Zastosowanie MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizynowej

Protokół masowego squirm ma na celu ilościowe określenie aktywności demetylazy lizyny za pomocą metylacji izotopowej i spektrometrii mas maldi, najpierw przeprowadzając reakcje demetylacji katalizowane enzymatycznie na peptydach zawierających metylowaną lizynę. Reszty następnie chemicznie metylują produkty peptydowe reakcji demetylazy z deuterowanym formaldehydem w celu wytworzenia jednolicie metylowanych peptydów, które jonizują w ten sam sposób przez maldi, przystępują do ilościowego oznaczania każdego rodzaju peptydu za pomocą spektrometrii wielu mas i uwzględniają nakładanie się izotopów. W celu zidentyfikowania względnych ilości un mono barwnika i trim metylowanych peptydów, wyniki masowego squirm określają względne ilości każdego produktu reakcji demetylazy na podstawie zmian masy.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak rutynowa spektrometria mas pleśni, jest to, że wynik masy uwzględnia różnice w jonizacji między różnie metylowanymi peptydami. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego podejścia, gdy opracowaliśmy metodę pomiaru poziomu acetylacji histonów przy użyciu izotopowo ciężkiego bezwodnika octowego. Wyzwaniem dla tej techniki jest wyodrębnienie danych o obszarze pików, które mogą być skomplikowane ze względu na nakładanie się otoczek izotopowych peptydów.

W reakcji demetylazy połączono 125 nanogramów rekombinowanej demetylazy specyficznej dla lizyny jednego enzymu z 0,25 mikrograma biotynylowanego peptydu dimetylohiszonu H w końcowej objętości 20 mikrolitrów buforu demetylazy. Przygotuj również próbkę kontrolną zawierającą peptyd o wielkości 0,25 mikrograma bez LSD, enzym jeden inkubuj reakcję i probówki kontrolne przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, aby przygotować R, dwie porowate kulki o grubości 20 mikronów, wymieszaj równe objętości kulek i metanolu.

Następnie dodać 10 objętości kwasu mrówkowego TFA, dodać osiem mikrolitrów porowatych kulek do każdej próbki i mieszać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie kondycjonuj dwie końcówki zamka błyskawicznego C 18. Dwukrotne pipetowanie 20 mikrolitrów 0,1% TFA, cztery razy 70% acetonitrylu 0,1% TFA i cztery razy ponownie 0,1% TFA.

Następnie załaduj dwie próbki na kondycjonowane końcówki zamka błyskawicznego. Za pomocą pipetera przepchnąć objętość przez żywicę C 18. Powtarzaj tę czynność, aż całkowita objętość obu próbek zostanie przepchnięta przez końcówki zamka błyskawicznego.

Następnie dwukrotnie umyj końcówki zamka błyskawicznego 20 mikrolitrami 0,1% próbek elucji TFA w buforze iluzji o pojemności 40 mikrolitrów, przystąp do całkowitego wyschnięcia za pomocą koncentratora próżniowego. Najpierw ponownie zawiesić próbkę w 100 mikrolitrach 50-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,4. Następnie dodaj osiem mikrolitrów dimetyloaminy i 16 mikrolitrów obniżonego formaldehydu.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Powtórzyć metylację redukcyjną, dodając nudną dimetyloaminę i deuterowany formaldehyd i inkubować przez dwie godziny. Za trzecim razem dodaj nudną dimetyloaminę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 godzin.

Ugasić reakcję za pomocą 12,5 mikrolitra jednego trzonowca o pH 7,4, przystąpić do całkowitego wysuszenia za pomocą koncentratora próżniowego o dużej prędkości. Najpierw Resus, zawiesić próbki reakcji kontrolnej i demetylazy w 100 mikrolitrach 50-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,4.

Teraz dodaj osiem mikrolitrów porowatych kulek do próbek reakcji kontroli i demetylazy i zbierz na końcówkach zamka błyskawicznego, jak pokazano wcześniej. Umieścić w dwóch mikrolitrach na płytce do pobierania próbek MALDI i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej do krystalizacji. Kontynuuj analizę próbek za pomocą spektrometrii mas.

Otwórz pliki spektro w oprogramowaniu do pracy i wyeksportuj je do oprogramowania M over Z. Dalsza weryfikacja produktów reakcji za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Najpierw należy określić stosunek powierzchni pików izotopów węgla 13 C dwa i węgla 13 C cztery w stosunku do piku monoizotopowego dla próbki kontrolnej.

Użyj tych obliczonych stosunków, aby określić ilościowo względną ilość peptydu występującego w każdej modyfikacji. Stan próbki reakcji demetylazy. Enzym LSD one może być skutecznie stosowany w masowej kwantyfikacji demetylacji lizyny.

Ponieważ reakcja kontrolna nie ulega metylacji redukcyjnej, wskazuje to typową otoczkę izotopową dla tego peptydu Wynikowe obszary pików określają stosunki tła peptydu istniejącego w węglu 13 C dwa i węglu 13 C cztery. Stany izotopowe, obszary pików z widma masowego dla reakcji kontrolnej umożliwiają ilościowe określenie względnej ilości peptydu istniejącego w każdym stanie modyfikacji. W reakcji demetylazy obszary pików z tych reakcji kontrolnych i demetylazy oznaczają 33,7% dimetylolizyny 4 42 0,3% monometylolizyny cztery i 24% niemetylowanej lizyny czterech.

To podejście do masowego squamu oferuje kluczowe informacje w dziedzinie epigenetyki histonów, takie jak to, w jaki sposób demetylacja reszt lizyny histonów przyczynia się do różnych chorób. Chociaż ten test metylacji został zastosowany do badania demetylaz, może być również stosowany do badania metylotransferaz.