System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest hodowla ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym w kulturach długoterminowych. Osiąga się to poprzez wstępne zamknięcie chondrocytów w kuleczkach alginianowych. Następnie chondrocyty są hodowane w płynie stawowym, co pozwala im na proliferację w środowisku 3D naśladującym ich naturalne warunki wzrostu.

Pożywkę należy wymieniać okresowo, aby zapewnić komórkom odpowiedni dostęp do składników odżywczych. Ostatnim etapem procedury jest odzyskanie chondrocytów z kulek alginianowych w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów oraz analizy histologicznej. Analizy te potwierdzają, że chondrocyty hodowane w kuleczkach alginianowych są żywotne, proliferują i wykazują znaczną ekspresję macierzy chrzęstnej.

Główną zaletą zastosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że analizujemy komórki chrząstki w układzie trójwymiarowym zamiast dwuwymiarowego. Ponadto jako medium stosujemy płyn stawowy zamiast pożywek sztucznych. Zatem połączenie konstrukcji trójwymiarowej i wykorzystania płynu stawowego pozwala nam analizować je w środowisku bardziej naturalnym, w przeciwieństwie do układu dwuwymiarowego na płytce i zastosowania sztucznych pożywek.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii chrząstki i inżynierii tkankowej. Na przykład: jak komórki chrząstki lub chondrocyty zachowują się w płynie stawowym w dłuższym terminie? A także: czy powinniśmy przyzwyczaić komórki chrząstki do płynu stawowego przed przeszczepieniem ich do organizmów biorców?

Przygotuj fiolkę o pojemności jednego mililitra zawierającą ludzkie chondrocyty stawowe lub ich zamrożone próbki, rozmrażając je w ciepłej wodzie przez minutę. Następnie przelej zamrożone komórki do fiolki zawierającej dwa mililitry ogrzanej pożywki do wzrostu chondrocytów. Aby usunąć medium do mrożenia zawierające DMSO, odwiruj komórki przy 3000 RPM przez trzy do pięciu minut, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w siedmiu mililitrach pożywki do wzrostu chondrocytów.

Następnie przenieś komórki na płytkę 10 cm i hoduj je do momentu uzyskania konfluencji. Komórki typu hacks należy wykorzystywać przy numerze pasażu nieprzekraczającym trzech lub czterech. Po osiągnięciu konfluencji przemyj komórki hacks roztworem chlorku sodu zamiast PBS.

Następnie zebrać komórki za pomocą trypsyny, używając 0,5 ml standardowego roztworu trypsyny z EDTA. Po odłączeniu się komórek od podłoża, odwirować je, aby uzyskać osad, który będzie gotowy do enkapsulacji 3D. Odessać nadsącz, a następnie zawiesić komórki w 1,2% roztworze alginianu przy gęstości 800 000 komórek na ml.

Następnie należy przygotować roztwór chlorku wapnia w objętości pięciokrotnie większej niż objętość roztworu alginianu hack. Roztwór należy powoli mieszać podczas przygotowywania alginianu hack. Roztwór alginianu hack należy naciągnąć pipetą do strzykawki o pojemności 12 ml z przymocowaną igłą o rozmiarze 22 G.

Po przygotowaniu chlorku wapnia, należy trzymać końcówkę strzykawki około sześciu cali nad powierzchnią roztworu chlorku wapnia. Wysokość strzykawki jest kluczowa. Roztwór chlorku wapnia jest bardzo ważny.

Jeśli nie uniesiesz go wystarczająco wysoko, kuleczki nie będą miały sferycznego kształtu. Następnie dodaj mieszaninę alginianu. Dodawaj go kroplami. Zazwyczaj w wyniku tego procesu powstają kuleczki o średnicy 2 mm, zawierające około 10⁴ komórek na kuleczkę.

Aby zwiększyć integralność kulek, należy mieszać je w roztworze przez 20 do 25 minut. Po zakończeniu mieszania należy odstawić kulki do osadzenia, a następnie odlać roztwór chlorku wapnia. Następnie kulki należy przemyć dwa do trzech razy roztworem chlorku sodu w objętości około dwa do trzy razy większej niż objętość kulek.

Zamiast stosować filtry, należy utrzymać kulki w stanie wilgotnym, pozwalając im osiąść pomiędzy kolejnymi zmianami roztworu piorącego. Po przemyciu chlorkiem wapnia przeprowadzić jedno przemycie i zastosować pożywkę do różnicowania chondrocytów. Następnie, używając szpatułki, przenieść kulki do naczyń hodowlanych i inkubować je przez 48 h w pożywce do wzrostu chondrocytów przed przeniesieniem ich do pożywki chondrocytowej.

Pożywka różnicująca z płynem stawowym; płyn stawowy musi zostać przygotowany bezpośrednio po pobraniu. Przenieś świeży płyn stawowy do probówek o pojemności 15 ml i natychmiast odwiruj je z prędkością 3000 RPM przez 15 minut. Aby usunąć resztki komórkowe, pobierz nadianadkład, który stanowi oczyszczony płyn stawowy, i podziel go na alikwoty do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu ustalenia optymalnego stężenia płynu stawowego.

Należy zastosować różne pożywki hodowlane składające się z płynu stawowego i pożywki do różnicowania chondrocytów w zmiennych stosunkach objętościowych, przy zachowaniu stałego stężenia kwasu askorbinowego oraz chlorku wapnia w kulturze. Płytki należy umieścić na platformie kołyszącej w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pożywki należy wymieniać co dwa do trzech dni, uprzednio usuwając zużyte pożywki.

Rozcieńczyć go roztworem chlorku wapnia, aby zmniejszyć lepkość i jednocześnie wzmocnić integralność kuleczek. Następnie powoli odpipetować je z płytek. Kuleczki można hodować do czterech tygodni przed zbiorem, w zależności od ich proliferacji, produkcji macierzy oraz celów eksperymentu.

Podczas odzyskiwania fragmentów tkanki z kulek alginianowych do analizy ekspresji genów lub analizy histologicznej, w przypadku analizy ekspresji genów należy trzykrotnie przemyć kulki alginianowe w roztworze chlorku wapnia, nie używając filtra. Izoluj chondrocyty poprzez zanurzenie ich w cytrynianie sodu w objętości od czterech do pięciu razy większej niż objętość kulek. Mieszaj zawiesinę przez 20 do 30 minut, a następnie odwiruj komórki w probówkach o pojemności 15 ml.

Odlej nadsącz i resuspenduj pellet komórkowy w buforze do lizy komórek z konwencjonalnego zestawu, a następnie zastosuj zestandaryzowany protokół oczyszczania RNA, aby przygotować przemyte kuleczki do fiksacji. Po przemyciach chlorkiem wapnia zastosuj inkubację przez noc w medium do różnicowania chondrogennego Wash Inc.

Utrwal kulki w 2 mL 70% etanolu przez ponad 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadź analizę histologiczną w celu barwienia DAPI. Inkubuj kulki alginianowe w roztworze DAPI przez godzinę przy delikatnym kołysaniu. Następnie przemyj kulki trzykrotnie roztworem chlorku wapnia przed obrazowaniem kulek alginianowych pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Kuleczki można również poddać sekcjonowaniu w celu przeprowadzenia barwienia błękitem Toluidyny oraz hematoksyliną i eozyną; histologiczne sekcje kuleczek alginianowych barwionych tymi metodami, nałożone na obrazy z mikroskopii w świetle przechodzącym, wykazały jednorodny rozkład komórek wewnątrz kuleczek hodowanych we wszystkich warunkach – od pożywek pozbawionych płynu stawowego po pożywki oparte całkowicie na płynie stawowym. Po zakończeniu 21-dniowego okresu hodowli zmierzono ekspresję genów w ludzkich chondrocytach stawowych hodowanych w płynie stawowym, pobranym od sześciu pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. Chondrocyty w dniu zerowym wykazywały minimalne poziomy ekspresji genów macierzy chrzęstnej; hodowla chondrocytów w 3D w pożywce do różnicowania chondrocytów lub w pożywce uzupełnionej płynem stawowym znacząco zwiększyła ekspresję genów chrzęstnych kolagenu typu II, ACAN oraz MMP 13, co wskazuje na redyferencjację chondrocytów.

Do 21. dnia zwiększenie odsetka płynu stawowego w pożywce doprowadziło do uzyskania porównywalnych poziomów markerów macierzy chrzęstnej. Chondrocyty hodowane w 100% płynie stawowym wykazywały ekspresję mRNA kolagenu typu II oraz ANDCAN, a nawet spadek ekspresji mRNA MMP 13, enzymu degradującego chrząstkę, w porównaniu do komórek hodowanych w samej pożywce. Co ciekawe, poziom ekspresji kaspazy 3, wskaźnika śmierci komórkowej, stopniowo spadał wraz ze wzrostem proporcji płynu stawowego, co sugeruje, że hodowla w płynie stawowym doprowadziła do obniżenia poziomu apoptozy.

Zatem hodowla ludzkich chondrocytów stawowych z wysokim stężeniem płynu stawowego w układzie 3D jest technologią wykonalną. Po opanowaniu technika enkapsulacji może zająć mniej niż godzinę. Należy upewnić się, że kuleczki są dokładnie przemywane pomiędzy zmianami pożywek.

Należy również uważać, aby nie uszkodzić kulek podczas korzystania z pipety.