Name: System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie maziowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj system 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie maziowym, który naśladuje naturalne warunki fizjologiczne. Ta metoda umożliwia długoterminową analizę zachowań komórek i badania regeneracji chrząstki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura oraz Dana Cairns (Tufts University) za pomoc w przechowywaniu i wirowaniu płynu stawowego. Praca ta była finansowana przez NIH (1R01AR059106-01A1) dla L.Z.

Trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym
W niniejszej pracy enkapsulowano ludzkie chondrocyty stawowe w kule alginianowe, stosując zmodyfikowany protokół enkapsulacji sugerowany przez producenta (Lonza, oraz 31). Wykorzystując te konstrukty 3D, opracowaliśmy system hodowli komórek w pożywce zawierającej różne stężenia ludzkiego płynu stawowego i oceniliśmy ekspresję genów chrząstki w tych konstruktach 3D.
1. Przygotowanie ludzkich chondrocytów stawowych (HAC) do enkapsulacji trójwymiarowej (3D)
<ol>
	<li>Rozmrozić fiolkę (1 ml) ludzkich chondrocytów stawowych (HAC) (Lonza) (pasaż 2) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 1 min.</li>
	<li>Wymieszać z 1 ml pożywki do wzrostu chondrocytów (Lonza) i wirować przy 3000 rpm przez 3-5 min w celu zebrania komórek. Odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować pellet komórkowy w pożywce do wzrostu chondrocytów (Lonza).</li>
	<li>Przesiać komórki do 10 cm płytki do hodowli tkanek (BD Biosciences) i hodować w pożywce do wzrostu chondrocytów (Lonza) aż do uzyskania konfluencji. HAC powinny być wykorzystywane w pasażu nie wyższym niż 3 lub 4 (P3 lub P4).</li>
	<li>Przemyć HAC na płytce za pomocą 155 mM NaCl zamiast standardowego PBS, a następnie przeprowadzić trypsynizację w celu zebrania komórek do enkapsulacji w kuleczkach alginianowych. Po odczepieniu komórek wirować je przy 3000 rpm przez 5 min. Komórki są teraz gotowe do enkapsulacji 3D.</li>
</ol>
2. Enkapsulacja HAC w koralikach 3D
Resuspender HAC w 1,2% roztworze alginianu (Sigma) przy gęstości 8x105cells/ml. Liczbę komórek określono przed enkapsulacją, korzystając ze standardowego licznika komórek. Bardzo ważne jest dokładne wymieszanie, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w kuleczkach.
<ol>
	<li>Przenieś mieszaninę roztworu HAC/alginianu pipetą do strzykawki o pojemności 12 ml z dołączoną igłą o rozmiarze 22G (Tyco healthcare, Inc.).</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj zlewkę o pojemności 50 mL z 102 mM CaCl2 w objętości 5-krotnie większej niż objętość roztworu HAC/alginianu. Umieść w zlewce mieszadło magnetyczne i powoli mieszaj roztwór 102 mM CaCl2 (z prędkością około 150 rpm).</li>
	<li>Trzymając końcówkę strzykawki na wysokości około 6 cali nad powierzchnią roztworu CaCl2, dodawaj mieszaninę HAC/alginianu do roztworu CaCl2 kroplami. Zazwyczaj otrzymane kule alginianowe mają średnicę 2 mm, a gęstość enkapsulacji wynosi około 104 komórek/kula. Uwaga: Wysokość strzykawki nad roztworem CaCl2 jest istotna. Krótsza odległość spowoduje powstanie kulek w kształcie łzy zamiast sferycznych, co doprowadzi do nierównomiernej integralności mechanicznej i enkapsulacji komórek.</li>
	<li>Pozostaw kulki do mieszania w roztworze CaCl2 przez 20-25 min. Choć inne protokoły enkapsulacji w alginianie wskazują znacznie krótszy czas inkubacji wynoszący 10 min, stwierdzono, że dłuższy czas inkubacji w roztworze CaCl2 poprawia integralność kulek.</li>
	<li>Usuń roztwór CaCl2, przemyj kulki 2-3 razy w 2-3 objętościach NaCl, a następnie raz w medium do różnicowania chondrocytów (Lonza). Podczas gdy inne protokoły enkapsulacji w kule alginianowe obejmują użycie filtra do powyższych procedur płukania, zaobserwowano, że kulki alginianowe często zaplątują się w filtrze i wysychają, co zmniejsza wydajność enkapsulacji. Najbardziej efektywnym rozwiązaniem okazało się pozwolenie kulkom na opadnięcie na dno zlewki przed wylaniem roztworu.</li>
	<li>Używając standardowej szpatułki, przenieś kulki do naczyń hodowlanych. Zazwyczaj hoduje się 12 kulek na studzienkę 3 cm przez 2 dni w medium wzrostowym dla chondrocytów, aby umożliwić chondrocytom adaptację do procesu enkapsulacji w medium, w którym były hodowane, przed przejściem na medium do różnicowania chondrocytów (Lonza) z płynem stawowym.</li>
</ol>
3. Hodowla chondrocytów w pożywce do hodowli w płynie stawowym
<ol>
	<li>Świeży płyn stawowy można pozyskać z poradni ambulatoryjnej (pozyskano go z Tufts Medical Center). Płyn stawowy można transportować do laboratorium w probówkach Falcon o pojemności 15 ml, a następnie niezwłocznie odwirować przy 3000 rpm przez 15min w celu usunięcia szczątków komórkowych. Płyn stawowy pozbawiony komórek należy rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Nadlodówkę można przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
	<li>Przed hodowlą zmieszać płyn stawowy z pożywką do różnicowania chondrocytów (CDM, Lonza) w różnych stosunkach objętościowych, przy stałym stężeniu 100mM kwasu askorbinowego i 9 mM CaCl2 (ta śladowa ilość CaCl2 ma na celu zapewnienie integralności kulek alginianowych).</li>
	<li>Płytkę należy umieścić na platformie kołyszącej w inkubatorze w temperaturze 37°C (częstotliwość kołysania: ok. 75 razy/min), aby wspomóc dystrybucję składników odżywczych wewnątrz kulek alginianowych oraz ograniczyć ich zlepianie się. Jest to szczególnie istotne, ponieważ hodujemy te chondrocyty przez przedłużony czas (do 4 tygodni). Uwaga: Choć pożywki do wzrostu i różnicowania chondrocytów (Lonza) zawierają dwa powszechnie stosowane antybiotyki – gentamycynę i amfoterycynę – nie dodawaliśmy żadnych antybiotyków podczas stosowania różnych stężeń płynu stawowego w hodowli chondrocytów. Nie zaobserwowano żadnych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Wymieniać mieszaniny pożywek co 2-3 dni. Lepkość płynu stawowego stanowiła główną przeszkodę w hodowli chondrocytów enkapsulowanych w kulkach alginianowych podczas długoterminowych kultur. Stwierdzono, że najskuteczniejszą metodą jest rozcieńczanie pożywki z dodatkiem płynu stawowego za pomocą 102mM CaCl2 (50% V/V), co dodatkowo wzmacnia integralność kulek alginianowych. W ten sposób pożywkę można powoli usunąć pipetą, nie uszkadzając kulek.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie HAC w kuleczkach alginianowych do analizy ekspresji genów
Należy zachować szczególną ostrożność podczas odzyskiwania HAC z kulek alginianowych do analizy ekspresji genów.
<ol>
	<li>Przemyć kule alginianowe 3 razy w 102 mM CaCl2, po około 5 min każdego razie.</li>
	<li>Odzyskać chondrocyty, dodając 55 mM NaCitrate w objętości 4-5 razy większej niż objętość kulek. Ważne jest, aby kule alginianowe były całkowicie zanurzone w roztworze NaCitrate. Wstrząsać lub inkubować na wytrząsarce przez 20-30 min.</li>
	<li>Odwirować komórki i odlać nadsącz.</li>
	<li>Do analizy RT-PCR resuspender pellet komórkowy w buforze do lizy komórek (Qiagen RNA isolation kit), a następnie przystąpić do oczyszczania RNA.</li>
</ol>
5. Fixowanie HAC w kuleczkach alginianowych do analizy histologicznej
Należy zachować szczególną ostrożność podczas odzyskiwania HAC z kulek 3D do analizy histologicznej.
<ol>
	<li>Przemyć kuleczki alginianowe 3 razy w 102 mM CaCl2, po około 5 min za każdym razem. Aby całkowicie usunąć lepki płyn stawowy, najskuteczniejszą metodą okazało się płukanie w pożywce do różnicowania chondrocytów (Lonza) przez noc, w inkubatorze z kołysaniem w temperaturze 37°C (częstotliwość kołysania: około 75 razy/min). Zastosowano pożywkę do wzrostu chondrocytów, aby zapewnić ich przeżycie podczas tego przedłużonego płukania oraz umożliwić maksymalne przenikanie utrwalacza.</li>
	<li>Utrwalić kuleczki w 70% etanolu przez noc, a następnie przystąpić do analizy histologicznej. Aby przeprowadzić barwienie Dapi, inkubować kuleczki alginianowe z roztworem Dapi (500ng/ml) przez 1h przy delikatnym kołysaniu, a następnie przemyć 3 razy w 102mM CaCl2 po 15 min za każdym razem. Obrazy Dapi można następnie oglądać pod mikroskopem fluorescencyjnym. Kuleczki można również poddać sekcjowaniu w celu barwienia błękitem alcianowym oraz H&amp;E.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Nasza metoda hodowli 3D chondrocytów ludzkich w wysokich stężeniach płynu stawowego została przedstawiona na schemacie widocznym na Rys. 1. Po enkapsulacji chondrocytów ludzkich w kulek alginianowych, pozwolono im rosnąć w pożywce uzupełnionej o różne proporcje płynu stawowego. Ze względu na lepkość płynu stawowego, niezbędne jest hodowanie chondrocytów w warunkach ciągłego kołysania, aby zapobiec zlepianiu się konstruktów chrzęstnych i zapewnić równomierny rozkład składników odżywczych. Niezbędne jest również dokładne przemycie kulek alginianowych przed odzyskaniem chondrocytów, aby bufor utrwalający lub lizujący mógł przeniknąć do wnętrza kulek (Rys. 1). Zdjęcia chondrocytów w kulkach alginianowych wykonane w jasnym polu (BF) przedstawiono na Rys. 2. Wykonano barwienie Dapi, aby potwierdzić jednolity rozkład komórek wewnątrz kulek (Rys. 2). Po zakończeniu 21-dniowego okresu hodowli przeprowadzono analizę ekspresji genów za pomocą qRT-PCR. Gen referencyjny GAPDH został wykorzystany do normalizacji wszystkich reakcji PCR, ponieważ określono go jako jeden z najwiarygodniejszych genów referencyjnych dla analiz qPCR w chondrocytach 32. Przykład przedstawiono na Rys. 3, gdzie przeanalizowano wyniki uzyskane z ludzkich chondrocytów stawowych hodowanych w płynie stawowym zebranym od sześciu pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Zgodnie z faktem, że chondrocyty z firmy Lonza były namnażane w hodowlach 2D, co nieuchronnie prowadzi do dedyferencjacji 33, stwierdzono, że chondrocyty w dniu 0 wykazywały minimalne poziomy ekspresji genów macierzy chrzęstnej (Rys. 3). Hodowla 3D chondrocytów w pożywce do różnicowania chondrocytów (Lonza) lub w pożywce uzupełnionej płynem stawowym znacząco zwiększyła ekspresję genów chrzęstnych kolagenu, agrekanu i MMP13, co wskazuje na redyferencjację chondrocytów do 21. dnia (Rys. 3) 34. Zwiększanie procentowej zawartości płynu stawowego w pożywkach doprowadziło do uzyskania porównywalnych poziomów ekspresji mRNA markerów macierzy chrzęstnej: kolagenu II i agrekanu (Rys. 3A i 3B). Co więcej, chondrocyty hodowane w 100% płynie stawowym wykazały nawet spadek ekspresji mRNA MMP13, enzymu degradującego chrząstkę, w porównaniu do komórek hodowanych w samej pożywce (Rys. 3C). Co ciekawe, poziom ekspresji wskaźnika śmierci komórkowej kaspazy 3 stopniowo malał wraz ze wzrostem proporcji płynu stawowego, co sugeruje, że hodowla w płynie stawowym doprowadziła do obniżenia poziomu apoptozy (Rys. 3D). Zatem nasze wyniki wykazują, że hodowanie ludzkich chondrocytów stawowych w wysokich stężeniach płynu stawowego w układzie 3D jest technologią wykonalną.
Tabele i rysunki
<img alt="Schemat enkapsulacji i hodowli chondrocytów; konfiguracja analizy ekspresji genów; proces odzyskiwania komórek." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Schemat metody hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego w 3D alginianowych kuletkach. Najpierw miesza się chondrocyty z roztworem alginianu. Po nakraplaniu do roztworu CaCl2 chondrocyty zostają unieruchomione wewnątrz sieciowanych kuletek hydrożelu alginianu wapnia. Te konstrukty 3D są następnie hodowane w medium do różnicowania chondrocytów (Lonza) z różnymi proporcjami ludzkiego płynu stawowego. Po 21 dniach hodowli w warunkach kołysania kuletki alginianowe zawierające komórki są dokładnie płukane, po czym komórki są odzyskiwane do analizy ekspresji genów.
<img alt="Kolejne obrazy mikroskopowe analizy fluorescencji i struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Obrazy w jasnym polu (BF) i barwione DAPI hodowle enkapsulowanych ludzkich chondrocytów stawowych z 0%, 30%, 50%, 70% i 100% płynu stawowego. Chondrocyty miały kształt sferyczny we wszystkich warunkach hodowli. Obrazy z jasnego pola (BF) oraz barwienia DAPI zostały nałożone na siebie w celu potwierdzenia lokalizacji i rozkładu chondrocytów. Wstawki przedstawiają powiększone obrazy. Groty strzałek wskazują kolokalizację chondrocytów na obrazach BF i barwienia DAPI.
<img alt="Wykresy słupkowe ekspresji mRNA dla kolagenu, agrekanu, MMP13 i kaspazy 3, D0 vs. D21." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3."> 
Rysunek 3. Analiza qRT-PCR enkapsulowanych ludzkich chondrocytów stawowych w dniu 0 (D0) oraz po 21 dniach hodowli (D21) w medium uzupełnionym różnymi proporcjami płynu stawowego (SF) (0%, 30%, 50%, 70% i 100%). Przedstawiono wyniki z czterech niezależnych próbek. GAPDH służył jako wewnętrzna referencja dla wszystkich reakcji PCR. A. Ekspresja mRNA kolagenu II. B. Ekspresja mRNA agrekanu. C. Ekspresja mRNA MMP13. D. Ekspresja mRNA kaspazy 3. Istotność statystyczną dla próbek z dnia 0 oraz próbek z dnia 21 hodowlanych w 0% i 100% płynu stawowego (SF) oceniono za pomocą oprogramowania INSTAT. * oznacza P&lt;0.05.

<ol><li>Centers for Disease Control and P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+state-specific+increases+in+self-reported+doctor-diagnosed+arthritis+and+arthritis-attributable+activity+limitations--United+States%2C+2005-2030%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).</li>
<li>Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+correlates+of+arthritis-attributable+work+limitation+in+the+US+population+among+persons+ages+18-64%3A+2002+National+Health+Interview+Survey+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data.</a> Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cartilage+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering cartilage tissue.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).</li>
<li>Glowacki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+engineering+of+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rehabil.+Res.+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro engineering of cartilage.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).</li>
<li>Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-In+vitro+Effects+of+Compression+and+Time+in+Culture+on+Aggregate+Modulus+and+on+Gene+Expression+and+Protein+content+of+Collagen+Type+II+in+Murine+Chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. , (2009).</li>
<li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering%3A+the+role+of+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering: the role of biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li>
<li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).</li>
<li>Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+in+chronic+inflammatory+synovitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Rheumatol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cytokines in chronic inflammatory synovitis.</a> Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).</li>
<li>Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secreted+glycoprotein+lubricin+protects+cartilage+surfaces+and+inhibits+synovial+cell+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth.</a> J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).</li>
<li>Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+reduces+inflammation+in+experimental+arthritis+by+modulating+TLR-2+and+TLR-4+cartilage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2011).</li>
<li>van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Biorheology. 37, 45-55 (2000).</li>
<li>Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+arthritic+synovial+fluid+influences+proteoglycan+biosynthesis+and+degradation+in+organ+culture+of+bovine+nasal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage.</a> Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).</li>
<li>Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+normal+synovial+fluid+on+the+metabolism+of+articular+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+nonresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor+1+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis.</a> Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+stimulation+of+chondrocyte+proteoglycan+synthesis+by+human+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid.</a> Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).</li>
<li>Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+unresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor-1.+A+novel+pathogenetic+mechanisms+for+cartilage+destruction+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis.</a> Agents Actions. 26, 193-195 (1989).</li>
<li>Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+and+peripheral+blood+immune+complexes+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+induce+apoptosis+in+cytokine-activated+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol.+Int%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes.</a> Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).</li>
<li>Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+autologous+synovial+fluid+induce+chondrogenic+differentiation+of+equine+mesenchymal+stem+cells%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study.</a> Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).</li>
<li>Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+normal+articular+cartilage+induced+by+late+phase+osteoarthritic+synovial+fluid+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs.</a> Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).</li>
<li>Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+subchondral+progenitor+cells+is+impaired+by+rheumatoid+arthritis+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid.</a> J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).</li>
<li>Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+culture+system%3A+Synovial+fibroblasts+modulate+articular+chondrocyte+matrix+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro.</a> Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).</li>
<li>Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+synovial+fluid+from+injured+knee+joints+on+in+vitro+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis.</a> Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).</li>
<li>Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+growth+factors+and+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+perichondrium%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Plast.+Reconstr.+Surg.+Hand.+Surg.%22%5BJournal%5D)">The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium.</a> Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).</li>
<li>Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+synovial+fluid+and+synovial+fluid+cells+on+chondrocyte+metabolism+in+short+term+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture.</a> J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).</li>
<li>Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+tissue+inhibits+proteoglycan+production+in+human+osteoarthritic+cartilage%3B+Establishment+and+characterisation+of+a+long-term+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture.</a> Arthritis Rheum. , (2011).</li>
<li>Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+knee+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Knee.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro.</a> Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).</li>
<li>van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).</li>
<li>Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+fluid+and+synovium+supernatants+up-regulate+tumor+necrosis+factor+receptors+on+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).</li>
<li>Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+positively+the+proliferation+of+bovine+satellite+cells+and+their+myogenic+differentiation+through+up-regulation+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD.</a> Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).</li>
<li>Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chondrocytic+gene+expression+by+biomechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Eukaryot.+Gene.+Expr%22%5BJournal%5D)">Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals.</a> Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).</li>
<li>Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+growth+characteristics+of+chondrocytes+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads.</a> Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).</li>
<li>Toegel, S., Huang, W., Piana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+qPCR+studies+on+chondroprotective+action%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action.</a> BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).</li>
<li>Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+human+chondrocytes+during+passaged+monolayer+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation.</a> J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).</li>
<li>Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chondrocytes+differentially+express+matrix+modulators+during+in+vitro+expansion+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).</li>
<li>Anat, J. 121, 107-118 (1976).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie opracowaliśmy metodę umożliwiającą hodowlę ludzkich chondrocytów stawowych w środowisku 3D w pożywce zawierającej wysokie stężenia ludzkiego płynu stawowego. Płyn stawowy jest jednym z głównych składników tworzących naturalne środowisko w jamie stawowej, w której bytują chondrocyty stawowe. Jednak lepkość płynu stawowego stanowiła główne wyzwanie dla trójwymiarowej długoterminowej hodowli chondrocytów. Aby przezwyciężyć trudność z utrzymaniem równomiernego rozkładu składników odżywczych w konstrukci...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela specyficznych odczynników i sprzętu:</td></tr><tr><td>Nazwa odczynnika</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Alginian (sól sodowa kwasu alginowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2158-250G</td><td>roztwór 2,4% przechowywany w 40&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny, ziarnisty</td><td>JT Baker</td><td>A19339</td><td></td></tr><tr><td>Chondrogenne medium wzrostowe</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156 (medium podstawowe)</td><td></td></tr><tr><td>CC-4409 (suplement)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium do różnicowania chondrogennego</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3226 (medium podstawowe)</td><td></td></tr><tr><td>CC-4408 (suplement)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie chondrocyty stawowe</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>Dapi (4&amp;#8242;,6-diamidino-2-fenyloindol dichlorowodorek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy mini (do ekstrakcji RNA)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do PCR: SYBR-green</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95053-500</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 12 ml</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>512852</td><td></td></tr><tr><td>Igła hipodermiczna 22G</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka platformowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Vari-mix</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IIa-forward</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Collagen IIa-reverse</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>MMP13-forward</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>MMP13-reverse</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Caspase 3-forward</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Caspase 3-reverse</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3&amp;rsquo;</td></tr></tbody></table>

system 3d do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Destrukcja chrząstki jest kluczową cechą patologiczną choroby zwyrodnieniowej stawów, która stanowi główną przyczynę niepełnosprawności w USA. Chrząstka u dorosłych nie regeneruje się efektywnie in vivo; w rezultacie choroba zwyrodnieniowa prowadzi do nieodwracalnej utraty chrząstki, której towarzyszy chroniczny ból i unieruchomienie 1,2. Inżynieria tkankowa chrząstki oferuje obiecujący potencjał w zakresie regeneracji i przywracania funkcji tkanki. Technologia ta zazwyczaj polega na wysiewaniu chondrocytów do rusztowań naturalnych lub syntetycznych i hodowli powstałej konstrukcji 3D w zrównoważonym medium przez określony czas, z celem stworzenia biochemicznie i biomechanicznie dojrzałej tkanki, którą można przeszczepić w miejsce ubytku in vivo 3-6. Osiągnięcie optymalnych warunków dla wzrostu chondrocytów i odkładania macierzy jest niezbędne dla sukcesu inżynierii tkankowej chrząstki.
 W naturalnej jamie stawowej chrząstka na powierzchni stawowej kości jest kąpana w płynie stawowym. Ten klarowny i lepki płyn dostarcza składników odżywczych do naczyniowej chrząstki stawowej oraz zawiera czynniki wzrostu, cytokiny i enzymy, które są istotne dla metabolizmu chondrocytów 7,8. Ponadto płyn stawowy ułatwia ruchy przy niskim tarciu między powierzchniami chrzęstnymi, głównie poprzez wydzielanie dwóch kluczowych składników: kwasu hialuronowego i lubrycyny 9 10. W przeciwieństwie do tego, chrząstka inżynierowana tkankowo jest najczęściej hodowana w sztucznych mediach. Choć media te prawdopodobnie pozwalają na zapewnienie bardziej zdefiniowanych warunków do badania metabolizmu chondrocytów, płyn stawowy najdokładniej odzwierciedla naturalne środowisko, w którym znajdują się chondrocyty stawowe.
 W rzeczywistości płyn stawowy ma tę zaletę, że jest łatwy do pobrania i przechowywania, a organizm często regularnie go uzupełnia. Kilka grup badawczych wzbogacało pożywkę hodowlaną płynem stawowym podczas hodowli ludzkich, bydlęcych, króliczych i psich chondrocytów, jednak najczęściej stosowano jedynie niskie stężenia płynu stawowego (poniżej 20%) 11-25. Choć chondrocyty kurczaka, konia i człowieka były hodowane w pożywkach z wyższym odsetkiem płynu stawowego, systemy te były dwuwymiarowe 26-28. Przedstawiamy tutaj naszą metodę hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w systemie 3D z wysokim odsetkiem płynu stawowego (do 100%) przez okres 21 dni. W ten sposób pokonaliśmy główną przeszkodę, jaką jest wysoka lepkość płynu stawowego. System ten umożliwia badanie ludzkich chondrocytów w płynie stawowym w układzie 3D, co można dodatkowo połączyć z dwoma innymi istotnymi czynnikami (ciśnieniem parcjalnym tlenu oraz obciążeniem mechanicznym) 29,30, które stanowią naturalne środowisko chrząstki, aby naśladować naturalne warunki jej wzrostu. Co więcej, system ten może być również wykorzystywany do analizy aktywności płynu stawowego na chondrocyty oraz stanowić platformę do opracowywania technologii regeneracji chrząstki i opcji terapeutycznych w leczeniu zapalenia stawów.

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Destrukcja chrząstki jest centralną cechą patologiczną choroby zwyrodnieniowej stawów, która stanowi jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności w USA. Chrząstka u osoby dorosłej nie...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest hodowla ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym w kulturach długoterminowych. Osiąga się to poprzez wstępne zamknięcie chondrocytów w kuleczkach alginianowych. Następnie chondrocyty są hodowane w płynie stawowym, co pozwala im na proliferację w środowisku 3D naśladującym ich naturalne warunki wzrostu.Pożywkę należy wymieniać okresowo, aby zapewnić komórkom odpowiedni dostęp do składników odżywczych. Ostatnim etapem procedury jest odzyskanie chondrocytów z kulek alginianowych w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów oraz analizy histologicznej. Analizy te potwierdzają, że chondrocyty hodowane w kuleczkach alginianowych są żywotne, proliferują i wykazują znaczną ekspresję macierzy chrzęstnej.Główną zaletą zastosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że analizujemy komórki chrząstki w układzie trójwymiarowym zamiast dwuwymiarowego. Ponadto jako medium stosujemy płyn stawowy zamiast pożywek sztucznych. Zatem połączenie konstrukcji trójwymiarowej i wykorzystania płynu stawowego pozwala nam analizować je w środowisku bardziej naturalnym, w przeciwieństwie do układu dwuwymiarowego na płytce i zastosowania sztucznych pożywek.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii chrząstki i inżynierii tkankowej. Na przykład: jak komórki chrząstki lub chondrocyty zachowują się w płynie stawowym w dłuższym terminie? A także: czy powinniśmy przyzwyczaić komórki chrząstki do płynu stawowego przed przeszczepieniem ich do organizmów biorców?Przygotuj fiolkę o pojemności jednego mililitra zawierającą ludzkie chondrocyty stawowe lub ich zamrożone próbki, rozmrażając je w ciepłej wodzie przez minutę. Następnie przelej zamrożone komórki do fiolki zawierającej dwa mililitry ogrzanej pożywki do wzrostu chondrocytów. Aby usunąć medium do mrożenia zawierające DMSO, odwiruj komórki przy 3000 RPM przez trzy do pięciu minut, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w siedmiu mililitrach pożywki do wzrostu chondrocytów.Następnie przenieś komórki na płytkę 10 cm i hoduj je do momentu uzyskania konfluencji. Komórki typu hacks należy wykorzystywać przy numerze pasażu nieprzekraczającym trzech lub czterech. Po osiągnięciu konfluencji przemyj komórki hacks roztworem chlorku sodu zamiast PBS.Następnie zebrać komórki za pomocą trypsyny, używając 0,5 ml standardowego roztworu trypsyny z EDTA. Po odłączeniu się komórek od podłoża, odwirować je, aby uzyskać osad, który będzie gotowy do enkapsulacji 3D. Odessać nadsącz, a następnie zawiesić komórki w 1,2% roztworze alginianu przy gęstości 800 000 komórek na ml.Następnie należy przygotować roztwór chlorku wapnia w objętości pięciokrotnie większej niż objętość roztworu alginianu hack. Roztwór należy powoli mieszać podczas przygotowywania alginianu hack. Roztwór alginianu hack należy naciągnąć pipetą do strzykawki o pojemności 12 ml z przymocowaną igłą o rozmiarze 22 G.Po przygotowaniu chlorku wapnia, należy trzymać końcówkę strzykawki około sześciu cali nad powierzchnią roztworu chlorku wapnia. Wysokość strzykawki jest kluczowa. Roztwór chlorku wapnia jest bardzo ważny.Jeśli nie uniesiesz go wystarczająco wysoko, kuleczki nie będą miały sferycznego kształtu. Następnie dodaj mieszaninę alginianu. Dodawaj go kroplami. Zazwyczaj w wyniku tego procesu powstają kuleczki o średnicy 2 mm, zawierające około 10⁴ komórek na kuleczkę.Aby zwiększyć integralność kulek, należy mieszać je w roztworze przez 20 do 25 minut. Po zakończeniu mieszania należy odstawić kulki do osadzenia, a następnie odlać roztwór chlorku wapnia. Następnie kulki należy przemyć dwa do trzech razy roztworem chlorku sodu w objętości około dwa do trzy razy większej niż objętość kulek.Zamiast stosować filtry, należy utrzymać kulki w stanie wilgotnym, pozwalając im osiąść pomiędzy kolejnymi zmianami roztworu piorącego. Po przemyciu chlorkiem wapnia przeprowadzić jedno przemycie i zastosować pożywkę do różnicowania chondrocytów. Następnie, używając szpatułki, przenieść kulki do naczyń hodowlanych i inkubować je przez 48 h w pożywce do wzrostu chondrocytów przed przeniesieniem ich do pożywki chondrocytowej.Pożywka różnicująca z płynem stawowym; płyn stawowy musi zostać przygotowany bezpośrednio po pobraniu. Przenieś świeży płyn stawowy do probówek o pojemności 15 ml i natychmiast odwiruj je z prędkością 3000 RPM przez 15 minut. Aby usunąć resztki komórkowe, pobierz nadianadkład, który stanowi oczyszczony płyn stawowy, i podziel go na alikwoty do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu ustalenia optymalnego stężenia płynu stawowego.Należy zastosować różne pożywki hodowlane składające się z płynu stawowego i pożywki do różnicowania chondrocytów w zmiennych stosunkach objętościowych, przy zachowaniu stałego stężenia kwasu askorbinowego oraz chlorku wapnia w kulturze. Płytki należy umieścić na platformie kołyszącej w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pożywki należy wymieniać co dwa do trzech dni, uprzednio usuwając zużyte pożywki.Rozcieńczyć go roztworem chlorku wapnia, aby zmniejszyć lepkość i jednocześnie wzmocnić integralność kuleczek. Następnie powoli odpipetować je z płytek. Kuleczki można hodować do czterech tygodni przed zbiorem, w zależności od ich proliferacji, produkcji macierzy oraz celów eksperymentu.Podczas odzyskiwania fragmentów tkanki z kulek alginianowych do analizy ekspresji genów lub analizy histologicznej, w przypadku analizy ekspresji genów należy trzykrotnie przemyć kulki alginianowe w roztworze chlorku wapnia, nie używając filtra. Izoluj chondrocyty poprzez zanurzenie ich w cytrynianie sodu w objętości od czterech do pięciu razy większej niż objętość kulek. Mieszaj zawiesinę przez 20 do 30 minut, a następnie odwiruj komórki w probówkach o pojemności 15 ml.Odlej nadsącz i resuspenduj pellet komórkowy w buforze do lizy komórek z konwencjonalnego zestawu, a następnie zastosuj zestandaryzowany protokół oczyszczania RNA, aby przygotować przemyte kuleczki do fiksacji. Po przemyciach chlorkiem wapnia zastosuj inkubację przez noc w medium do różnicowania chondrogennego Wash Inc.Utrwal kulki w 2 mL 70% etanolu przez ponad 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadź analizę histologiczną w celu barwienia DAPI. Inkubuj kulki alginianowe w roztworze DAPI przez godzinę przy delikatnym kołysaniu. Następnie przemyj kulki trzykrotnie roztworem chlorku wapnia przed obrazowaniem kulek alginianowych pod mikroskopem fluorescencyjnym.Kuleczki można również poddać sekcjonowaniu w celu przeprowadzenia barwienia błękitem Toluidyny oraz hematoksyliną i eozyną; histologiczne sekcje kuleczek alginianowych barwionych tymi metodami, nałożone na obrazy z mikroskopii w świetle przechodzącym, wykazały jednorodny rozkład komórek wewnątrz kuleczek hodowanych we wszystkich warunkach – od pożywek pozbawionych płynu stawowego po pożywki oparte całkowicie na płynie stawowym. Po zakończeniu 21-dniowego okresu hodowli zmierzono ekspresję genów w ludzkich chondrocytach stawowych hodowanych w płynie stawowym, pobranym od sześciu pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. Chondrocyty w dniu zerowym wykazywały minimalne poziomy ekspresji genów macierzy chrzęstnej; hodowla chondrocytów w 3D w pożywce do różnicowania chondrocytów lub w pożywce uzupełnionej płynem stawowym znacząco zwiększyła ekspresję genów chrzęstnych kolagenu typu II, ACAN oraz MMP 13, co wskazuje na redyferencjację chondrocytów.Do 21. dnia zwiększenie odsetka płynu stawowego w pożywce doprowadziło do uzyskania porównywalnych poziomów markerów macierzy chrzęstnej. Chondrocyty hodowane w 100% płynie stawowym wykazywały ekspresję mRNA kolagenu typu II oraz ANDCAN, a nawet spadek ekspresji mRNA MMP 13, enzymu degradującego chrząstkę, w porównaniu do komórek hodowanych w samej pożywce. Co ciekawe, poziom ekspresji kaspazy 3, wskaźnika śmierci komórkowej, stopniowo spadał wraz ze wzrostem proporcji płynu stawowego, co sugeruje, że hodowla w płynie stawowym doprowadziła do obniżenia poziomu apoptozy.Zatem hodowla ludzkich chondrocytów stawowych z wysokim stężeniem płynu stawowego w układzie 3D jest technologią wykonalną. Po opanowaniu technika enkapsulacji może zająć mniej niż godzinę. Należy upewnić się, że kuleczki są dokładnie przemywane pomiędzy zmianami pożywek.Należy również uważać, aby nie uszkodzić kulek podczas korzystania z pipety.

a-3d-system-for-culturing-human-articular-chondrocytes-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System 3D do hodowania ludzkich chrzęstkowców stawowych w płynie maziowym

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Metody opisane w tym artykule pokazują, jak przekształcić komercyjną drukarkę atramentową w biodrukarkę z jednoczesną polimeryzacją UV. Drukarka jest w stanie konstruować strukturę tkankową 3D z komórek i biomateriałów. Badanie, które wykazało, że tutaj skonstruowano chrząstkę nową 3D.

Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Udostępniamy szczegółowe metody generowania czterech typów tkanek z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, które są używane do rekapitulacji chrząstki, kości, poduszeczki tłuszczowej i błony maziowej w ludzkim stawie kolanowym. Te cztery tkanki są zintegrowane z dostosowanym bioreaktorem i połączone za pomocą mikrofluidyki, tworząc w ten sposób staw kolanowy na chipie.

Stworzenie stawu kolanowego na chipie do modelowania chorób stawów i testowania leków

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Poznaj system 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie maziowym, który naśladuje naturalne warunki fizjologiczne. Ta metoda umożliwia długoterminową analizę zachowań komórek i badania regeneracji chrząstki.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Przeglądaj więcej filmów