Name: Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnej od zarazków za pomocą spektroskopii 1H NMR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę oceny zmian metabolicznych w wątrobie myszy wolnej od zarazków podczas postępującej kolonizacji za pomocą spektroskopii NMR. Technika ta umożliwia nieinwazyjne monitorowanie metabolitów mikrobiotycznych w moczu oraz profilowanie metaboliczne bioptatów wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wszystkie widma NMR wykorzystane jako przykłady ilustracyjne pochodzą z wcześniej opublikowanego badania7, które było wspierane finansowo przez firmę Nestlé.

1. Kolonizacja zwierząt wolnych od zarazków i pobieranie próbek
 <ol>
 <li>Wyjąć zwierzęta wolne od mikroorganizmów (germ-free) z izolatorów i umieścić je w konwencjonalnej pracowni hodowlanej w klatkach wyposażonych w filtr, przed zwierzętami konwencjonalnymi, które będą służyć jako grupa kontrolna (Rysunek 1).</li>
 <li>Zmieszać połowę ściółki (3-dniowej) pobranej z kontrolnej klatki konwencjonalnej ze ściółką zwierząt wolnych od mikroorganizmów. Przy każdej konieczności wymiany ściółki zawsze zachować 1/3 brudnej ściółki konwencjonalnej w celu utrzymania poziomu bakterii (zachować ją przez co najmniej 3 dni).</li>
 <li>Zebrać mocz do mikroprobówki o pojemności 1,5 mL, trzymając mysz nad probówką i wspomagając mikcję poprzez delikatny masaż jelit. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze co najmniej -40°C do czasu analizy NMR. Do akwizycji z wykorzystaniem sondy NMR 5 mm wymagana jest objętość minimum 20 μL, jednak w celu poprawy jakości profilowania metabolicznego zaleca się użycie 30 μL.</li>
 <li>Zwierzęta należy poddać eutanazji bez użycia jakichkolwiek środków anestetycznych, aby uniknąć zakłócenia sygnałów NMR wynikających z wątrobowego metabolizmu związków anestetycznych (np. zastosować zwichnięcie karku, a następnie potwierdzić zgon poprzez upuszczenie krwi).</li>
 </ol>
 2. Zalecenia dotyczące pobierania biopsji wątroby
 <ol>
 <li>Aby uniknąć kontaminacji, nie należy używać żadnych produktów zawierających alkohol. Narzędzia należy myć wyłącznie wodą lub roztworem soli fizjologicznej. </li>
 <li>Nie należy przebijać pęcherzyka żółciowego. W przypadku wycieku żółci tkankę należy natychmiast przemyć wodą lub roztworem soli fizjologicznej.</li>
 <li>Pobrać biopsje wątroby (około 15-50 mg) z lewego płata, zgodnie z rysunkiem 2. Aby zapewnić powtarzalność biopsji, należy pobierać materiał konsekwentnie z centrum lewego płata, unikając obszarów obwodowych, gdzie tkanka jest cieńsza. </li>
 <li>Biopsje należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu analizy NMR.</li>
 </ol>
 3. Akwizycja widm 1H NMR mikroobjętości moczu
 <ol>
 <li>Przygotować 0,2M roztwór buforu fosforanowego sodu w D2O (99,8 %), pH 7,4 zawierający 1 mM kwas 3-(trimetylosililo)propionowy-d4 (TSP).</li>
 <li>Zmieszać 30 μL moczu z 30 μL buforu fosforanowego sodu.</li>
 <li>Przenieść 50 μL zmieszanego roztworu do kapilary NMR o średnicy 1,7 mm (Rycina 3 (2)) za pomocą szklanej strzykawki o objętości 50 μL wyposażonej w metalową igłę (średnica zewnętrzna 0,5 mm). Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Założyć adapter kapilarny (Rycina 3 (3)) na górną część kapilary zawierającej próbkę moczu i umieścić ją w mikroprobówce NMR o średnicy 2,5 mm przeznaczonej do sondy NMR 5 mm (Rycina 3 (1)). Tego zestawu probówek należy używać jako standardowej probówki NMR 5 mm do akwizycji widma.</li>
 <li>Użyć pręta ekstrakcyjnego (Rycina 3 (4)), aby wyjąć kapilarę z probówki NMR 2,5 mm, delikatnie przykręcając adapter kapilarny i wyciągając go.</li>
 </ol>
 4. 1H HR MAS NMR biopsji tkanki wątroby: przygotowanie próbki
 <ol>
 <li>Elementy i narzędzia rotora MAS przedstawiono na Rysunku 4.</li>
 <li>Wprowadź biopsjat (około 15-50 mg) do rotora cyrkonowego (Rysunek 4 (1)) i wypełnij pozostałą objętość czystą D2O w celu stabilizacji sygnału (NMR lock). Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogłoby to pogorszyć jakość późniejszego shimmingu i pozyskiwania danych.</li>
 <li>Wprowadź teflonowy dystans 50 μL (Rysunek 4 (2)) za pomocą śruby cylindrycznej (Rysunek 4 (5)). Wykręć ją i skalibruj za pomocą głębokościomierza z krótkiej strony (Rysunek 4 (8)). Na tym etapie należy zwrócić szczególną uwagę na próbkę, ponieważ jej część może wycieknąć przez otwór w dystansie. W takim przypadku część biopsjatu ulegnie zniszczeniu, a waga próbki nie będzie już wiarygodna. Konieczne jest zatem ponowne przygotowanie próbki od samego początku.</li>
 <li>Umieść pin z gwintem (Rysunek 4 (3)) i delikatnie przykręć go śrubokrętem (Rysunek 4 (6)). Osusz pozostałą wodę za pomocą serwetki.</li>
 <li>Umieść nakrętkę (Rysunek 4 (4)) na górze rotora i włóż ją do prasowania rotora (Rysunek 4 (6)). Dociskaj mocno, aż nakrętka znajdzie się na swoim miejscu. Między rotorem a nakrętką nie powinno pozostać żadnej szczeliny.</li>
 <li>Zaznacz połowę spodu rotora czarnym markerem, aby umożliwić optyczną detekcję prędkości wirowania.</li>
 <li>Umieść rotor w spektrometrze NMR i rozpocznij wirowanie z częstotliwością 5 kHz. Pozyskaj widmo 1H NMR, stosując sekwencję impulsów CPMG13 zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
 <li>Do kalibracji widm NMR użyj rezonansu anomeru α glukozy przy 5,22 ppm (dublet).</li>
 <li>Aby rozpakować rotor, zdejmij nakrętkę za pomocą zdejmaka do nakrętek (Rysunek 4 (9)). Wykręć pin z gwintem i usuń teflonowy dystans za pomocą śruby cylindrycznej. Umyj dokładnie wodą i detergentem.</li>
 </ol>
 5. Reprezentatywne wyniki
 Aktywność mikrobiomu jelitowego można monitorować za pomocą profilowania metabolicznego moczu. W literaturze opisano liczne mikrobiologiczne ko-metabolity w moczu, które można zidentyfikować za pomocą 1H NMR7,14-17. Ko-metabolity te są szczególnie użyteczne do monitorowania procesu kolonizacji, ponieważ stanowią szybki i nieinwazyjny sposób oceny stabilności nowo ustanowionego ekosystemu. Rycina 5A wyraźnie ilustruje pojawienie się mikrobiologicznych ko-metabolitów w trakcie procesu kolonizacji. Rycina ta przedstawia profil metaboliczny moczu uzyskany zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2 dla zwierzęcia kolonizowanego przez 20 dni według procedury opisanej w kroku 1. Zwierzę to nie wydalało siarczanu indoksylu oraz minimalnych ilości fenyloacetyloglicyny (PAG) i siarczanu p-krezolu w stanie wolnym od drobnoustrojów (dzień 0 – kolor niebieski). W miarę postępu kolonizacji trzy te markery metabolizmu białek przez mikrobiotę jelitową znacznie zwiększają swoją koncentrację, osiągając stan równowagi w 20. dniu (kolor czerwony). Jest to szczególnie łatwe do monitorowania w grupie zwierząt, co zilustrowano na rycinie 5B przy użyciu rezonansu PAG. Wykres ten uzyskano poprzez całkowanie pola pod rezonansami zaznaczonymi na szaro na rycinie 5A (δ 7,40-7,43), odpowiadającymi specyficznemu rezonansowi (tripletowi) PAG dla grupy 7 zwierząt.
 1Spektroskopia NMR z wysoką rozdzielczością i magicznym kątem obrotu (HR MAS) to nieniszcząca technika, która pozwala na szybkie i powtarzalne pozyskiwanie profili metabolicznych z dowolnego rodzaju biopsji18. W niniejszym protokole wykorzystaliśmy tę potężną metodę do uzyskania profilu metabolicznego wątroby 2 myszy przed (kolor niebieski) i po (kolor czerwony) kolonizacji (Rysunek 6). Rysunek ten dobrze obrazuje informacje, jakie można wywieść z profilu metabolicznego opartego na NMR MAS. Można zwizualizować liczne aminokwasy, jak również metabolity pochodzące z metabolizmu energetycznego, takie jak glukoza, glikogen, mleczan, trójglicerydy, (D)-3-hydroksymaślan i nikotynuran. Profile te zawierają również informacje istotne dla stresu oksydacyjnego (np. kwas askorbinowy, glutation), metabolizmu nukleotydów (np.kinoza, urydyna) oraz metabolizmu metyloamin (np. cholina, tlenek trimetyloaminy). W tym przykładzie wyraźnie widać, że mysz wolna od drobnoustrojów nie wykazuje niemal w ogóle glikogenu oraz bardzo niskie poziomy glukozy i trójglicerydów, co zostało wcześniej opublikowane7.
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig1.jpg" alt="Proces kolonizacji myszy wolnych od zarazków; mocz, biopsja wątroby; profil metaboliczny NMR; schematy, widma." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1."> Rysunek 1. Przegląd protokołu kolonizacji. Zwierzęta wolne od zarazków oraz zwierzęta konwencjonalne są utrzymywane obok siebie w klatkach wyposażonych w filtry, a ich mioty są wymieniane, aby umożliwić progresywną kolonizację przez konwencjonalną mikrobiotę jelitową (1). Aktywność mikrobioty jelitowej jest monitorowana za pomocą profilowania metabolicznego opartego na 1H NMR (2-3). Metabolizm wątroby jest oceniany za pomocą profilowania metabolicznego opartego na 1H HR MAS NMR (4-5).
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig2.jpg" alt="Schemat anatomii wątroby z zaznaczonymi płatami; wskazano miejsce pobrania biopsji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> Rysunek 2. Anatomia wątroby myszy. Wątroba jest przedstawiona w taki sposób, aby płaska strona organu przylegała do stołu. Aby uzyskać powtarzalne wyniki biopsji, zaleca się zawsze pobieranie próbek z centrum lewego płata, zgodnie z zaznaczeniem przerywanym prostokątem.
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig3.jpg" alt="Aparat chromatograficzny; kolumny szklane, adaptery do konfiguracji metody rozdzielania cieczy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3."> Rycina 3. Zestaw kapilar NMR 1,7 mm do pracy z mikrobiwolumenami. Legenda: 1: mikrorurka NMR 2,5 mm, 2: kapilara NMR 1,7 mm, 3: adapter kapilarny, 4: pręt do ekstrakcji.
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig4.jpg" alt="Komponenty układu spektroskopowego do eksperymentu z wzbudzeniem optycznym; obejmuje narzędzia i części metalowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4."> Rysunek 4. Wyposażenie rotora MAS. Legenda: 1: rotor MAS, 2: przekładka teflonowa 50 μL, 3: pin gwintowany, 4: nakrętka, 5: śruba cylindryczna, 6: śrubokręt, 7: upychacz rotora, 8: głębokościomierz.
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig5.jpg" alt="Widmo NMR porównujące wariacje Indoxyl-S w czasie, wraz z analizą wykresu stężenia PAG." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5."> Rycina 5. Ewolucja profili metabolicznych moczu podczas kolonizacji. 
 
 <ol class="ualpha">
 <li>Powiększenie obszaru aromatycznego widm pomiędzy 6,8-7,8 ppm, w którym można zaobserwować mikrobiologiczne ko-metabolity. Widma 1H NMR pochodzą od jednego osobnika z dnia 0 (niebieski), 4 (zielony), 15 (pomarańczowy) i 20 (czerwony) po kolonizacji. Szara strefa odpowiada obszarowi, który został zintegrowany w celu przygotowania wykresu w części B.
Legenda: 1-MeHistamine: 1-metylohistamina; Indoxyl-S: indoksylosiarczan; His: histydyna; p-Cresol-S: p-krezolosiarczan; PAG: fenyloacetyloglicyna.
</li>
 <li>Średnie stężenie PAG podczas kolonizacji (n=7). Do porównania różnic w stężeniu PAG w różnych punktach czasowych wykorzystano test t Studenta: a: p&lt;0,05 w porównaniu z dniem 0; b: p&lt;0,01 w porównaniu z dniem 10.</li>
 </ol>
 
 
 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig6.jpg" alt="Wykres spektroskopii NMR; piki wskazujące metabolity takie jak glukoza, mleczan; analiza przesunięcia chemicznego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6."> Rysunek 6.Typowe widma 1H HR MAS NMR o częstotliwości 600 MHz z biopsji wątroby myszy wolnych od mikroorganizmów (niebieski) oraz byłych wolnych od mikroorganizmów (czerwony). Pogrubione protony odpowiadają za rezonans triglicerydów. 
Legenda: 3-HB: 3-hydroksymaślan, GSH: zredukowany glutation, TGs: triglicerydy, TMAO: tlenek trimetyloaminy.

<ol><li>Cani, P. D., Delzenne, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microflora+as+a+target+for+energy+and+metabolic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Clin.+Nutr.+Metab.+Care%22%5BJournal%5D)">Gut microflora as a target for energy and metabolic.</a> Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).</li>
<li>Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology%3A+human+gut+microbes+associated+with+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity.</a> Nature. 444, 1022-1023 (2006).</li>
<li>Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+pandemics+and+the+modification+of+digestive+bacterial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+is+linked+to+marked+but+reversible+alterations+in+the+mouse+distal+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Host.+Microbe%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome.</a> Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).</li>
<li>Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+routines+cause+animal+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laboratory routines cause animal stress.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).</li>
<li>Muyzer, G., Smalla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+%28DGGE%29+and+temperature+gradient+gel+electrophoresis+%28TGGE%29+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).</li>
<li>Claus, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization-induced+host-gut+microbial+metabolic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Waters, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+magic+angle+spinning+1H+NMR+spectroscopy+of+intact+liver+and+kidney%3A+optimization+of+sample+preparation+procedures+and+biochemical+stability+of+tissue+during+spectral+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition.</a> Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).</li>
<li>Bollard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1H+and+1H-13C+magic+angle+spinning+NMR+spectroscopy+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver.</a> Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).</li>
<li>Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+methods+and+applications+in+biomedical+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).</li>
<li>Tate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+normal+and+renal+cell+carcinoma+kidney+cortical+biopsy+samples+using+pattern+recognition+of+%281%29H+magic+angle+spinning+%28MAS%29+NMR+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22NMR.+Biomed%22%5BJournal%5D)">Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra.</a> NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+variation+in+metabolic+signatures+of+human+gastrointestinal+biopsies+revealed+by+high-resolution+magic-angle+spinning+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy.</a> Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22The+review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microorganisms%2C+mammalian+metabolism+and+personalized+health+care%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).</li>
<li>Martin, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+probiotic+Lactobacillus+paracasei+treatment+on+the+host+gut+tissue+metabolic+profiles+probed+via+magic-angle-spinning+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy.</a> Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).</li>
<li>Swann, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+Antibiotic-Induced+Microbial+Recolonization+Impacts+on+the+Host+Metabolic+Phenotypes+of+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats.</a> J. Proteome. Res. , (2011).</li>
<li>Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-digestible+food+ingredients%2C+colonic+microbiota+and+the+impact+on+gut+health+and+immunity%3A+a+role+for+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug.+Metab%22%5BJournal%5D)">Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics.</a> Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+magic-angle-spinning+NMR+spectroscopy+for+metabolic+profiling+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues.</a> Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHooper%2C+LV+%22Methods+in+microbiology%22">Methods in microbiology</a>. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. 31, Academic Press. 559-589 (2002).</li>
<li>Rahija, R. J. Ch. 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRahija%2C+RJ+%22The+mouse+in+biomedical+research%22">The mouse in biomedical research</a>. Fox, J. G. , Academic Press. 217-234 (2007).</li>
<li>Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+flora+and+the+origin+of+some+urinary+aromatic+phenolic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds.</a> Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).</li>
<li>Koopman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Normalization%27+of+germfree+mice+after+direct+and+indirect+contact+with+mice+having+a+%27normal%27+intestinal+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">'Normalization' of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a 'normal' intestinal microflora.</a> Lab Anim. 20, 286-290 (1986).</li>
<li>Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+lipid-dependent+regulation+of+de+novo+lipogenesis+and+lipid+partitioning+by+ketogenic+essential+amino+acids+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+and+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice.</a> Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).</li>
<li>Spagou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GC-MS+metabolic+profiling+study+of+plasma+samples+from+mice+on+low-+and+high-fat+diets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets.</a> J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).</li>
<li>Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microbial+phenolic+acids+in+human+faeces+by+UPLC-ESI-TQ+MS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS.</a> J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).</li>
<li>Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry-based+metabolomics+in+clinical+chemistry+and+toxicology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review.</a> Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).</li>
<li>Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+and+potential+developments+in+the+analysis+of+urine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent and potential developments in the analysis of urine: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+spectroscopy.+Application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).</li>
<li>Bodenhausen, G., Ruben, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+abundance+15N+NMR+by+enhanced+heteronuclear+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical.+Physics.+Letters%22%5BJournal%5D)">Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy.</a> Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).</li>
<li>Fan, T. W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two-dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Fan, T., Lane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+profiling+of+metabolites+and+isotopomers+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).</li>
<li>Fonville, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+partial+least+squares+models+and+related+chemometric+approaches+in+metabonomics+and+metabolic+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemometrics%22%5BJournal%5D)">The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping.</a> Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).</li>
<li>Merrifield, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+system-wide+characterisation+of+the+pig%3A+a+model+for+human+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology.</a> Mol. Biosyst. , (2011).</li>
<li>Tugnoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+gastric+mucosa+by+HR-MAS+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Sitter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HR+MAS+MR+spectroscopic+profiles+of+breast+cancer+tissue+with+clinical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters.</a> NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling%2C+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine%2C+plasma%2C+serum+and+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole opisano procedurę progresywnej kolonizacji w środowisku otwartym w celu dalszego zbadania wpływu mikrobioty jelitowej na metabolizm wątrobowy, ocenianego za pomocą profilowania 1H HR MAS NMR nienaruszonych próbek z biopsji. W literaturze opisano różne metody kolonizacji. Najczęstszymi metodami kolonizacji zwierząt zdefiniowaną mikrobiotą są gavage doustny lub zanieczyszczona woda pitna19,20. Można również zastosować inokulację kałem, zgodnie z wcześniejszymi opisami21</su...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela specyficznych odczynników i sprzętu:</td></tr><tr><td>mikroprobówka 2,5 mm</td><td>New Era</td><td>NE-H5/2.5-V-Br</td><td></td></tr><tr><td>kapilara 1,7 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NORS175001</td><td></td></tr><tr><td>adapter kapilarny</td><td>New Era</td><td>NE-325-5/1.7</td><td></td></tr><tr><td>pręt do ekstrakcji</td><td>New Era</td><td>NE-341-5</td><td></td></tr><tr><td>rotor HR-MAS BL4 z zestawem sferycznych przekładek teflonowych 50 &amp;mu;L</td><td>Bruker Corporation</td><td>HZ07213</td><td></td></tr><tr><td>zestaw narzędzi do wkładów 50 &amp;mu;L</td><td>Bruker Corporation</td><td>B2950</td><td></td></tr><tr><td>spektrometr NMR Advance III 600 MHz</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda stałych prób HR MAS NMR &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tlenek deuteru 99,9 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>530867-1L</td><td></td></tr><tr><td>kwas 3-(trimetylosilil)propionowy-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (TSP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów za pomocą spektroskopii 1h nmr

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Powszechnie wiadomo, że bakterie jelitowe znacząco przyczyniają się do homeostazy organizmu gospodarza, zapewniając szereg korzyści, takich jak ochrona immunologiczna i synteza witamin. Dostarczają one również gospodarzowi znacznej ilości składników odżywczych, co czyni ten ekosystem kluczowym organem metabolicznym. W obliczu rosnącej liczby dowodów na powiązanie między florą jelitową a zespołem metabolicznym, zrozumienie interakcji metabolicznych między gospodarzem a jego mikrobiotą jelitową staje się ważnym wyzwaniem współczesnej biologii.1-4
 Kolonizacja (nazywana również procesem normalizacji) oznacza zasiedlenie organizmu wcześniej wolnego od drobnoustrojów zwierzęcia przez mikroorganizmy. Choć jest to naturalny proces zachodzący podczas narodzin, stosuje się go również u dorosłych zwierząt wolnych od drobnoustrojów w celu kontrolowania ekosystemu flory jelitowej oraz dalszego określania jego wpływu na metabolizm gospodarza. Powszechną procedurą kontroli procesu kolonizacji jest metoda zgłębnika (gavage) z użyciem pojedynczego mikroorganizmu lub ich mieszaniny. Metoda ta prowadzi do bardzo szybkiej kolonizacji, jednak jej wadą jest wywoływanie ekstremalnego stresu5. Dlatego też użyteczne jest zminimalizowanie stresu i uzyskanie wolniejszego procesu kolonizacji, aby stopniowo obserwować wpływ zasiedlenia bakteryjnego na metabolizm gospodarza.
 W niniejszym manuskrypcie opisujemy procedurę oceny modyfikacji metabolizmu wątrobowego podczas procesu stopniowej kolonizacji z wykorzystaniem nieniszczącej techniki profilowania metabolicznego. Proponujemy monitorowanie kolonizacji mikrobioty jelitowej poprzez ocenę metabolicznej aktywności mikrobioty jelitowej odzwierciedlonej w wydalaniu z moczem mikrobiologicznych kometabolitów za pomocą profilowania metabolicznego opartego na 1H NMR. Pozwala to na ocenę stabilności aktywności mikrobioty jelitowej poza etapem stabilnego ustanowienia ekosystemu mikrobioty jelitowej, który zazwyczaj ocenia się poprzez monitorowanie bakterii kałowych za pomocą DGGE (denaturującej żelowej elektroforezy gradientowej).6 Kolonizacja odbywa się w konwencjonalnym otwartym środowisku i jest inicjowana przez brudną ściółkę zanieczyszczoną przez zwierzęta konwencjonalne, które będą służyć jako grupy kontrolne. Ponieważ gryzonie są zwierzętami koprofagicznymi, zapewnia to homogeniczną kolonizację, zgodnie z wcześniejszymi opisami.7
 Profil metaboliczny wątroby jest mierzony bezpośrednio z nienaruszonej biopsji wątroby przy użyciu spektroskopii NMR 1H High Resolution Magic Angle Spinning. Ta półilościowa technika oferuje szybki sposób oceny, bez uszkadzania struktury komórkowej, głównych metabolitów, takich jak trójglicerydy, glukoza i glikogen, w celu dalszej oceny złożonej interakcji między procesem kolonizacji a metabolizmem wątrobowym7-10. Metodę tę można zastosować również do każdej biopsji tkankowej11,12.

Opisano procedurę progresywnej kolonizacji w celu dalszej oceny jej wpływu na metabolizm wątroby gospodarza. Kolonizację monitoruje się nieinwazyjnie poprzez ocenę wydalania z moczem mikrobiologicznych ko-metabolitów za pomocą profilowania metabolicznego opartego na NMR, natomiast metabolizm wątrobowy ocenia się za pomocą profilowania NMR w technice High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) nienaruszonych próbek biopsji.

Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów za pomocą spektroskopii 1H NMR

Powszechnie wiadomo, że bakterie jelitowe w znacznym stopniu przyczyniają się do homeostazy gospodarza, zapewniając szereg korzyści, takich jak ochrona immunologiczna i witaminy...

Celem niniejszej procedury jest ocena wpływu postępującej kolonizacji na metabolizm wątrobowy gospodarza. Jest to realizowane poprzez stopniową kolonizację myszy wolnych od mikroorganizmów (germ-free). Proces kolonizacji jest monitorowany poprzez ocenę wydalania z moczem metabolitów mikrobiologicznych za pomocą spektroskopii NMR.Po monitorowaniu procesu kolonizacji pobiera się biopsję wątroby myszy i przygotowuje ją do profilowania metabolicznego. Profil metaboliczny wątroby można następnie uzyskać z nienaruszonej biopsji, wykorzystując nieniszczącą spektroskopię NMR z rotacją pod kątem magicznym (MAS) o wysokiej rozdzielczości. Ostatecznie zastosowanie protonowej spektroskopii NMR pozwala na wykrycie różnych metabolitów zaangażowanych w szlaki metaboliczne, takie jak szlaki energetyczne oraz szlaki stresu oksydacyjnego.Niniejszy eksperyment pozwala na uzyskanie informacji na temat funkcji wątroby podczas kolonizacji. Można go również zastosować w odniesieniu do innych układów, takich jak nerki. Aby przeprowadzić kolonizację zwierząt, należy wyjąć myszy wolne od drobnoustrojów z izolatorów i umieścić je w klatkach w konwencjonalnej pracowni hodowlanej, wyposażonych w filtr przed zw

assessing-hepatic-metabolic-changes-during-progressive-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy bez drobnoustroju za pomocą spektroskopii 1H NMR

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) służy do wykrywania dysregulacji metabolitów u pacjentów z różnymi chorobami. Technika ta pozwala na ilościowe określenie zaburzonych metabolitów, odkrywając patofizjologiczne wglądy. W tym miejscu opisujemy krok po kroku procedurę podejścia opartego na NMR w celu charakterystyki metabolicznej pacjentów.

Identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów zaburzonych u pacjentów w stanie krytycznym przy użyciu metabolomiki opartej na NMR

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Opisana metoda przedstawia procedurę, zgodnie z którą mątwka hawajska Euprymna scolopes oraz jej bakteryjny symbiont Vibrio fischeri są hodowane oddzielnie, a następnie łączone w celu umożliwienia specyficznej kolonizacji organu świetlnego mątwy przez bakterie. Opisano metody wykrywania kolonizacji za pomocą luminescencji bakteryjnej oraz poprzez bezpośrednie liczenie kolonii.

Kolonizacja mątwy Euprymna scolopes przez Vibrio fischeri

Poznaj metodę oceny zmian metabolicznych w wątrobie myszy wolnej od zarazków podczas postępującej kolonizacji za pomocą spektroskopii NMR. Technika ta umożliwia nieinwazyjne monitorowanie metabolitów mikrobiotycznych w moczu oraz profilowanie metaboliczne bioptatów wątroby.

Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów za pomocą spektroskopii ¹H NMR

Przeglądaj więcej filmów