Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza rozwoju drzewa dendrytycznego komórek burkini w różnych warunkach eksperymentalnych. Realizuje się to poprzez wstępne przygotowanie organotypowych kultur plastrów móżdżku myszy postnatalnej, a następnie hodowlę tych plastrów w różnych warunkach eksperymentalnych.

Na przykład, należy przetestować efekt agonistów MGL R one, a następnie utrwalić hodowle i uwidocznić morfologię poszczególnych komórek Purkinjego oraz ich drzew dendrytycznych za pomocą immunobarwienia przeciwciałami anty-Calbindin. Końcowym etapem jest analiza drzew dendrytycznych komórek Purkinjego wyhodowanych w warunkach kontrolnych lub eksperymentalnych, co ostatecznie wynika z mikroskopii fluorescencyjnej immunobarwionych komórek Purkinjego. Ilościowa ocena wielkości i rozgałęzień ich drzew dendrytycznych wykazuje, że aktywacja receptora neuroprzekaźnika, w szczególności MGL R one, głęboko wpływa na rozwój drzew dendrytycznych komórek Purkinjego.

Główną zaletą tej techniki jest fakt, że podczas okresu hodowli dochodzi do niemal całkowitego wzrostu wypustek komórek Purkinjego, co pozwala na badanie w warunkach in vitro tak złożonych zagadnień, jak rozwój drzewa dendrytycznego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, na przykład dotyczące wpływu aktywności na wzrost i rozwój wypustek neuronalnych. Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparuj móżdżek z mózgu szczenięcia myszy PA w lodowatym medium preparacyjnym pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie, używając siekarki do tkanek McIlwain, należy pociąć móżdżek na plastry o grubości 350 micron w orientacji strzałkowej. Po rozdzieleniu plastrów, należy umieścić je na wkładkach do hodowli komórkowych Millipore, układając około sześciu plastrów na jednej wkładce. Następnie należy inkubować je w płytkach sześciodołkowych, uprzednio wypełnionych 0,75 milliliters medium inkubacyjnego na dołek, w atmosferze uwilgotnionej z dodatkiem 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius.

Rozpocząć leczenie farmakologiczne w trzecim dniu in vitro, dodając PMA lub DHPG w odpowiednim stężeniu do pożywki hodowlanej. Odnawiać leki wraz ze zmianą pożywki hodowlanej co drugi lub trzeci dzień. W celu utrwalenia hodowli.

Najpierw należy usunąć pożywkę hodowlaną, a następnie ostrożnie dodać trzy mililitry paraformaldehydu do każdego dołka zawierającego skrawki móżdżku przytwierdzone do membrany Millicell Insert. Po całonocnej fiksacji kultur należy usunąć utrwalacz. Następnie kultury należy wypłukać buforem fosforanowym.

Następnie do hodowli należy dodać przeciwciało królicze przeciwko kalbindynie, rozcieńczone w roztworze blokującym. Przeciwciało królicze przeciwko kalbindynie należy rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w celu selektywnej wizualizacji komórek Purkinjego, a monoklonalne przeciwciało przeciwko NeuN w stosunku 1:500 w celu selektywnej wizualizacji komórek ziarnistych w roztworze blokującym.

Inkubować hodowle z tymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C przy słabym mieszaniu. Następnego dnia przemyć hodowle trzykrotnie buforem fosforanowym 0,1 M, a następnie rozcieńczyć przeciwciała wtórne: kozie przeciwko króliczym Alexa 568 oraz kozie przeciwko mysim Alexa 488 w stosunku 1:500 w buforze fosforanowym 0,1 M z dodatkiem 0,1% Triton X 100.

Inkubować hodowle z barwnikiem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przepłukaniu hodowli buforem fosforanowym, wyjąć plasterki tkanek z dołka hodowlanego za pomocą pędzla i nanieść je na szkiełka SuperFrost Plus. Przykryć szkiełka dewizorkami, stosując odpowiednie medium montażowe.

Następnie należy obejrzeć hodowle pod zwykłym mikroskopem z wyposażeniem do epi-fluorescencji lub pod mikroskopem konfokalnym z fluorescencyjnym znakowaniem komórek bikini. Wielkość drzewa dendrytycznego danej komórki można łatwo zmierzyć, jeśli drzewo to nie nakłada się na inne komórki. Po zidentyfikowaniu komórki bikini z nienakładającym się drzewem dendrytycznym, należy ją obejrzeć przy użyciu obiektywu 20 x.

Obraz jest rejestrowany za pomocą kamery cyfrowej, a następnie analizowany w programie do analizy obrazu. W naszym laboratorium wykorzystuje się program Image Pro plus. Pozwala on na obrysowanie drzewa dendrytycznego komórki za pomocą jednego kliknięcia myszą.

Używając narzędzia magiczna różdżka w trybie pomiaru, program oblicza następnie powierzchnię zajmowaną przez drzewo dendrytyczne i eksportuje ją do programu Ms.Xl. Następnie, przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism, przeprowadzana jest analiza statystyczna danych dotyczących liczby punktów rozgałęzień. Ze względu na silnie rozgałęzioną i drobną morfologię drzewa ENDR komórek kinji, muszą być one liczone ręcznie. Plik obrazu komórek kinji w powiększeniu 20x jest powiększony w programie Adobe Photoshop tak, aby zajmował większość ekranu.

Następnie każdy punkt rozgałęzienia zostaje policzony i zaznaczony czerwoną kropką. Zidentyfikowane komórki typu bikini były fotografowane wielokrotnie w celu monitorowania wzrostu drzewa dendrytycznego. Od drugiego do siódmego podziału (div) obserwowano ciągły wzrost rozgałęzień dendrytów.

Od 4. do 11. dnia hodowli (div) drzewo dendrytyczne uległo znacznemu rozrostowi. Pokazano to tutaj. Przedstawiono przykłady hamowania rozwoju drzewa dendrytycznego komórek bikini przez pKC lub mglR1. Stymulacja A i D pokazuje nieleczone komórki kontrolne z dobrze rozwiniętym drzewem dendrytycznym. Po dziewięciu dniach traktowania PMA dendryty wydają się pogrubione, a rozmiar drzewa dendrytycznego jest silnie zredukowany, co pokazano w BNE.

Z drugiej strony, CNF wykazały, że po dziewięciu dniach traktowania DHPG drzewo dendrytyczne uległo znacznemu zmniejszeniu. W przeciwieństwie do traktowania PMA, na dendrytach pierwotnych i wtórnych obecnych było wiele bardzo cienkich i krótkich odgałęzień bocznych.

Pomiary ilościowe przedstawione tutaj pokazują, że zarówno rozmiar drzewa dendrytycznego na górnym wykresie słupkowym, jak i liczba punktów rozgałęzień na dolnym wykresie słupkowym uległy znacznemu zmniejszeniu po traktowaniu PMA lub DHPG; różnice między kontrolnymi drzewami dendrytycznymi a drzewami dendrytycznymi komórek Purkinje z kultur traktowanych były istotne. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe metody, takie jak elektrofizjologia, aby odpowiedzieć na kolejne pytania, na przykład dotyczące funkcjonalnych konsekwencji zmienionej morfologii drzewa dendrytycznego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować organotypowe kultury skrawków móżdżku oraz jak analizować komórki Purkinje i ich morfologię.