Name: Zastosowanie MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizynowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę MassSQUIRM do ilościowego pomiaru aktywności demetylazy lizynowej z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI i izotopowego znakowania. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie zmian w poziomach metylacji lizyny w badaniach epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy UAMS Proteomics Facility za wsparcie w zakresie spektrometrii masowej. Finansowanie tego projektu zapewniły granty NIH: P20RR015569, P20RR016460 oraz R01DA025755.

Niniejszy protokół został zmodyfikowany na podstawie pracy Blair et al. 6.
1. Test demetylacji LSD1
<ol>
	<li>W końcowej objętości 20 μL połączyć 125 ng rekombinowanego LSD1 z 0,25 μg peptydu dimetylowanej histony H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) w buforze do demetylazy (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% glicerolu). Dodatkowo przeprowadzić kontrolę z samym peptydem bez enzymu. Kontrola ta jest przeznaczona do sekcji 3 i nie wymaga metylacji redukcyjnej.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Aby zebrać peptydy, dodać 8 μL kulek POROS R2 20 micron do każdej próbki i mieszać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kulki POROS przygotować poprzez zawieszenie 1 objętości kulek w 1 objętości metanolu, a następnie dodać 10 objętości 5% kwasu mrówkowego / 0,2% TFA.</li>
	<li>Uwarunkować dwie końcówki C18 ZipTips, aspirując 20 μL 0,1% TFA do końcówki i wypychając roztwór pipetorem. Powtórzyć tę czynność dwukrotnie z 0,1% TFA, czterokrotnie z 70% acetonitrylu / 0,1% TFA oraz ponownie czterokrotnie z 0,1% TFA.</li>
	<li>Nanieść dwie próbki (kontrolną oraz reakcję demetylacji) na uwarunkowane ZipTips C18, pipetując zawiesinę kulek za żywicę C18 w ZipTips i przepychając objętość pipetorem.</li>
	<li>Przemyć ZipTips dwukrotnie 20 μL 0,1% TFA.</li>
	<li>Eluować w 40 μL 70% acetonitrylu / 0,1% TFA.</li>
	<li>Całkowicie liofilizować każdy eluat za pomocą koncentratora SpeedVac.</li>
</ol>
2. Metylowanie redukcyjne
Ta część protokołu została zmodyfikowana na podstawie prac Blair et al. oraz Rayment et al. 6,7.
<ol>
	<li>Resuspender reakcję demethylazy w 100 μL 50 mM buforu fosforanowego, pH 7.4.</li>
	<li>Do reakcji demethylazy dodać 8 μL boranu dimetyloaminy w stężeniu 15 mg/mL. Boran dimetyloaminy rozpuszcza się w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7.4, aby otrzymać roztwór stokowy o stężeniu 15 mg/mL. Należy go przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Do reakcji demethylazy dodać 16 μL deuterowanego formaldehydu w stężeniu 250 mM. Deuterowany formaldehyd 250 mM przygotowuje się poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego w H20. Należy go przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4°C przez 2 godziny.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.2, 2.3 i 2.4.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.2.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4°C przez ok. 15 godzin.</li>
	<li>Do próbki z reakcją demethylazy dodać 12.5 μL 1M Tris, pH 7.4, aby zatrzymać reakcję redukcyjnego metylowania.</li>
</ol>
3. Spektrometria mas MALDI
<ol>
	<li>Dodaj kulki POROS R2 20 micron do reakcji demetylacji, a następnie zbierz je na ZipTips zgodnie z opisem w krokach 1.3-1.6.</li>
</ol>
Uwaga: Kontrolę należy zawiesić ponownie w 100 μL 50 mM buforu fosforanowego o pH 7.4 i traktować tak samo jak pozostałą próbkę, zaczynając od kroku 3.1.
<ol start="2">
	<li>Przenieś próbki kontrolne i próbki z reakcją demetylazy z ZipTips na płytkę do próbek MALDI, eluując je za pomocą 2 μL 33% nasyconego kwasu 2,5-dihydroksybenzoenowego. Aby przygotować 33% kwasu 2,5-dihydroksybenzoenowego, należy sporządzić nasycony roztwór kwasu 2,5-dihydroksybenzoenowego w 70% acetonitrylu / 0,1% TFA, a następnie rozcieńczyć go do stężenia 33% nasycenia w 70% acetonitrylu / 0,1% TFA. Pozostaw eluowane próbki do wyschnięcia i krystalizacji.</li>
	<li>Zarejestruj widma mas za pomocą spektrometru mas PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF lub innego dostępnego spektrometru mas MALDI o wysokiej rozdzielczości 8,9,10.</li>
	<li>Przeanalizuj widma i wyznacz powierzchnie pików przy użyciu oprogramowania PerkinElmerSciex TOFworks lub oprogramowania dostarczonego przez producenta spektrometru mas.</li>
	<li>Zweryfikuj produkty reakcji za pomocą MS2 przy użyciu dostępnego systemu spektrometrii mas z możliwością przeprowadzania spektrometrii mas tandemowej.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Aby skompensować nakładanie się izotopowe wynikające z użycia ciężkiego formaldehydu (Rysunek 1B), wyznacz stosunek pola powierzchni piku (A) izotopów 13C2 i 13C4 względem piku monoisotopowego dla próbki kontrolnej, która nie została poddana metylacji redukcyjnej (Rys. 2A). 
	Eq 1: A13C2/A12C = r1 
	Eq 2: A13C4/A12C = r2 
	Pozwoli to określić stosunek peptydów występujących w tych stanach izotopowych (r1 i r2) specyficzny dla danego eksperymentu i spektrometru mas.</li>
	<li>Wykorzystaj wartości r1 i r2 w poniższych wzorach do ilościowego oznaczenia względnej zawartości peptydu w każdym stanie modyfikacji w próbce reakcji demethylazy (Rys. 2B): 
	Eq 3: H3K4me2= A1 
	Eq 4: H3K4me = A2 - r1(A1) 
	Eq 5: H3K4 =A3 - r2(A1) - [r1(A2 - r1(A1))]</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Wykorzystując LSD1, wykazujemy skuteczność metody MassSQUIRM w ilościowym oznaczaniu demetylacji lizyny. Zgodnie z opisem w sekcji Tekst Protokołu, przeprowadziliśmy test demetylazy z użyciem 125 ng LSD1 oraz 0,25 μg peptydu dimetylowanej histony H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin). Próbki z reakcji kontrolnej i demetylazy poddano metylacji redukcyjnej oraz spektrometrii mas MALDI. Reakcja kontrolna, która nie została poddana metylacji redukcyjnej, wykazała typową obwiednię izotopową dla tego peptydu i dostarczyła pól powierzchni pików do równań 1 i 2 (Rysunek 2A). Widmo mas dla reakcji demetylazy dostarczyło pól powierzchni pików do równań 3-5 (Rysunek 2B). Wykorzystując pola powierzchni pików z reakcji kontrolnej i demetylazy, ustaliliśmy, że LSD1 zdemetyluje peptyd, dając następujące produkty reakcji: 33,7% dimetylowanej Lys4, 42,3% monometylowanej Lys4 oraz 24% niemetylowanej Lys4. Pełną analizę aktywności demetylazy LSD1, a także badania nad inhibitorami, przedstawiono w pracy Blair et al. 6. Należy zauważyć, że zmiana zmiennych, takich jak czas reakcji, stężenie enzymu i stężenie substratu, pozwoli na szczegółową analizę aktywności.
<img alt="Schemat procesu sekwencjonowania białek; analiza spektrometrii mas; fragmentacja peptydów i intensywność." src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd metody MassSQUIRM. (A) Przedstawiono peptyd N-końcowy histony H3 będący nie- (zielony), mono- (czerwony) lub di- (niebieski) metylowany w pozycji lizyny 4. Zróżnicowanie składu chemicznego każdego peptydu prowadzi do różnic w jonizacji, co komplikuje kwantyfikację. (B) Metylacja redukcyjna przekształca wszystkie reszty lizyny w stan di-metylowany, co sprawia, że wszystkie peptydy jonizują się w podobny sposób. Zastosowanie ciężkiego formaldehydu w reakcji metylacji redukcyjnej pozwala na zachowanie tożsamości pierwotnego metylowania. Otwarte kółka oznaczają metylację lekką, a zamknięte kółka metylację ciężką. Zmodyfikowano na podstawie Blair et al. 20116.
<img alt="Analiza spektrometrii mas; wykres m/z pokazujący znakowanie izotopowe peptydów; wynik chromatografii." src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. MassSQUIRM może być wykorzystywany do ilościowego oznaczania różnicowo zmetylowanych peptydów. (A) Di-zmetylowany syntetyczny peptyd histony H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) został poddany analizie za pomocą spektrometrii mas, a stosunki pików w odniesieniu do piku monoisotopowego zapisano jako r1 i r2 w równaniach 1 i 2. (B) Ten sam syntetyczny peptyd inkubowano z 125 ng LSD1 w buforze demethylazowym przez dwie godziny w 37°C. Następnie próbki poddano analizie MassSQUIRM. Mieszana populacja nakładających się pików reprezentuje trzy różne stany metylacji, jak pokazano na Rysunku 1B. Pola pod pikami monoisotopowymi zapisano jako A1, A2 i A3. Pola pików wykorzystano w równaniach 3-5. Puste kółka oznaczają lekką metylację, natomiast pełne kółka oznaczają ciężką metylację. Zmodyfikowano na podstawie Blair et al. 20116.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

MassSQUIRM to niedroga i ilościowa metoda kompleksowej analizy aktywności demetylaz lizyny uczestniczących w mono- i dimetylacji. MassSQUIRM umożliwia oznaczanie ilościowe nie tylko produktu reakcji, ale także produktów pośrednich. Analiza ta może służyć jako potężne narzędzie w badaniu mechanizmu działania LSD1 oraz innych demetylaz histonów. Będzie ona również przydatna w klasyfikacji wielu nowo odkrytych enzymów demetylaz lizyny, takich jak PHF8, i mogłaby zostać zastosowana do określonych enzymów metylotransferaz.

<table><tbody><tr><td>LSD1</td><td>BPS Biosciences</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>peptyd H3K4me2-biotyna</td><td>Przygotowano w laboratorium</td><td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td><td></td></tr><tr><td>kule POROS R2 20 μm</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-1129-06</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; ZipTip</td><td>EMD Millipore</td><td>ZTC18M</td><td></td></tr><tr><td>Kwas triflorooctowy (TFA)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td></td></tr><tr><td>Boran dimetyloaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>180238</td><td></td></tr><tr><td>izotopowo ciężki &lt;em&gt;d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;-formaldehyd</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-805-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka</td><td>06440</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Savant</td><td>DNA110</td><td></td></tr><tr><td>spektrometr mas MALDI-prOTOF oraz oprogramowanie TOFworks</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie metody masssquirm do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Niedawno odkryto, że regulatory epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w wielu różnych chorobach 1-3. W konsekwencji enzymy te stanowią główne cele badań nad małymi cząsteczkami i rozwoju leków 4. Wiele regulatorów epigenetycznych zostało odkrytych niedawno i wciąż podlega klasyfikacji. Wśród tych enzymów znajdują się demetylazy lizyny, które usuwają grupy metylowe z lizyn w histonach i innych białkach. Ze względu na nowatorski charakter tej klasy enzymów opracowano niewiele testów służących do badania ich aktywności. Stanowiło to przeszkodę zarówno w klasyfikacji, jak i w badaniach wysokoprzepustowych demetylaz histonowych. Obecnie istnieje bardzo niewiele testów demetylaz. Te, które są dostępne, mają zazwyczaj charakter jakościowy i nie potrafią jednocześnie rozróżnić różnych stanów metylowania lizyny (braku metylowania, mono-, di- oraz trimetylowania). Spektrometria mas jest powszechnie stosowana do określania aktywności demetylaz, ale obecne metody spektrometryczne nie rozstrzygają, czy różnie zmetylowane peptydy jonizują się w odmienny sposób. Różnicowa jonizacja zmetylowanych peptydów utrudnia porównywanie stanów metylowania i sprawia, że nie jest ono ilościowe (Rysunek 1A). Zatem dostępne testy nie są zoptymalizowane pod kątem kompleksowej analizy aktywności demetylaz.
Opisujemy tutaj metodę o nazwie MassSQUIRM (ilościowe oznaczanie spektrometrią mas z wykorzystaniem izotopowego redukcyjnego metylowania), która opiera się na redukcyjnym metylowaniu grup aminowych za pomocą deuterowanego formaldehydu w celu wymuszenia dimetylowania wszystkich lizyn, co sprawia, że stają się one w zasadzie tym samym gatunkiem chemicznym i w związku z tym jonizują w ten sam sposób (Rysunek 1B). Jedyną różnicą chemiczną po redukcyjnym metylowaniu jest obecność wodoru i deuteru, co nie wpływa na wydajność jonizacji w technice MALDI. Analiza MassSQUIRM jest specyficzna dla produktów reakcji demetylaz z lizynami nie-metylowanymi, monometylowanymi lub dimetylowanymi. Metoda ta ma zastosowanie również do metylotransferaz lizyny dających te same produkty reakcji. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy kombinację chemii redukcyjnego metylowania i spektrometrii mas MALDI do pomiaru aktywności LSD1, demetylazy lizyny zdolnej do usuwania grup dimetylowych i monometylowych, w syntetycznym substracie peptydowym 5. Analiza ta jest prosta i łatwo dostępna dla każdego laboratorium posiadającego dostęp do spektrometru mas MALDI wewnątrz jednostki lub poprzez zaplecze proteomiczne. Metoda ta posiada około 8-krotny zakres dynamiczny i jest łatwo skalowalna do formatu wielodołkowego 5.

Przedstawiamy metodę wykorzystującą spektrometrię mas MALDI oraz chemię redukcyjnego metylowania do ilościowego określania zmian w metylowaniu lizyny.

Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

W ostatnim czasie odkryto, że regulatory epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w przebiegu wielu różnych chorób 1-3. W konsekwencji enzymy te stanowią główny cel dla małych...

Protokół mass squirm ma na celu ilościowe określenie aktywności demetylazy lizyny z wykorzystaniem metylacji izotopowej i spektrometrii mas MALDI. W pierwszej kolejności przeprowadza się reakcje demetylacji katalizowane enzymatycznie na peptydach zawierających metylowaną lizynę. Następnie produkty reakcji demetylazy poddaje się chemicznej metylacji przy użyciu deuterowanego formaldehydu, aby uzyskać jednorodnie zmetylowane peptydy jonizujące się w identyczny sposób w MALDI. Kolejnym krokiem jest ilościowe oznaczenie każdego gatunku peptydów za pomocą spektrometrii mas MALDI i uwzględnienie nakładania się izotopów. Aby zidentyfikować względne ilości peptydów niezmetylowanych, monometylowanych, dimetylowanych i trimetylowanych, wyniki analizy mass squirm pozwalają określić względne ilości każdego produktu reakcji demetylazy na podstawie zmian masy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rutynowa spektrometria mas, jest to, że wynik masy uwzględnia różnice w jonizacji pomiędzy peptydami o różnym stopniu metylowania. Pomysł na to podejście pojawił się podczas opracowywania metody pomiaru poziomów acetylacji histonów przy użyciu izotopowo ciężkiego be

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności lizynowej demetylazy

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Tablice peptydowe syntetyzowane metodą SPOT mogą być używane do analizy specyficzności substratowej metylotransferaz lizynowych białek (PKMT) oraz do zdefiniowania spektrum substratów PKMT, aby zrozumieć ich biologiczną rolę. Protokół ten opisuje, jak syntetyzować macierze peptydowe, metylować je za pomocą PKMT i analizować wyniki.

Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru docelowego zaangażowania KDM1A w próbkach ludzkich lub zwierzęcych komórek, tkanek lub krwi leczonych inhibitorami KDM1A. Protokół wykorzystuje znakowanie chemoprobem wolnego enzymu KDM1A i bezpośrednią kwantyfikację docelowego zajęcia za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe i może być stosowany w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Poznaj metodę MassSQUIRM do ilościowego pomiaru aktywności demetylazy lizynowej z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI i izotopowego znakowania. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie zmian w poziomach metylacji lizyny w badaniach epigenetycznych.

Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Przeglądaj więcej filmów