Name: Sita o wysokiej i niskiej przepustowości z nicieniami węzłów korzeniowych Meloidogyne spp. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj metody przesiewowe wysokiej i niskiej przepustowości do oceny roślin zakażonych nicieniami węzłów korzeniowych Meloidogyne spp. Techniki te umożliwiają reprodukcyjną i jednorodną infekcję korzeni, wspierając programy hodowlane odpornych odmian.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Kaloshiana są finansowane z grantu Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (2007-35607-17765). Badania w laboratorium Robertsa są finansowane z grantów Agencji Stanów Zjednoczonych ds. Międzynarodowego Rozwoju (GDG-G-00-02-00012-00 oraz EDH-A-00-07-00005) oraz California Dry Bean Advisory Board.

1. Wzrost siewek pomidora w doniczkach i tackach
<ol>
 <li>W przypadku testów doniczkowych nasiona pomidora wysiewa się do pojedynczej doniczki w glebie bogatej w materię organiczną, takiej jak Sunshine mix. Rośliny należy utrzymywać w szklarni w temperaturze 22-28°C. Po wykiełkowaniu rośliny nawozi się raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.</li>
 <li>Około dwóch tygodni po wykiełkowaniu, w stadium dwóch liści właściwych, siewki przesadza się pojedynczo do doniczek (o średnicy 10 cm i głębokości 17 cm) wypełnionych sterylną glebą piaszczystą składającą się w 90% z piasku i w 10% z mieszanki organicznej. Należy dodać nawóz o spowolnionym uwalnianiu Osmocote i utrzymywać rośliny w szklarni w temperaturze 22-28°C przez dwa tygodnie. Następnie należy kontynuować nawożenie roślin raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.</li>
 <li>W przypadku przesiewów wysokoprzepustowych nasiona wysiewa się bezpośrednio do tacek w glebie piaszczystej, przykrywa tackę folią spożywczą do momentu wykiełkowania i utrzymuje w warunkach opisanych powyżej. Po wykiełkowaniu dodaje się nawóz o spowolnionym uwalnianiu Osmocote i nawozi rośliny raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.</li>
</ol>
2. Wzrost rośliny wilczego bobu w woreczkach do siewek
<ol>
 <li>Nasiona są albo kiełkowane w szalce Petri wyścielonej kilkoma warstwami papieru Kimwipe, a następnie przenoszone pojedynczo do woreczków, albo umieszczane bezpośrednio w papierowej bruździe woreczka i tam kiełkowane.</li>
 <li>Woreczki umieszcza się w plastikowych wiszących teczkach, po dwa w każdej, a teczki układa się pionowo w regale. Regal należy umieścić w komorze z kontrolowanym środowiskiem, utrzymując temperaturę 25-28 °C oraz cykl 16 h światła / 8 h ciemności. Regały można również utrzymywać w szklarni, jednak wymagają one przykrycia folią lub sztywnym papierem z obu stron łodyg roślin, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia grzybami.</li>
 <li>Woreczki należy podlewać raz lub dwa razy dziennie wodą z odwróconej osmozy. Około 10 do 14 dni po wysiewie, gdy rozwinie się odpowiedni system korzeniowy z wierzchołkami korzeni trzeciorzędowych (Rysunek 1), siewki są gotowe do inokulacji.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja jaj nicieni
Ekstrakcja jaj z zainfekowanych korzeni została zmodyfikowana na podstawie protokołu opracowanego przez Hussey i Barkera (1973).
<ol>
 <li>Na trzy do czterech dni przed inokulacją nicieniami, wyekstrahuj jaja nicieni korzeniowych z zainfekowanych korzeni pomidora. Przed rozpoczęciem ekstrakcji jaj dokładnie umyj obszar roboczy gorącą wodą, aby uniknąć kontaminacji. W gorącej wodzie umyj również blender, dwa wiadra, wspornik z drucianej siatki, gumowy młotek, trzy sita o oczkach 425, 90 i 25 μm, cylinder miarowy oraz nożyczki.</li>
 <li>Ułóż sita jedno na drugim w następującej kolejności (od góry do dołu): 425, 90 i 25 μm. Jaja zostaną zebrane na dolnym sicie o oczkach 25 μm. Umieść sita na wsporniku z drucianej siatki w zlewie. Pod siatką ustaw wiadro, aby zbierać przefiltrowany roztwór.</li>
 <li>Odetnij i wyrzuć wierzchołki zainfekowanej rośliny (roślin), służącej jako źródło inokulum. Ostrożnie wyjmij roślinę z doniczki. Umyj korzenie, zanurzając je w plastikowym wiadrze wypełnionym wodą. Płucz korzenie dalej pod bieżącą wodą, aż cząstki gleby zostaną z nich całkowicie usunięte.</li>
 <li>Pokrój korzenie nożyczkami na małe kawałki. Usuń korzeń palowy.</li>
 <li>Umieść posiekane korzenie z jednej rośliny w dużym plastikowym słoiku z pokrywką, dodaj niewielką ilość 10% roztworu wybielacza, aby przykryć korzenie, i zamknij pokrywkę.</li>
 <li>Wstrząsaj słoikiem z korzeniami przez 2 min.</li>
 <li>Otwórz słoik i wlej korzenie na górne sito, a następnie przemyj je wężem z zamontowaną dyszą rozpylającą. Płucz dokładnie, aż całkowicie zniknie zapach wybielacza. Użyj młotka, aby opukać boki sit, zapobiegając zapychaniu się oczek.</li>
 <li>Zdejmij górne sito i wypłucz zanieczyszczenia pozostałe na drugim sicie.</li>
 <li>Zdejmij drugie sito i zbierz z ostatniego sita drobne zanieczyszczenia, w których znajdują się jaja. Delikatnym strumieniem wody z butelki przesuń zanieczyszczenia na jedną stronę sita. Zbierz zanieczyszczenia i jaja do czystego zlewki z minimalną ilością wody.</li>
 <li>Przefiltruj jeszcze raz wodę zebraną w wiadrze przez sito 25 μm, aby zebrać ewentualne jaja, które mogły przejść. Dokładnie wypłucz wodą i zbierz do tej samej zlewki.</li>
 <li>Wyrzuć resztki roślinne z górnego sita i dokładnie umyj wszystkie trzy sita wodą pod ciśnieniem. Nie dotykaj siatki sit, ponieważ może to zniekształcić wielkość oczek.</li>
</ol>
4. Wykluwanie jaj nicieni
<ol>
 <li>Wyłóż czysty metalowy koszyczek kilkoma warstwami ręczników papierowych Kimwipe i umieść go na szklanej płytce Petriego. Zachowaj 1-cm odstęp między dnem koszyczka a płytką.</li>
 <li>Wlej wyekstrahowane jaja nicieni na papier w drucianym koszyczku. Dodaj tyle cieczy, aby dno drucianego koszyczka dotykało powierzchni wody, ale nie było w niej zanurzone. Przykryj całość plastikową pokrywką.</li>
 <li>Codziennie sprawdzaj stopień odparowania wody i dolewaj wody do płytki Petriego tak, aby dno koszyczka dotykało tafli wody. Zapobiegnie to wysychaniu jaj.</li>
 <li>Co drugi dzień zbieraj wodę zawierającą J2 z płytek Petriego do zlewki. Jeśli nie zostanie ona użyta natychmiast, napowietrzaj zebrany inokulum w temperaturze pokojowej, korzystając z laboratoryjnego zasilania powietrzem lub pompy akwariowej. Zużyj napowietrzone inokulum w ciągu 2 dni. J2 można zbierać z układu wylęgania przez okres 6-8 dni.</li>
</ol>
5. Infekcja korzeni pomidora w doniczkach lub tackach oraz ocena infekcji
<ol>
 <li>Wykorzystaj trzy alikwoty zebranych nicieni, aby zliczyć liczbę J2 za pomocą szkiełka liczącego lub szalki, oblicz średnią i określ pożądaną objętość do inokulacji. Zazwyczaj stosuje się 3000 J2 na roślinę w doniczkach oraz 500 J2 dla roślin hodowanych w tackach do siewek.</li>
 <li>Mieszaj inokulum na magnetycznej mieszalce z wytrząsaniem przy niskiej prędkości.</li>
 <li>Przed inokulacją roślin upewnij się, że gleba jest wilgotna, ale nie zbyt mokra. W przypadku inokulacji w doniczkach, wykonaj ołówkiem trzy otwory o głębokości około połowy doniczki w piasku wokół systemu korzeniowego każdego pomidora (Rycina 2). Zainokuluj każdą roślinę, wprowadzając J2 do trzech otworów za pomocą pipety. Następnie zakryj otwory.</li>
 <li>W przypadku wysokoprzepustowych przesiewów w tackach, użyj zmodyfikowanej igły z uszczelnioną końcówką i otworami bocznymi, przyklejonej do końcówki pipety 5-ml wraz z pipetorem (Rycina 3), aby wprowadzić J2 do gleby. Alternatywnie nicienie można wprowadzić zgodnie z krokiem 5.3.</li>
 <li>Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze 24-27°C przez sześć do ośmiu tygodni. Kontynuuj nawożenie dwa razy w miesiącu preparatem Miracle-Gro.</li>
 <li>W celu oceny infekcji ostrożnie wyjmij rośliny z doniczek i wymyj korzenie (zgodnie z opisem w kroku 3.3).</li>
 <li>Zabarw masy jaj na niebiesko, zanurzając korzenie w roztworze 1 mg/L erioglaucyny przez 15 min.</li>
 <li>Opłucz korzenie w wodzie i dokonaj oceny, licząc zabarwione masy jaj w poszczególnych systemach korzeniowych. Do wizualizacji mas jaj można użyć podświetlanej lupy biurkowej.</li>
 <li>Jeśli przesiewane rośliny są potrzebne do dalszych badań genetycznych, nie odcinaj nadziemnych części roślin przed myciem korzeni do oceny. Po zabarwieniu i zliczeniu mas jaj przesadź siewki do gleby organicznej, mocno przytnij pędy, aby zmniejszyć transpirację i utrzymuj je w szklarni.</li>
</ol>
6. Zakażanie korzeni rośliny wiązki w woreczkach i ocena zakażenia
<ol>
 <li>Policzyć inokulum nicieni i mieszać na magnetycznym mieszadle zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
 <li>Wyjąć woreczki z wiszących folderów i położyć na powierzchni poziomej. Każdy woreczek zaszczepić 1500 J2 w 5 ml. Podnieść plastikową pokrywę woreczka i równomiernie rozprowadzić nicienie na powierzchni korzeni.</li>
 <li>Przez 24 h po inokulacji przechowywać woreczki w pozycji poziomej, przykryte ciemnym papierem w celu odcięcia światła, a następnie umieścić je ponownie w wiszących folderach w komorze wzrostowej.</li>
 <li>Podlewać rośliny w razie potrzeby, raz lub dwa razy dziennie, połową stężenia roztworu Hoaglanda (Hoagland &amp; Arnon, 1950; Tabela 1) do czasu zaobserwowania reakcji na nawóz, zazwyczaj w postaci intensywniejszego zazielenienia liści i bardziej wigornego wzrostu pędów. Zazwyczaj rośliny podlewa się połową stężenia roztworu Hoaglanda przez 3 kolejne dni. Następnie utrzymywać wilgotność woreczków za pomocą wody.</li>
 <li>Około 30 dni (zakres 28-35 dni) po inokulacji nasączyć każdy woreczek około 10-20 ml erioglaucyny w stężeniu 75 mg/L. Pozostawić woreczki zalane barwnikiem w pozycji poziomej przez noc.</li>
 <li>Odsączyć woreczki i ocenić systemy korzeniowe, licząc masy jaj pod oświetloną lupą biurkową.</li>
 <li>Jeśli wyselekcjonowane rośliny są potrzebne do dalszych badań genetycznych lub prac hodowlanych, ostrożnie wyciągnąć korzenie z papieru, przesadzić do doniczek z glebą organiczną i utrzymywać w szklarni.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Odpowiednie stadia roślin pomidora i vinesy dla inokulacji nicieniami w dwóch opisanych systemach przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. Ponadto przykłady dobrze zainfekowanych korzeni pomidora i vinesy przedstawiono na Rysunkach 4 i 5. Jak w większości testów odporności na choroby, zaleca się użycie co najmniej 6–10 roślin na genotyp do inokulacji nicieniami w celu obliczenia średniego stopnia infekcji. Zmienność infekcji nicieniowej między roślinami tego samego genotypu można zmniejszyć, stosując jednolitą wielkość roślin oraz precyzyjną ilość i sposób podania inokulum.
Stosowanie tacek i woreczków do wzrostu umożliwia przesiewanie od setek do tysięcy roślin na niewielkiej powierzchni uprawnej. Woreczki do wzrostu pozwalają również na szybką i wydajną nieniszczącą ocenę infekcji nicieni korzennych bez konieczności mycia korzeni (Rycina 4).
<img alt="Wzrost korzeni rośliny, eksperyment hydroponiczny, siewka w przezroczystym plastikowym podłożu, badania edukacyjne." src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Dwutygodniowa roślina rośliny z grupy Vigna grown w woreczku, gotowa do inokulacji nicieniami korzeniowymi.
<img alt="Obserwacja wzrostu rośliny pomidora w plastikowej doniczce; badanie botaniczne nad rozwojem roślin." src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Trzytygodniowa roślina pomidora przygotowana do inokulacji nicieniami korzeniowymi.
<img alt="Sonda światłowodowa, układ spektroskopowy, pomiar optyczny, schemat analizy transmisji światła." src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zmodyfikowana igła i końcówka pipety używane do wysokoprzepustowego zaszczepiania nicieni. Dół igły został uszczelniony, a w jej korpusie za pomocą wiązki laserowej wywiercono trzy zestawy otworów. Następnie zmodyfikowaną igłę przyklejono do końcówki pipety o pojemności 5 ml.
<img alt="Symbioza guzków korzeniowych, wiązanie azotu, schemat; interakcja bakterii glebowych w roślinach strączkowych." src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. System korzeniowy pomidora zainfekowany nicieniami glebowymi (root-knot nematodes).
<img alt="Schemat budowy korzenia, przedstawiający symbiotyczne relacje rośliny z grzybnią zabarwioną na niebiesko." src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. System korzeniowy rośliny z gatunku cowpea z masami jaj zabarwionymi erioglaucyną 30 dni po inokulacji, hodowany w temperaturze 28 °C.

<ol><li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li>
<li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Circ%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li>
<li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.%2C+including+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li>
<li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li>
<li>Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatkin%2C+OA+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Manual%22">Calif. Agric. Exp. Stn. Manual</a>. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).</li>
<li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li>
<li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li>
<li>Perry, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+RN+%22Root-Knot+Nematodes%22">Root-Knot Nematodes</a>. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).</li>
<li>Starr, J. L., Cook, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStarr%2C+JL+%22Resistance+to+Parasitic+Nematodes%22">Resistance to Parasitic Nematodes</a>. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Istnieją dwa krytyczne kroki dla pomyślnego przesiewu nicieni: przygotowanie wysoce infekcyjnego inokulum oraz użycie roślin na odpowiednim etapie rozwojowym. Stopień wykluwania się jaj nicieni korzeniowych jest bardzo zmienny i mieści się w przedziale od 5% do 50%. Dlatego w celu uzyskania optymalnego poziomu wykluć i wysoko infekcyjnych J2, należy zwrócić szczególną uwagę na procedury ekstrakcji jaj i ich wykluwania. Jaja powinny być eksponowane na podchloryn sodu przez minimalny czas, a podchloryn należy dokładnie wypłukać z mieszaniny korzeniowej. Podczas wykluwania jaj zawiesina zawierająca jaja nie powinna być zanurzona w wodzie. Ponadto należy unikać przedostawania się jaj do znajdującej się poniżej szalki Petriego, w której zbierane są wyklute larwy. Jednym ze sposobów uniknięcia przedostania się jaj podczas procesu wykluwania jest niepolewanie wodą bezpośrednio chusteczki Kimwipe, ponieważ papier może się przerwać. Zamiast tego należy wlewać wodę bezpośrednio do szalki Petriego.
Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżo wyklutych stadiów J2. Jeśli wskaźnik wylęgu jest niski i wymagana jest większa ilość inokulum, stadia J2 można przechowywać w temperaturze 15°C przez dłuższy czas. Przed inokulacją należy ogrzać przechowywane inokulum do temperatury pokojowej, aby ożywić nicienie. Nie należy jednak przechowywać stadiów J2 przez zbyt długi czas, nawet w temperaturze 15°C, ponieważ głodne stadia J2 nie będą efektywnie infekować.
Młode siewki stanowią najlepszy etap rozwojowy dla inokulacji nicieniami glebowymi z rodzaju Root-knot. Należy jednak zrównoważyć to z wytworzeniem odpowiedniego systemu korzeniowego, który zapewni dostateczną liczbę wierzchołków korzeni jako punktów wniknięcia dla J2. Utrzymanie optymalnych warunków wzrostu roślin jest również kluczowe dla przeprowadzanych badań przesiewowych. Należy unikać nadmiernego podlewania roślin, szczególnie tych hodowanych w woreczkach. Nadmierne podlewanie woreczków, objawiające się stojącą wodą na ich dnie, może sprzyjać wzrostowi grzybów i pogorszyć stan zdrowotny korzeni.
Dzięki obu testom można przeprowadzić dalszą ocenę infekcji nicieni oraz obliczyć liczbę jaj na system korzeniowy oraz liczbę jaj na gram świeżego korzenia. W przypadku testów na pomidorach poszczególne korzenie są ważone, a jaja ekstrahowane zgodnie z opisem przygotowania inokulum (sekcja 3). Przy przetwarzaniu dużej liczby próbek roślinnych, poszczególne systemy korzeniowe można zmielić w blenderze w celu ekstrakcji jaj. Liczbę jaj należy policzyć w co najmniej trzech alikwotach, a następnie obliczyć liczbę jaj na gram świeżego systemu korzeniowego. W przypadku testów w saszetkach system korzeniowy jest oddzielany od papierowej wkładki, ważony, a następnie jaja są ekstrahowane.

przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Nematody galasowe (rodzaj Meloidogyne) są obligatoryjnymi pasożytami roślin. Są one niezwykle polifagiczne i uznawane za jedne z najważniejszych ekonomicznie nematod pasożytniczych roślin. Mikroskopijna larwa drugiego stadium (J2), która przeszła jedno linienie wewnątrz jaja, stanowi stadium infekcyjne. Larwy J2 wykluwają się z jaj, przemieszczają się swobodnie w glebie w warstwie wody i lokalizują wierzchołki korzeni odpowiednich gatunków roślin. Po wniknięciu do korzenia rośliny migrują w stronę cylindra naczyniowego, gdzie tworzą miejsce żerowania i rozpoczynają pobieranie pokarmu za pomocą stylletów. Wielokomórkowe miejsce żerowania składa się z kilku powiększonych komórek wielojądrowych, zwanych „komórkami olbrzymimi”, które powstają z komórek przechodzących kariokinezę (powtarzającą się mitozę) bez cytokinezy. Sąsiednie komórki perycyklu dzielą się i zwiększają swoją objętość, co prowadzi do powstania typowej gali lub narośli korzeniowej, będącej charakterystycznym objawem infekcji nematodami galasowymi. Po rozpoczęciu żerowania larwy J2 stają się osiadłe i przechodzą trzy kolejne linienia, aby osiągnąć stadium dorosłe. Dorosła samica składa 150-250 jaj w galaretowatej macierzy na powierzchni lub poniżej powierzchni korzenia. Z jaj wykluwają się nowe infekcyjne larwy J2 i rozpoczynają nowy cykl. Cykl życiowy nematody galasowej dopełnia się w ciągu 4-6 tygodni w temperaturze 26-28°C.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy tradycyjny protokół zakażania roślin uprawianych w doniczkach nicien korzeniakami oraz dwie metody służące do analiz wysokoprzepustowych. Pierwsza metoda wysokoprzepustowa jest stosowana w przypadku roślin o małych nasionach, takich jak pomidor, natomiast druga dotyczy roślin o dużych nasionach, takich jak vines i fasola zwyczajna. Duże nasiona umożliwiają przedłużony wzrost siewek przy minimalnej suplementacji składników odżywczych. Pierwsza analiza wysokoprzepustowa wykorzystuje siewki hodowane w piasku w tackach, natomiast w drugiej analizie rośliny są hodowane w woreczkach bez użycia gleby. Woreczek do wzrostu siewek wykonany jest z papierowego knota o wymiarach 15,5 x 12,5cm, złożonego u góry w celu utworzenia rynienki o głębokości 2 cm, w której umieszcza się nasiono lub siewkę. Papierowy knot znajduje się wewnątrz przezroczystego plastikowego woreczka. Takie woreczki umożliwiają bezpośrednią obserwację objawów infekcji nicieniowskiej, powstawania narośli korzeniowych oraz produkcji mas jaj pod powierzchnią przezroczystego opakowania. Obie metody pozwalają na wykorzystanie przesiewanych roślin po fenotypowaniu do krzyżowania lub produkcji nasion. Dodatkową zaletą stosowania woreczków do wzrostu jest niewielkie zapotrzebowanie na przestrzeń, ponieważ woreczki są przechowywane w plastikowych wiszących teczkach rozmieszczonych w regałach.

Opisano dwie odrębne metody przesiewania roślin pod kątem infekcji nicielami okrągłymi (nematodami) tworzącymi narośla korzeniowe. Opisane podejścia obejmują wysokoprzepustowe badania z użyciem nematod w sposób niedestrukcyjny, co ułatwia wykorzystanie tych roślin w programach hodowlanych.

Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Nematody okorzeniowe (rodzaj Meloidogyne) są obligatoryjnymi pasożytami roślin. Są one niezwykle polifagiczne i uznawane za jedne z najważniejszych pod względem ekonomicznym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przesiew roślin zainfekowanych przez nicienie korzeniowe. Najpierw należy wyhodować zdrowe siewki w glebie piaszczystej lub woreczkach do wzrostu. Następnie należy przygotować inokulum składające się z silnie zainfekowanych larw drugiego stadium nicieni korzeniowych.Następnie należy prawidłowo zaszczepić i zainfekować siewki. Na koniec oceniamy rozwój mas jaj nicieni w systemie korzeniowym rośliny żywiciela. Zaprezentujemy wysokoprzepustowy oraz niskoprzepustowy screening roślin z korzeniami, a nie samych nicieni.Głównymi zaletami systemu o wysokiej przepustowości są ograniczone wymagania przestrzenne dla wzrostu roślin oraz łatwość oceny infekcji. Podejścia te pozwalają na uzyskanie powtarzalnej i jednorodnej infekcji korzeni roślin przez nicienie, co przekłada się na lepszą ocenę statusu rośliny jako gospodarza. Zazwyczaj osoby rozpoczynające ocenę roślin pod kątem obecności nicieni korzeniowych mogą napotkać trudności, jeśli nie zastosują odpowiedniego stadium rozwojowego podczas infekowania korzeni nicieniami.Kolejną metodą jest wykorzystanie kilkudniowych młodzieży w stadium infekcyjnym, które zazwyczaj wykazują niską zakaźność. Procedura zostanie zaprezentowana przez studenta studiów podyplomowych i doktoranta. W moim laboratorium zaprezentuję procedurę przesiewową w torbach wzrostowych do testów doniczkowych. Posiej nasiona pomidora w pojedynczej doniczce wypełnionej glebą bogatą w materię organiczną, taką jak sunshine mix, utrzymując temperaturę w szklarni od 22 do 28 °C po wykiełkowaniu.Podlewaj raz w tygodniu nawozem Miracle-Gro. Około dwóch tygodni po kiełkowaniu, w fazie dwóch liści właściwych, przesadź poszczególne siewki do doniczek wypełnionych sterylną ziemią piaszczystą (90% piasku i 10% materii organicznej). Dodaj nawóz o spowolnionym uwalnianiu OsmoCoat i utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze od 22 do 28 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie. Kontynuuj nawożenie raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.W przypadku przesiewów wysokoprzepustowych nasiona roślin należy wysiać bezpośrednio do tacki z glebą piaszczystą. Przykryć folią spożywczą do czasu kiełkowania i pielęgnować zgodnie z wcześniejszym opisem. Po wykiełkowaniu dodać nawóz o spowolnionym uwalnianiu Osmo coats i nawozić raz w tygodniu preparatem Miracle Grow. Nasiona kiełkują w szalce Petri wyłożonej kilkoma warstwami papieru Kim White, w inkubatorze w temperaturze od 25 do 28 °C, a następnie siewki należy przenieść do oddzielnych woreczków.Alternatywnie nasiona można umieścić w papierowej bruzdzie, aby wykiełkowały bezpośrednio w oddzielnych woreczkach. Woreczki należy umieścić w plastikowych wiszących teczkach, a następnie ułożyć teczki na stojaku w pozycji pionowej.Umieść statyw w komorze klimatycznej z utrzymaną temperaturą od 25 do 28 °C oraz 16-godzinnym cyklem oświetlenia. Przy 8-godzinnym cyklu ciemności podlewaj woreczki raz lub dwa razy dziennie wodą w sposób odwrócony osmotycznie około 10 do 14 dni po wysianiu. Gdy rozwinie się odpowiedni system korzeniowy z wierzchołkami korzeni trzeciorzędowych, siewki są gotowe do inokulacji. Przed rozpoczęciem ekstrakcji jaj dokładnie umyj obszar roboczy oraz wszystkie narzędzia gorącą wodą, aby uniknąć kontaminacji.Umieść wiadro w zlewie w celu zbierania przepłukanych roztworem próbek i ustaw nad nim wspornik z drucianej siatki. Ułóż trzy sita jedno na drugim, od góry do dołu, w kolejności malejącej wielkości oczek, tak aby jaja zostały zebrane na sicie o rozmiarze 25 micron.Wyjmij roślinę z doniczki i umyj korzenie, zanurzając je w plastikowym wiadrze wypełnionym wodą. Płucz korzenie dalej pod bieżącą wodą, aż do usunięcia wszystkich cząstek gleby. Następnie wyizoluj jaja nicieni korzeniowych z zainfekowanych korzeni pomidora.Najpierw należy pociąć korzenie na małe kawałki za pomocą nożyczek, usuwając korzeń palowy. Posiekane korzenie z jednej rośliny należy umieścić w dużym plastikowym słoiku z pokrywką i dodać tyle 10% roztworu wybielacza, aby całkowicie przykrył korzenie. Następnie należy zamknąć pokrywkę i wstrząsać słoikiem przez dwie minuty.Otwórz słoik, wysyp korzenie na górne sito i płucz za pomocą węża z końcówką rozpylającą. Płucz dokładnie, aż całkowicie ustąpi zapach wybielacza. Użyj młotka, aby opukać boki sit i zapobiec ich zapychaniu.Zatrzymaj proces, wyjmij górne sito i opłucz z niego zanieczyszczenia. Zrób to samo z drugim sitem. Wyjmij drugie sito i zbierz drobne zanieczyszczenia, w tym jaja z poprzedniego sita, używając łagodnego strumienia wody z butelki.Przesunąć zanieczyszczenia na jedną stronę sita. Zebrać zanieczyszczenia i jaja do czystego zlewka z minimalną ilością wody. Przefiltrować wodę zebraną w wiadrze przez sito o oczkach 25 micron, aby zebrać ewentualne jaja, które mogły zostać pominięte.Dokładnie wypłukać wodą i zebrać do tego samego zlewki. Wyłożyć czysty metalowy koszyczek kilkoma warstwami ręcznika papierowego KimWipe i umieścić go na szklanej płytce Petriego, zachowując jeden centymetr odstępu między dnem koszyczka a płytką.Przelej wyekstrahowane jaja nicieni na papier w drucianym koszyku. Dolej odpowiednią ilość cieczy tak, aby dno drucianego koszyka stykało się z powierzchnią wody, ale nie było w niej zanurzone.Codziennie przykrywaj górę plastikową pokrywką. Sprawdzaj stopień odparowania wody i dolewaj wodę do szalki Petriego tak, aby dno koszyka stykało się z wodą. Aby zapobiec wysychaniu jaj, co drugi dzień przez okres od sześciu do ośmiu dni zbieraj wodę zawierającą młodociane drugiego stadium (J2) ze szalki Petriego do zlewki.Jeśli nie są one wykorzystywane od razu, należy natychmiast napowietrzyć zebrane szczepionki w temperaturze pokojowej, korzystając z laboratoryjnego zasilania powietrzem lub pompy akwariowej. Kolejny krok rozpocznij od mieszania szczepionki na mieszadle magnetycznym przy niskiej prędkości. Wykorzystaj trzy alikwoty zebranych nicieni.Aby obliczyć liczbę J twos w księgowaniu. Preparat lub naczynie, oblicz średnią i określ pożądaną objętość dla inokulacji. Są to J twos widziane pod mikroskopem.Zazwyczaj w przypadku roślin w doniczkach stosuje się 3000 J twos na roślinę, a dla roślin hodowanych w tackach siewnych 500 J twos. Przed inokulacją roślin należy upewnić się, że gleba jest wilgotna, ale nie zbyt mokra. W celu inokulacji w doniczkach należy wykonać trzy otwory o głębokości około połowy wysokości doniczki w piasku wokół każdego systemu korzeniowego pomidora.Za pomocą ołówka wykonaj inokulację każdej rośliny, wprowadzając J twos do trzech otworów przy użyciu pipety. Następnie zakryj otwory dla wysokoprzepustowych przesiewów w tackach. Użyj zmodyfikowanej igły z uszczelnioną końcówką i otworami bocznymi, przyklejonej do pipety o pojemności 5 ml.Użyj pipety, aby wprowadzić J twos do gleby. Przechowuj rośliny w szklarni w temperaturze od 24 do 27 °C przez okres od sześciu do ośmiu tygodni. Kontynuuj nawożenie dwa razy w miesiącu preparatem Miracle-Gro.W celu oceny stopnia zakażenia należy odciąć nadziemne części roślin, ostrożnie wyjąć rośliny z doniczek i wypłukać korzenie. Następnie należy zabarwić masy jaj na niebiesko, zanurzając korzenie w roztworze o stężeniu 1 mg/L.Przez 15 minut przeprowadzać barwienie Aerio. Przepłukać korzenie w wodzie i ocenić, licząc zabarwione masy jaj na poszczególnych systemach korzeniowych. Aby ułatwić wizualizację mas jaj oraz liczenie nicieni, można użyć podświetlonego powiększacza, a inokulum mieszać na mieszalniku magnetycznym, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.Wyjmij woreczki z zawieszek i połóż je na powierzchni poziomej. Zaszczep każdy woreczek 1 500 osobnikami J2 w pięciu mililitrach. Podnieś plastikową pokrywę woreczka i równomiernie rozprowadź nicienie po powierzchni korzeni.Przechowywać woreczki w pozycji poziomej przez 24 godziny po inokulacji, przykryte ciemnym papierem w celu wykluczenia światła. Następnie umieścić woreczki z powrotem w wiszących folderach w wodzie w komorze wzrostu. Rośliny należy podlewać raz lub dwa razy dziennie przez około trzy dni pożywką Hoaglanda o połowie standardowego stężenia, aż do momentu zaobserwowania odpowiedzi na nawóz.Zazwyczaj obserwuje się intensywniejsze zazielenienie liści i bardziej wigorystyczny wzrost pędów. Po trzech dniach należy utrzymywać woreczki w stanie wilgotnym, podlewając je wodą. Około 30 dni po inokulacji każdy woreczek należy nasycić około 10 do 20 mililitrów roztworu o stężeniu 75 miligramów liter.Prześwietlanie powietrzne. Pozostaw woreczki wypełnione barwnikiem w pozycji poziomej przez całą noc. Następnego dnia opróżnij woreczki i oceń systemy korzeniowe, licząc masy jaj pod podświetlanym blatem.Na powiększeniu widoczne są korzenie silnie zainfekowanej rośliny pomidora z rozprzestrzenionymi masami jaj zabarwionymi na niebiesko. Zastosowanie tacek umożliwia przesiewanie setek roślin na małej powierzchni wzrostu. Worki do wzrostu pozwalają również na szybką i wydajną niedestrukcyjną ocenę infekcji korzeni przez nicienie, bez konieczności mycia korzeni.Metoda ta umożliwia również wysokoprzepustowe przesiewanie tysięcy roślin na niewielkiej powierzchni uprawnej. Przedstawiony tutaj system korzeniowy rośliny cow P, wyhodowanej w torebce, wykazuje niebiesko zabarwione masy jaj po inokulacji. Moment przeprowadzenia infekcji jest krytyczny w przypadku testów roślinnych z wykorzystaniem nicieni.Opóźnienie infekcji nawet o kilka dni może skutkować bardzo niskim poziomem zarażenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć teraz dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić infekcję oraz oceniać rośliny zainfekowane nicieniami korzeniami smugowymi. Proszę pamiętać, że korzenie zainfekowane nicieniami wymagają odpowiedniego obchodzenia.Autoklawowanie korzeni przed ich utylizacją ograniczy rozprzestrzenianie się nicieni. Należy również zachować ostrożność przy stosowaniu glifosatu w formie oprysku, ponieważ wysokie dawki tej substancji mają działanie rakotwórcze.W związku z tym należy używać rękawiczek podczas pracy z korzeniami zainfekowanymi tym odczynnikiem, a także podczas jego przygotowywania.

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wysoki i niski przepływ ekranów z nicieniami z rodzaju Meloidogyne spp.

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

W tym filmie demonstrujemy test przesiewowy w celu określenia skuteczności małocząsteczkowych nematocydów przeciwko nicieniom. Nematocydy uważa się za skuteczne, jeśli powodują zmniejszenie liczby ruchomych nicieni w próbce po ekspozycji.

Test przesiewowy nematocydów drobnocząsteczkowych: metoda o średniej przepustowości do badania przesiewowego potencjalnych nematocydów przeciwko Ditylenchus dipsaci

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Tutaj przedstawiono protokół szybkiego, nieniszczącego badania przesiewowego genotypów bawełny pod kątem odporności na nicienie reniform. Protokół obejmuje wizualne badanie korzeni sadzonek bawełny zakażonych nicieniami w celu określenia odpowiedzi na infekcję. Pęd wegetatywny z każdej rośliny jest następnie rozmnażany w celu odzyskania roślin do produkcji nasion.

Badania przesiewowe genotypów bawełny pod kątem odporności na nicienie Reniform

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Obecny protokół opisuje niezawodną i prostą metodę hodowli, zbierania i badania przesiewowego Ditylenchus dipsaci.

Hodowla i badania przesiewowe pasożytniczego nicienia Ditylenchus dipsaci

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Poznaj metody przesiewowe wysokiej i niskiej przepustowości do oceny roślin zakażonych nicieniami węzłów korzeniowych Meloidogyne spp. Techniki te umożliwiają reprodukcyjną i jednorodną infekcję korzeni, wspierając programy hodowlane odpornych odmian.

Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Przeglądaj więcej filmów