Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji mikrowstrzykiwanych cząsteczek i ich eukariotycznych celów subkomórkowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie znakowanych fluorescencyjnie małych cząsteczek lub białek do cytoplazmy hodowanej komórki ssaków i obserwacja indukowanych zmian morfologicznych z rozdzielczości mikrometrowej na wielonanometrową. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę komórek ssaków na szkiełkach nakrywkowych z siatką i mikrowstrzyknięcie im znakowanej fluorescencyjnie małej cząsteczki lub białka będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie komórki są utrwalane w formaldehydzie, obserwowane i obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Następnie komórki utrwala się aldehydem glutarowym, dzielą, barwi i obrazuje za pomocą mikroskopii elektronowej. Na koniec obrazy wykonane podczas mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej w jasnym polu są łączone i wyrównywane. Ostatecznie korelacja tych obrazów pozwala badaczowi na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości perturbacji wywołanych przez małą cząsteczkę lub białko będące przedmiotem zainteresowania.

Cześć, nazywam się dr Evan Reddick i pracuję w laboratorium dr Neila Alto na wydziale mikrobiologii w University of Texas Southwestern Medical Center w Dallas. Dzisiaj opowiem Wam o procedurze M Clem, czyli mikroiniekcji, korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z samodzielnymi technikami, takimi jak mikroiniekcja lub mikroskopia, jest to, że tutaj są one wykonywane razem i wspomagane przez użycie szkiełka nakrywkowego z siatką.

To właśnie ten szkiełko nakrywkowe w siatkę pozwala badaczom powrócić do tej samej komórki podczas różnych części protokołu. Ponadto technika ta daje badaczowi możliwość obserwowania subkomórkowych zmian architektonicznych z szerokiej gamy małych cząsteczek lub białek do wstrzykiwania, i to z rozdzielczością od mikrometra do wielu nanometrów. Aby przygotować się do hodowli mikroiniekcyjnej, komórek, takich jak normalna nerka szczura lub unieśmiertelnione komórki raka szyjki macicy, na blaszonych szkiełkach nakrywkowych z fototrawionego szkła, umieszczonych na dwóch żywych komórkach, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

W zależności od harmonogramu eksperymentu, który ma być użyty, dostosuj płynność współdziałania komórek. W pełni zlewająca się płytka bardzo utrudni identyfikację mikro wstrzykniętych komórek w mikroskopie elektronowym. Dlatego komórki nasienne takie jak one osiągają około 50% płynności co w dniu krótkiego eksperymentu i około 25% płynności co.

W dniu dłuższego eksperymentu Przygotuj znakowane fluorescencyjnie białko DNA lub małe cząsteczki w odpowiednim buforze do końcowej objętości 50 mikrolitrów. W zależności od wybranego fluoru dodaj barwnik śledzący, taki jak czerwień teksańska lub błękit kaskadowy. Dodaj stężenie od 0,5 do jednego miligrama na mililitr.

Przefiltruj roztwór przez filtr odśrodkowy o wielkości 0,22 mikrona. Po wyciągnięciu igieł do mikroiniekcji zgodnie z wytycznymi producenta, ostrożnie pipetować do mikrolitrów roztworu do tylnej części igły. Załaduj igłę do ramienia mikromanipulatora komercyjnego urządzenia do mikroiniekcji podłączonego do odwróconego mikroskopu.

Umieść naczynie z hodowanymi komórkami w uchwycie naczynia mikroskopu odwróconego. Znajdź komórki rosnące w siatce fototrawionej i zanotuj alfanumeryczny identyfikator siatki. Zostanie to wykorzystane we wszystkich kolejnych krokach.

Ważne jest, aby wybierać komórki do mikroiniekcji, które są przyklejone blisko środka szkiełka nakrywkowego, i unikać tych znajdujących się blisko obrzeży. Jest to ważne, ponieważ zapewni to wydajny transfer interesujących komórek do centralnej części z żywicy epon, która zostanie później użyta do mikroskopii elektronowej Ręcznie, ręcznie opuść ramię iniekcyjne na szkiełko nakrywkowe i użyj mikromanipulatora, aby opuścić igłę, aż końcówka delikatnie dotknie powierzchni komórek. Mikro wstrzyknij co drugą komórkę w wybranej siatce dla komórek hodowanych z płynnością około 50% Co, spodziewaj się około 80 komórek na siatkę 600 mikrometrów kwadratowych, co da N około 30 do 40 eksperymentalnych i kontrolowanych komórek.

Po wstrzyknięciu należy umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze na żądany okres czasu w celu przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej. Wyrzuć pożywkę wzrostową i utrwal komórki formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zastąp utrwalacz jednym XPBS.

Następnie udokumentuj rozmieszczenie komórek, wykonując od pięciu do 10 zdjęć wybranej siatki w jasnym polu przy małym i dużym powiększeniu. Aby zidentyfikować mikro wstrzyknięte komórki, wykonaj obrazy fluorescencyjne na długościach fal wzbudzenia i emisji obojętnego oka barwnika iniekcyjnego. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zbierz Zacka obrazy mikrokomórek, którym wstrzyknięto mikro komórki w dużym powiększeniu w tej samej wcześniej zobrazowanej siatce.

Duże powiększenie jest potrzebne do skorelowania obrazów fluorescencyjnych ze strukturami subkomórkowymi, które zostaną zidentyfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej. Po obrazowaniu konfokalnym użyj płynu do usuwania szkiełek nakrywkowych, aby oddzielić szkiełko nakrywkowe od naczynia i umieść je komórką do góry w świeżym naczyniu hodowlanym zawierającym jeden XPBS. Przejdź do przetwarzania pod mikroskopię elektronową.

Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami EM. Aby utrwalić plamę i odwodnić próbki, przygotuj żywicę epon i umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na probówce wypełnionej żywicą eonową. Pozostaw żywicę do polimeryzacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Aby usunąć szkiełko nakrywkowe z żywicy epon. Szybko zanurz go w ciekłym azocie. Szok temperaturowy od 60 stopni Celsjusza do minus 196 stopni Celsjusza.

Usuwa szkiełko nakrywkowe z rurki z żywicą. Odczekaj od pięciu do 10 minut, a następnie wyjmij probówkę, która jest teraz wolna od szkiełka nakrywkowego. Pod lunetą sekcyjną sprawdź powierzchnię żywicy, aby zlokalizować interesującą Cię siatkę.

Za pomocą sterylnej żyletki lub skalpela przytnij blok epon w taki sposób, aby tylko siatka zainteresowania znajdowała się na wierzchołku bloku, z ultramikrotonowymi ciętymi szeregowymi sekcjami przyciętego bloku, użyj octanu pisuaru i cytrynianu ołowiu, aby skontrastować sekcje przy użyciu standardowych protokołów. Przenieś żądane komórki w mikroskopie elektronowym, używając względnego położenia komórek jako przewodnika. Korzystając z wcześniej wykonanych obrazów fluorescencyjnych o wysokiej rozdzielczości.

Zidentyfikuj obszary zainteresowania na mikrofotografii elektronowej, które odpowiadają sygnałowi fluorescencyjnemu. Użyj punktów orientacyjnych, takich jak położenie heterochromatyny i otoczki jądrowej, aby określić, który fluorescencyjny obraz Zacka odpowiada wycinkowi EM. Obecnie obrazowany za pomocą programu do obrazowania, takiego jak Image J lub Adobe Photoshop, zmniejsz krycie obrazu fluorescencyjnego do 50% i nałóż go na odpowiedni obraz TEM.

Wyrównaj obrazy, dostosowując pokazaną skalę. Oto wyniki mikroiniekcji oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej. To zdjęcie przedstawia mikrofotografię w jasnym polu komórek NRK rosnących na szkiełku nakrywkowym trawionym laserowo.

Zwróć uwagę na litery b i m w tle używane do identyfikacji siatki zawierającej wstrzyknięte komórki. Strzałki wskazują dwie komórki zidentyfikowane i zobrazowane za pomocą mikroskopii elektronowej. Pokazano tutaj fluorescencyjny obraz obojętnej kaskady barwników śledzących w kolorze niebieskim, używany do identyfikacji mikrokomórek, którym wstrzyknięto mikro.

Oto nakładka sygnałów jasnego pola i fluorescencji małej cząsteczki znakowanej aminą. Panel ten przedstawia korelację mikroskopii fluorescencyjnej w jasnym polu i mikroskopii elektronowej wstrzykniętej komórki. Grot strzałki wskazuje fluorescencyjną punktualność zobrazowaną w większym powiększeniu w tym panelu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mikrowstrzykiwać interesujące Cię białko i śledzić jego subkomórkowe zmiany morfologiczne, które wywołuje, za pomocą procedury mikroiniekcji Clem lub korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej.