Analiza morfologii dendrytycznej komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych

Ogólnym celem tej procedury jest analiza rozwoju drzewa dendrytycznego komórek burkini w różnych warunkach eksperymentalnych. Osiąga się to poprzez uprzednie założenie organtypowych kultur plasterkowych móżdżku myszy po urodzeniu. Następnie uprawiaj kultury plastrów w różnych warunkach eksperymentalnych.

Na przykład, przetestuj działanie agonistów MGL R, a następnie utrwal kultury i ujawnij morfologię poszczególnych komórek bikini, drzew dendrytycznych za pomocą barwienia immunologicznego anty Calbindin. Ostatnim krokiem jest analiza drzew dendrytycznych komórek Perkina. Wyhodowane w warunkach kontrolnych lub eksperymentalnych ostatecznie wynikają z mikroskopii fluorescencyjnej komórek Perkina barwienia immunologicznego, a ilościowa ocena wielkości i rozgałęzień ich drzewa dendrytycznego pokazuje, że aktywacja receptora neuroprzekaźnika, w szczególności MGL R one, głęboko wpływa na rozwój drzewa dendrytycznego per kinji cell.

Główną zaletą tej techniki jest to, że prawie całkowity wyrostek praw końcowych komórek Perkin następuje w okresie hodowli, a zatem bardzo złożone zagadnienie, takie jak rozwój drzewa dendrytycznego, można badać w warunkach in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii rozwojowej, takie jak to, w jaki sposób aktywność wpływa na wzrost i rozwój procesów neuronalnych. Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparuj móżdżek z mózgu szczeniaka myszy PA w lodowatym podłożu pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie pokrój móżdżek na plastry o grubości 350 mikronów w orientacji strzałkowej za pomocą rozdrabniacza tkanek McIlwaina. Po oddzieleniu plastrów umieść je na wkładkach do hodowli komórek miliporowych po około sześciu plasterkach na wkładkę. Następnie inkubuj je na sześciu płytkach dołkowych wypełnionych 0,75 mililitra pożywki inkubacyjnej na studzienkę w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Leczenie farmakologiczne należy rozpocząć w trzecim dniu in vitro, dodając PMA lub DHPG w pożądanym stężeniu do pożywki hodowlanej. Leki należy odnawiać wraz ze zmianą pożywki hodowlanej co drugi lub trzeci dzień. Dla fiksacji kultury.

Najpierw usuń pożywkę hodowlaną, a następnie ostrożnie dodaj trzy mililitry aldehydu paraform do każdej studzienki zawierającej plastry móżdżku przyczepione do błony milikomórki. Wstawiać. Po nocnym utrwaleniu posiewów usuń utrwalacz. Następnie przepłukać kultury buforem fosforanowym.

Następnie dodaj do kultury królik przeciw krowom, rozcieńczony w roztworze blokującym. Rozcieńczyć króliczą anty kalbindynę w ilości od jednego do 1000 w celu selektywnej wizualizacji komórek kinji i monoklonalną anty nową N w temperaturze od jednego do 500. Do selektywnej wizualizacji komórek ziarnistych w roztworze blokującym.

Inkubuj z nim kultury przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod agitacją zabijania. Następnego dnia trzykrotnie przepłukać kultury 0,1-molowym buforem fosforanowym, rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe. Koza anty królik, Alexa 5 68 i koza anty mysz Alexa 4 88 w jednym do 500 w 0,1 molowym buforze fosforanowym plus 0,1% Triton X 100.

Inkubuj z nim kultury przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym wypłukaniu kultur w buforze fosforanowym, dobrze usuń plastry plamy z kultury za pomocą pędzla i zamontuj je na szkiełkach super frosts plus glass. Szkiełka nakrywkowe umieścić za pomocą odpowiedniego medium montażowego.

Następnie obejrzyj hodowle pod zwykłym mikroskopem ze sprzętem do fluorescencji epi lub pod mikroskopem konfokalnym z fluorescencyjnym znakowaniem komórek bikini. Wielkość drzewa dendrytycznego danej komórki można łatwo zmierzyć, jeśli drzewo nie nakłada się na inne komórki. Po zidentyfikowaniu komórki bikini z nienakładającym się na siebie drzewem dendrytycznym, ogląda się ją za pomocą soczewki 20x.

Obraz jest rejestrowany za pomocą aparatu cyfrowego, a następnie analizowany za pomocą programu do analizy obrazu. W naszym laboratorium używany jest obraz Pro plus. Umożliwia obrysowanie drzewa dendrytycznego komórki za pomocą jednego kliknięcia myszką.

Za pomocą narzędzia magicznej różdżki w trybie pomiaru, program następnie oblicza obszar pokryty drzewem dendrytycznym i eksportuje go do Ms.Xl.Następnie analiza statystyczna danych jest wykonywana za pomocą oprogramowania GraphPad Prism dla liczby punktów rozgałęzień. Ze względu na silnie rozgałęzioną i drobną morfologię drzewa ENDR komórek kinji, należy je liczyć ręcznie. Plik obrazu 20 x komórek kinji jest powiększany tak, aby pokrywał większość ekranu za pomocą programu Adobe Photoshop.

Następnie każdy punkt rozgałęzienia jest zliczany i oznaczany czerwoną kropką. Zidentyfikowane komórki bikini były wielokrotnie fotografowane w celu monitorowania wzrostu drzewa dendrytycznego. Od działu drugiego do siódmego nastąpił ciągły wzrost rozgałęzień dendrytów.

Od działki czwartej do jedenastej drzewo dendrytyczne znacznie się rozrosło. Pokazano. Oto przykłady zahamowania rozwoju drzewa dendrytycznego komórek bikini przez p KC lub mgl R jeden, stymulacja A i D pokazuje nieleczone komórki kontrolne z dobrze rozwiniętym drzewem dendrytycznym. Po dziewięciu dniach leczenia PMA dendri wydają się pogrubione, a drzewo dendrytyczne jest znacznie zmniejszone, jak pokazano w BNE.

Z drugiej strony. CNF pokazują, że po dziewięciu dniach leczenia DHPG to drzewo dendrytyczne znacznie zmniejszyło swoje rozmiary. W przeciwieństwie do leczenia PMA, wiele bardzo cienkich i krótkich gałęzi bocznych było obecnych na dendrytach pierwotnych i wtórnych.

Pomiary ilościowe pokazują, że zarówno rozmiar drzewa dendrytycznego na górnym wykresie słupkowym, jak i liczba punktów rozgałęzień na dolnym wykresie słupkowym zostały znacznie zmniejszone po leczeniu PMA lub DHPG różnice między kontrolowanymi drzewami dendrytycznymi a drzewami dendrytycznymi komórek bikini z kultur poddanych działaniu środka były znaczące. Po tej procedurze można wykonać dodatkowe metody, takie jak elektrofizjologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalne implikacje zmienionej morfologii drzewa dendrytycznego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować organotypowe kultury warstw móżdżku oraz jak analizować komórki kinia i mitologię.