Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wprowadzenie fluorescencyjnie znakowanych małych cząsteczek lub białek do cytoplazmy hodowanej komórki ssaka oraz obserwacja indukowanych zmian morfologicznych w rozdzielczości od mikrometra do wielu nanometrów. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek ssaków na siatkowanych szkiełkach nakrywkowych i mikroiniekcję interesującej, fluorescencyjnie znakowanej małej cząsteczki lub białka. Następnie komórki są utrwalane w formaldehydzie, a następnie obserwowane i obrazowane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Następnie komórki są utrwalane glutaraldehydem,ycinane, barwione i obrazowane przy użyciu mikroskopii elektronowej. Na koniec obrazy uzyskane podczas mikroskopii fluorescencyjnej w polu jasnym oraz mikroskopii elektronowej są łączone i wyrównywane. Ostatecznie korelacja tych obrazów pozwala badaczowi na obrazowanie z wysoką rozdzielczością perturbacji wywołanych przez badaną małą cząsteczkę lub białko.

Witajcie, jestem dr Evan Reddick z laboratorium dr. Neila Alto w wydziale mikrobiologii na University of Texas Southwestern Medical Center w Dallas. Dzisiaj opowiem Państwu o procedurze M Clem, czyli korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej z wykorzystaniem mikroiniekcji. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z technikami samodzielnymi, takimi jak mikroiniekcja czy mikroskopia, jest fakt, że są one tutaj wykonywane wspólnie, przy wsparciu siatkowanego szkiełka nakrywkowego.

To właśnie ta siatka na szkiełku nakrywce pozwala badaczom na powrót do tej samej komórki na różnych etapach protokołu. Ponadto technika ta umożliwia badaczowi obserwację indukowanych zmian w architekturze subkomórkowej pod wpływem szerokiego spektrum wstrzykiwanych małych cząsteczek lub interesujących białek, z rozdzielczością od mikrometra do wielu nanometrów. Aby przygotować się do mikroiniekcji, hoduje się komórki, takie jak prawidłowe komórki nerek szczura lub unieśmiertelnione komórki raka szyjki macicy, na trawionych fotochemicznie szkiełkach nakrywkach z siatką, przymocowanych do naczyń do hodowli żywych komórek, inkubując je w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

W zależności od planowanego harmonogramu eksperymentu należy dostosować stopień konfluencji komórek. W pełni konfluencyjna płytka znacznie utrudni identyfikację komórek poddanych mikroiniekcji w mikroskopie elektronowym. Należy zatem wysiać komórki w taki sposób, aby osiągnęły one około 50% konfluencji w dniu krótkiego eksperymentu oraz około 25% konfluencji.

W dniu przeprowadzenia dłuższego eksperymentu przygotować znakowane fluorescencyjnie białka, DNA lub małe cząsteczki w odpowiednim buforze do końcowej objętości 50 µL. W zależności od wybranego fluoroforu dodać barwnik śledzący, taki jak Texas red lub cascade blue. Dodać stężenie od 0,5 do 1 mg/mL.

Przefiltruj roztwór przez wirówkowy filtr o porach 0,22 micron. Po przygotowaniu igieł do mikroiniekcji zgodnie z wytycznymi producenta, ostrożnie pipetuj cztery mikrolitry roztworu do tylnej części igły. Umieść igłę w ramieniu mikromanipulatora komercyjnego urządzenia do mikroiniekcji przymocowanego do mikroskopu odwróconego.

Umieść naczynie z hodowlą komórek w uchwycie na naczynia mikroskopu odwróconego. Znajdź komórki rosnące w obrębie wytrawionej fotochemicznie siatki i zanotuj alfanumeryczny identyfikator danej siatki. Będzie on wykorzystywany we wszystkich kolejnych krokach.

Ważne jest, aby do mikrowstrzyknięcia wybrać komórki przylegające blisko centrum szkiełka podstawowego i unikać tych znajdujących się na obrzeżach. Jest to istotne, ponieważ zapewni efektywny transfer wybranych komórek do centralnej części żywicy epon stosowanej później w mikroskopii elektronowej. Ręcznie opuść ramię do iniekcji nad szkiełko podstawowe i za pomocą mikromanipulatora obniżaj igłę, aż jej końcówka delikatnie dotknie powierzchni komórek. Wykonaj mikrowstrzyknięcie do co drugiej komórki w obrębie wybranej siatki; dla komórek hodowanych przy konfluencji około 50% można spodziewać się około 80 komórek na siatce o powierzchni 600 µm², co zapewni grupę N wynoszącą około 30 do 40 komórek eksperymentalnych i kontrolnych.

Po wstrzyknięciu należy umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze na wybrany czas w celu przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej. Należy usunąć pożywkę wzrostową i utrwalić komórki formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie należy zastąpić utrwalacz roztworem XPBS.

Następnie udokumentuj rozmieszczenie komórek, wykonując od pięciu do 10 obrazów w jasnym polu wybranej siatki przy niskim i wysokim powiększeniu. Aby zidentyfikować komórki poddane mikroiniekcji, wykonaj obrazy fluorescencyjne przy długościach fal wzbudzenia i emisji obojętnego barwnika iniekcyjnego. Używając mikroskopu konfokalnego, zgromadź stos obrazów mikroiniekcyjnych komórek przy wysokim powiększeniu w obrębie tej samej wcześniej obrazowanej siatki.

Wymagane jest duże powiększenie w celu skorelowania obrazów fluorescencyjnych ze strukturami subkomórkowymi, które zostaną zidentyfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej. Po obrazowaniu konfokalnym należy użyć płynu do usuwania szkiełek nakrywkowych, aby oddzielić szkiełko od naczynia, a następnie umieścić je stroną z komórkami do góry w nowym naczyniu hodowlanym zawierającym jeden XPBS. Następnie należy przejść do przetwarzania próbek pod kątem mikroskopii elektronowej.

Należy postępować zgodnie ze standardowymi protokołami EM. Aby utrwalić, zabarwić i odwodnić próbki, należy przygotować żywicę epon i umieścić szkiełko nakrywki stroną z komórkami do dołu w probówce wypełnionej żywicą epon. Pozostawić żywicę do polimeryzacji w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.

Aby usunąć szkiełko nakrywkę z żywicy epon, należy szybko zanurzyć ją w ciekłym azocie. Powoduje to szok termiczny z 60 °C do -196 °C.

Usunięto szkiełko przykrywowe z probówki z żywicą. Odczekaj od pięciu do 10 minut, a następnie wyjmij probówkę, z której szkiełko przykrywowe zostało już oddzielone. Pod stereomikroskopem obejrzyj powierzchnię żywicy, aby zlokalizować interesującą Cię siatkę.

Używając sterylnego ostrza do golenia lub skalpela, przytnąć blok epon tak, aby w wierzchołku bloku znajdowała się tylko interesująca nas siatka; za pomocą ultramikrotomu wykonać seryjne przekroje z przyciętego bloku, a następnie kontrastować preparaty przy użyciu octanu uranylu i cytrynianu ołowiu zgodnie ze standardowymi protokołami. Zlokalizować pożądane komórki w mikroskopie elektronowym, posługując się względnym rozmieszczeniem komórek jako wskazówką, wykorzystując wcześniej wykonane obrazy fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości.

Zidentyfikuj w mikrofotografii elektronowej obszary zainteresowania odpowiadające sygnałowi fluorescencyjnemu. Wykorzystaj punkty orientacyjne, takie jak położenie heterochromatyny i otoczka jądrowa, aby ustalić, który obraz fluorescencyjny Zack odpowiada przekrojowi EM. Korzystając z programu do obrazowania, takiego jak Image J lub Adobe Photoshop, zmniejsz przezroczystość obrazu fluorescencyjnego do 50% i nałóż go na odpowiadający mu obraz TEM.

Dopasuj obrazy, regulując wyświetlaną skalę. Oto wyniki mikroiniekcji oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej. Ten obraz przedstawia mikrografię w polu jasnym komórek NRK rosnących na szkiełku nakrywkowym z trawioną laserowo siatką szklaną.

Zwróć uwagę na litery tła b i m używane do identyfikacji siatki zawierającej wstrzyknięte komórki. Strzałki wskazują dwie komórki zidentyfikowane i obrazowane za pomocą mikroskopii elektronowej. Przedstawiony tutaj obraz fluorescencyjny pokazuje obojętny barwnik śledzący cascade blue, użyty do identyfikacji komórek poddanych mikroiniekcji.

Oto nałożenie sygnałów w polu jasnym i fluorescencyjnych dla małej cząsteczki znakowanej aminą. Ten panel przedstawia korelację mikroskopii w polu jasnym, fluorescencyjnej i elektronowej wstrzykniętej komórki. Grot strzałki wskazuje fluorescencyjne punkty (puncta), zobrazowane przy większym powiększeniu na tym panelu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić mikroiniekcję interesującego białka oraz jak śledzić indukowane przez nie wewnątrzkomórkowe zmiany morfologiczne, wykorzystując procedurę mikroiniekcji CLEM, czyli korelatywnej mikroskopii świetlnej i elektronowej.