Name: Analiza morfologii dendrytycznej komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę analizy morfologii dendrytycznej komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych myszy. Technika immunobarwienia i mikroskopii fluorescencyjnej pozwala ilościowo ocenić rozwój drzew dendrytycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Uniwersytet w Bazylei, Katedrę Biomedycyny oraz Szwajcarski Narodowy Fundusz Naukowy (31003A-116624).

1. Przygotowanie organotypowych hodowli plastrów móżdżku
Hodowle plastrów móżdżku przygotowuje się z myszy w 8. dobie po urodzeniu P(8) przy użyciu metody inkubacji statycznej 10. W naszym laboratorium wykorzystujemy myszy B6CF1. W niektórych eksperymentach zastosowano również myszy transgeniczne, które selektywnie ekspresują EGFP w komórkach Purkinjego. Przygotowanie hodowli plastrów zajmuje około 30 minut na jednego młodszego osobnika, czyli 3 godziny dla miotu składającego się z 6 myszy. Wszystkie etapy są przeprowadzane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy użyciu wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych.
<ol>
 <li>Móżdżek szczeniąt myszy w wieku P8 jest wycinany z mózgu w lodowatym medium przygotowawczym (MEM (Gibco nr katalogowy 11012) z glutamax 1:100, pH 7.3) przy użyciu stereomikroskopu.</li>
 <li>Móżdżek jest cięty na plastry o grubości 350 μm w orientacji strzałkowej za pomocą ciachacza do tkanek McIlwain.</li>
 <li>Plastry są umieszczane na wkładkach do hodowli komórkowych Millipore (ok. 6 plastrów na wkładkę, Millipore PICM03050) i inkubowane w płytkach 6-dołkowych z 0,75 ml na dołek medium inkubacyjnego (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml surowicy konia, 1 ml glutamax I, 0,65 ml sterylnego 10% roztworu glukozy, pH 7.3) w nawilżonej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Wszystkie odczynniki do hodowli tkanek pochodziły z Gibco, Invitrogen.</li>
 <li>Traktowanie farmakologiczne jest zazwyczaj rozpoczynane w 3. dniu in vitro (DIV3) poprzez dodanie leku w pożądanym stężeniu do medium hodowlanego. Forbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oraz (RS)-3,5-dihydroksyfenyloglicyna (DHPG) pochodziły z Tocris, UK. Ponieważ wiele leków wymaga zastosowania DMSO lub etanolu do przygotowania roztworu zapasowego (np. PMA), należy zadbać o to, aby całkowita ilość rozpuszczalnika dodanego do medium hodowlanego nie przekraczała 1% (7,5 μl na dołek). Leki są odnawiane wraz ze zmianą medium hodowlanego co 2nd lub 3rd dzień.</li>
</ol>
2. Fixacja i immunostaining organotypowych kultur plastrów móżdżka
Istotną zaletą móżdżku jest dostępność przeciwciał, które specyficznie i intensywnie barwią główne neurony móżdżku, tzn. komórki Purkinjego oraz komórki ziarniste. Morfologię dendrytów komórek Purkinjego można uwidocznić poprzez immunobarwienie przeciwciałami anty-kalbindyna D28K.
<ol>
 <li>W celu utrwalenia kultur usuwa się pożywkę i ostrożnie dodaje 3 ml zimnej 4% paraformaldehydu w 0,1M buforze fosforanowym (pH 7,4) na każdą studzienkę zawierającą wkładkę Millicell z przytwierdzonymi do membrany skrawkami móżdżku. Kultury utrwala się przez noc, następnie usuwa utrwalacz i płucze kultury buforem fosforanowym.</li>
 <li>Do immunobarwienia stosuje się następujące przeciwciała: królicze anty-kalbindyna D-28K (Swant, Bellinzona, Szwajcaria) w rozcieńczeniu 1:1000 do selektywnej wizualizacji komórek Purkinjego oraz monoklonalne anty-NeuN (Chemicon, Millipore) w rozcieńczeniu 1:500 do selektywnej wizualizacji komórek ziarnistych 12. Królicze anty-GFP pochodziło z firmy Abcam, UK. Fluorescencyjne przeciwciała wtórne Alexa pochodziły z firmy Molecular Probes, Invitrogen.</li>
 <li>Kultury poddaje się permeabilizacji i blokowaniu poprzez dodanie 3% normalnego surowiczego osocza koziego + 0,3% TritonX100 w 0,1 M buforze fosforanowym (roztwór blokujący). Przeciwciała anty-kalbindyna D28K i anty-NeuN rozcieńcza się w roztworze blokującym, a następnie kultury inkubuje się z roztworem blokującym zawierającym przeciwciała przez noc w temperaturze 4 °C przy lekkim mieszaniu. Wszystkie rozcieńczenia podano jako % (v/v); Triton X100 pobierano z 10% roztworu zapasowego w celu ułatwienia pipetowania.</li>
 <li>Kultury płucze się 3x 0,1 M buforem fosforanowym, a następnie inkubuje z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi, np. kozimi anty-króliczymi Alexa 568 oraz kozimi anty-mysimi Alexa 488 rozcieńczonymi 1:500 w 0,1M buforze fosforanowym + 0,1% TritonX100 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie kultury płucze się 3x 0,1M buforem fosforanowym.</li>
 <li> zabarwione skrawki usuwa się ze studzienki hodowlanej za pomocą pędzla, a następnie osadza na szkiełkach Superfrost plus i przykrywa szkiełkami nakrywkowymi z zastosowaniem odpowiedniego medium montażowego, np. Mowiol. Kultury można teraz obserwować pod zwykłym mikroskopem z wyposażeniem do epifluorescencji lub pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
3. Obserwacja pojedynczych komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków
<ol>
 <li>Po immunobarwieniu kalbindyną D28k całyy cytoplazma komórek Purkinjego jest intensywnie zabarwiona, w tym dendryty i akson. Ze względu na gęste ułożenie komórek Purkinjego w warstwie komórek Purkinjego, drzewa dendrytyczne większości tych komórek nakładają się na siebie, co utrudnia badanie pełnego drzewa pojedynczej komórki. Jednakże, z powodu śmierci części komórek Purkinjego podczas procesu przygotowania, w wielu kulturach występują obszary o zmniejszonej gęstości tych komórek. W takich obszarach możliwe jest znalezienie komórek Purkinjego z pełnym drzewem dendrytycznym, które nie nakłada się na inne komórki. W tych komórkach drzewo dendrytyczne może być oglądane i analizowane z jakością porównywalną do barwienia metodą Golgiego. Ponieważ w móżdżku komórki Purkinjego są jedynym typem komórek wykazującym ekspresję kalbindyny D28K, komórki te są identyfikowane jako komórki Purkinjego.</li>
 <li>Alternatywną metodą jest wykorzystanie kultur pochodzących od myszy B6;FVB-Tg(Pcp2-EGFP)146.244Yuza/J (zwanych tutaj myszami Pcp2-EGFP, dostępnych w Jackson Laboratories), które wykazują ekspresję EGFP pod specyficznym dla komórek Purkinjego promotorem L7 11. W takich kulturach skrawków żywe komórki Purkinjego mogą być wizualizowane dzięki ekspresji EGFP. Możliwe jest również śledzenie morfologii dendrytycznej pojedynczej komórki w czasie. Alternatywnie, po fiksacji, komórki Purkinjego wykazujące ekspresję EGFP mogą zostać poddane immunobarwieniu przeciwciałem anty-GFP. Obie metody nadają się do barwienia dendrytów, ciał komórkowych i aksonów komórek Purkinjego w kulturach organotypowych. Ponieważ promotor L7 u myszy Pcp2-EGFP nie jest eksprimowany w każdej komórce Purkinjego i występują różnice w częstotliwości ekspresji między myszami (Kapfhammer, dane nie przedstawione), kultury skrawków pochodzące od tych zwierząt ułatwiają wizualizację i pomiar komórek Purkinjego, których drzewa dendrytyczne nakładają się na drzewa innych komórek Purkinjego. Takie drzewa dendrytyczne można oglądać indywidualnie, gdy sąsiednie komórki Purkinjego z nakładającymi się drzewami dendrytycznymi nie wykazują ekspresji GFP (Rysunek 1A, B).</li>
</ol>
4. Pomiar rozmiaru drzewa dendrytycznego i liczby punktów rozgałęzień komórek Purkinjego
<ol>
 <li>Wielkość drzewa dendrytycznego. Dzięki fluorescencyjnemu znakowaniu komórek Purkinjego wielkość drzewa dendrytycznego danej komórki można łatwo zmierzyć, o ile nie nakłada się ono na inne komórki. Ponieważ immunobarwienie kalbindyną znakuje wszystkie komórki Purkinjego, identyfikacja komórek z nienakładającymi się drzewami dendrytycznymi może być trudna. W takim przypadku zaleca się stosowanie Pcp2-EGFP, aby ułatwić identyfikację odpowiedniej liczby komórek Purkinjego z nienakładającymi się drzewami dendrytycznymi. Po zidentyfikowaniu komórki Purkinjego z nienakładającym się drzewem dendrytycznym, ogląda się ją przez obiektyw 20x i rejestruje obraz za pomocą kamery cyfrowej. Obraz ten można następnie przeanalizować za pomocą programu do analizy obrazu. Używamy programu Image Pro plus, który pozwala na obrysowanie drzewa dendrytycznego komórki jednym kliknięciem myszy przy użyciu narzędzia magiczna różdżka w trybie pomiaru (Rysunek 2A). Program oblicza następnie powierzchnię zajmowaną przez drzewo dendrytyczne i eksportuje ją do programu MS Excel. Analizę statystyczną danych przeprowadza się za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (patrz poniżej).</li>
 <li>Liczba punktów rozgałęzień. Ze względu na silnie rozgałęzioną i delikatną morfologię drzewa dendrytycznego komórki Purkinjego, punkty rozgałęzień muszą być liczone ręcznie. Plik obrazu komórek Purkinjego wykonany przy powiększeniu 20x jest powiększany w programie Adobe Photoshop tak, aby zajmował większość ekranu. Następnie każdy punkt rozgałęzień jest liczony i zaznaczany jasnym punktem (Rysunek 2B).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Monitorowanie rozwoju drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego w okresie hodowli 
Organotypowe hodowle skrawków pochodzące od myszy Pcp2-EGFP, które wykazują ekspresję EGFP specyficznie w komórkach Purkinjego, pozwalają na badanie morfologii poszczególnych komórek przez wiele dni hodowli. W ten sposób można w przejrzysty sposób udokumentować wzrost i rozwój drzewa dendrytycznego w okresie hodowli. Żywe, zidentyfikowane komórki Purkinjego były fotografowane co 2gi lub 3ci dzień hodowli przy użyciu obiektywu 10x. Wybrano obiektyw o małym powiększeniu, aby uniknąć i zminimalizować uszkodzenia fototoksyczne komórek wywołane oświetleniem światłem fluorescencyjnym. Rysunek 3 przedstawia dwa przykłady komórek Purkinjego sfotografowanych w żywych hodowlach. Pierwsza komórka była śledzona od 2 dnia in vitro do 7 dnia in vitro (Rysunek 3, A-C). Wyraźnie widać, że drzewo dendrytyczne tej komórki w tym okresie czasu wypuszcza kilka nowych gałęzi i zwiększa swój rozmiar. W drugim przykładzie komórka Purkinjego była śledzona od 4. do 11. dnia in vitro (Rysunek 3, D-F). Małe drzewo dendrytyczne obecne w DIV4 ulega znacznemu rozszerzeniu w tym okresie. Oba przykłady pokazują, że większość drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego obecnego pod koniec okresu hodowli rzeczywiście rozwinęła się w kulturze.
Rozwój drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego jest hamowany przez stymulację PKC lub mGluR1 
Organotypowe hodowle skrawków móżdżku hodowano przez 11 dni. Począwszy od 2nd dnia in vitro, niektóre hodowle traktowano PMA (50 nM), estrem forbolowym stymulującym PKC, lub DHPG (10 μM), agonistą mGluR1, aż do momentu utrwalenia hodowli. Wcześniej wykazano, że oba związki hamują i ograniczają wzrost dendrytów komórek Purkinjego 7, 8, 9, 5. W nieleczonych skrawkach kontrolnych komórki Purkinjego wytworzyły typowe, duże i silnie rozgałęzione drzewo dendrytyczne, które z wizualizowano za pomocą immunostynowania przeciwciałem anty-Kalbindyna (Rysunek 4A) lub w hodowlach z komórkami Purkinjego wykazującymi ekspresję EGFP, za pomocą immunostynowania przeciwciałem anty-GFP (Rysunek 4D). W hodowlach traktowanych PMA morfologia drzewa dendrytycznego uległa głębokiej zmianie. Dendryty wydawały się pogrubione i posiadały jedynie kilka krótkich odgałęzień bocznych. Wiele komórek Purkinjego, w przeciwieństwie do hodowli kontrolnych, nie było już jednobiegunowych, z jednym głównym dendrytem wychodzącym z ciała komórki, lecz wytworzyło dwa lub więcej dendrytów głównych (Rysunek 4B, E). Obszar zajmowany przez drzewo dendrytyczne był wyraźnie zmniejszony (patrz. poniżej). Podobna sytuacja miała miejsce w hodowlach traktowanych DHPG. Drzewo dendrytyczne komórek Purkinjego było znacznie zredukowane pod względem rozmiaru, a rozgałęzienie było wyraźnie ograniczone (Rysunek 4C, F). Wystąpiły jednak również pewne różnice jakościowe w porównaniu z hodowlami traktowanymi PMA. Nie zaobserwowano pogrubienia gałęzi dendrytycznych, a dendryty główne posiadały wiele bardzo krótkich dendrytów wtórnych (Rysunek 4C, F), co sugeruje, że zdarzenia sygnałowe zachodzące w komórkach Purkinjego traktowanych PMA i DHPG mogą być podobne, ale nie identyczne.
Ilościowa ocena wielkości drzewa dendrytycznego i liczby punktów rozgałęzień komórek Purkinjego W celu ilościowej oceny mierzy się wielkość drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego oraz liczbę punktów rozgałęzień na jedną komórkę Purkinjego zgodnie z powyższym opisem. Wyniki z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów są łączone, przy czym analizie musi zostać poddanych minimum 20 komórek. Średnią wartość powierzchni zajmowanej przez drzewa dendrytyczne w eksperymentach kontrolnych przyjmuje się za 100%, a wartości dla pozostałych eksperymentów wyraża się odpowiednio jako wartości procentowe. Analizę statystyczną danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Ponieważ nie zakładamy, że wszystkie wyznaczone wartości pochodzą z rozkładu Gaussa, stosujemy testy statystyczne, które nie wymagają takiego rozkładu wartości pomiarowych. Do porównywania wielu warunków i testowania istotności statystycznej wykorzystujemy test Kruskala-Wallisa, a następnie odpowiednią procedurę testów post hoc dla statystyki opartej na rangach, np. zaimplementowaną w teście post hoc Dunna w programie GraphPad Prism. Wyniki są zazwyczaj prezentowane w formie wykresów słupkowych. Przykład takiej oceny statystycznej przedstawiono na Rysunku 5. Zarówno analiza wielkości drzewa dendrytycznego (Rysunek 5A), jak i liczby punktów rozgałęzień na komórkę Purkinjego (Rysunek 5B) wykazują wyraźne różnice między grupą kontrolną a grupami traktowanymi DHPG lub PMA. Oba parametry różniły się z istotnością statystyczną p&lt;0.001 zgodnie z testem Kruskala-Wallisa.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, komórki neuronalne, barwienie zielono-czerwone, ekspresja białek, obrazowanie komórkowe." src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Komórka Purkinjego znakowana EGFP. U myszy Pcp2-EGFP nie wszystkie komórki Purkinjego wykazują ekspresję EGFP. W związku z tym drzewa dendrytyczne niektórych komórek Purkinjegich mogą być obserwowane pojedynczo, gdy wykazują one ekspresję EGFP (kanał EGFP na A), podczas gdy sąsiednie komórki Purkinjego o nakładających się drzewach dendrytycznych nie wykazują tej ekspresji (wynik negatywny w kanale EGFP na A, wynik pozytywny w barwieniu anty-Kalbindyna w kanale czerwonym na B). Pasek skali = 50 μm.
<img alt="Analiza morfologii neuronalnej; porównanie mikroskopii fluorescencyjnej, czerwone barwienie, wzory rozgałęzień." src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pomiar parametrów dendrytycznych komórek Purkinjego. (A). Rozmiar drzewa dendrytycznego można łatwo zmierzyć, obrysowując kontur komórki Purkinjego za pomocą jednego kliknięcia myszą w oprogramowaniu do analizy obrazu Image Pro plus, wykorzystując narzędzie magiczna różdżka. Narzędzie magiczna różdżka jest używane w taki sposób, aby całe drzewo dendrytyczne, wliczając w to somę komórki i wszystkie odnogi dendrytyczne, zostało całkowicie otoczone linią. (B). Liczbę punktów rozgałęzień zlicza się ręcznie na obrazach komórek Purkinjego. Każdy punkt rozgałęzień jest zaznaczony żółtą kropką. Pasek skali = 50 μm.
<img alt="Etapy wzrostu neuronów na obrazie mikroskopowym, od DIV2 do DIV11, pokazujące rozwój dendrytów." src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Monitorowanie rozwoju drzewa dendrytycznego komórki Purkinjego. Zidentyfikowane komórki Purkinjego były wielokrotnie fotografowane w celu monitorowania wzrostu drzewa dendrytycznego. (A-C): Drzewo dendrytyczne komórki Purkinjego rosnące i rozwijające się od 2. dnia in vitro (DIV) do DIV7. W tym okresie hodowli obserwuje się ciągły wzrost i rozgałęzianie dendrytów. (D-F): Drzewo dendrytyczne komórki Purkinjego rosnące i rozwijające się od DIV4 do DIV11. Drzewo dendrytyczne ulega znacznemu rozszerzeniu w tym okresie hodowli. Pasek skali = 50 μm.
<img alt="Mikroskopia odpowiedzi neuronalnej w warunkach Ctr, PMA i DHPG; obrazowanie fluorescencyjne, analiza komórek." src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Rozwój drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego jest hamowany przez stymulację PKC lub mGluR1. (A), (D): Nieleczone komórki kontrolne z dobrze rozwiniętym drzewem dendrytycznym. (B), (E): Po 9 dniach traktowania PMA dendryty wydają się pogrubione, a drzewo dendrytyczne jest znacznie zredukowane pod względem rozmiaru. Komórki często tracą polaryzację i stają się bipolarne (E). (C), (F): Po 9 dniach traktowania DHPG drzewo dendrytyczne jest znacznie zredukowane pod względem rozmiaru. W przeciwieństwie do traktowania PMA, na dendrytach pierwotnych i wtórnych obecnych jest wiele bardzo cienkich i krótkich odgałęzień bocznych. Komórki często tracą polaryzację i stają się bipolarne (F). Komórki Purkinjego zwizualizowano za pomocą immunostaining anty-Kalbindyną w (A - C) oraz za pomocą ekspresji EGFP w kulturach pochodzących od myszy Pcp2-EGFP w (D - F). Pasek skali = 50 μm.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący wielkość drzewa dendrytycznego i punkty rozgałęzień w warunkach kontrolnych, po zastosowaniu PMA oraz DHPG." src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ilościowa ocena wielkości drzewa dendrytycznego i rozgałęzień komórek Purkinjego. Pomiary ilościowe wykazują, że zarówno wielkość drzewa dendrytycznego (górny wykres słupkowy), jak i liczba punktów rozgałęzień (dolny wykres słupkowy) są znacznie zredukowane po zastosowaniu PMA lub DHPG. Różnice między drzewami dendrytycznymi w grupie kontrolnej a drzewami dendrytycznymi komórek Purkinjego z kultur poddanych działaniu preparatów były istotne przy p&lt;0,001.

<ol><li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li>
<li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li>
<li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li>
<li>Kapfhammer, L. C. Cerebellar slice cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKapfhammer%2C+LC+%22Protocols+for+Neural+cell+culture%22">Protocols for Neural cell culture</a>. Doering, J. P. , 4th edition, Springer Protocols Handbooks. 285-298 (2010).</li>
<li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li>
<li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-%CE%BAB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li>
<li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li>
<li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C%3F-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li>
<li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li>
<li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EEC), a protokoły zostały zatwierdzone i dopuszczone przez szwajcarskie organy nadzorcze. Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Metody przedstawione w niniejszym opracowaniu pozwalają na badanie rozwoju dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków móżdżku oraz na ilościową ocenę ekspansji dendrytów komórek Purkinjego poprzez pomiar wielkości drzewa dendrytycznego i liczby punktów rozgałęzień dendrytów. Oczywiście możliwa jest bardziej szczegółowa i zaawansowana analiza ilościowa dendrytów komórek Purkinjego, np. poprzez wyznaczenie całkowitej długości dendrytów, przeprowadzenie analizy Sholla lub określenie wymiaru fraktalnego...

analiza morfologii dendrytów komórek purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Komórki Purkinjego stanowią atrakcyjny system modelowy do badania rozwoju dendrytów, ponieważ posiadają one imponujące drzewo dendrytyczne, które jest ściśle zorientowane w płaszczyźnie strzałkowej i rozwija się głównie w okresie postnatalnym u małych gryzoni 3. Ponadto dostępnych jest kilka przeciwciał, które selektywnie i intensywnie znakują komórki Purkinjego wraz ze wszystkimi wypustkami, z czego najszerzej stosowane jest przeciwciało anty-Kalbindyna D28K. Do obserwacji dendrytów w żywych komórkach, poprzez laboratoria Jackson labs, dostępne są myszy wykazujące selektywną ekspresję EGFP w komórkach Purkinjego 11. Organotypowe hodowle skrawków móżdżku umożliwiają łatwe manipulacje eksperymentalne w zakresie rozwoju dendrytów komórek Purkinjego, ponieważ większość ekspansji drzewa dendrytycznego tych komórek zachodzi właśnie w okresie hodowli 4. Przedstawiamy tutaj krótki, niezawodny i prosty protokół obrazowania i analizy morfologii dendrytów komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych hodowlach skrawków móżdżku. W wielu przypadkach pożądana jest ilościowa ocena drzewa dendrytycznego komórki Purkinjego. Skupiamy się tutaj na dwóch parametrach: wielkości drzewa dendrytycznego oraz liczbie punktów rozgałęzień, które można szybko i łatwo określić w hodowlach skrawków móżdżku barwionych przeciwciałem anty-kalbindyną. Te dwa parametry stanowią niezawodny i czuły miernik zmian w drzewie dendrytycznym komórek Purkinjego. Na przykładzie traktowania aktywatorem kinazy białkowej C (PKC) PMA oraz receptorami metabotropowymi glutaminianu 1 (mGluR1) demonstrujemy, w jaki sposób wizualizuje się i ilościowo ocenia różnice w rozwoju dendrytów. Połączenie rozbudowanego drzewa dendrytycznego, selektywnych i intensywnych metod immunobarwienia, organotypowych hodowli skrawków obejmujących okres wzrostu dendrytów oraz modelu mysiego ze specyficzną ekspresją EGFP w komórkach Purkinjego sprawia, że komórki te są potężnym systemem modelowym do odkrywania mechanizmów rozwoju dendrytów.

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Komórki Purkinjego stanowią atrakcyjny model badawczy w studiach nad rozwojem dendrytów, ponieważ posiadają one imponujące drzewo dendrytyczne, które jest ściśle...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza rozwoju drzewa dendrytycznego komórek burkini w różnych warunkach eksperymentalnych. Realizuje się to poprzez wstępne przygotowanie organotypowych kultur plastrów móżdżku myszy postnatalnej, a następnie hodowlę tych plastrów w różnych warunkach eksperymentalnych.Na przykład, należy przetestować efekt agonistów MGL R one, a następnie utrwalić hodowle i uwidocznić morfologię poszczególnych komórek Purkinjego oraz ich drzew dendrytycznych za pomocą immunobarwienia przeciwciałami anty-Calbindin. Końcowym etapem jest analiza drzew dendrytycznych komórek Purkinjego wyhodowanych w warunkach kontrolnych lub eksperymentalnych, co ostatecznie wynika z mikroskopii fluorescencyjnej immunobarwionych komórek Purkinjego. Ilościowa ocena wielkości i rozgałęzień ich drzew dendrytycznych wykazuje, że aktywacja receptora neuroprzekaźnika, w szczególności MGL R one, głęboko wpływa na rozwój drzew dendrytycznych komórek Purkinjego.Główną zaletą tej techniki jest fakt, że podczas okresu hodowli dochodzi do niemal całkowitego wzrostu wypustek komórek Purkinjego, co pozwala na badanie w warunkach in vitro tak złożonych zagadnień, jak rozwój drzewa dendrytycznego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, na przykład dotyczące wpływu aktywności na wzrost i rozwój wypustek neuronalnych. Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparuj móżdżek z mózgu szczenięcia myszy PA w lodowatym medium preparacyjnym pod mikroskopem stereoskopowym.Następnie, używając siekarki do tkanek McIlwain, należy pociąć móżdżek na plastry o grubości 350 micron w orientacji strzałkowej. Po rozdzieleniu plastrów, należy umieścić je na wkładkach do hodowli komórkowych Millipore, układając około sześciu plastrów na jednej wkładce. Następnie należy inkubować je w płytkach sześciodołkowych, uprzednio wypełnionych 0,75 milliliters medium inkubacyjnego na dołek, w atmosferze uwilgotnionej z dodatkiem 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius.Rozpocząć leczenie farmakologiczne w trzecim dniu in vitro, dodając PMA lub DHPG w odpowiednim stężeniu do pożywki hodowlanej. Odnawiać leki wraz ze zmianą pożywki hodowlanej co drugi lub trzeci dzień. W celu utrwalenia hodowli.Najpierw należy usunąć pożywkę hodowlaną, a następnie ostrożnie dodać trzy mililitry paraformaldehydu do każdego dołka zawierającego skrawki móżdżku przytwierdzone do membrany Millicell Insert. Po całonocnej fiksacji kultur należy usunąć utrwalacz. Następnie kultury należy wypłukać buforem fosforanowym.Następnie do hodowli należy dodać przeciwciało królicze przeciwko kalbindynie, rozcieńczone w roztworze blokującym. Przeciwciało królicze przeciwko kalbindynie należy rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w celu selektywnej wizualizacji komórek Purkinjego, a monoklonalne przeciwciało przeciwko NeuN w stosunku 1:500 w celu selektywnej wizualizacji komórek ziarnistych w roztworze blokującym.Inkubować hodowle z tymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C przy słabym mieszaniu. Następnego dnia przemyć hodowle trzykrotnie buforem fosforanowym 0,1 M, a następnie rozcieńczyć przeciwciała wtórne: kozie przeciwko króliczym Alexa 568 oraz kozie przeciwko mysim Alexa 488 w stosunku 1:500 w buforze fosforanowym 0,1 M z dodatkiem 0,1% Triton X 100.Inkubować hodowle z barwnikiem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przepłukaniu hodowli buforem fosforanowym, wyjąć plasterki tkanek z dołka hodowlanego za pomocą pędzla i nanieść je na szkiełka SuperFrost Plus. Przykryć szkiełka dewizorkami, stosując odpowiednie medium montażowe.Następnie należy obejrzeć hodowle pod zwykłym mikroskopem z wyposażeniem do epi-fluorescencji lub pod mikroskopem konfokalnym z fluorescencyjnym znakowaniem komórek bikini. Wielkość drzewa dendrytycznego danej komórki można łatwo zmierzyć, jeśli drzewo to nie nakłada się na inne komórki. Po zidentyfikowaniu komórki bikini z nienakładającym się drzewem dendrytycznym, należy ją obejrzeć przy użyciu obiektywu 20 x.Obraz jest rejestrowany za pomocą kamery cyfrowej, a następnie analizowany w programie do analizy obrazu. W naszym laboratorium wykorzystuje się program Image Pro plus. Pozwala on na obrysowanie drzewa dendrytycznego komórki za pomocą jednego kliknięcia myszą.Używając narzędzia magiczna różdżka w trybie pomiaru, program oblicza następnie powierzchnię zajmowaną przez drzewo dendrytyczne i eksportuje ją do programu Ms.Xl. Następnie, przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism, przeprowadzana jest analiza statystyczna danych dotyczących liczby punktów rozgałęzień. Ze względu na silnie rozgałęzioną i drobną morfologię drzewa ENDR komórek kinji, muszą być one liczone ręcznie. Plik obrazu komórek kinji w powiększeniu 20x jest powiększony w programie Adobe Photoshop tak, aby zajmował większość ekranu.Następnie każdy punkt rozgałęzienia zostaje policzony i zaznaczony czerwoną kropką. Zidentyfikowane komórki typu bikini były fotografowane wielokrotnie w celu monitorowania wzrostu drzewa dendrytycznego. Od drugiego do siódmego podziału (div) obserwowano ciągły wzrost rozgałęzień dendrytów.Od 4. do 11. dnia hodowli (div) drzewo dendrytyczne uległo znacznemu rozrostowi. Pokazano to tutaj. Przedstawiono przykłady hamowania rozwoju drzewa dendrytycznego komórek bikini przez pKC lub mglR1. Stymulacja A i D pokazuje nieleczone komórki kontrolne z dobrze rozwiniętym drzewem dendrytycznym. Po dziewięciu dniach traktowania PMA dendryty wydają się pogrubione, a rozmiar drzewa dendrytycznego jest silnie zredukowany, co pokazano w BNE.Z drugiej strony, CNF wykazały, że po dziewięciu dniach traktowania DHPG drzewo dendrytyczne uległo znacznemu zmniejszeniu. W przeciwieństwie do traktowania PMA, na dendrytach pierwotnych i wtórnych obecnych było wiele bardzo cienkich i krótkich odgałęzień bocznych.Pomiary ilościowe przedstawione tutaj pokazują, że zarówno rozmiar drzewa dendrytycznego na górnym wykresie słupkowym, jak i liczba punktów rozgałęzień na dolnym wykresie słupkowym uległy znacznemu zmniejszeniu po traktowaniu PMA lub DHPG; różnice między kontrolnymi drzewami dendrytycznymi a drzewami dendrytycznymi komórek Purkinje z kultur traktowanych były istotne. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe metody, takie jak elektrofizjologia, aby odpowiedzieć na kolejne pytania, na przykład dotyczące funkcjonalnych konsekwencji zmienionej morfologii drzewa dendrytycznego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować organotypowe kultury skrawków móżdżku oraz jak analizować komórki Purkinje i ich morfologię.

the-analysis-purkinje-cell-dendritic-morphology-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkiniego w hodowlach tkwiących narządów

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Ten film ilustruje technikę uzyskiwania organotypowych wycinków móżdżku z mózgu szczeniaka myszy i hodowania tych wycinków w pożywkach uzupełnionych składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu, aby naśladować rozwój móżdżku in vitro. Dodatkowo określone wycinki móżdżku są traktowane badanym związkiem, a zdolność neuroprotekcyjna związku jest analizowana przy użyciu techniki barwienia immunofluorescencyjnego.

Analiza przeżywalności komórek Purkiniego w organotypowych kulturach warstwowych móżdżku

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Poznaj metodę analizy morfologii dendrytycznej komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych myszy. Technika immunobarwienia i mikroskopii fluorescencyjnej pozwala ilościowo ocenić rozwój drzew dendrytycznych.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Przeglądaj więcej filmów