Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przesiew roślin zainfekowanych przez nicienie korzeniowe. Najpierw należy wyhodować zdrowe siewki w glebie piaszczystej lub woreczkach do wzrostu. Następnie należy przygotować inokulum składające się z silnie zainfekowanych larw drugiego stadium nicieni korzeniowych.

Następnie należy prawidłowo zaszczepić i zainfekować siewki. Na koniec oceniamy rozwój mas jaj nicieni w systemie korzeniowym rośliny żywiciela. Zaprezentujemy wysokoprzepustowy oraz niskoprzepustowy screening roślin z korzeniami, a nie samych nicieni.

Głównymi zaletami systemu o wysokiej przepustowości są ograniczone wymagania przestrzenne dla wzrostu roślin oraz łatwość oceny infekcji. Podejścia te pozwalają na uzyskanie powtarzalnej i jednorodnej infekcji korzeni roślin przez nicienie, co przekłada się na lepszą ocenę statusu rośliny jako gospodarza. Zazwyczaj osoby rozpoczynające ocenę roślin pod kątem obecności nicieni korzeniowych mogą napotkać trudności, jeśli nie zastosują odpowiedniego stadium rozwojowego podczas infekowania korzeni nicieniami.

Kolejną metodą jest wykorzystanie kilkudniowych młodzieży w stadium infekcyjnym, które zazwyczaj wykazują niską zakaźność. Procedura zostanie zaprezentowana przez studenta studiów podyplomowych i doktoranta. W moim laboratorium zaprezentuję procedurę przesiewową w torbach wzrostowych do testów doniczkowych. Posiej nasiona pomidora w pojedynczej doniczce wypełnionej glebą bogatą w materię organiczną, taką jak sunshine mix, utrzymując temperaturę w szklarni od 22 do 28 °C po wykiełkowaniu.

Podlewaj raz w tygodniu nawozem Miracle-Gro. Około dwóch tygodni po kiełkowaniu, w fazie dwóch liści właściwych, przesadź poszczególne siewki do doniczek wypełnionych sterylną ziemią piaszczystą (90% piasku i 10% materii organicznej). Dodaj nawóz o spowolnionym uwalnianiu OsmoCoat i utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze od 22 do 28 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie. Kontynuuj nawożenie raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.

W przypadku przesiewów wysokoprzepustowych nasiona roślin należy wysiać bezpośrednio do tacki z glebą piaszczystą. Przykryć folią spożywczą do czasu kiełkowania i pielęgnować zgodnie z wcześniejszym opisem. Po wykiełkowaniu dodać nawóz o spowolnionym uwalnianiu Osmo coats i nawozić raz w tygodniu preparatem Miracle Grow. Nasiona kiełkują w szalce Petri wyłożonej kilkoma warstwami papieru Kim White, w inkubatorze w temperaturze od 25 do 28 °C, a następnie siewki należy przenieść do oddzielnych woreczków.

Alternatywnie nasiona można umieścić w papierowej bruzdzie, aby wykiełkowały bezpośrednio w oddzielnych woreczkach. Woreczki należy umieścić w plastikowych wiszących teczkach, a następnie ułożyć teczki na stojaku w pozycji pionowej.

Umieść statyw w komorze klimatycznej z utrzymaną temperaturą od 25 do 28 °C oraz 16-godzinnym cyklem oświetlenia. Przy 8-godzinnym cyklu ciemności podlewaj woreczki raz lub dwa razy dziennie wodą w sposób odwrócony osmotycznie około 10 do 14 dni po wysianiu. Gdy rozwinie się odpowiedni system korzeniowy z wierzchołkami korzeni trzeciorzędowych, siewki są gotowe do inokulacji. Przed rozpoczęciem ekstrakcji jaj dokładnie umyj obszar roboczy oraz wszystkie narzędzia gorącą wodą, aby uniknąć kontaminacji.

Umieść wiadro w zlewie w celu zbierania przepłukanych roztworem próbek i ustaw nad nim wspornik z drucianej siatki. Ułóż trzy sita jedno na drugim, od góry do dołu, w kolejności malejącej wielkości oczek, tak aby jaja zostały zebrane na sicie o rozmiarze 25 micron.

Wyjmij roślinę z doniczki i umyj korzenie, zanurzając je w plastikowym wiadrze wypełnionym wodą. Płucz korzenie dalej pod bieżącą wodą, aż do usunięcia wszystkich cząstek gleby. Następnie wyizoluj jaja nicieni korzeniowych z zainfekowanych korzeni pomidora.

Najpierw należy pociąć korzenie na małe kawałki za pomocą nożyczek, usuwając korzeń palowy. Posiekane korzenie z jednej rośliny należy umieścić w dużym plastikowym słoiku z pokrywką i dodać tyle 10% roztworu wybielacza, aby całkowicie przykrył korzenie. Następnie należy zamknąć pokrywkę i wstrząsać słoikiem przez dwie minuty.

Otwórz słoik, wysyp korzenie na górne sito i płucz za pomocą węża z końcówką rozpylającą. Płucz dokładnie, aż całkowicie ustąpi zapach wybielacza. Użyj młotka, aby opukać boki sit i zapobiec ich zapychaniu.

Zatrzymaj proces, wyjmij górne sito i opłucz z niego zanieczyszczenia. Zrób to samo z drugim sitem. Wyjmij drugie sito i zbierz drobne zanieczyszczenia, w tym jaja z poprzedniego sita, używając łagodnego strumienia wody z butelki.

Przesunąć zanieczyszczenia na jedną stronę sita. Zebrać zanieczyszczenia i jaja do czystego zlewka z minimalną ilością wody. Przefiltrować wodę zebraną w wiadrze przez sito o oczkach 25 micron, aby zebrać ewentualne jaja, które mogły zostać pominięte.

Dokładnie wypłukać wodą i zebrać do tego samego zlewki. Wyłożyć czysty metalowy koszyczek kilkoma warstwami ręcznika papierowego KimWipe i umieścić go na szklanej płytce Petriego, zachowując jeden centymetr odstępu między dnem koszyczka a płytką.

Przelej wyekstrahowane jaja nicieni na papier w drucianym koszyku. Dolej odpowiednią ilość cieczy tak, aby dno drucianego koszyka stykało się z powierzchnią wody, ale nie było w niej zanurzone.

Codziennie przykrywaj górę plastikową pokrywką. Sprawdzaj stopień odparowania wody i dolewaj wodę do szalki Petriego tak, aby dno koszyka stykało się z wodą. Aby zapobiec wysychaniu jaj, co drugi dzień przez okres od sześciu do ośmiu dni zbieraj wodę zawierającą młodociane drugiego stadium (J2) ze szalki Petriego do zlewki.

Jeśli nie są one wykorzystywane od razu, należy natychmiast napowietrzyć zebrane szczepionki w temperaturze pokojowej, korzystając z laboratoryjnego zasilania powietrzem lub pompy akwariowej. Kolejny krok rozpocznij od mieszania szczepionki na mieszadle magnetycznym przy niskiej prędkości. Wykorzystaj trzy alikwoty zebranych nicieni.

Aby obliczyć liczbę J twos w księgowaniu. Preparat lub naczynie, oblicz średnią i określ pożądaną objętość dla inokulacji. Są to J twos widziane pod mikroskopem.

Zazwyczaj w przypadku roślin w doniczkach stosuje się 3000 J twos na roślinę, a dla roślin hodowanych w tackach siewnych 500 J twos. Przed inokulacją roślin należy upewnić się, że gleba jest wilgotna, ale nie zbyt mokra. W celu inokulacji w doniczkach należy wykonać trzy otwory o głębokości około połowy wysokości doniczki w piasku wokół każdego systemu korzeniowego pomidora.

Za pomocą ołówka wykonaj inokulację każdej rośliny, wprowadzając J twos do trzech otworów przy użyciu pipety. Następnie zakryj otwory dla wysokoprzepustowych przesiewów w tackach. Użyj zmodyfikowanej igły z uszczelnioną końcówką i otworami bocznymi, przyklejonej do pipety o pojemności 5 ml.

Użyj pipety, aby wprowadzić J twos do gleby. Przechowuj rośliny w szklarni w temperaturze od 24 do 27 °C przez okres od sześciu do ośmiu tygodni. Kontynuuj nawożenie dwa razy w miesiącu preparatem Miracle-Gro.

W celu oceny stopnia zakażenia należy odciąć nadziemne części roślin, ostrożnie wyjąć rośliny z doniczek i wypłukać korzenie. Następnie należy zabarwić masy jaj na niebiesko, zanurzając korzenie w roztworze o stężeniu 1 mg/L.

Przez 15 minut przeprowadzać barwienie Aerio. Przepłukać korzenie w wodzie i ocenić, licząc zabarwione masy jaj na poszczególnych systemach korzeniowych. Aby ułatwić wizualizację mas jaj oraz liczenie nicieni, można użyć podświetlonego powiększacza, a inokulum mieszać na mieszalniku magnetycznym, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.

Wyjmij woreczki z zawieszek i połóż je na powierzchni poziomej. Zaszczep każdy woreczek 1 500 osobnikami J2 w pięciu mililitrach. Podnieś plastikową pokrywę woreczka i równomiernie rozprowadź nicienie po powierzchni korzeni.

Przechowywać woreczki w pozycji poziomej przez 24 godziny po inokulacji, przykryte ciemnym papierem w celu wykluczenia światła. Następnie umieścić woreczki z powrotem w wiszących folderach w wodzie w komorze wzrostu. Rośliny należy podlewać raz lub dwa razy dziennie przez około trzy dni pożywką Hoaglanda o połowie standardowego stężenia, aż do momentu zaobserwowania odpowiedzi na nawóz.

Zazwyczaj obserwuje się intensywniejsze zazielenienie liści i bardziej wigorystyczny wzrost pędów. Po trzech dniach należy utrzymywać woreczki w stanie wilgotnym, podlewając je wodą. Około 30 dni po inokulacji każdy woreczek należy nasycić około 10 do 20 mililitrów roztworu o stężeniu 75 miligramów liter.

Prześwietlanie powietrzne. Pozostaw woreczki wypełnione barwnikiem w pozycji poziomej przez całą noc. Następnego dnia opróżnij woreczki i oceń systemy korzeniowe, licząc masy jaj pod podświetlanym blatem.

Na powiększeniu widoczne są korzenie silnie zainfekowanej rośliny pomidora z rozprzestrzenionymi masami jaj zabarwionymi na niebiesko. Zastosowanie tacek umożliwia przesiewanie setek roślin na małej powierzchni wzrostu. Worki do wzrostu pozwalają również na szybką i wydajną niedestrukcyjną ocenę infekcji korzeni przez nicienie, bez konieczności mycia korzeni.

Metoda ta umożliwia również wysokoprzepustowe przesiewanie tysięcy roślin na niewielkiej powierzchni uprawnej. Przedstawiony tutaj system korzeniowy rośliny cow P, wyhodowanej w torebce, wykazuje niebiesko zabarwione masy jaj po inokulacji. Moment przeprowadzenia infekcji jest krytyczny w przypadku testów roślinnych z wykorzystaniem nicieni.

Opóźnienie infekcji nawet o kilka dni może skutkować bardzo niskim poziomem zarażenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć teraz dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić infekcję oraz oceniać rośliny zainfekowane nicieniami korzeniami smugowymi. Proszę pamiętać, że korzenie zainfekowane nicieniami wymagają odpowiedniego obchodzenia.

Autoklawowanie korzeni przed ich utylizacją ograniczy rozprzestrzenianie się nicieni. Należy również zachować ostrożność przy stosowaniu glifosatu w formie oprysku, ponieważ wysokie dawki tej substancji mają działanie rakotwórcze.

W związku z tym należy używać rękawiczek podczas pracy z korzeniami zainfekowanymi tym odczynnikiem, a także podczas jego przygotowywania.