut. W przypadku kolumny GC o długości 30 m ustaw opóźnienie rozpuszczalnika na około pięć minut, a zakres stosunku masy do ładunku między 60 a 500. Próbki analizuj za pomocą GCMS, stosując objętość wstrzyknięcia 1 µL przy stosunku podziału od 1:5 do 1:10 i przepływie gazu nośnego helu wynoszącym 1,2 mL na minutę po zakończeniu analizy.

Analizę danych GCMS należy przeprowadzić w programie Microsoft Excel. Na tej rycinie przedstawiono czas retencji w GC oraz charakterystyczne piki stosunku masy do ładunku dla każdego aminokwasu. Pochodne T-B-D-M-S aminokwasów są zazwyczaj wyraźnie rozdzielane przez MS na dwa naładowane fragmenty: fragment M minus 57, który obejmuje cały aminokwas, oraz fragment M minus 159, w którym brakuje grupy alfa-karboksylowej aminokwasu w przypadku leucyny i izoleucyny.

Peak M minus 57 był pokrywał się z innymi fragmentami piku masy. N minus 15 może być wykorzystany do analizy całego znakowania aminokwasów. Ponadto grupa F 3 0 2 jest często wykrywana w większości aminokwasów i zawiera jedynie pierwszą grupę alfa-karboksylową oraz drugie atomy węgla w szkielecie aminokwasu.

Jednakże, ponieważ ten pik Ms.Peak często charakteryzuje się wysokim stosunkiem szumu do sygnału, F 3 0 2 nie jest zalecany do ilościowej analizy strumieni metabolicznych. Deratyzacja aminokwasów lub głównych metabolitów wprowadza znaczące ilości naturalnie znakowanych izotopów, w tym węgla 13, tlenu 18, krzemu 29 i krzemu 30. Szum pomiarowy wynikający z obecności izotopów naturalnych w surowym widmie masowym lub izotopowym może zostać skorygowany przy użyciu opublikowanego oprogramowania.

Końcowe dane dotyczące znakowania izotopowego przedstawiono jako ułamki masy. Na przykład M zero, M1, M dwa, M trzy oraz M cztery reprezentują fragmenty zawierające od zera do czterech atomów węgla znakowanych izotopem węgla 13. Ten 5 1 1 2 nie zawiera enzymu 3-aninian amoniak-liazy, który katalizuje konwersję 3-aninianu do 2-ketomaślanu w typowej ścieżce syntezy izlo.

W związku z tym, aby rozstrzygnąć kwestię szlaku metabolicznego w tym organizmie, szczep cyana THESEI 5 1 1 42 hodowano w medium ASP two z 54 millimolar glycerol i analizowano za pomocą GCMS zgodnie z opisem w tym filmie; jak pokazano tutaj, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 wykorzystuje glycerol znakowany w drugiej pozycji jako główne źródło węgla. Zaobserwowano, że thianine oraz alanina, których prekursorem jest pyruvate, posiadają jeden znakowany węgiel, podczas gdy ISO leucine została znakowana trzema węglami. Zatem synteza w cyana, these 5 1 1 4 2 nie może pochodzić ze szlaku thianine stosowanego przez większość organizmów. Z drugiej strony leucine i ISO leucine wykazują identyczne wzorce znakowania w oparciu o fragment M minus 15 oraz fragment M minus 1 59.

Na przykład izotop lub dane z N minus 15 zawierające NIEFRAGMENTOWANE aminokwasy wykazały identyczne znakowanie dla leucyny i izoleucyny. Zatem leucyna i izoleucyna muszą być syntetyzowane z tych samych prekursorów: pirogronianu i acetylo-CoA. Obserwacja ta jest zgodna z przejściem znakowanego węgla w ścieżce cytramalowej dla syntezy izoleucyny.

Metodę tę można wykorzystać do badania metabolizmu szerokiej gamy mikroorganizmów; po opanowaniu techniki cały proces od początku do końca można przeprowadzić w około jeden tydzień.