Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnej od zarazków za pomocą spektroskopii 1H NMR
December 15th, 2011
Procedura progresywnej kolonizacji jest opisana, aby dokładniej ocenić jej wpływ na metabolizm wątrobowy gospodarza. Kolonizacja jest monitorowana nieinwazyjnie poprzez ocenę wydalania z moczem kometabolitów drobnoustrojów za pomocą profilowania metabolicznego opartego na NMR, podczas gdy metabolizm wątrobowy jest oceniany za pomocą profilowania NMR nienaruszonej biopsji za pomocą High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS).
Celem tej procedury jest ocena wpływu postępującej kolonizacji na metabolizm wątrobowy gospodarza. Osiąga się to poprzez najpierw stopniową kolonizację myszy wolnych od zarazków. Proces kolonizacji jest monitorowany poprzez ocenę wydalania z moczem kometabolitów drobnoustrojów za pomocą spektroskopii NMR.
Po monitorowaniu procesu kolonizacji od myszy pobiera się biopsję wątroby i przygotowuje ją do profilowania metabolicznego. Profil metaboliczny wątroby można następnie uzyskać z nienaruszonej biopsji za pomocą nieniszczącej spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości z wirowaniem pod magicznym kątem. Ostatecznie zastosowanie spektroskopii protonowej NMR ujawnia różne metabolity zaangażowane w szlaki metaboliczne, takie jak szlaki energii i stresu oksydacyjnego.
Tak więc ten eksperyment może dostarczyć informacji na temat funkcji wątroby podczas kolonizacji. Może być również stosowany przez system, taki jak nerka. Aby skolonizować zwierzęta, należy usunąć myszy wolne od zarazków z izolatorów i umieścić je w konwencjonalnym pomieszczeniu hodowlanym w klatkach, wyposażonych w filtr przed konwencjonalnymi zwierzętami, które służą jako kontrola.
Następnie wymieszaj połowę trzydniowego miotu pobranego z konwencjonalnej klatki kontrolnej ze ściółką zwierząt wolnych od zarazków, zbierz mocz do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra, dotykając myszką rurki i pomagając w delikatnym masowaniu jelit. Do akwizycji za pomocą pięciomilimetrowej sondy NMR wymagane jest co najmniej 20 mikrolitrów, ale zaleca się użycie 30 mikrolitrów w celu poprawy jakości profilowania metabolicznego. Natychmiast zamroź mocz w ciekłym azocie, przechowuj w temperaturze co najmniej minus 40 stopni Celsjusza do czasu analizy NMR.
Przed akwizycją NMR należy przygotować 0,2-molowy roztwór buforowy fosforanu sodu w ciężkiej wodzie. pH 7,4 zawierający jeden milimolowy TSP wymieszać 30 mikrolitrów moczu z 30 mikrolitrami buforu fosforanu sodu. Przenieś 50 mikrolitrów zmieszanego roztworu do 1,7-milimetrowej rurki kapilarnej NMR za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 50 mikrolitrów wyposażonej w metalową igłę.
Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków. Zamontuj adapter kapilarny na górze kapilary zawierającej próbkę moczu i umieść go w 2.5-milimetrowej mikroprobówce NMR dla pięciomilimetrowej sondy NMR. Ta kombinacja probówek może być używana jako standardowa pięciomilimetrowa rurka NMR do akwizycji spektralnej.
W tej demonstracji do zbierania danych użyto zaawansowanego spektrometru NMR o częstotliwości trzech 700 megaherców. Uzyskaj jednowymiarowe widma NMR protonów przy użyciu parametrów omówionych w pisemnym protokole. Po pobraniu NMR użyj pręta ekstrakcyjnego, aby usunąć kapilarę z 2.5-milimetrowej rurki NMR, delikatnie przykręcając adapter kapilarny, aby wyciągnąć go po eutanazji zwierząt, jak omówiono w pisemnym protokole.
Przygotuj się do biopsji wątroby. Nie używaj żadnych produktów zawierających alkohol, aby uniknąć zanieczyszczenia i myj narzędzia wodą lub roztworem soli fizjologicznej. Pobrać biopsje wątroby z lewego płata w celu wykonania powtarzalnych biopsji.
Zbieraj konsekwentnie w środku lewego płata, unikając obszarów obwodowych, w których tkanka jest cieńsza. Uważaj, aby nie przebić pęcherzyka żółciowego w przypadku wycieku żółci. Natychmiast umyj chusteczkę wodą lub roztworem soli fizjologicznej.
Natychmiast zamroź biopsje w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy NMR Aby przygotować się do H-R-M-A-S-N-M-R, włóż trzecią biopsję do wirnika cyrkonowego i napełnij resztę objętości czystą ciężką wodą do zamka NMR. Uważaj, aby nie tworzyć żadnych pęcherzyków, ponieważ mogą one wpłynąć na jakość późniejszego podkładkowania i pozyskiwania danych. Włóż przekładkę teflonową o pojemności 50 mikrolitrów za pomocą cylindrycznej.
Odkręć go i skalibruj za pomocą ogranicznika głębokości na krótszym boku. Umieść kołek gwintowany na przekładce i delikatnie przykręć go śrubokrętem. Suchy dom, wszelkie resztki wody z kawałkiem chusteczki.
Następnie umieść nasadkę w górnej części rotora i włóż ją do wału wirnika. Dociśnij mocno, aż nasadka znajdzie się na swoim miejscu. Między wirnikiem a jego nasadką nie powinno być żadnej wolnej przestrzeni, zaznacz połowę dolnej części wirnika za pomocą czarnego markera, aby umożliwić optyczne wykrywanie prędkości wirowania.
Gdy wirnik zostanie wystarczająco upakowany, umieść go w spektrometrze NMR i zacznij rozkręcać się do pięciu kiloherców. Tu. Używany jest zaawansowany spektrometr trzech 500 megaherców. Uzyskaj widmo protonowego NMR za pomocą sekwencji impulsów CP MG.
Zgodnie z wytycznymi producenta, obfity alfa i numeryczny pik dubletu glukozy na poziomie 5,22 części na milion może być wykorzystany do kalibracji wynikowych widm NMR. Aby rozpakować wirnik, należy zdjąć nasadkę, użyć narzędzia do usuwania nasadki, odkręcić kołek gwintowany i usunąć teflonową przekładkę. Za pomocą cylindrycznej urządzenie można dokładnie umyć wodą i detergentem.
Pojawienie się kometabolitów mikrobiologicznych w jelitach w procesie kolonizacji jest wyraźnie zilustrowane w tym widmie protonowym profilu metabolicznego moczu dla zwierzęcia skolonizowanego 20 dni. Zwierzę to nie wydalało żadnych łagodnych siarczanów i bardzo małych ilości fenyloacetyloglicyny, w skrócie PAG i siarczanu komórek que w stanie wolnym od zarazków. Wraz z postępem kolonizacji te trzy markery metabolizmu białek w mikrobiocie jelitowej znacznie się zwiększają i osiągają równowagę w 20 dniu.
Integrując specyficzny pik trypletowy PAG, możliwe było ilościowe określenie wzrostu tego konkretnego markera w czasie. Wykres ten przedstawia średnie stężenie PAG podczas kolonizacji dla grupy siedmiu zwierząt przy użyciu spektroskopii protonów H-R-M-A-S-N-M-R, uzyskano wątrobowy profil metaboliczny dwóch myszy przed i po kolonizacji. Rysunek ten dobrze ilustruje informacje, które można uzyskać z profilu metabolicznego opartego na A-M-A-S-N-M-R.
Można uwidocznić liczne aminokwasy, a także metabolity pochodzące z metabolizmu energetycznego. Profile te zawierają również informacje dotyczące stresu oksydacyjnego, metabolizmu nukleotydów i metabolizmu metyloaminy. W tym przykładzie jest bardzo jasne, że wolna od zarazków mysz prawie nie wykazuje glikogenu i bardzo niskie ilości glukozy i trójglicerydów.
Tak więc, postępując zgodnie z tą procedurą, można zastosować wiele narzędzi statystycznych, takich jak chemioterapia, w celu grupowania próbek logicznych zgodnie z profilem metabolicznym i wyróżnienia biomarkerów związanych ze stanem metabolicznym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie opisuje progresywny proces kolonizacji w celu oceny jego wpływu na metabolizm wątroby gospodarza. Kolonizacji dokonuje się nieinwazyjnie poprzez wydalanie mikrobialnych kometabolitów z moczem przy użyciu profilowania metabolizmu opartego na spektroskopii NMR.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Metabolizm
- Mikrobiologia
Tło
- Zrozumienie wpływu mikrobioty jelitowej na metabolizm gospodarza jest kluczowe.
- Nieinwazyjne techniki monitorowania są niezbędne do dokładnych ocen.
- Spektroskopia NMR zapewnia szczegółowe profilowanie metabolizmu.
- Progresywna kolonizacja może ujawniać wgląd w szlaki metaboliczne.
Cel badania
- Oceniać wpływ progresywnej kolonizacji na metabolizm wątroby.
- Monitorować wydalanie mikrobialnych kometabolitów z moczu.
- Analizę biopsji wątroby na potrzeby profilowania metabolizmu za pomocą NMR.
Stosowane metody
- Progresywna kolonizacja myszy wolnych od drobnoustrojów.
- Oceny wydalania mikrobialnych kometabolitów z moczem poprzez spektroskopię NMR.
- Zbieranie biopsji wątroby na potrzeby profilowania metabolizmu.
- Spektroskopia NMR z wykorzystaniem High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) do analizy nienaruszonych biopsji.
Główne wyniki
- Identyfikacja różnych metabolitów zaangażowanych w szlaki energetyczne i stres oksydacyjny.
- Skuteczne monitorowanie kolonizacji poprzez analizę metabolitów w moczu.
- Wgląd w związek między mikrobiotą jelitową a metabolizmem wątroby.
- Demonstracja nietoksycznych technik profilowania do badań metabolicznych.
Wnioski
- Progresywny proces kolonizacji skutecznie wpływa na metabolizm wątroby.
- Techniki oparte na NMR są cenne w badaniu interakcji metabolicznych.
- Dalsze badania mogą zweryfikować terapeutyczne implikacje mikrobioty na metabolizm.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding host-microbiota metabolic interactions is critical for de-risking therapeutic targets in metabolic disease. This method enables non-destructive, longitudinal assessment of hepatic metabolic shifts during progressive gut colonization, providing mechanistic insights for target validation. It supports predictive confidence in early discovery by linking microbial activity to host pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking microbial co-metabolite excretion as a functional readout of gut microbiota activity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through longitudinal monitoring of colonization impact on hepatic energy and oxidative stress pathways.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating microbial establishment with measurable shifts in glucose, glycogen, and triglyceride levels in intact liver tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream screening by establishing reproducible colonization models with quantifiable urinary biomarkers.
- Quantitative Output: Provides semi-quantitative metabolic profiling of intact liver biopsies via HR MAS NMR, enabling detection of key metabolites in energy and stress pathways.
- Platform Reuse: The NMR-based approach can be applied to other tissues (e.g., kidney), supporting cross-organ metabolic profiling in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models metabolic syndrome risk by revealing how progressive colonization alters hepatic metabolism in germ-free mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase microbial metabolite tracking to preclinical validation of host metabolic responses.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway-level interactions between gut microbiota and host hepatic function, reducing ambiguity in target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative assessment of microbiota-host metabolic interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by monitoring urinary excretion of microbial co-metabolites (e.g., phenyl acetyl glycine) as colonization progresses.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized, non-invasive monitoring of colonization using NMR-based urinary metabolic profiling.
- Analytics: Delivers quantitative metabolic readouts from intact liver biopsies, including glucose, glycogen, triglycerides, and oxidative stress markers, to compare metabolic states.
- Translational Research: Links microbial metabolic activity to hepatic pathway modulation, supporting preclinical continuity in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reproducible, non-destructive NMR workflow applicable across tissue types for metabolic profiling in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in host-microbiota metabolic interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through non-invasive colonization monitoring and intact tissue profiling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked biomarkers of metabolic pathway engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated hepatic metabolic responses to colonization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, germ-free animal handling, and metabolic profiling techniques.
- Dependent on HR MAS NMR instrumentation, capillary sample preparation tools, and cryogenic storage for urine and tissue samples.
- Necessitates cross-team standardization between microbiology, metabolomics, and pathology teams for consistent sample collection and analysis.
- Must account for variability in coprophagic behavior and environmental colonization when adapting to different model systems or facilities.
- Limited by the semi-quantitative nature of HR MAS NMR and the need for careful bubble-free sample preparation to ensure spectral quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Colonization of Germ-free Animals and Sample Collection
2:07
1H NMR Acquisition of Urine Microvolume
3:25
Collection of Liver Biopsy
4:09
1H High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR of Liver Tissue Biopsy: Sample Preparation
5:55
Urinary and Hepatic Metabolic Profiling through 1H NMR and 1H HR MAS NMR Spectra
7:32
Conclusion
