Name: Mikroskopia przyżyciowa śledziony: analiza ilościowa ruchliwości pasożyta i przepływu krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii przyżyciowej do ilościowej analizy ruchliwości pasożytów malarii i przepływu krwi w śledzionie myszy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy szczególnie wdzięczni S. Graewe oraz V. Heussler za wstępne przeszkolenie i ciągły wkład w zakres mikroskopii intravitalnej pasożytów malarii, J. Burns za przekazanie transgenicznych pasożytów GFP, A. Bosch (Confocal Unit, CCiT-UB, IDIBAPS) za pomoc w analizie i kwantyfikacji obrazów oraz P. Astola za wsparcie techniczne. Dziękujemy R. Tous i I. Caralt za produkcję wideo. MF jest stypendystą studiów doktoranckich Generalitat de Catalunya. HAP jest profesorem badawczym ICREA. Prace w laboratorium HAP są finansowane przez Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy grantowej N° 242095, przez Prywatną Fundację CELLEX (Katalonia, Hiszpania) oraz przez Hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
<li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li>
<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wdrożenie mikroskopii intravitalnej śledziony w tym gryzoniowym modelu malarii otworzyło możliwość badania dynamicznego przechodzenia pasożytów przez ten narząd, który do tej pory, ze względów technicznych, był uważany za „czarną skrzynkę”. W niniejszej pracy dołożono dużych starań, aby dostosować ilościową metodę umożliwiającą analizę porównawczą różnych linii pasożytów na poziomie pojedynczych komórek oraz populacji. W przeciwieństwie do innych tkanek i komórek obrazowanych wcześniej w przebiegu malarii 3,5,...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS-SP5 Serial no. 5100000419</td><td> </td></tr><tr><td>Ketamina (Ketolar 50 mg/ml)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>631028</td><td> </td></tr><tr><td>Midazolam 15 mg/3 ml</td><td>Normon</td><td>838193</td><td> </td></tr><tr><td>Dekstran 70 000 MW, sprzężony z Texas Red</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td> </td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny, izomer I (FITC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td> </td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td> </td></tr><tr><td>Barwnik Giemsy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GS1</td><td>Roztwór roboczy w stężeniu 10% w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Loctite</td><td>9975-0880</td><td> </td></tr></tbody></table>

mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Wprowadzenie mikroskopii wewnątrzorganicznej w eksperymentalnych gryzoniach modelach malarii pozwoliło na dokonanie znaczących postępów w wiedzy na temat interakcji między pasożytem a gospodarzem 1,2. W ten sposób obrazowanie in vivo pasożytów malarii podczas stadiów preerytrocytarnych ujawniło aktywne wnikanie pasożytów do węzłów chłonnych skóry 3, pełny rozwój pasożyta w skórze 4 oraz tworzenie merosomu pochodzącego z hepatocytów, aby zapewnić migrację i uwalnianie merozoitów do krwiobiegu 5. Co więcej, rozwój pojedynczych pasożytów w erytrocytach został niedawno udokumentowany przy użyciu obrazowania 4D, co podważyło nasze obecne spojrzenie na eksport białek w malarii 6. Zatem obrazowanie wewnątrzorganiczne radykalnie zmieniło nasz pogląd na kluczowe zdarzenia w rozwoju Plasmodium. Niestety, ze względu na ograniczenia techniczne, brakuje badań nad dynamicznym przechodzeniem pasożytów malarii przez śledzionę, główny organ limfatyczny doskonale przystosowany do usuwania zainfekowanych czerwonych krwinek.
Wykorzystując mysi model malarii Plasmodium yoelii u myszy Balb/c, wdrożyliśmy obrazowanie śródoperacyjne śledziony i wykazaliśmy zróżnicowane przebudowy tego narządu oraz przyleganie zainfekowanych erytrocytów (pRBCs) do komórek barierowych pochodzenia fibroblastycznego w czerwonej miazdze podczas infekcji nieletalną linią pasożyta P.yoelii 17X w przeciwieństwie do infekcji letalną linią pasożyta P.yoelii 17XL 7. Aby dojść do tych wniosków, opracowano specyficzną metodologię z wykorzystaniem bezpłatnego oprogramowania ImageJ, umożliwiającą charakterystykę szybkiego ruchu trójwymiarowego pojedynczych pRBCs. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu pozwalają na określenie prędkości, kierunkowości oraz czasu rezydencji pasożytów w śledzionie, co stanowi parametry określające przyleganie in vivo. Ponadto opisujemy metodologię kwantyfikacji przepływu krwi za pomocą mikroskopii śródoperacyjnej oraz zastosowanie różnych środków barwiących w celu uzyskania wglądu w złożoną strukturę mikrokrążenia śledziony.
Oświadczenie etyczne
Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w zapleczach dla zwierząt Uniwersytetu w Barcelonie zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Barcelonie CEEA-UB (protokół nr DMAH: 5429). Samice myszy Balb/c w wieku 6-8 tygodni zostały pozyskane z Charles River Laboratories.

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Wprowadzenie mikroskopii intravitalnej w eksperymentalnych modelach malarii u gryzoni pozwoliło na dokonanie istotnych postępów w wiedzy na temat oddziaływań między pasożytem a gospodarzem 1,2. ...

W niniejszej procedurze przedstawiamy ilościową metodę mikroskopii przyżyciowej służącą do oceny dynamiki przechodzenia pasożytów przez śledzionę. W modelu malarii u gryzoni myszy zainfekowane transgenicznymi pasożytami GFP są przygotowywane do mikroskopii przyżyciowej śledziony; kaniulacja żyły śledzionowej umożliwi wstrzyknięcie barwników przyżyciowych. W trakcie eksperymentu obrazowane są fluorescencyjne komórki przemieszczające się w różnych obszarach śledziony.Przedstawiamy metodologię opisu mobilności pasożytów w trójwymiarowym wolnym przedziale miazgi czerwonej oraz obliczania przepływu krwi w naczyniach. Parametry te zostały wykorzystane do porównania dynamiki śledziony u dwóch szczepów PULE. Dzień dobry wszystkim.Nazywam się Nando El Portillo, a jednym z głównych pytań badawczych w moim laboratorium jest próba zrozumienia roli śledziony w malarii. Splenomegalia jest jednym z charakterystycznych objawów tej choroby, jednak ze względu na kwestie techniczne i etyczne prowadzenie badań nad tym organem jest bardzo trudne. Aby temu zaradzić, wykorzystaliśmy technologie, które pozwalają nam obserwować dynamiczne przemieszczanie się tego pasożyta i ilościowo oceniać to zjawisko.To właśnie wyjaśnią Lorena i MI w poniższych protokołach. Badania te są prowadzone częściowo we współpracy z grupami dr. Ler z Uniwersytetu w Hamburgu w Niemczech oraz dr Marii Kbo tutaj, w szpitalu Clinic, i otrzymały ogólne finansowanie z funduszy Cellex oraz ministerialnego CIA In Espanol. Infekcję rozpoczyna się od Dawcy M zakażonego letalnymi lub nieletalnymi pasożytami GFP przy poziomie 10% pasożytów. Aby sprawdzić obecność pasożytów, należy pobrać małą kroplę krwi z żyły ogonowej myszy i rozmazać ją na szkiełku mikroskopowym.Przygotuj preparat do barwienia kolorymetrycznego z użyciem GIMs. Roztwór ten umożliwi wizualizację zakażonych erytrocytów po wyschnięciu; utrwal rozmaz krwi w metanolu przez dwie minuty, nałóż roztwór GIMs i inkubuj przez 20 minut. Przemyj szkiełko bieżącą wodą z kranu i wysusz, a następnie określ procentowy udział zakażonych erytrocytów w stosunku do całkowitej liczby erytrocytów, korzystając z mikroskopu świetlnego z obiektywem imersyjnym 100x.Zainfekuj myszy letalnymi lub nieletalnymi pasożytami otrzymanymi z krwi ogonowej myszy dawców i rozcieńczonymi w PBS. Dostosuj dawkę tak, aby wstrzyknąć pół miliona pasożytów na mysz w celu osiągnięcia poziomu pasożytnictwa obwodowego wynoszącego 1% w trzeciej dobie po infekcji; podaj preparat do jam brzusznych. Alternatywnie, w grupie kontrolnej można zastosować RBC znakowane FITC.Od zwierząt pobiera się jeden mililitr krwi tętniczej z myszy, a następnie pellet płucze poprzez wirowanie w PBS zawierającym EDTA, resuspendsuje w roztworze FITC i inkubuje przez dwie godziny w ciemności przy delikatnym mieszaniu. Po tym czasie nadłącznie usuwa się przez wirowanie i przeprowadza dokładne płukanie. Preparat wstrzykuje się myszy kontrolnej do uzyskania średniego stężenia 1% w krążeniu obwodowym, a następnie przystępuje się do eksperymentów in vivo.Witajcie, nazywam się mija. Aby obrazować śledzionę in vivo, musimy przeprowadzić niewielką operację chirurgiczną zwierzęcia w celu odsłonięcia śledziony; tę technikę opanowałam pod kierunkiem Stephanie GR w laboratorium Heislera, której chciałabym podziękować. Teraz pokażę Państwu, jak postępować.Obrazowanie zakażonego mięśnia przeprowadzono w trzeciej dobie po zakażeniu, gdy poziom paratu wynosił 1% w obu szczepach. Przez cały czas trwania procedury mysz należy utrzymywać w znieczuleniu i w kontrolowanej temperaturze. Należy chronić oczy przed odwodnieniem i przed przystąpieniem do dalszych czynności zweryfikować, czy mysz jest całkowicie znieczulona, poprzez uciśnięcie poduszeczki stopy, aby ułatwić dożylną administrację substancji.W trakcie eksperymentu przeprowadź kaniulację ogonowej żyły myszy w celu założenia kaniuli. W jednym końcu rurki umieść małą igłę, a w drugim aplikator. Napełnij kaniulę solą fizjologiczną, usuwając pęcherzyki powietrza, i sprawdź, czy roztwór przepływa przez kaniulę prawidłowo.Kaniulacja żyły bocznej ogona zostanie przeprowadzona w warunkach sterylnych. W celu zwiększenia widoczności żyły należy zastosować delikatną konstrikcję u nasady ogona. Następnie należy wprowadzić końcówkę kaniuli do wnętrza żyły.Pojawienie się krwi będzie wskazywać, że igła jest prawidłowo umiejscowiona. Jeśli tak nie jest, należy powtórzyć kanulację powyżej miejsca wkłucia w żyłę, a następnie przymocować kaniulę do ogona za pomocą kleju i taśmy. Odsłoń dolną część śledziony poprzez niewielkie nacięcie skóry i mięśni po lewej stronie grzbietowej zwierzęcia.Umieść śledzionkę w miejscu, w którym obserwuje się mniejszy ruch oddechowy, i nanieś PBS na powierzchnię zewnętrzną, aby zapewnić nawilżenie oraz oczyścić ją z włosów myszy. Przykryj śledzionkę osłonką, aby umożliwić wizualizację. Witaj, nazywam się Lorena.Przedstawiony protokół pozwoli na wizualizację przemieszczania się pasożytów PULI przez śledzionę. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu transgenicznych pasożytów GFP. Materiał udostępniony przez Jamesa Burnesa z Drexel University.Obrazowanie ruchu fluorescencyjnych pasożytów pozwoli nam ustalić, czy istnieją różnice w zachowaniu między szczepami letalnymi a nieletalnymi. Eksperymenty z mikroskopii żywych organizmów przeprowadzono przy użyciu mikroskopu wielofotonowego Leica, wyposażonego w system inkubacji z kontrolą temperatury oraz obiektyw glicerynowy 63 x. Umieść zwierzę na stoliku mikroskopu z pokrywką szkłem, tak aby śledziona była skierowana w dół, w stronę obiektywu. Początkowo.Wizualizacja śledziony przy mniejszych powiększeniach zapewni ogólny wgląd w strukturę mikrokrażową tego narządu. Po ustawieniu ostrości na śledzionie przy użyciu autofluorescencji tkanki, obserwuje się pasożyty GFP przechodzące przez różne obszary śledziony. Dzień dobry, nazywam się Maria Albo z Centrów Naukowo-Technologicznych Uniwersytetu w Barcelonie i przeprowadzimy obrazowanie intravitalne śledziony.W celu zbadania przepływu krwi oraz mobilności zainfekowanych erytrocytów wykorzystamy mikroskop konfokalny wyposażony w skaner rezonansowy, który umożliwia obrazowanie z wysoką prędkością, co jest niezwykle przydatne w celu uniknięcia artefaktów ruchowych narządu. Jest to mikroskop spektralny, który pozwala na wybór zakresu widzenia. Aby uzyskać bardzo szybki obraz, przeprowadzimy jednoczesną akwizycję dwóch znakowań fluoresceiną oraz odbicia.Wybierz różne obszary do obrazowania przy użyciu RBC, barwników refleksyjnych, kontrastowych oraz barwników Vidala, aby uwidocznić mikrokrążenie śledziony. Teraz wyjaśnimy, jak mierzyć mobilność pasożytów w przepływie krwi w naczyniach, wykorzystując mikroskopię Vidala oraz oprogramowanie ImageJ do śledzenia ruchu pasożytów w trójwymiarowej sieci miazgi czerwonej. Pozyskaj obrazy dla pięciu płaszczyzn Z, korzystając z trybu szybkiego skanowania.Przekształć stosy obrazów w filmy kolorowe z kodowaniem osi Z, aby ułatwić śledzenie pojedynczych komórek fluorescencyjnych. Szczegółowe informacje zawarto w tekście; śledź różne cząsteczki w czasie i w głębi każdego filmu, korzystając z współrzędnych X, Y, Z oraz T. Parametry mobilności, takie jak kierunkowość, średnia prędkość i czas przebywania, mogą zostać obliczone i przedstawione w formie map rozkładu, co umożliwia analizę porównawczą między populacjami szczepów. Przepływ naczyniowy w śledzionie można obrazować poprzez systemową iniekcję kilku cząsteczek fluorescencyjnych, takich jak dekstryna, opisanych w tabeli pomocniczej.Następnie, wykorzystując endogenny kontrast refleksyjny erytrocytów, należy przeprowadzić skanowanie przepływu krwi wzdłuż linii środkowej, ustawiając naczynia poziomo w kierunku skanowania laserowego i stosując ulepszone uśrednianie liniowe (Line average). Na obrazach tych smugi powstające w wyniku ruchu komórek zostaną wykorzystane do obliczenia przepływu krwi; należy wykonać obrazy naczyń o różnych średnicach oraz w różnych fazach cyklu serca, aby skompensować fluktuacje. Śledziona od dawna była uważana za „czarną skrzynkę” w badaniach nad malarią, dlatego opracowaliśmy ilościową metodę mikroskopii intravitalnej, aby uzyskać wgląd w dynamikę infekcji pasożytniczej i przepływu krwi w tym narządzie, co pozwoliło nam odpowiedzieć na istotne pytania biologiczne, takie jak przyleganie zainfekowanych czerwonych krwinek do śledziony in vivo.Dziękujemy i.

intravital-microscopy-spleen-quantitative-analysis-parasite-mobility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopia przyżyciowa śledziony: analiza ilościowa ruchliwości pasożyta i przepływu krwi

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

Poznaj metodę mikroskopii przyżyciowej do ilościowej analizy ruchliwości pasożytów malarii i przepływu krwi w śledzionie myszy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów GFP.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Przeglądaj więcej filmów