Name: Konstruowanie hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanu obciążonych komórkami macierzystymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę dostarczania komórek macierzystych z mikrosfer chitozanu do hydrożelu kolagenowego. Technika zachowuje multipotencjalność komórek i zwiększa ich trwałość po aplikacji w zastosowaniach z zakresu medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.O.Z. otrzymał wsparcie w ramach grantu przyznanego przez The Geneva Foundation. S.N. otrzymał wsparcie w ramach grantu na stypendium podoktorskie z Pittsburgh Tissue Engineering Initiative.

1. Izolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego (ASC)
Uwaga: Wszystkie procedury były wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Wyizolować tkankę tłuszczową okołonerkową i nadjądrzową szczura, a następnie przemyć ją sterylnym buforem Hanksa (HBSS) zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą6.</li>
	<li>Rozdrobić tkankę, przenieść 1-2 g do probówki o pojemności 50 mL zawierającej 25 mL HBSS z 1% FBS i odwirować przy 500 g przez 8 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać wolno pływającą warstwę tkanki tłuszczowej, przenieść ją do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 mL i inkubować z 25 mL kolagenazy typu II (200 U/mL) w HBSS przez 45 min w 37 °C na wytrząsarce orbitalnej (125 rpm).</li>
	<li>Ostrożnie usunąć frakcję ciekłą (znajdującą się poniżej warstwy tłuszczu i tkanki tłuszczowej) i przefiltrować sekwencyjnie przez nylonowe filtry o oczkach 100-μm i 70-μm. Odwirować filtrat przy 500 g przez 10 min w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i dwukrotnie przemyć osad 25 mL HBSS.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 50 mL pożywki wzrostowej (MesenPRO RS Basal Medium) uzupełnionej o MesenPRO RS Growth Supplement, antybiotyk-antymykotyk (100 U/mL penicyliny G, 100 μg/mL siarczanu streptomycyny oraz 0,25 μg/mL amfoterycyny B) oraz 2 mM L-glutaminy, a następnie przenieść komórki pipetą do 2 kolb T75 (25 mL/kolba).</li>
	<li>Hodować ASC w inkubatorze z 5% CO2 w warunkach wilgotnych w temperaturze 37 °C (do wszystkich eksperymentów wykorzystuje się ASC z pasażu 2-4).</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrośfer chitosanowych (CSM)
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>CSM są przygotowywane za pomocą procesu emulgowania woda-w-oleju wraz z techniką koacervacji jonowej zgodnie z naszym poprzednim protokołem6. Emulgować roztwór wodny chitosanu (6 mL 3%w/v chitosanu w 0,5 M kwasie octowym) w 100 mL mieszaniny fazy olejowej składającej się z oleju sojowego, n-oktanolu (1:2 v/v) i 5% emulgatora sorbitanu monooleinianu (span 80), stosując jednocześnie mieszanie mechaniczne (1700 rpm) i magnetyczne (1000 rpm) w przeciwnych kierunkach. Ta podwójna metoda mieszania zapewnia, że micelle utworzone na wczesnym etapie, przed zajściem sieciowania, pozostają w roztworze i nie osiadają na dnie. Ponadto magnetyczny mieszadło pomaga w deagregacji chitosanu podczas tworzenia i utwardzania micelli.</li>
	<li>Mieszaninę mieszać w sposób ciągły przez około 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnej emulsji woda-w-oleju. Sieciowanie jonowe inicjuje się poprzez dodawanie 1,5 mL 1% w/v wodorotlenku potasu w n-oktanolu co 15 min przez 4 h (łącznie 24 mL).</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji sieciowania powoli zdekantować fazę olejową z mieszaniny zawierającej CSM i natychmiast przenieść sfery do 100 mL acetonu. Przemywać sfery acetonem do całkowitego usunięcia fazy olejowej.</li>
	<li>Wysuszyć odzyskane sfery w desykanatorze próżniowym i poddać analizie bez dalszego przetwarzania. Średnią wielkość cząstek CSM, powierzchnię właściwą na miligram oraz jednostkową objętość sześcianu określono za pomocą analizatora wielkości cząstek.</li>
	<li>Do dalszych eksperymentów przemyć CSM trzykrotnie sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości soli i wysterylizować alkoholem absolutnym.</li>
</ol>
3. Wyznaczanie liczby wolnych grup aminowych w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Wyznaczyć liczbę wolnych grup aminowych obecnych w CSM po sieciowaniu jonowym, stosując analizę kwasem trinitrobenzenosulfonowym (TNBS) według metody Bubinsa i Ofnera7. Inkubować 5 mg mikrosfer z 1 mL 0,5% roztworu TNBS w probówce szklanej o pojemności 50 mL przez 4 h w temperaturze 40 °C, a następnie przeprowadzić hydrolizę po dodaniu 3 mL 6N HCl w temperaturze 60 °C przez 2 h.</li>
	<li>Ostudzić próbki do temperatury pokojowej i wyekstrahować wolny TNBS, dodając 5 mL wody dejonizowanej oraz 10 mL eteru etylowego.</li>
	<li>Podgrzewać 5 mL alikwot fazy wodnej do 40 °C w kąpieli wodnej przez 15 min w celu odparowania pozostałości eteru, ostudzić do temperatury pokojowej i rozcieńczyć 15 mL wody.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 345 nm za pomocą spektrofotometru, używając roztworu TNBS bez chitozanu jako próbki ślepej oraz chitozanu użytego do przygotowania CSM w celu wyznaczenia całkowitej liczby grup aminowych. Oszacować liczbę wolnych grup aminowych w CSM w stosunku do chitozanu.</li>
</ol>
4. Ładowanie ASC do CSM
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzano w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Równoważyć 5 mg sterylizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (CSM) z sekcji 2.5 w sterylnym roztworze HBSS przez noc, a następnie przenieść do wkładki do płytki hodowlanej z membraną o rozmiarze porów 8 μm (płytka 24-dołkowa).</li>
	<li>Po osadzeniu się CSM na membranie, ostrożnie odessać HBSS i dodać 300 μL pożywki wzrostowej do wnętrza wkładki oraz 700 μL pożywki wzrostowej na zewnątrz wkładki.</li>
	<li>Resuspender ASC w odpowiednim stężeniu (1 x 104 do 4 x 104) w 200 μL pożywki wzrostowej i zasiać nad CSM wewnątrz wkładki do płytki hodowlanej. Końcowa objętość pożywki we wkładce hodowlanej po zasiewie wynosi 500 μL.</li>
	<li>Inkubować ASC zasiane na CSM przez 24 h w inkubatorze z nawilżaniem, przy 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Wyznaczanie procentowego stopnia załadowania ASC oraz żywotności komórek w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Po inkubacji zebrać CSM obciążone ASC do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, nie naruszając komórek, które migrowały do membrany wkładu.</li>
	<li>Usunąć pozostałą pożywkę i dodać do probówki 250 μL świeżej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 25 μL roztworu MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliumu] (5 mg/mL) i inkubować przez 4 h w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, przy 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć pożywkę, dodać 250 μL dimetylosulfoksydu i mieszać mieszaninę na wirówce typu vortex przez 2-5 min w celu rozpuszczenia kompleksu formazanu.</li>
	<li>Odwirować CSM przy 2700 x g przez 5 min, a następnie zmierzyć absorbancję supernatantu przy 570 nm, przyjmując 630 nm jako referencję.</li>
	<li>Wyznaczyć liczbę komórek związanych z CSM w odniesieniu do wartości absorbancji uzyskanej dla znanych liczb żywych ASC.</li>
</ol>
6. Charakterystyka żelu kolagenowego z zatopionymi ASC-CSM
Uwaga: Wszystkie procedury były wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Wymieszać CSM załadowany komórkami ASC (5 mg zawierające ≈ 2 x 104 komórek) z kolagenem typu 1 (7,5 mg/mL) wyekstrahowanym z ścięgna ogona szczura zgodnie z metodą Bornsteina8 i przeprowadzić fibrylację po dostosowaniu pH do 6,8 przy użyciu 2 N NaOH.</li>
	<li>Przenieść zfibrylowaną mieszaninę kolagen-ASC-CSM do płytki 12-dołkowej i inkubować przez 30 min w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po całkowitej fibrylacji inkubować żele kolagen-ASC-CSM do 14 dni w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uwolnienie i migrację komórek z CSM do żelu obserwowano przy użyciu standardowych technik mikroskopowych.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
W niniejszym badaniu opracowaliśmy strategię in vitro dostarczania komórek macierzystych z mikrosfer chitosanowych (CSM) do rusztowania z żelu kolagenowego. Przygotowano porowate CSM o jednolitym rozmiarze (średnica 175-225 μm) i składzie, które wykorzystano jako nośniki komórek (Rycina 2). Po inkubacji ASC z CSM, komórki przyczepiły się w stężeniu 2 x 104 komórek/5mg CSM. Komórki wykazywały zdolność do rozprzestrzeniania się na powierzchni mikrosfer, jednocześnie wprowadzając filopodia w porowate szczeliny mikrosfery (Rycina 3). Po zmieszaniu CSM obciążonych komórkami z żelem kolagenowym, komórki natychmiast zaczęły migrować do wnętrza żeli (Rycina 4).
<img alt="Wykres charakterystyki biomateriałów; porównuje chitosan i kolagen pod kątem cech takich jak biokompatybilność." src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Zalety biologiczne stosowania chitosanu i kolagenu w systemie dostarczania komórek macierzystych.
<img alt="Schemat izolacji ASC i przygotowania CSM; proces obciążania rusztowania do analizy gojenia ran." src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat przedstawiający ogólną strategię podwójnego zastosowania rusztowań kolagenowych obciążonych ASC-CSM. Rysunki 2, 3 i 4 są zaznaczone na schemacie, aby pomóc w interpretacji obrazów.
<img alt="Schemat procesu ładowania ASC i CSM; mieszanie w insertach hodowlanych do badań komórkowych." src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schematyczna reprezentacja procesu wysiewania komórek macierzystych na mikro sfery chitozanowe. Proces obejmuje współhodowlę ASC z CSM w insercie do płytek hodowlanych z membraną o rozmiarze porów 8- μm. Po 24 godzinach mikrosfery są usuwane z insertu i są gotowe do osadzenia w macierzy biomateriału.
<img alt="Confocal, SEM, and TEM microscopy of cellular structures for imaging analysis and characterization." src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3. Charakterystyka morfologiczna CSM obciążonych ASC. Panel A przedstawia mikrofotografię ASC-obciążonego CSM, natomiast panel B pokazuje to samo pole widzenia z nałożonym obrazem uzyskanym za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. ASC zostały uprzednio obciążone kalceiną AM (kolor zielony). Panel C przedstawia obraz z SEM nieobciążonej mikrosfery, natomiast panel D pokazuje komórki załadowane na mikrosferę (gwiazdki). Obraz TEM w panelu E przedstawia przekrój poprzeczny nieobciążonej mikrosfery. W całej mikrosferze znajduje się wiele porów i szczelin. Panel F przedstawia przekrój poprzeczny mikrosfery z przytwierdzonymi komórkami (strzałki), które wprowadzają filopodia do szczelin. Powiększenia oryginalne: A &amp; B= 70x; C= 500x, D= 2000x; E&amp;F= 2 500x.
<img alt="Obrazy mikroskopowe komórek podkreślające cechy strukturalne i różnice w morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Migracja ASC z CSM do trójwymiarowego rusztowania kolagenowego. Panele A i B przedstawiają CSM z komórkami migrującymi od mikrosfery do macierzy kolagenowej w 3 dniu (A, strzałki). Panel B pokazuje podobną hodowlę po 12 dniach. Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) przedstawiono w panelach C, D i E. Gwiazdki w panelach C i D wskazują przekrój mikrosfery z komórkami migrującymi od mikrosfery (strzałki). Powiększenie fragmentu panelu D przedstawiono w panelu E, gdzie widoczne są filopodia komórkowe przyczepione do włókien kolagenowych (wstawka). Powiększenie oryginalne: A&amp;B = 100x; C&amp;D = 6,000x; E = 20,000x, wstawka = 150,000x.
<img alt="Schemat CSM dla terapii komórkowej: regulowana powierzchnia, wstrzykiwalność, dostarczanie leków, konstrukty tkankowe." src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Schemat przedstawiający szerokie zastosowania CSM w medycynie regeneracyjnej i dostarczaniu leków.

<ol><li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+bone%2C+cartilage%2C+tendon+and+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.</a> Bone. 39, 678-683 (2006).</li>
<li>Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+strategies+for+adipose+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering strategies for adipose tissue repair.</a> Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).</li>
<li>Pountos, I., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Biology of mesenchymal stem cells.</a> Injury. 36, Suppl 3. S8-S12 (2005).</li>
<li>Kim, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+and+its+derivatives+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications.</a> Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).</li>
<li>Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+chitosan+and+its+derivatives+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine.</a> J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).</li>
<li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).</li>
<li>Bubnis, W. A., Ofner, C. M. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li>
<li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li>
<li>Shanmuganathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+chitosan+microspheres+for+doxycycline+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Polym%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery.</a> Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).</li>
<li>Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+a+new+microcapsule+membrane+combining+alginate%2C+chitosan%2C+polyethylene+glycol+and+poly-L-lysine+for+cell+transplantation+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications.</a> Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).</li>
<li>Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%3A+a+unique+hypoimmunogenic+platform+for+long-term+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy.</a> FASEB J. 24, 22-31 (2010).</li>
<li>Zielinski, B. A., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+a+matrix+for+mammalian+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation.</a> Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).</li>
<li>Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+for+Adipose+Tissue+Engineering+with+Adipose-Derived+Stem+Cells+Using+Different+Scaffolds+of+Natural+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol.+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin.</a> Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).</li>
<li>Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-chitosan+complex+coacervation+for+cell+encapsulation%3A+effect+on+mechanical+properties+and+on+long-term+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability.</a> Biopolymers. 82, 570-579 (2006).</li>
<li>Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fsilk+fibroin-based+tissue-engineered+graft+seeded+with+adipose-derived+stem+cells+enhances+nerve+regeneration+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).</li>
<li>Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-chitosan%2FPLGA-alginate+nanoparticle+blends+as+biodegradable+colloidal+gels+for+seeding+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlves+da+Silva%2C+ML+%22+J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22"> J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2010).</li>
<li>Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biocompatibility+study+of+electrospun+chitosan+microfiber+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).</li>
<li>Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+channels+containing+spinal+cord-derived+stem%2Fprogenitor+cells+for+repair+of+subacute+spinal+cord+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat.</a> Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32, 57-64 (2011).</li>
<li>Altman, A. M., Gupta, V., RÃ­os, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion%2C+migration+and+mechanics+of+human+adipose-tissue-derived+stem+cells+on+silk+fibroin-chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix.</a> Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).</li>
<li>Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Human+adipose-derived+stem+cells+seeded+on+a+silk+fibroin-chitosan+scaffold+enhance+wound+repair+in+a+murine+soft+tissue+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model.</a> Stem Cells. 27, 250-258 (2009).</li>
<li>Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+chitosan-gelatin-chondroitin+porous+scaffold+improves+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów finansowych.
Zastrzeżenia
Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako oficjalne ani odzwierciedlające stanowisko Departamentu Obrony lub rządu USA. Autorzy są pracownikami rządu USA, a niniejsza praca została przygotowana w ramach ich oficjalnych obowiązków. Wszystkie prace były wspierane przez US Army Medical Research and Materiel Command. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem przeanalizowanym i zatwierdzonym przez Institutional Review Board przy US Army Medical Research and Materiel Command oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem.

Główną przeszkodą w terapii opartej na komórkach macierzystych jest opracowanie wydajnych metod dostarczania komórek do określonych obszarów w celu ich regeneracji. Ze względu na zmienność między pacjentami, rodzaj tkanki, rozmiar i głębokość uszkodzenia, metodologia dostarczania komórek macierzystych musi być ustalana indywidualnie dla każdego przypadku. Chociaż osadzanie komórek macierzystych w macierzy i dostarczanie ich do miejsca rany wydaje się kolejnym logicznym podejściem w inżynierii tkankowej, nadal istnieją pe...

<table><tbody><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6685</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Filtr z nylonowej siatki 70-&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Filtr z nylonowej siatki 100-&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>System pożywek wzrostowych MesenPRO</td><td>Invitrogen</td><td>12746-012</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T75</td><td>BD Biosciences</td><td>137787</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Chitozan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>N-oktanol</td><td>Acros Organics</td><td>150630025</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Sorbitanu monooleinian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6760</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-4859</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Kwas trinitrobenzenosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Eter etylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472-484</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Wkładki do płytek do hodowli tkankowych 8-&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Odczynnik MTT</td><td>Invitrogen</td><td>M6494</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania komórek Qtracker (Q tracker 655)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>Q2502PMP</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Kolagen typu 1</td><td>Travigen</td><td>3447-020-01</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>Materiał zużywalny</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mieszadło orbitalne</td><td>New Brunswick Scienctific</td><td>C24</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Inkubator z nawilżaniem i atmosferą 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Model 370</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mieszadło z napędem górnym</td><td>IKA</td><td>Visc6000</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Corning</td><td>PC-210</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Suszarka próżniowa</td><td>–</td><td>–</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Analizator wielkości cząstek</td><td>Malvern Instruments</td><td>STP2000 Spraytec</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp210</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Spektrofotometr UV/Vis Beckman Coulter DU800</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mieszadło Vortex</td><td>Diagger</td><td>3030a</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny/fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus Corporation</td><td>Skanujący mikroskop konfokalny laserowy FV-500</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Leo 435 VP</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JEOL 1230</td><td>Sprzęt</td></tr></tbody></table>

konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Wykazano, że wielopotencjalne komórki macierzyste są niezwykle użyteczne w dziedzinie medycyny regeneracyjnej1-3. Jednakże, aby efektywnie wykorzystać te komórki do regeneracji tkanek, należy wziąć pod uwagę szereg zmiennych. Zmienne te obejmują: całkowitą objętość i powierzchnię miejsca implantacji, właściwości mechaniczne tkanki oraz mikrośrodowisko tkankowe, w tym stopień unaczynienia i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. W związku z tym materiały stosowane do dostarczania tych komórek muszą być biokompatybilne, o określonym składzie chemicznym, przy jednoczesnym zachowaniu wytrzymałości mechanicznej naśladującej tkankę gospodarza. Materiały te muszą być również przepuszczalne dla tlenu i substancji odżywczych, aby zapewnić korzystne mikrośrodowisko do adhezji i proliferacji komórek. Chitozan, kationowy polisacharyd o doskonałej biokompatybilności, może być łatwo modyfikowany chemicznie i wykazuje wysokie powinowactwo do wiązania się z makrocząsteczkami in vivo4-5. Chitozan naśladuje część glikozaminoglikanową macierzy zewnątrzkomórkowej, co pozwala mu pełnić funkcję podłoża dla adhezji, migracji i proliferacji komórek. W niniejszym badaniu wykorzystujemy chitozan w formie mikrosfer do dostarczenia komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) do trójwymiarowego rusztowania opartego na kolagenie6. W celu uzyskania maksymalnej liczby załadowanych komórek określono optymalny stosunek komórek do mikrosfer w odniesieniu do czasu inkubacji i gęstości komórek. Po wysianiu komórek ASC na mikrosfery chitozanowe (CSM), zostają one osadzone w rusztowaniu kolagenowym i mogą być utrzymywane w kulturze przez dłuższy czas. Podsumowując, niniejsze badanie przedstawia metodę precyzyjnego dostarczania komórek macierzystych w obrębie trójwymiarowego rusztowania biomateriałowego.

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Wykazano, że wielopotencjalne komórki macierzyste są niezwykle użyteczne w dziedzinie medycyny regeneracyjnej1-3. Jednakże, aby efektywnie wykorzystać te komórki ...

Niniejszy protokół przedstawia strategię in vitro dostarczania komórek macierzystych z mikrosfer chitozanowych do rusztowania z żelu kolagenowego, a następnie ich pozyskiwania i hodowli. Pierwotne komórki macierzyste adipocytów są następnie emulgowane i odzyskiwane z preparatu mikrosfer chitozanowych. Następnie komórki macierzyste wysiewa się na mikrosfery chitozanowe i hoduje w insertach do płytek hodowlanych z membraną o rozmiarze porów ośmiu mikronów, aby uzyskać CSM załadowane komórkami macierzystymi, a na koniec system dostarczania mikrosfer miesza się z trójwymiarowym rusztowaniem z żelu kolagenowego.W ostateczności system CSM ten oferuje potencjał do zastosowania w medycynie regeneracyjnej oraz w dostarczaniu leków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie komórek czy mikroenkapsulacja, jest zdolność komórek do przywierania do materiału nośnika i przeżycia po początkowej aplikacji. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ mikrosfery esan posiadają wrodzony ładunek statyczny.Załadunek komórek na złoże mikrosfer będzie trudny bez ich naruszenia. Wyciąć i wypłukać tkankę tłuszczową krocza i na

constructing-collagen-hydrogel-for-delivery-stem-cell-loaded-chitosan

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tworzenie hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrokulek z komórkami macierzystymi z chitosanem

Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Ten artykuł opisuje enkapsulację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) za pomocą urządzenia do ogniskowania przepływu współosiowego. Wykazaliśmy, że ta technologia enkapsulacji mikroprzepływowej umożliwia efektywne tworzenie sferoid hPSC.

Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrokapsułek typu core-shell zawierających sferoidy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę dostarczania komórek macierzystych z mikrosfer chitozanu do hydrożelu kolagenowego. Technika zachowuje multipotencjalność komórek i zwiększa ich trwałość po aplikacji w zastosowaniach z zakresu medycyny regeneracyjnej.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Przeglądaj więcej filmów