Mikroskopia przyżyciowa śledziony: analiza ilościowa ruchliwości pasożyta i przepływu krwi

W tej procedurze pokazujemy podejście ilościowej mikroskopii przyżyciowej w celu oceny dynamiki przejścia pasożyta przez śledzionę. W modelu malarii u gryzoni myszy zakażone transgenicznymi pasożytami GFP są przygotowywane do mikroskopii przyżyciowej kaniulacji żył śledziony, która umożliwi wstrzyknięcie barwników przyżyciowych. Podczas eksperymentu komórki fluorescencyjne poruszają się obrazem w różnych obszarach śledziony.

Przedstawiamy mitologię, aby opisać ruchliwość pasożyta w trójwymiarowym powolnym komorze czerwonej miazgi i obliczyć przepływ krwi w naczyniach. Parametry te wykorzystano do porównania dynamiki śledziony dwóch szczepów PLE. Witam wszystkich.

Nazywam się Nando El Portillo i jednym z głównych pytań badawczych w moim laboratorium jest próba zrozumienia roli śledziony w malarii. Splenomegalia S jest jednym z charakterystycznych aspektów tej choroby, ale ze względu na kwestie techniczne i etyczne próba zajęcia się badaniami tego narządu jest bardzo trudna. W tym celu udostępniliśmy technologie, które pozwalają nam zobaczyć dynamiczne przechodzenie tego pasożyta i określić ilościowo to zjawisko.

To jest to, co Lorena i MI wyjaśnią w tych protokołach. Badania te są częściowo prowadzone we współpracy z grupami dr Ler z Uniwersytetu w Hamburgu w Niemczech i dr Marii Kbo w klinice szpitalnej i otrzymały ogólne finansowanie znalezionego fion Cellex i ministerialnego CIA w Español infekcja jest inicjowana od dawcy M zakażonego śmiertelnymi lub nieśmiertelnymi pasożytami GFP na poziomie 10% pasożytów. Aby sprawdzić pasożyta, weź małą kroplę krwi z żyły ogona myszy i rozszerz ją pod mikroskopem.

Przesuń barwienie metryczne chole za pomocą GIMs. Roztwór pozwoli na wizualizację zakażonych czerwonych krwinek po wysuszeniu, utrwalenie rozmazu krwi metanolem przez dwie minuty, nałożenie roztworu GIM i inkubację przez 20 minut. Umyj szkiełko bieżącą wodą z kranu i na sucho policz procentową zawartość pbc w stosunku do całkowitej liczby erytrocytów za pomocą mikroskopu świetlnego ze stukrotnym olejem. Cel.

Zainfekuj myszy śmiertelnymi lub nieśmiertelnymi pasożytami uzyskanymi z krwi ogona myszy dawców rozcieńczonej w PBS. Dostosuj dawkę, aby wstrzyknąć pół miliona pasożytów na mysz, aby osiągnąć 1% pasożyta obwodowego w trzecim dniu po zakażeniu i wstrzyknąć dootrzewnowy. Alternatywnie, w kontroli można stosować RBC oznaczone przez FITC.

Zwierzęta pobierają jeden mililitr krwi tętniczej od myszy i myją osad przez odwirowanie w PBS zawierającym EDTA, ponownie rozciągają się w roztworze FITC i inkubują przez dwie godziny w ciemności z delikatnym mieszaniem. Po tym czasie usunąć sklarowany osad przez odwirowanie i dokładnie przemyć. Wstrzyknąć myszowi kontrolnemu, aby uzyskać średnio 1% w krążeniu obwodowym i przejść do eksperymentów in vivo.

Cześć, jestem mija. Aby zobrazować śledzionę in vivo, musimy wykonać niewielką synergię zwierzęcia, aby odsłonić śledzionę za pomocą oczywiście tej techniki. Nauczyłem się tego od Stephanie GR w laboratorium pracownika Heislera, której chciałbym podziękować, a teraz pokażę Ci, jak postępować.

Obrazowanie zakażonej miozy Wykonywane w trzecim dniu po zakażeniu, gdy parat wynosi 1% w obu szczepach. Utrzymuj mysz w znieczuleniu i regulowanej temperaturze przez cały czas trwania zabiegu. Chroń oczy przed nawodnieniem i sprawdź, czy mysz jest całkowicie znieczulona, pingując opuszkę stopy przed kontynuowaniem, aby ułatwić dożylne podawanie substancji.

W trakcie eksperymentu należy kanniulować żyłę ogona myszy, aby zbudować kaniulę. Włóż małą igłę do jednego końca tubki, a jej aplikator do drugiego. Załaduj kaniulę fizjologiczną solą fizjologiczną usuwającą pęcherzyki i sprawdź, czy roztwór prawidłowo przepływa przez kaniulę.

Żyła boczna ogona zostanie kaniulowana do czysta. Popraw jego widoczność, wykonując miękkie zwężenie u podstawy ogona. Wprowadź końcówkę kaniuli do wnętrza żyły.

Pojawienie się krwi będzie wskazywać, że igła jest dobrze ustawiona. Jeśli tak nie jest, powtórz kaniulację przed żyłą, a następnie przymocuj kaniulę do ogona za pomocą kleju i taśmy. Odsłoń dolną część śledziony przez małe nacięcie w skórze i mięśniach po lewej stronie grzbietowej zwierzęcia.

Umieść śledzionę w miejscu, w którym obserwuje się mniejszy ruch oddechu i nałóż PBS na odsłoniętą powierzchnię, aby była czysta od włosów myszy i nawilżona. Uszczelnij śledzionę osłoną snu, aby umożliwić wizualizację. Cześć, mam na imię Lorena.

Przedstawiony protokół pozwoli nam zobrazować przemieszczanie się pasożytów PULI przez śledzionę. Było to możliwe dzięki transgenicznym pasożytom GFP. Uprzejmie prosimy o darowiznę od Jamesa Burnesa z Uniwersytetu Drexel.

Obrazowanie ruchu fluorescencyjnych pasożytów pozwoli nam dowiedzieć się, czy istnieją różnice w zachowaniu między szczepami śmiertelnymi i nieśmiertelnymi. Eksperymenty mikroskopowe Vidala przeprowadzono w mikroskopie wielofotonowym Leica, wyposażonym w system inkubacji z kontrolą temperatury i obiektywem 63 x glicerol. Umieść zwierzę na stoliku mikroskopu z osłoną, śledzioną senną skierowaną w dół do obiektywu. Początkowo.

Wizualizacja śledziony w mniejszych powiększeniach zapewni ogólny obraz struktury mikrokrążenia narządu. Skoncentruj śledzionę za pomocą autofluorescencyjnej tkanki, obserwuje się, że pasożyty GFP przechodzą przez różne obszary śledziony. Witam, nazywam się Maria Albo z Centrów Naukowo-Technologicznych Uniwersytetu w Barcelonie i będziemy wykonywać obrazowanie przyżyciowe śledziony.

W celu zbadania przepływu krwi i ruchliwości zakażonych czerwonych krwinek użyjemy mikroskopu konfokalnego wyposażonego w skan rezonansowy, który umożliwia obrazowanie z dużą prędkością, co jest bardzo przydatne, aby uniknąć ruchu narządu. Jest to mikroskop spektralny, który pozwala na wybór zakresu widzenia. Aby bardzo szybko zobrazować, wykonamy jednoczesną akwizycję dwóch fluorescein, znakowanie i odbicie.

Wybierz różne strefy do obrazowania za pomocą RBC, odbicia, kontrastu i barwników Vidal, aby udowodnić mikrokrążenie śledziony. Wyjaśnimy teraz, jak mierzyć ruchliwość pasożyta w przepływie krwi w naczyniach za pomocą mikroskopii Vidal i oprogramowania do obrazowania J, aby śledzić ruch pasożyta w trójwymiarowej siatce czerwonej miazgi. Rejestruj obrazy na pięciu głębokościach Z w trybie szybkiego skanowania.

Konwertuj stosy obrazów na kolorowe filmy z kodem Z, aby ułatwić śledzenie pojedynczych komórek fluorescencyjnych. Szczegółowe informacje są podane w tekście, śledź różne cząstki w czasie na głębokości na każdym filmie za pomocą współrzędnych X, Y, Z i T, parametry mobilności, takie jak kierunkowość, średnia prędkość i czas przebywania, można obliczyć i przedstawić jako mapy rozmieszczenia, aby umożliwić analizę porównawczą między populacjami szczepów. Przepływ naczyniowy w śledzionie można zobrazować przez ogólnoustrojowe wstrzyknięcie kilku cząsteczek fluorescencyjnych opisanych w tabeli pomocniczej, takich jak dekstryna.

Korzystając z endogennego kontrastu odbicia erytrocytów, skanuj przepływ krwi w linii środkowej, ustawiając naczynia poziomo w kierunku skanowania laserowego i używając ulepszonej średniej liniowej. Na tych obrazach smugi powstające w wyniku poruszających się komórek zostaną wykorzystane do obliczenia przepływu krwi, wykonania zdjęć naczyń o różnych średnicach i w cyklu serca w celu skompensacji wahań. Śledziona od dawna jest uważana za czarną skrzynkę w badaniach nad malarią, a tutaj opracowaliśmy ilościowe podejście do mikroskopii przyżyciowej, aby uzyskać wgląd w dynamikę infekcji pasożytniczej i przepływ krwi w tym narządzie, co pozwoliło nam odpowiedzieć na ważne pytania biologiczne, takie jak przyleganie in vivo zakażonych czerwonych krwinek do śledziony.

Dziękuję i.