Cytometria przepływowa z użyciem zablokowanych kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (LNA flow-FISH): metoda detekcji bakteryjnych małych RNA

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie ekspresji bakteryjnego RNA w poszczególnych komórkach bakteryjnych. Osiąga się to najpierw poprzez zaprojektowanie sondy z zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA) z modyfikacją biotyny TEG na końcu 5'. Jeśli następnie komórki bakteryjne zostaną utrwalone, poddane działaniu dathylu, nadtlenku sodu lub dsy, a w następnym kroku przepuszczone, RNA ulega denaturacji, a sonda LNA ulega hybrydyzacji.

Po trzecie, komórki są przemywane, blokowane i barwione. Na koniec fluorescencję komórkową mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej. W rezultacie można ocenić zmiany w ekspresji RNA w czasie oraz w obrębie populacji.

Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące względnej obecności i obfitości gatunków RNA w pojedynczej komórce oraz stopnia, w jakim ekspresja ta zmienia się w populacjach homogenicznych lub heterogenicznych. Chociaż metoda ta jest obecnie wykorzystywana do monitorowania ekspresji bakteryjnych małych RNA, w teorii może być stosowana do wykrywania RNA w potencjalnie każdym typie komórki. Po zaprojektowaniu sekwencji sondy LNA, należy użyć narzędzia blast, aby upewnić się, że sonda jest swoista wyłącznie dla interesującego nas SRNA lub mRNA.

Przy zamawianiu sondy należy dodać modyfikację biotyny TEG na końcu 5' oligonukleotydu LNA. Dołączenie biotyny jest niezbędne do barwienia po hybrydyzacji przy użyciu koniugatu streptawidyna-digoksygenina. W metodzie należy uwzględnić trzy kontrole negatywne: kontrolę 1A, czyli kontrolę bez LNA, w której podczas hybrydyzacji nie dodaje się sondy LNA.

Krok drugi, kontrola negatywna barwnika, w której sonda LNA hybrydyzuje z docelowym sRNA, ale zdarzenie hybrydyzacji nie jest wykrywane ze względu na brak barwnika fluorescencyjnego. I trzeci, kontrola nieekspresyjnego sRNA lub mRNA, wykorzystująca sondę LNA skierowaną przeciwko nieistniejącemu lub nieekspresyjnemu sRNA w celu monitorowania hybrydyzacji niespecyficznej; należy rozpocząć od zebrania 1×10⁸ komórek badanych bakterii i przeniesienia ich do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie należy odwirować komórki bakteryjne przy 2300 ×g przez pięć minut.

Usuń nadsącz za pomocą pipety, nie przez zlanie. Następnie resuspenduj osad w 400 µL PBS, dodaj 400 µL utrwalacza PFA z kwasem octowym w PBS i dokładnie wymieszaj komórki. Teraz inkubuj zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 25 °C.

Po ponownym odwirowaniu komórek przy 4 500 ×g przez dwie minuty, należy po pięciu minutach raz wymieszać zawiesinę w wirówce Vortex. Osad należy przemyć dwukrotnie 400 µl PBS.

Na koniec ponownie zawiesić osad w 400 µL PBS i przechowywać utrwalone komórki w temperaturze 4°C do siedmiu dni. Rozpocząć od dodania 400 µL świeżo przygotowanego, 1% roztworu dsy do każdej próbki utrwalonych komórek bakteryjnych. Następnie dokładnie wymieszać zawiesiny komórkowe za pomocą pipety.

Inkubować tę mieszaninę przez 12 minut w temperaturze 25 °C, a następnie, po dwukrotnym przemyciu komórek 400 µL PBS, dodać do nich 800 µL świeżo przygotowanego roztworu lizozymu. Roztwór komórek z lizozymem dokładnie wymieszać za pomocą vortexa i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 25 °C, sporadycznie mieszając. Po odwirowaniu komórek dodać 800 µL świeżo przygotowanego roztworu proteinazy K do osadu i dokładnie wymieszać resuspensję komórek za pomocą pipetowania.

Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 25 °C, mieszając w wirówce (vortex) w połowie czasu inkubacji. Po odwirowaniu i przemyciu komórek 400 µL PBS, resuspendować je w kolejnych 400 µL PBS, a następnie przenieść po 100 µL zawiesiny do czterech osobnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml; po tym czasie osadzić komórki i usunąć nadsącz. Następnie inkubować wszystkie cztery próbki w 100 µL buforu do hybrydyzacji w temperaturze 60 °C przez 60 minut. Po zakończeniu hybrydyzacji dodać 1 ml roztworu SSC z dodatkiem Tween 20 (SSCT) do mieszaniny hybrydyzacyjnej, aby umożliwić oddzielenie komórek od lepki roztworu do hybrydyzacji.

Po odwirowaniu i zebraniu osadu, do pelletów dodaje się 200 µL roztworu formamidu SSCT i dokładnie miesza. Następnie próbki inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzejnym. Do mieszaniny dodaje się 1 mL SSCT, a po ponownym odwirowaniu i zebraniu osadu, komórki resuspenduje się w 500 µL SSCT i inkubuje roztwór komórkowy przez 40 minut w bloku grzejnym.

Po wirowaniu i otrzymaniu osadu, do zhybrydyzowanych komórek dodaje się 200 µL buforu blokującego, a następnie inkubuje komórki przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Po ponownym wirowaniu, w przypadku kontroli bez barwnika, do osadów dodaje się 50 µL roztworu stripped avid and dye, a następnie dokładnie miesza komórki. Dodaje się 50 µL buforu blokującego.

Wszystkie próbki inkubować przez kolejne 12 minut w temperaturze 25°C przy stałym mieszaniu w termomikserze, chroniąc probówki przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Następnie komórki przemyć raz 500 µL buforu SSCT i raz 400 µL PBS z dodatkiem tween 20 lub PBST. Po usunięciu nadsączów dodać 100 µL biotynilowanych przeciwciał przeciwko strippinowi w PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25°C, mieszając sporadycznie; przeciwciało to zwiąże się z koniugatem strippin DI wprowadzonym w poprzednim kroku.

Następnie, po odwirowaniu i dwukrotnym przemyciu komórek 400 µl PBST, przeprowadź ponowne barwienie, dodając do komórek 50 µl roztworu strippingowanego avid i barwnika, a następnie wymieszaj dokładnie. Krok ten zwiększa moc sygnału na każdą zhybrydyzowaną sondę LNA dla kontroli bez barwnika. Ponownie dodaj 50 µl samego buforu blokującego, a następnie inkubuj wszystkie probówki przez 12 minut w temperaturze 25 °C w termomikserze przy stałym mieszaniu.

Po inkubacji z roztworem barwnika ponownie przemyj komórki 500 µl buforu SSCT, a następnie raz 400 µl PBST po drugim płukaniu. Ponownie zawieś osad w 200 µl PBST i przechowuj komórki w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia analizy cytometrycznej. W przypadku mniejszych komórek bakteryjnych ustaw prędkość przepływu w cytometrze na niską, aby zmniejszyć rozmiar rdzenia (core size). Dodatkowo, w przypadku cytometrów przepływowych z progami odcięcia dla rozproszenia światła w przód (forward scatter threshold), ustaw próg na jak najniższą wartość, aby zapewnić detekcję małych komórek bakteryjnych.

Przykład komórek, które zostały skutecznie utrwalone i permeabilizowane, przedstawiono tutaj na wykresie kropkowym z cytometrii przepływowej przy zastosowaniu opisanych wcześniej warunków. W przypadku permeabilizacji populacja komórek jest niewielka i homogenna, co wskazuje na małą liczbę agregatów komórkowych. Jednakże przy zastosowaniu wyższych stężeń lizozymu komórki mają większą tendencję do agregowania się i wykazują zwiększone wartości rozproszenia przedniego (forward scatter), co świadczy o obecności większych cząstek, jak widać na tym wykresie kropkowym.

Poniżej przedstawiono przykład danych z cytometrii przepływowej z udanego eksperymentu LNA flow fish. Histogram wykazuje specyficzne wykrycie docelowego SRNA wraz z trzema kontrolami negatywnymi. Kontrola negatywna bez barwnika (no die) zaznaczona kolorem fioletowym wykazuje najniższą fluorescencję, a następnie występują kontrole negatywne bez LNA (no LNA) oraz SRNA niewyrażanego (non expressed SRNA), odpowiednio w kolorze niebieskim i czerwonym.

Ostatecznie próbka z LNA specyficzną dla SRNA wykazuje największą fluorescencję w kolorze czarnym. Po opanowaniu techniki, jej prawidłowe przeprowadzenie zajmuje około sześciu godzin. Ponadto metoda ta dostarcza więcej informacji i jest bardziej opłacalna niż R-T-P-C-R.

Po przeprowadzeniu tej procedury można znakować dodatkowe sondy innymi HAPS i dodawać je podczas etapu hybrydyzacji, aby umożliwić multipleksową detekcję RNA.I.