Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów za pomocą spektroskopii ¹H NMR

Celem niniejszej procedury jest ocena wpływu postępującej kolonizacji na metabolizm wątrobowy gospodarza. Jest to realizowane poprzez stopniową kolonizację myszy wolnych od mikroorganizmów (germ-free). Proces kolonizacji jest monitorowany poprzez ocenę wydalania z moczem metabolitów mikrobiologicznych za pomocą spektroskopii NMR.

Po monitorowaniu procesu kolonizacji pobiera się biopsję wątroby myszy i przygotowuje ją do profilowania metabolicznego. Profil metaboliczny wątroby można następnie uzyskać z nienaruszonej biopsji, wykorzystując nieniszczącą spektroskopię NMR z rotacją pod kątem magicznym (MAS) o wysokiej rozdzielczości. Ostatecznie zastosowanie protonowej spektroskopii NMR pozwala na wykrycie różnych metabolitów zaangażowanych w szlaki metaboliczne, takie jak szlaki energetyczne oraz szlaki stresu oksydacyjnego.

Niniejszy eksperyment pozwala na uzyskanie informacji na temat funkcji wątroby podczas kolonizacji. Można go również zastosować w odniesieniu do innych układów, takich jak nerki. Aby przeprowadzić kolonizację zwierząt, należy wyjąć myszy wolne od drobnoustrojów z izolatorów i umieścić je w klatkach w konwencjonalnej pracowni hodowlanej, wyposażonych w filtr przed zwierzętami konwencjonalnymi, które pełnią rolę kontrolną.

Następnie wymieszaj połowę ściółki trzyodniowej z klatki kontrolnej (tradycyjnej) ze ściółką zwierząt wolnych od drobnoustrojów. Pobierz mocz do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml, trzymając mysz nad probówką i wspomagając oddawanie moczu poprzez delikatne masowanie pęcherza. Do analizy z wykorzystaniem sondy NMR 5 mm wymagane jest minimum 20 µL, jednak w celu poprawy jakości profilowania metabolicznego zaleca się użycie 30 µL. Mocz należy bezzwłocznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze co najmniej -40 °C do czasu przeprowadzenia analizy NMR.

Przed pomiarem NMR przygotować 0,2 M roztwór buforu fosforanowego sodu w ciężkiej wodzie o pH 7.4 zawierający 1 mM TSP. Wymieszać 30 µL mocznika z 30 µL buforu fosforanowego sodu. Przenieść 50 µL wymieszanego roztworu do kapilary NMR o średnicy 1,7 mm, używając szklanej strzykawki o pojemności 50 µL wyposażonej w metalową igłę.

Należy zadbać o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Nałożyć adapter kapilarny na górną część kapilary zawierającej próbkę moczu, a następnie umieścić ją w 2,5 milimetrowej mikroprobówce NMR przeznaczonej do pięciomilimetrowej sondy NMR. Taka kombinacja probówek może być stosowana jako standardowa pięciomilimetrowa probówka NMR do akwizycji widm.

W niniejszym pokazie do gromadzenia danych wykorzystano spektrometr NMR Bruker Advanced Three 700 MHz. Należy zarejestrować jednowymiarowe widma NMR protonów, stosując parametry omówione w protokole pisemnym. Po akwizycji NMR należy użyć pręta ekstrakcyjnego, aby usunąć kapilarę z probówki NMR o średnicy 2,5 mm, delikatnie przykręcając adapter kapilarny i wyciągając ją po uśmierceniu zwierząt, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Przygotuj się do biopsji wątroby. Aby uniknąć kontaminacji, nie używaj żadnych produktów zawierających alkohol, a narzędzia myj wodą lub roztworem soli fizjologicznej. W celu zapewnienia powtarzalności biopsji pobieraj materiał z lewego płata wątroby.

Próbki należy pobierać konsekwentnie z centrum lewego płata, unikając obszarów obwodowych, gdzie tkanka jest cieńsza. Należy uważać, aby nie przebić pęcherzyka żółciowego, co mogłoby spowodować wyciek żółci. Tkankę należy niezwłocznie przemyć wodą lub roztworem soli fizjologicznej.

Biopsje należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy NMR. Aby przygotować próbkę do H-R-M-A-S-N-M-R, należy umieścić trzecią biopsję w rotorze cyrkonowym i uzupełnić pozostałą objętość czystą wodą ciężką w celu stabilizacji sygnału NMR (NMR lock). Należy uważać, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, ponieważ mogłyby one pogorszyć jakość późniejszego shimmingu i akwizycji danych. Za pomocą śruby cylindrycznej należy włożyć teflonowy dystans o objętości 50 µL.

Odkręć go i skalibruj za pomocą głębokościomierza na krótkiej stronie. Umieść pin gwintowany na przekładce i delikatnie przykręć go śrubokrętem. Osusz chusteczką wszelką pozostałą wodę.

Następnie załóż pokrywę na górną część rotora i włóż go do opakowania rotora. Dociśnij mocno, aż pokrywa znajdzie się na swoim miejscu. Między rotorem a jego pokrywą nie powinno pozostać żadnej szczeliny. Zaznacz czarnym markerem połowę spodu rotora, aby umożliwić optyczne wykrywanie prędkości wirowania.

Po odpowiednim upakowaniu rotora należy umieścić go w spektrometrze NMR i rozpocząć wirowanie z częstotliwością 5 kHz. W tym przypadku wykorzystano spektrometr Bruker Avance III 500 MHz. Należy zarejestrować widmo ¹H NMR przy użyciu sekwencji impulsów CPMG.

Zgodnie z wytycznymi producenta, obfity dublet piku glukozy alfa i beta przy 5,22 ppm może zostać wykorzystany do kalibracji uzyskanych widm NMR. Aby rozpakować rotor, należy zdjąć nasadkę za pomocą narzędzia do jej usuwania, wykręcić pin gwintowany i wyjąć teflonową przekładkę. Za pomocą wkrętu cylindrycznego można dokładnie umyć aparat, używając wody i detergentu.

Zmiany w obecności ko-metabolitów mikrobioty jelitowej w trakcie procesu kolonizacji są wyraźnie przedstawione na tym widmie protonowym profilu metabolicznego moczu zwierzęcia kolonizowanego przez 20 dni. Zwierzę to w stanie wolnym od zarazków (germ-free) nie wydalało indoksylosiarczanu oraz wydalało bardzo małe ilości fenyloacetyloglicyny (w skrócie PAG) i kwasy taurursylosiarczanu. W miarę postępu kolonizacji stężenia tych trzech markerów metabolizmu białek przez mikrobiotę jelitową znacznie wzrastają, osiągając stan równowagi w 20. dniu.

Dzięki całkowaniu specyficznego piku tripletowego PAG możliwe było ilościowe określenie wzrostu tego konkretnego markera w czasie. Schemat ten przedstawia średnie stężenie PAG podczas kolonizacji dla grupy siedmiu zwierząt; przy użyciu spektroskopii protonowej H-R-M-A-S-N-M-R uzyskano profil metaboliczny wątroby dwóch myszy przed i po kolonizacji. Rycina ta dobrze obrazuje informacje, jakie można wywieść z profilu metabolicznego opartego na A-M-A-S-N-M-R.

Można zwizualizować liczne aminokwasy, a także metabolity pochodne metabolizmu energetycznego. Profile te zawierają również informacje istotne dla stresu oksydacyjnego, metabolizmu nukleotydów oraz metabolizmu metyloamin. W tym przykładzie wyraźnie widać, że mysz wolna od drobnoustrojów nie wykazuje niemal w ogóle glikogenu oraz bardzo niskich ilości glukozy i triglicerydów.

Postępując zgodnie z tą procedurą, można zastosować wiele narzędzi statystycznych, takich jak chemometria, w celu pogrupowania próbek logicznych zgodnie z profilem metabolicznym oraz wyróżnienia biomarkerów związanych ze stanem metabolicznym.