Konstruowanie hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanu obciążonych komórkami macierzystymi

Protokół ten oferuje strategię in vitro polegającą na dostarczeniu komórek macierzystych z mikrosfer chitozanu do rusztowania w żelu kolagenowym, pobraniu i hodowli. Pierwotne komórki macierzyste adipocytów następnie emulgują i odzyskują preparat mikrosfer chitozanu. Następnie zasiej komórki macierzyste na mikrosferach chitozanu i hoduj je w wkładce do hodowli membranowej o wielkości porów o wielkości ośmiu mikronów, aby wytworzyć CSM załadowany CSM, a na koniec wymieszaj system dostarczania mikrosfer z trójwymiarowym rusztowaniem z żelu kolagenowego.

Ostatecznie, ten system CSM oferuje potencjał do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej i dostarczaniu leków. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak iniekcja komórek lub mikrokapsułkowanie, jest zdolność komórek do przyczepiania się do materiału nośnego i utrzymywania się po pierwszym zastosowaniu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ mikrosfery esan mają nieodłączny ładunek statyczny.

A ładowanie komórek nad złożem mikrosferycznym będzie wyzwaniem bez ich zakłócania. Wyciąć i umyć, tkankę tłuszczową krocza i naskórka z owijki zmielić tkankę, a następnie przenieść jeden do dwóch gramów do 25 mililitrów HBSS zawierających 1% FBS. Po odwirowaniu zebrać swobodnie pływającą warstwę tkanki tłuszczowej do 125-mililitrowej kolby Erlenmeyera.

Dodaj 25 mililitrów kolagenazy typu drugiego i inkubuj reakcję na wytrząsarce orbitalnej. Teraz ostrożnie usuń frakcję ciekłą znajdującą się poniżej warstwy oleju i tłuszczu i przefiltruj sekwencyjnie przez nylonowe filtry siatkowe o wielkości 170 mikronów. Zbierz komórki przez odwirowanie po dwóch myciach 25 mililitrami.

HBSS Resus, zawiesić osad w 30 mililitrach uzupełnionego podłoża wzrostowego mesen pro. Podzielić oczyszczone komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej na dwie kolby hodowlane T 75 i amplifikować preparat A SC w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ten protokół CSM to proces emulgowania wody w oleju, który wykorzystuje technikę koeracji jonowej.

Emulgować sześć mililitrów wodnego roztworu chitozanu w 100 mililitrach mieszaniny fazy olejowej za pomocą mieszania napowietrznego i magnetycznego jednocześnie w przeciwnych kierunkach przez jedną godzinę do stabilnej emulsji wodno-olejowej, dodawać 1,5 mililitra 1% wodorotlenku potasu w liczbie oktalnej co 15 minut przez cztery godziny. Po zakończeniu jonowej reakcji sieciowania powoli zdekantuj fazę olejową i natychmiast dodaj kulki do 100 mililitrów acetonu. Umyj kulki acetonem, aż faza olejowa zostanie całkowicie usunięta.

Następnie wysusz odzyskane kulki w próżni. Osuszanie Określ średnią powierzchnię wielkości cząstek CSM na miligram i jednostkę sześcienną objętości za pomocą analizatora wielkości cząstek. Kontynuuj trzykrotne mycie CSM sterylną wodą, aby usunąć resztki soli.

Teraz wysterylizuj preparat CSM alkoholem absolutnym do użycia w eksperymentach komórkowych w szklanej probówce o pojemności 50 mililitrów, wymieszaj pięć miligramów mikrosfer z jednym mililitrem 0,5% roztworu TNBS inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie dodaj trzy mililitry sześciu normalnych kwasów solnych i inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej dodaj pięć mililitrów wody dejonizowanej i 10 mililitrów eteru Ethel.

Aby wyekstrahować wolny TNBS, usuń pięciomililitrową porcję fazy wodnej i ogrzej do 40 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 15 minut, aby odparować resztki eteru po schłodzeniu do temperatury otoczenia. Rozcieńczyć 15 mililitrami wody za pomocą spektrofotometru. Zmierzyć absorbancję przygotowanych mikrosfer chitozanu przy 345 nanometrach przy użyciu TNBS jako ślepej próby.

Należy również zmierzyć chitozan użyty do przygotowania CSM. Teraz oblicz liczbę wolnych grup aminowych CSM w stosunku do całkowitej liczby grup aminowych w chitozanie. Zrównoważyć pięć miligramów wysterylizowanego CSM w sterylnym HBSS przez noc.

Przenieś CSM do wkładki membranowej o grubości ośmiu mikronów dla 24-dołkowych płytek hodowlanych. Po ustabilizowaniu się CSM ostrożnie zassaj HBSS. Teraz dodaj 300 mikrolitrów pożywki wzrostowej do wnętrza wkładki i 700 mikrolitrów pożywki wzrostowej na zewnątrz wkładki. Resus.

Zawieś komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej w 200 mikrolitrach wzrostu, podłoża i nasion nad CSM wewnątrz płytki hodowlanej. Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś CSM załadowany SC do sterylnej mikroprobówki wirówkowej bez naruszania komórek, które migrowały do membrany wkładki.

Teraz usuń pozostałą pożywkę i dodaj 250 mikrolitrów świeżej pożywki wzrostowej do każdej probówki. Dodać 25 mikrolitrów pięciu miligramów na mililitr roztworu MTT i inkubować przez cztery godziny. Usunąć pożywkę i dodać 250 mikrolitrów wiru tlenku dimetylosulfu w celu rozpuszczenia postaci jako wirówki złożonej, CSM w temperaturze 2, 700 G przez pięć minut.

Zmierzyć absorbancję supernatantu przy 570 nanometrach, używając 630 nanometrów jako odniesienia. Przystąp do określenia liczby komórek związanych z CSM w stosunku do wartości chłonności uzyskanej ze znanej liczby żywotnych A SC. Wymieszaj pięć miligramów CSM załadowanego SC z 7,5 miligramami na mililitr. Kolagen typu pierwszego ekstrahowany ze szczurów.

Ścięgno ogonowe, dostosować pH do 6,8 za pomocą dwóch normalnych wodorotlenków sodu i wlać do płytki hodowlanej. Włóż do fibrylacji, a następnie przenieś na 12-dołkową płytkę i inkubuj przez 30 minut. Kontynuuj odświeżanie podłoża dla żeli kolagenowych A-S-C-C-S-M co drugi dzień okresu inkubacji.

Monitoruj również, uwalniaj i migruj komórki z CSM do żelu przy użyciu standardowych technik mikroskopowych. Poniższy przykład opisuje strategię in vitro polegającą na dostarczaniu komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu z mikrosfer chitozanu do rusztowania w żelu kolagenowym. Obrazy SEM i TEM wskazują na przygotowanie porowatego CSM o jednolitym rozmiarze.

Inkubacja mikrosfer z pierwotnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej wskazuje na 4 000 komórek na miligram wapnia CSM. Barwienie SC wykazuje rozprzestrzenianie się po CSM z rozszerzaniem filopodiów w porowate szczeliny mikrosfery. Kiedy CSM załadowany komórkami zostanie zmieszany z żelem kolagenowym, komórki migrują do żelu i można je śledzić w czasie.

Implikacje tej techniki natychmiast rozciągają się w kierunku terapii masywnej i przewlekłej utraty tkanki. Jednak ten schemat leczenia ma znacznie większy potencjał ze względu na jego wszechstronność w integracji z różnymi komórkami i/lub biomateriałami stosowanymi w leczeniu różnych poziomów utraty tkanek miękkich i serca. Wątpię, czy ta metoda może zapewnić wgląd w dostarczanie komórek gospodarza.

Może być również stosowany do innych systemów, takich jak zastrzyki, dostarczanie leków terapeutycznych, opracowywanie systemów hybrydowych do dostarczania zarówno komórek, jak i leków terapeutycznych razem.