Name: Potwierdzenie i odkrycie szlaku metabolicznego poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę znakowania izotopowego 13C aminokwasów proteinogennych w celu analizy szlaków metabolicznych bakterii za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii masowej GC-MS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane z grantu NSF Career (MCB0954016) oraz grantu DOE Bioenergy Research (DEFG0208ER64694).

1. Hodowla komórkowa (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Hodować komórki w pożywce minimalnej z dodatkiem mikroelementów, soli, witamin oraz specyficznie znakowanych substratów węglowych, które są najodpowiedniejsze do badania danej ścieżki metabolicznej. Do hodowli komórkowej należy używać kolb z wytrząsaniem lub bioreaktorów. Nutrienty organiczne, takie jak ekstrakt z drożdży, mogą zakłócać pomiar znakowania aminokwasów, dlatego nie mogą one znajdować się w pożywce hodowlanej.	</li>
	<li>Monitorować wzrost komórek poprzez pomiar gęstości optycznej hodowli przy optymalnej długości fali (np. OD730 dla Cyanothece 51142) przy użyciu spektrofotometru UV/Vis.</li>
	<li>Komórki można początkowo hodować w pożywce nieznakowanej. Do inokulacji pożywki znakowanej (stosunek inokulacji 3% (v/v)) zaleca się użycie komórek w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego. Hodowlę znakowaną należy następnie poddać pasażowaniu (stosunek inokulacji 3% v/v) w tej samej pożywce znakowanej, aby uniknąć wprowadzenia nieznakowanego węgla z początkowego inokulum.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja aminokwasów
<ol>
	<li>Zebrać subkulturowane komórki (10mL) w środkowej fazie logarytmicznej wzrostu poprzez wirowanie (10 min, 8000×g).</li>
	<li>Resuspendować osad w 1,5mL 6M HCl i przenieść go do przezroczystej szklanej fiolki do GC z zakrętką. Zakręcić fiolki i umieścić je w piecu w temperaturze 100°C na 24 godziny, aby zhydrolizować białka biomasy do aminokwasów. Hydroliza osadów biomasy może przynieść 16 z 20 powszechnych aminokwasów (Rycina 2) 5. Cysteina i tryptofan ulegają degradacji, a glutamina i asparagina są przekształcane odpowiednio w glutaminian i asparagian.</li>
	<li>Wirować roztwór aminokwasów z prędkością 20 000×g przez 5 min w probówkach Eppendorf 2 ml, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek GC. Krok ten usuwa cząstki stałe z roztworu hydrolizy.</li>
	<li>Zdjąć zakrętki z fiolek GC i całkowicie osuszyć próbki strumieniem powietrza za pomocą ewaporatora Thermo Scientific Reacti-Vap (uwaga: do osuszania próbek można również użyć liofilizatora). Krok ten można przeprowadzić w ciągu nocy.</li>
</ol>
3.	Derywatyzacja aminokwasów i warunki GC-MS
Analiza aminokwasów lub metabolitów naładowanych/silnie polarnych za pomocą GC wymaga ich pochodnejzacji, aby aminokwasy stały się lotne i mogły zostać rozdzielone metodą chromatografii gazowej 2.
<ol>
	<li>Rozpuścić wysuszone próbki w 150 μL tetrahydrofuranu (THF) oraz 150 μL odczynnika do derywatyzacji N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide.</li>
	<li>Inkubować wszystkie próbki w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze od 65 do 80°C przez 1 godzinę. Okazjonalnie mieszać na wirówce typu vortex, aby upewnić się, że metabolity w fiolce zostały rozpuszczone.</li>
	<li>Wirować próbki z prędkością 20,000×g przez 10 min, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek do GC. Nadsącz powinien być klarownym, żółtawym roztworem. Ze względu na nasycenie detektorów, dokładność pomiaru GC-MS może zostać zaburzona przez wysokie stężenie wstrzykniętych aminokwasów poddanych derywatyzacji TBDMS (próbki te często mają ciemnobrązowy kolor), dlatego przed pomiarem GC-MS należy rozcieńczyć takie próbki za pomocą THF 6.</li>
	<li>Próbki poddać analizie GC-MS (stosunek split 1:5 lub 1:10, objętość wtrysku = 1 μL, gaz nośny hel = 1.2 mL/min). Zastosować następujący program temperatury GC: utrzymywać 150°C przez 2 minuty, zwiększać temperaturę o 3°C na minutę do 280°C, zwiększać o 20°C na minutę do 300°C, a następnie utrzymywać przez 5 minut. Opóźnienie rozpuszczalnika (solvent delay) można ustawić na ok. 5 min (dla kolumny GC o długości 30 metrów). Zakres stosunku masy do ładunku (m/z) w MS można ustawić pomiędzy 60 a 500.</li>
</ol>
4.	Analiza danych GC-MS
<ol>
	<li>Pomiar aminokwasów poddanych derywatyzacji TBDMS może być również pod wpływem dyskryminacji izotopowej podczas rozdziału GC. Izotopy lekkie poruszają się w kolumnie GC nieco szybciej niż izotopy ciężkie. Aby zmniejszyć potencjalne błędy pomiarowe, można uśrednić widmo masowe dla całego zakresu piku aminokwasu 6</li>
	<li>Widma GC i MS metabolitów poddanych derywatyzacji TBDMS były raportowane wcześniej7. Czas retencji GC oraz charakterystyczne piki m/z dla każdego aminokwasu przedstawiono na Rysunku 3.</li>
	<li>Derywatyzacja aminokwasów lub metabolitów centralnych wprowadza znaczące ilości naturalnie występujących izotopów, w tym 13C (1,13%), 18O (0,20%), 29Si (4,70%) i 30Si (3,09%). Szum pomiarowy wynikający z obecności naturalnych izotopów w surowym widmie izotopomerów masy można skorygować przy użyciu opublikowanego oprogramowania5, 8. Końcowe dane dotyczące znakowania izotopowego raportowane są jako frakcje masowe, np. M0, M1, M2, M3 i M4 (reprezentujące fragmenty zawierające od zera do czterech atomów węgla znakowanego 13C).</li>
	<li>Pomiar aminokwasów może dostarczyć informacji o znakowaniu izotopowym ośmiu kluczowych metabolitów prekursorowych: 2-oksoglutaranu, 3-fosfoglicerynianu, acetylo-CoA, erytrozo-4-fosforanu, szczawiooctanu, fosfoenolopirogronianu, pirogronianu i rybozo-5-fosforanu. Wzorce znakowania w tych metabolitach mogą być wykorzystane do identyfikacji kilku centralnych szlaków metabolicznych (Rysunek 2) 9. Wyniki eksperymentów z znakowaniem można dodatkowo potwierdzić przy użyciu innych metod biochemicznych (np. RT-PCR).</li>
</ol>
5. Analiza szlaków metabolicznych z wykorzystaniem danych o znakowanych aminokwasach
Badając jedynie kilka kluczowych aminokwasów uzyskanych z dobrze zaprojektowanych eksperymentów z użyciem znacznika 13C, możemy ujawnić szereg unikalnych szlaków lub aktywności enzymatycznych bez konieczności przeprowadzania złożonej analizy strumienia metabolicznego 13C dla całego metabolizmu centralnego.
<ol>
	<li>Szlak Entnera-Doudoroffa: jako źródło węgla można zastosować glukozę [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, znakowanie seryny będzie znacznie niższe niż znakowanie alaniny 10.</li>
	<li>Rozgałęziony cykl TCA: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C]. Jeśli cykl TCA jest przerwany, asparaginian może być znakowany dwoma atomami węgla, podczas gdy glutaminian jest znakowany tylko jednym atomem węgla 11, 12.</li>
	<li>Wiązanie CO2 w cyklu Calvina-Bensona-Basshama w metabolizmie miksotroficznym: jako źródła węgla stosuje się zarówno nieznakowany CO2, jak i znakowane substraty węglowe. Jeśli cykl Calvina jest funkcjonalny, znakowanie seryny i histydyny będzie znacznie rozcieńczone w porównaniu z innymi aminokwasami. Metoda ta pozwala określić względne wiązanie CO2 w obecności organicznych źródeł węgla w pożywce 13.</li>
	<li>Oksydacyjny szlak pentozofosforanowy: jako źródło węgla można zastosować glukozę [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, udział nieznakowanej alaniny wyniesie &gt;50% 12.</li>
	<li>Szlak anaplerotyczny (np. PEP + CO2 à szczawiooctan): jako źródło węgla można zastosować 13CO2 i nieznakowane substraty węglowe (np. glicerol lub pirogronian). Jeśli szlak ten jest aktywny, znakowanie asparaginianu będzie znacznie wyższe w porównaniu z alaniną i seryną 13.</li>
	<li>Re-cytrynianowa syntaza: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C]. Jeśli enzym jest aktywny, glutaminian jest znakowany w grupie β-karboksylowej 3, 4.</li>
	<li>Szlak citramalanowy: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C], glicerol [2-13C] lub octan [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, stopień znakowania leucyny i izoleucyny jest identyczny 14.</li>
	<li>Cykl seryno-izocytrynianowej liazazy: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C] lub mleczan [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, znakowany będzie atom węgla na trzeciej pozycji w serynie 15.</li>
	<li>Wykorzystanie składników odżywczych (tj. egzogennych aminokwasów): można zastosować pożywkę z całkowicie znakowanymi substratami węglowymi i nieznakowanymi aminokwasami. Jeśli komórki selektywnie wykorzystują te suplementowane nieznakowane składniki odżywcze, zaobserwowany zostanie znaczny spadek stopnia znakowania tych aminokwasów w biomasie. Metodę tę można wykorzystać do zbadania, które suplementy odżywcze są preferowane przez komórkę 16.</li>
</ol>6. Reprezentatywne wyniki
Niedawne badania nad bioenergetyką odżywiły zainteresowanie wykorzystaniem nowych mikroorganizmów fototroficznych do produkcji bioenergii i wychwytu CO2. W ostatnich latach zastosowano całkiem sporo analiz metabolizmu 13C, w tym zaawansowane analizy strumieni metabolicznych 13C (13C-MFA), aby zbadać centralny metabolizm bakterii fototroficznych, ponieważ wiedza biochemiczna na temat centralnych szlaków metabolicznych w tych organizmach niemodelowych nie jest wystarczająco ugruntowana10, 11, 17-20. Przedstawiamy tutaj przykład odkrycia alternatywnego szlaku syntezy izoleucyny u Cyanothece 51142 21. Cyanothece 51142 nie posiada enzymu (EC 4.3.1.19, treonina amoniak-liaza), który katalizuje przekształcenie treoniny w 2-ketomaślan w typowym szlaku syntezy izoleucyny. Aby rozstrzygnąć kwestię szlaku syntezy izoleucyny, hodujemy Cyanothece 51142 (20 mL) w pożywce ASP2 22 z 54 mM glicerolu (2-13C, &gt;98%). Cyanothece 51142 wykorzystuje glicerol znakowany w pozycji 2nd jako główne źródło węgla. Obserwujemy, że treonina i alanina mają jeden znakowany węgiel, podczas gdy izoleucyna jest znakowana trzema węgielmi. Zatem synteza w Cyanothece 51142 nie może pochodzić ze szlaku treoninowego stosowanego przez większość organizmów (Rycina 4). Z drugiej strony leucyna i izoleucyna wykazują identyczne wzory znakowania w oparciu o fragment (M-15)+ i fragment (M-159)+. Na przykład dane izotopomerowe dla [M-15]+ (zawierające niefragmentowane aminokwasy) wykazują identyczne znakowanie dla leucyny (M0=0.01, M1=0.03, M2=0.21, M3=0.69) i izoleucyny (M0=0.01, M1=0.03, M2=0.24, M3=0.67). Zatem leucyna i izoleucyna muszą być syntetyzowane z tych samych prekursorów (tj. pirogronianu i acetylo-CoA). Obserwacja ta jest zgodna z przejściem znakowanego węgla w szlaku citramalanowym syntezy izoleucyny. Aby potwierdzić ten szlak, przeszukujemy bazę danych Joint Genome Institute i stwierdzamy obecność syntazy citramalanowej CimA (cce_0248) u Cyanothece.
<img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="Schemat przepływu metabolicznego; znakowane substraty, analiza izotopomerów, rozdział GC, derywatyzacja TBDMS." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. 
Etapy analizy szlaków z wykorzystaniem 13C.
<img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="Schemat szlaków metabolicznych z glukozą, G6P, cyklem TCA i szlakami syntezy aminokwasów." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. 
Aminokwasy wykorzystane do określenia wzoru znakowania ich prekursorów metabolicznych. ACoA, acetylo-CoA; AKG, α-ketoglutaran; C5P, rybozo-5-fosforan; CIT, cytrynian; E4P, erytrozo-4-fosforan; G6P, glukozo-6-fosforan; OAA, szczawiooctan; PEP, fosfoenolopirogronian; PGA, 3-fosfoglicerynian; PYR, pirogronian.
<img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="Wyniki chromatografii i spektrometrii mas; wykres czasu retencji i obfitości aminokwasów." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Piki GC dla 16 aminokwasów. Aminokwasy poddane derywatyzacji TBDMS są rozbijane przez MS na dwa fragmenty: (M-57)+, zawierający cały aminokwas, oraz (M-159)+, w którym brakuje grupy α-karboksylowej aminokwasu. W przypadku leucyny i izoleucyny fragment (M-57)+ nakładał się na inne piki masowe. Sugerujemy wykorzystanie fragmentu (M-15)+ do analizy znakowania całego aminokwasu. Grupa (f302)+ jest wykrywana w większości aminokwasów i zawiera jedynie pierwszy (grupa α-karboksylowa) i drugi atom węgla w szkielecie aminokwasu. Ponieważ ten pik MS często charakteryzuje się wysokim stosunkiem szumu do sygnału, (f302)+ nie jest zalecany do ilościowej analizy strumieni metabolicznych7.
<img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig4.jpg" alt="Schemat szlaku metabolicznego, od glikolizy do aminokwasów, enzym CimA; dane dotyczące znakowania izotopowego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. 
Przejścia znakowania w szlakach izoleucyny u Cyanothece 51142 (zmodyfikowane z naszej poprzedniej publikacji)21.

<ol><li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li>
<li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li>
<li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluxome+analysis+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li>
<li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li>
<li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis%3A+mass+isotope+correction%2C+data+consistency+checking%2C+and+precursor+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li>
<li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li>
<li>Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li>
<li>Tang, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe%28III%29-NTA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li>
<li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calvin+cycle+flux%2C+pathway+constraints%2C+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase%2Freductase%3A+The+ethylmalonyl-CoA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li>
<li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li>
<li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unicellular%2C+aerobic+nitrogen-%C3%AF%C2%AC%C2%81xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li>
<li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li>
<li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-based+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten polega na dostarczeniu komórkom znakowanego substratu i pomiarze wynikających z tego wzorów znakowania izotopowego w aminokwasach za pomocą GC-MS. Ponieważ dane MS (stosunki m/z) dostarczają jedynie ogólnej ilości znakowania jonów MS, musimy ocenić rozkłady izotopomerów aminokwasów poprzez analizę stosunków m/z zarówno dla aminokwasów niefragmentowanych (M-57)+, jak i fragmentowanych (tj. (M-159)+ oraz (f302)+). Ponadto możemy przeprowadzić kilka hodowli komórkowych w chemicz...

<table><tbody><tr><td>TBDMS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19915</td><td>-</td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34865</td><td>-</td></tr><tr><td>Znakowany podłoże węglowe</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>Zależnie od wymagań eksperymentalnych</td><td>Strona internetowa: &lt;a href=&quot;http://www.isotope.com">http://www.isotope.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Chromatograf gazowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>Hewlett-Packard, model 7890A</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Kolumny GC&lt;/em&gt;</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>DB5 (30m)</td><td>-</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5975C</td><td>-</td></tr><tr><td>Odparowarka Reacti-Vap</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TS-18825</td><td>Do suszenia próbek aminokwasów</td></tr></tbody></table>

potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13c aminokwasów proteinogennych

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Mikroby posiadają złożone szlaki metaboliczne, które można badać za pomocą metod biochemicznych i genomiki funkcjonalnej. Ważną techniką pozwalającą na badanie centralnego metabolizmu komórkowego i odkrywanie nowych enzymów jest analiza metabolizmu wspomagana 13C 1. Technika ta opiera się na znakowaniu izotopowym, w którym mikroby są karmione substratami znakowanymi 13C. Śledząc ścieżki przejścia atomów między metabolitami w sieci biochemicznej, możemy określić funkcjonalne szlaki metaboliczne i odkryć nowe enzymy.
Jako metoda uzupełniająca dla transkryptomiki i proteomiki, podejścia do analizy szlaków metabolicznych wspomaganej izotopomerami obejmują trzy główne etapy 2. Po pierwsze, hodujemy komórki na substratach znakowanych 13C. Na tym etapie kluczowymi czynnikami są skład pożywki oraz dobór znakowanych substratów. Aby uniknąć szumów pomiarowych wynikających z obecności nieznakowanego węgla w suplementach odżywczych, wymagana jest pożywka minimalna z jednym źródłem węgla. Ponadto wybór znakowanego substratu opiera się na tym, jak skutecznie pozwoli on wyjaśnić analizowany szlak. Ponieważ nowe enzymy często wiążą się z inną stereochemią reakcji lub produktami pośrednimi, zazwyczaj substraty z pojedynczym znakowaniem węgla są bardziej informacyjne dla wykrywania nowych szlaków niż substraty znakowane jednorodnie3, 4. Po drugie, analizujemy wzory znakowania aminokwasów za pomocą GC-MS. Aminokwasy występują w białkach w dużych ilościach, zatem można je uzyskać poprzez hydrolizę biomasy. Aminokwasy mogą zostać poddane derywatyzacji za pomocą N-(tert-butylo-dimetylosilylo)-N-metylotryfluoroacetamidu (TBDMS) przed rozdziałem w GC. Aminokwasy zderywatyzowane TBDMS mogą ulegać fragmentacji w MS, co prowadzi do powstania różnych zestawów fragmentów. Na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z) aminokwasów pofragmentowanych i niepofragmentowanych możemy wywnioskować możliwe wzory znakowania głównych metabolitów, które są prekursorami aminokwasów. Po trzecie, śledzimy przejścia węgla 13C w proponowanych szlakach i na podstawie danych izotopomerowych potwierdzamy, czy szlaki te są aktywne 2. Pomiar aminokwasów dostarcza informacji o znakowaniu izotopowym ośmiu kluczowych metabolitów prekursorowych w metabolizmie centralnym. Te kluczowe węzły metaboliczne mogą odzwierciedlać funkcje powiązanych z nimi głównych szlaków.
Analiza metabolizmu wspomagana izotopem 13C za pomocą aminokwasów proteinogennych może być szeroko stosowana do charakterystyki funkcjonalnej słabo poznanych procesów metabolicznych drobnoustrojów1. W niniejszym protokole wykorzystamy Cyanothece 51142 jako szczep modelowy, aby zademonstrować zastosowanie znakowanych substratów węglowych w odkrywaniu nowych funkcji enzymatycznych.

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Mikroorganizmy posiadają złożone szlaki metaboliczne, które można badać przy użyciu metod biochemicznych i genomiki funkcjonalnej. Jedną z istotnych technik służących do badania...

Celem niniejszego protokołu jest badanie metabolizmu bakteryjnego z wykorzystaniem analizy metabolicznej wspomaganej węglem 13. W pierwszej kolejności mikroorganizmy są hodowane w obecności znakowanych substratów węglowych, które są wbudowywane w białka mikrobiologiczne. Następnie mikroorganizmy są zbierane, a aminokwasy ekstrahowane, hydrolizowane i poddawane derywatyzacji.Próbki nanosi się na chromatograf gazowy i spektrometr masowy (GCMS). Poprzez śledzenie ścieżek przejść atomów między metabolitami w sieci biochemicznej można określić funkcjonalne szlaki metaboliczne wykorzystywane przez drobnoustroje. Jestem Bertem Burla.Metoda, którą tutaj przedstawiamy, może być stosowana jako uzupełnienie transkryptomiki i proteomiki w celu określenia szlaków metabolicznych u mikroorganizmów. Wykorzystaliśmy tę technikę do badania mikroorganizmów fotosyntetyzujących, takich jak sinice, pod kątem myotroficznego lub heterotroficznego wykorzystywania węgla. W tym filmie posłużymy się szczepem modelowym ANOTHE 5 1 1 42, aby zademonstrować zastosowanie znakowanych substratów węglowych w odkrywaniu nowych funkcji enzymatycznych.Procedurę zaprezentujemy ja, li Yu oraz Chu Yang Fang. Rozpocznij tę procedurę od hodowli bakterii cyana thesei w nieoznakowanym medium. Gdy bakterie osiągną środkową fazę logarytmicznego wzrostu, zaszczep 3% objętości do medium znakowanego węglem 13.Następnie, aby uniknąć wprowadzenia nieznakowanego węgla z początkowej subkultury szczepionki do tego samego znakowanego medium w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego, gdy bakterie Cy Thesei znakowane węglem 13 osiągną środkową fazę wzrostu logarytmicznego, należy zebrać 10 mililitrów poprzez wirowanie. Osad należy resuspender w 1,5 mililitrach kwasu solnego o stężeniu sześć molar i przenieść do przeźroczystej szklanej fiolki z zakrętką do chromatografii gazowej lub GC.Zakręć fiolki i umieść je w piecu nagrzanym do 100 °C na 24 godziny, aby przeprowadzić hydrolizę białek biomasy do aminokwasów. Hydroliza pelletów biomasy pozwala na uzyskanie 16 z 20 powszechnie występujących aminokwasów. Po hydrolizie przenieś roztwór aminokwasów do probówek do mikrowirówki o pojemności 2 mL, a następnie wiruj przy 20 000 ×g przez pięć minut w celu osadzenia cząstek stałych.Po wirowaniu przenieś nadosady do nowych fiolek do GC, aby usunąć cząstki stałe z roztworu hydrolizy, zapobiegając ich przedostaniu się do kolumny GC. Następnie aminokwasy są poddawane derywatyzacji, aby uczynić je lotnymi dla rozdzielenia metodą chromatografii gazowej. Próbki po wysuszeniu rozpuść w 150 µL tetrahydrofuranu (THF) oraz 150 µL N,O-bis(trimetylsilylo)trifluoroacetamidu (BSTFA).Odczynnik do derywatyzacji acetamidem, T-B-D-M-S: wszystkie próbki inkubować w piecu w temperaturze od 65 do 80 °C przez jedną godzinę. Próbki należy sporadycznie mieszać w wstrząsarce typu vortex, aby upewnić się, że metabolity w fiolce są rozpuszczone. Próbki wirować przy 20 000 ×g przez 10 minut, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek do GC.Nadlodówka powinna być klarownym, żółtawym roztworem. Parametry temperatury GC są następujące: utrzymanie 150 °C przez dwie minuty, następnie wzrost z prędkością 3 °C na minutę do 280 °C.Zwiększać temperaturę w tempie 20 °C na minutę do 300 °C, a następnie utrzymać ją przez pięć minut. Następnie, w przypadku 30-metrowej kolumny GC, ustawić opóźnienie rozpuszczalnika na około pięć minut, a zakres stosunku masy do ładunku w przedziale od 60 do 500. Próbki analizować za pomocą GCMS, stosując objętość wtrysku 1 µL przy stosunku podziału od 1:5 do 1:10 oraz gaz nośny hel w przepływie 1,2 mL na minutę po zakończeniu cyklu.Przeanalizuj dane z GCMS za pomocą programu Microsoft Excel. Czas retencji w GC oraz unikalne piki stosunku masy do ładunku dla każdego aminokwasu przedstawiono na tej figurze. Pochodne T-B-D-M-S aminokwasów są zazwyczaj wyraźnie rozdzielane przez MS na dwa naładowane fragmenty: fragment M minus 57, który zawiera cały aminokwas, oraz fragment M minus 1 59, w którym brakuje grupy alfa-karboksylowej aminokwasu w przypadku leucyny i izoleucyny. ピк M minus 57 nakładał się na inne piki masowe fragmentów. Fragment N minus 15 może być wykorzystany do analizy całego znakowania aminokwasów. Ponadto grupa F 3 0 2 jest często wykrywana w większości aminokwasów i zawiera jedynie pierwszą grupę alfa-karboksylową oraz drugi węgiel w szkielecie aminokwasu.Jednakże, ponieważ ten pik Ms.Peak często charakteryzuje się wysokim stosunkiem szumu do sygnału, F 3 0 2 nie jest zalecany do ilościowej analizy strumieni metabolicznych. Deriwatyzacja aminokwasów lub głównych metabolitów wprowadza znaczne ilości naturalnie znakowanych izotopów, w tym węgla 13, tlenu 18, krzemu 29 oraz krzemu 30. Szum pomiarowy wynikający z obecności izotopów naturalnych w surowym widmie mas lub izotopowym może zostać skorygowany przy użyciu opublikowanego oprogramowania.Końcowe dane dotyczące znakowania izotopowego przedstawiono jako ułamki masowe. Na przykład M zero, M1, M dwa, M trzy oraz M cztery, reprezentujące fragmenty zawierające od zera do czterech atomów węgla znakowanych izotopem węgla 13 cyana. Ten 5 1 1 2 nie zawiera enzymu lianina amoniak-liazy, który katalizuje konwersję lianiny do 2-ketobutyranu w typowej ścieżce syntezy izli.W związku z tym, aby rozstrzygnąć kwestię szlaku metabolicznego w tym organizmie, szczep cyana THESEI 5 1 1 42 był hodowany w medium ASP two z 54 mM glicerolu i analizowany za pomocą GCMS, zgodnie z opisem w tym filmie. Jak pokazano tutaj, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 wykorzystuje glicerol znakowany w drugiej pozycji jako główne źródło węgla; zaobserwowano, że treonina i alanina, których prekursorem jest pirogronian, posiadają jeden znakowany węgiel, podczas gdy izoleucyna została znakowana trzema węglami. Zatem synteza w cyana these 5 1 1 4 2 nie może pochodzić ze szlaku treoninowego stosowanego przez większość organizmów. Z drugiej strony, leucyna i izoleucyna wykazują identyczne wzory znakowania w oparciu o fragment M minus 15 oraz fragment M minus 1 59.Na przykład izotop lub dane z N minus 15 zawierające NIEPOODZIELONE aminokwasy wykazały identyczne znakowanie dla leucyny i izoleucyny. Zatem leucyna i izoleucyna muszą być syntetyzowane z tych samych prekursorów, pirogronianu i acetylo-CoA. Obserwacja ta jest zgodna z przejściem znakowanego węgla w szlaku cytramalatu dla syntezy izoleucyny.Metodę tę można wykorzystać do badania metabolizmu szerokiego spektrum mikroorganizmów, a po opanowaniu techniki cały proces można przeprowadzić od początku do końca w około jeden tydzień.

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Potwierdzenie szlaków metabolicznych i odkrycie poprzez 13C-oznaczanie aminokwasów proteinogennych

Procedury znakowania izotopami stabilnymi z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O (procedury LeO) są wszechstronnymi narzędziami w ilościowych i jakościowych badaniach proteomicznych. W procedurach wspomaganych proteazami (PALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez proteolityczne rozszczepienie oraz reakcje wymiany tlenu karboksylowego katalizowane przez proteazy. W procedurze katalizowanej kwasowo (ALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez wymianę tlenu karboksylowego przy niskim pH.

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Walidacja aktywności enzymatycznych związanych ze szlakami biochemicznymi może być wyjaśniona za pomocą analizy komplementacji funkcjonalnej (FCA). W tym manuskrypcie opisano test FCA wykazujący aktywność enzymatyczną enzymów biorących udział w metabolizmie aminokwasów, rygorystycznej odpowiedzi bakterii i biosyntezie peptydoglikanu bakteryjnego.

Analiza komplementarności funkcjonalnej (FCA): ćwiczenie laboratoryjne zaprojektowane i wdrożone w celu uzupełnienia nauczania szlaków biochemicznych

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Poznaj metodę znakowania izotopowego 13C aminokwasów proteinogennych w celu analizy szlaków metabolicznych bakterii za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii masowej GC-MS.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie ¹³C aminokwasów proteinogennych

Przeglądaj więcej filmów