Name: Znakowanie immunohistologiczne mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych, tchawicy i mięśniach w ścianie ciała larwy Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę znakowania mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych larw Drosophila za pomocą immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie organizacji mikrotubul w tkankach ciała larwy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy instytucji RIKEN za finansowanie. P10-Gal4 był uprzejmym darem Alaina Vincenta (Université Paul Sabatier, Tuluza, Francja).

1. Przygotowanie odczynników
Uwagi przed rozpoczęciem: Disekcję oraz barwienie immunohistochemiczne przeprowadza się w komorze magnetycznej, a larwę unieruchamia się za pomocą specjalnie uformowanych szpilek entomologicznych. Szczegółowe instrukcje dotyczące konstrukcji komory magnetycznej oraz przygotowania tych szpilek znajdują się w powiązanych referencjach 14,15. W skrócie, w arkuszu magnetycznym wycina się kwadratowy otwór o wymiarach 1x1cm, a do tylnej części arkusza przymocowuje się szkiełko nakrywkowe, tworząc niewielką komorę. Boki komory uszczelnia się klejem epoksydowym; po zastygnięciu kleju komorę należy kilkakrotnie przemyć 70% etanolem przed użyciem. Szpilki do dyssekcji przygotowuje się poprzez zgięcie ich do pożądanego kształtu, a następnie przykleja do metalowej zakładki14,15. Zamiast metalowej zakładki stosowaliśmy odwrócony stalowy pinezkę z płaską główką z uchwytem wykonanym z odciętej żółtej końcówki. Zastosowanie takiej konfiguracji komory magnetycznej pozwala na precyzyjną kontrolę nad rozmieszczeniem szpilek i rozciąganiem tkanki podczas dyssekcji.
Aby wywołać ekspresję genu reporterowego w różnych podzbiorach neuronów DA, badacze mogą wykorzystać kilka różnych linii Gal4 (podsumowanych przez Shimono i współpracowników16). Wiele z tych linii jest dostępnych w publicznych centrach zasobów. W tym reprezentatywnym protokole przeprowadzamy immunobarwienie linii, w której współetykietowane są dwie kontrastujące klasy neuronów DA: najprostsza – klasa I oraz najbardziej złożona – klasa IV (P10-Gal417,18, UAS-mCD8::Kusabira-Orange (KO)).
<ol>
 <li>Przygotuj sól fizjologiczną HL3.1 wolną od Ca++
 <ol>
 <li>Skład w mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl2 , 10 NaHCO3 , 5 HEPES, 115 sacharozy oraz 5 trehalozy; pH 7,219. Sterylizuj przez filtrowanie i przechowuj w 4°C. Uwaga: Roztwór wolny od Ca++ zapobiega skurczom mięśni podczas sekcji.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotuj bufor PHEM 2x
 <ol>
 <li>Skład w mM: 130 PIPES, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Sterylizuj przez filtrowanie i przechowuj w 4°C.
 Uwaga: Składniki te nie rozpuszczą się, dopóki pH nie zbliży się do 7,0.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotuj utrwalacz bezpośrednio przed przeprowadzeniem fiksacji.
 <ol>
 <li>Aby przygotować 25 ml roztworu, najpierw zmieszaj 2 g paraformaldehydu, 100 μl 1M NaOH i 10 ml wody w probówce typu Falcon o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Wstrząsaj utrwalacz w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C z użyciem mieszadla, aż roztwór stanie się przejrzysty. (Całkowita objętość wyniesie około 11,5 ml).</li>
 <li>Schłodź utrwalacz na lodzie.</li>
 <li>Dodaj 12,5 ml buforu PHEM 2x.</li>
 <li>Dostosuj pH do 7,0 za pomocą 1M HCl.</li>
 <li>Dopełnij roztwór wodą do objętości 25 ml.</li>
 <li>Przefiltruj roztwór przez papier Whatmana.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Disekcja larw
Uwaga przed rozpoczęciem: Sieci mikrotubul, a w szczególności te w dendrytach sensorycznych, ulegają szybkiej degradacji po rozpoczęciu sekcji. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces tego protokołu są szybkie przeprowadzenie sekcji w czasie krótszym niż pięć minut oraz natychmiastowa fiksacja.
<ol>
 <li>Przemyj larwę w wodzie i szybko przenieś ją do kropli za pomocą pętli z włosa.</li>
 <li>Ułóż larwę stroną grzbietową do góry, a stroną brzuszną do szkła. Uwaga: Taka orientacja służy do badania neuronów skupiska brzusznego. Aby zbadać neurony skupiska grzbietowego, należy odwrócić orientację.</li>
 <li>Użyj centralnej szpilki entomologicznej, aby przymocować koniec przedni w pobliżu haczyków gębowych. Dla uzyskania najlepszych rezultatów umieść szpilkę blisko końca.</li>
 <li>Umieść kroplę soli fizjologicznej HL3.1 w komorze do sekcji.</li>
 <li>Odcięty sam skrajny koniec tylny larwy za pomocą mikronożyczek. Uwaga: Ten krok otwiera otwór w tylnej części larwy, co umożliwi dostęp mikronożyczkom (krok 2.7).</li>
 <li>Chwyć pęsetą odcinek jelita, który teraz wystaje z otworu na tylnym końcu larwy. Delikatnie wyciągnij całe jelito.</li>
 <li>Wprowadź końcówkę jednego ostrza mikronożyczek przez otwór i przetnij wzdłuż linii środkowej brzusznej w kierunku przednim.</li>
 <li>Używając szpilek narożnych, przymocuj teraz wolne narożniki – najpierw tylne, a następnie przednie. Jednocześnie delikatnie rozciągnij preparat larwy.</li>
</ol>
3. Fiksacja, blokowanie, barwienie i montaż preparatów z przekrojów poprzecznych larw
Uwagi przed rozpoczęciem: Wszystkie etapy fiksacji i barwienia są przeprowadzane w komorze do sekcji. Podczas tego procesu należy uważać, aby nie potrącić szpilek entomologicznych utrzymujących larwę, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia tkanek. Aby zapobiec wysychaniu preparatu, wszystkie etapy barwienia należy przeprowadzać w małym pojemniku typu Tupperware, otoczonym zwilżonymi chusteczkami.
<ol>
 <li>Odssać bufor HL3.1 wolny od Ca++ za pomocą żółtej końcówki. Bezzwłocznie dodać utrwalacz, używając innej pipety automatycznej.</li>
 <li>Delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół, aby zmieszać utrwalacz z pozostałymi śladami buforu HL3.1 wolnego od Ca++ w komorze. Natychmiast go odessać, a następnie dodać do komory świeży utrwalacz.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
 <li>Przemyć 6 razy po 10 min w PBST (0,1% Triton X-100 w PBS).</li>
 <li>Blokować 5% surowicą kozią w PBST przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zastąpić roztwór blokujący przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBST. Stosowane przeciwciała pierwszorzędowe to mysie anty-α-Tubulin (DM1A) oraz szczurze anty-CD8 (5H10), oba rozcieńczone 1/1000. 
 Uwaga: W pewnych okolicznościach badacz może chcieć zastąpić mysie anty-α-Tubulin (DM1A) mysimi anty-Futsch (22C10)20,21 rozcieńczonymi 1/1000 (patrz dyskusja).</li>
 <li>Inkubować przez noc (przez co najmniej 16 h) w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przemyć 6 razy po 10 min w PBST.</li>
 <li>Dodać roztwór przeciwciał wtórnych rozcieńczony w 5% surowicy koziej w PBST. Stosowane przeciwciała wtórne to Alexa Fluor 488 kozie anty-mysie IgG oraz Cy3 osioł anty-szczurze IgG. Próbkę należy trzymać przykrytą, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforów22.</li>
 <li>Inkubować albo w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, albo przez noc w temperaturze 4°C, a następnie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć 6 razy po 10 min w PBST.</li>
 <li>Umieścić preparat z larwy na szkiełku stroną kutykuli do dołu, zamontować w 80% glicerolu i uszczelnić brzegi szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci w celu wykonania „szybkiego” montażu. 
 Uwaga: Aby uzyskać lepsze klarowanie tkanki i trwały, stabilny preparat, należy zamontować w DPX zgodnie z wcześniejszym opisem23.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Barwienie fluorescencyjne analizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Na rysunkach 1-2 różne gałęzie w obrębie drzewa dendrytów wykazują odmienną organizację cytoszkieletu. Rysunek 1 przedstawia fragment drzewa dendrytów neuronu DA klasy IV w pierwszym stadium larwalnym (1st instar). Całe drzewo jest oznakowane mCD8::KO i wykryte przy użyciu przeciwciała anty-CD8 oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Cy3). Tubulinę wykryto za pomocą przeciwciała anty α-Tubulin oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488). Główne gałęzie są dodatnie pod kątem obecności tubuliny, natomiast niektóre cienkie gałęzie boczne są ujemne pod kątem tubuliny. Film 1 stanowi zestaw przekrojów seryjnych podobnego barwienia neuronu DA klasy I. Rysunek 2 przedstawia fragment drzewa dendrytów neuronu DA klasy IV zabarwionego przeciwciałami przeciwko Futsch i CD8 w pierwszym stadium larwalnym (1st instar). Główne gałęzie są dodatnie pod kątem Futsch, a niektóre cienkie gałęzie boczne są ujemne pod kątem Futsch. Rysunek 3. Tracheje w ścianie ciała larwy wykazują złożoną organizację mikrotubul. Filmy 2 i 3 przedstawiają przekroje seryjne barwienia mięśni ściany ciała i trachei.
<img alt="mikroskopia fluorescencyjna mCD8 α-Tubulin, lokalizacja białek, wynik eksperymentalny, analiza obrazowania komórkowego" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rys. 1 przedstawia obszar arboryzacji neuronu DA klasy IV w pierwszym stadium larwalnym (1st instar). Cała arboryzacja jest znakowana mCD8::KO i wykrywana przy użyciu przeciwciała anty-CD8 oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Cy3). Tubulinę wykrywa się za pomocą przeciwciała anty-&amp;-Tubulin oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Alexa 488). Panele A-C: sekwencyjne przekroje konfokalne w osi z (0,5μm), C'-C": barwienie pojedynczym przeciwciałem z panelu C. Wyróżniono przykłady gałęzi z mikrotubulami (żółta grot strzałki) lub bez mikrotubul (fioletowa grot strzałki). Czerwone groty strzałek wskazują mikrotubule w leżących poniżej komórkach nabłonkowych.
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej białek mCD8 i α-Futsch, zaznaczonych kolorowymi markerami." src="/files/ftp_upload/3662/3662fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ryc. 2 przedstawia podobny obszar drzewa dendrytycznego neuronu da klasy IV, barwionego przeciwciałami przeciwko Futsch i CD8 w 1st stadium larwalnym. Całe drzewo dendrytyczne jest znakowane mCD8::KO i wykrywane za pomocą przeciwciała anty-CD8 oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Cy3). Futsch jest wykrywany za pomocą przeciwciała anty-Futsch oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Alexa 488). Główne gałęzie są dodatnie pod kątem Futsch, natomiast niektóre cienkie gałęzie boczne są ujemne pod kątem Futsch. Wyróżniono przykłady gałęzi z Futsch (żółta grot grota) oraz bez Futsch (fioletowy grot grota).
<img alt="Struktura α-tubuliny, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, podkreślający sieć mikrotubul, skala 37.5µm." src="/files/ftp_upload/3662/3662fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Tkanka tchawki barwiona zgodnie z opisanym powyżej protokołem anty-tubulinowym. Larwa znajduje się w trzecim stadium rozwojowym i została poddana sekcji zgodnie z wcześniejszym opisem23,24. Film 3 przedstawia powiększone przekroje seryjne z pola zaznaczonego kwadratem.
Film 1. Przekroje seryjne obrazujące barwienie tubuliny w całym drzewie dendrytycznym neuronu klasy I. Całe drzewo zaznaczono mCD8::KO (magenta) i wykryto za pomocą przeciwciała anty-CD8 oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Cy3). Tubulinę (zieleń) wykryto za pomocą przeciwciała anty-α-Tubulin oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488). Skala: jeden bok obrazu wideo odpowiada 46,88μm w przekroju. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie1.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>
Film 2. Przekroje seryjne obrazujące barwienie tubuliny w mięśniach ściany ciała larwy trzeciego instaru. Tubulinę wykryto przy użyciu przeciwciała przeciwko α-Tubulinie oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488). Skala: jeden bok obrazu wideo odpowiada 46.88μm w przekroju. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie2.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>
Film 3. Przekroje seryjne obrazujące barwienie tubuliny w tchawce ściany ciała larwy trzeciego stadium, zaznaczonej kwadratem na Ryc. 3. Tubulinę wykryto przy użyciu przeciwciała anty-α-Tubulin oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488). Skala: jeden bok obrazu wideo odpowiada 46.88μm w przekroju. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie3.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>

<ol><li>Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+continued%3A+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamon+y+Cajal%2C+S+%22Histology+of+the+nervous+system+of+man+and+vertebrates%2C+1995+translation%22">Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation</a>. , Oxford University Press. (1911).</li>
<li>London, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic computation.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament-stabilizing+protein+tropomyosin+regulates+the+size+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields.</a> J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).</li>
<li>Ye, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+dendritic+and+axonal+development+by+the+novel+Kruppel-like+factor+Dar1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1.</a> J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63, 788-802 (2009).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+methods+for+the+anatomical+study+of+Drosophila+embryonic+and+larval+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions.</a> Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+action+of+Engrailed+and+Gooseberry-Neuro+in+neuroblast+6-4+is+triggering+the+formation+of+embryonic+posterior+commissure+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles.</a> PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).</li>
<li>Dubois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collier+transcription+in+a+single+Drosophila+muscle+lineage%3A+the+combinatorial+control+of+muscle+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity.</a> Development. 134, 4347-4355 (2007).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26, 357-370 (2000).</li>
<li>Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+development+in+the+Drosophila+retina%3A+monoclonal+antibodies+as+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes.</a> Cell. 36, 15-26 (1984).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+Analysis+of+Drosophila+Larval+Peripheral+Sensory+Neuron+Dendrites+and+Axons+Using+Genetic+Mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics.</a> J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).</li>
<li>Tao, J., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+have+a+rapid+program+of+injury-induced+degeneration+that+is+molecularly+distinct+from+developmental+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning.</a> J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).</li>
<li>Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+axonal+sprouting+and+dendrite+branching+by+the+Nrg-Ank+complex+at+the+neuron-glia+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface.</a> Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).</li>
<li>Mattie, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+microtubule+growth%2C+%2BTIPs%2C+and+kinesin-2+are+required+for+uniform+microtubule+polarity+in+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites.</a> Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).</li>
<li>Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin-dependent+synaptic+growth%3A+evidence+that+Dlar+signals+via+Diaphanous+to+modulate+synaptic+actin+and+dynamic+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules.</a> J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Aby zrozumieć, w jaki sposób powstają złożone kształty komórek, ważne jest umożliwienie dokładnej oceny organizacji mikrotubul. W niniejszym opracowaniu opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do oceny organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych o rozgałęzienym drzewie dendrytycznym. Poza barwieniem neuronów sensorycznych, metoda ta pozwala na skuteczne barwienie immunohistologiczne tchawki, mięśni oraz innych tkanek ściany ciała.
Niniejszy protokół ...

<table><tbody><tr><td>Pinceta</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko &amp;alpha;-tubulinie (Klon: DM1A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Rozcieńczenie 1/1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko Futsch (Klon: 22C10), nadsącz</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>22C10</td><td>Rozcieńczenie 1/1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało szczurze przeciwko CD8 (Klon: 5H10)</td><td>Caltag</td><td>MCD0800</td><td>Rozcieńczenie 1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało przeciwko mysiej IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Cy3 przeciwciało przeciwko szczurzej IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-166-150</td><td>Rozcieńczenie 1/200</td></tr></tbody></table>

immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy drosophila

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

Aby zrozumieć, w jaki sposób powstają różnice w złożonych kształtach komórek, ważne jest dokładne śledzenie organizacji mikrotubul. Ściana ciała larwy Drosophila zawiera kilka typów komórek, które służą jako modele do badania morfogenezy komórek i tkanek. Na przykład tchawki są wykorzystywane do badania morfogenezy cewek1, a neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej (DA) larwy Drosophila stały się głównym systemem do wyjaśniania ogólnych i specyficznych dla klasy neuronów mechanizmów różnicowania dendrytów2-5 oraz ich degeneracji6.
Kształt gałęzi dendrytów może znacznie różnić się pomiędzy klasami neuronów, a nawet pomiędzy różnymi gałęziami jednego neuronu7,8. Badania genetyczne w neuronach DA sugerują, że różnice w organizacji cytoszkieletu mogą leżeć u podstaw różnic morfologicznych w kształcie gałęzi dendrytycznych4,9-11. Przedstawiamy niezawodną metodę znakowania immunologicznego do badania organizacji mikrotubul in vivo w arboryzacji dendrytów neuronów sensorycznych DA (Ryciny 1, 2, Film 1). Niniejszy protokół ilustruje sekcję i immunobarwienie larwy pierwszego stadium, czyli etapu, w którym zachodzi aktywny wzrost dendrytów neuronów sensorycznych oraz organizacja ich rozgałęzień 12,13.
Oprócz barwienia neuronów sensorycznych, metoda ta pozwala na trwałe znakowanie organizacji mikrotubul w mięśniach (Filmy 2, 3), tchawce (Rycina 3, Film 3) oraz innych tkankach ściany ciała. Jest ona cenna dla badaczy pragnących analizować organizację mikrotubul in situ w ścianie ciała podczas badania mechanizmów kontrolujących kształt tkanek i komórek.

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób powstają różnice w złożonych kształtach komórek, ważne jest dokładne śledzenie organizacji mikrotubul. Larwalne... Drosophila...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych we wczesnym stadium larwy drosophila. Osiąga się to poprzez uprzednie unieruchomienie larwy za pomocą pinezek w magnetycznej komorze do sekcji, a następnie szybkie przeprowadzenie sekcji w celu uzyskania preparatu w formie plastra (filet) larwy. Następnie, wciąż w komorze magnetycznej, preparat zostaje natychmiast utrwalony i poddany immunobarwieniu.Ostatnim krokiem jest montaż tkanki; konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna pozwala następnie uwidocznić rozkład mikrotubul w dendrytach dopaminergicznych neuronów sensorycznych. Witam, nazywam się Ol Kareem. Dzisiaj zaprezentuję protokół immunohistochemicznego znakowania mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawce oraz mięśniach ściany ciała larwy.Metoda ta została opracowana w celu zapewnienia wglądu w organizację Myco TL w obwodowych neuronach sensorycznych. Ponadto może ona zostać zastosowana do badania sieci Myco TL oraz innych typów komórek i tkanek ściany ciała larwy. Przed rozpoczęciem: dla powodzenia tego protokołu krytyczne jest przygotowanie świeżego utrwalacza bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury.Kluczowe jest również tło genetyczne linii. Na przykład, aby zbadać arboryzację dendrytyczną neuronów, należy wybrać zwierzęta wykazujące ekspresję markera w błonach tych neuronów, takiego jak MCDA cherry lub MCDA, RA orange. Używając pętelki z włosa, szybko przemyj larwę pierwszego stadium w wodzie, a następnie przenieś ją do komory sekcyjnej.Aby zbadać neurony skupiska brzusznego, należy ułożyć larwy grzbietem do góry, tak aby strona brzuszna przylegała do szkła. W celu zbadania neuronów skupiska grzbietowego, należy zmienić orientację ciała za pomocą szpilki entomologicznej, mocując koniec przedni w pobliżu haków gębowych. Dla uzyskania najlepszych rezultatów należy umieścić szpilkę blisko końca ciała.Mikrosieci, sieci potrójne, a w szczególności te w sensorycznym DDR, ulegają szybkiej degradacji po rozpoczęciu sekcji. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces niniejszego protokołu są sprawne przeprowadzenie pierwszej sekcji oraz szybka fiksacja. Za pomocą pęsety i mikronozyci odetnij najbardziej tylny koniec larwy.Chwyć tkankę jelita wystającą z nowego otworu i ostrożnie wyciągnij całe jelito. Następnie za pomocą mikronożyczek wprowadź jedno ostrze do tego samego otworu i przetnij tkankę wzdłuż linii środkowej brzusznej w kierunku przednim. Teraz przypnij uwolnione narożniki tylne i, jeśli jest to konieczne, delikatnie rozciągnij preparat larwy w formie fileta.Szybko usuń pozostałe narządy wewnętrzne. Następnie niezwłocznie przystąp do fiksacji, aby zachować delikatne mikrotubule.Zacznij od odessania buforu HL 3.1 pozbawionego wapnia za pomocą pipety, jednocześnie napełniając komorę świeżo przygotowanym utrwalaczem. Używając innej pipety, niezwłocznie wymień ten rozcieńczony utrwalacz. Wszystkie etapy utrwalania i inkubacji przeprowadzane są w komorze do sekcji z użyciem świeżego utrwalacza.Podczas tego procesu należy uważać, aby nie potrącić szpilek entomologicznych utrzymujących larwę, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia tkanki. Pozostaw próbkę w spokoju na 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zakończyć proces fiksacji. Przemyj preparat z larwy sześciokrotnie przy użyciu PBST, wykonując każde płukanie przez 10 minut.W związku z tym larwy płukano w celu usunięcia utrwalacza przez łącznie jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Mieszanie podczas inkubacji nie jest konieczne i może spowodować przypadkowe uszkodzenie tkanek. Aby przygotować próbki do barwienia, należy usunąć ostatnią porcję buforu PBST i zablokować utrwalony filet, wypełniając komorę 5% surowicą kozią w PBST, a następnie zastąpić roztwór blokujący przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBST.Użyte przeciwciała pierwszorzędowe to mysie anty-α-tubulina oraz szczurze anty-CD8, oba rozcieńczone 1:1000. Aby zapobiec wysychaniu preparatu podczas eksperymentu, należy umieścić komorę w plastikowym pojemniku z wilgotną chusteczką. Inkubować filet w przeciwciałach przez co najmniej 16 godzin w temperaturze 4 °C.Następnego dnia nie związane przeciwciała pierwszorzędowe należy usunąć, wykonując sześć przemyć w roztworze PBST przez 10 minut każde, analogicznie do etapu usuwania utrwalacza. Po godzinie przemywania w PBST należy dodać roztwór przeciwciał wtórnych rozcieńczonych w 5% surowicy koziej w PBST. W tym przykładzie przeciwciałami są LOR 4 88, anty-mysie IgG oraz P SI trzy anty-szczurze IgG; od tego momentu należy przykryć komorę, aby zapobiec fotoblaknięciu Fluor four, a następnie inkubować preparat z przeciwciałami wtórnymi przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym usuń niezwiązane przeciwciała, stosując ten sam rygorystyczny schemat sześciu przemyć w PBST przez 10 minut każde. Teraz preparat jest gotowy do montowania; aby szybko go zamontować, zanurz tkankę w małej kropli 80% glicerolu za pomocą pęsety. Chwyć sam koniec przedniego odcinka w pobliżu haczyków gębowych i przenieś go na szkiełko przedmiotowe stroną kutykularną do dołu. Uszczelnij brzegi szkiełka nakrywnego lakierem do paznokci, aby poprawić przejrzystość tkanki i uzyskać trwały, stabilny preparat.Zgodnie z wcześniejszym opisem Mountain DPX, barwienie fluorescencyjne wykazało, że różne gałęzie w obrębie drzewa dendrytycznego wykazują odmienną organizację cytoszkieletu; w drzewie dendrytycznym neuronu DA klasy czwartej z larwy pierwszego stadium gałęzie główne są dodatnie pod kątem obecności tubuliny. Podczas gdy niektóre cienkie gałęzie boczne nie są, zestaw seryjnych przekrojów z podobnym barwieniem neuronu DA klasy pierwszej, przedstawiony w formie filmu, jest bardziej treściwy, gdy immunobarwienie tubuliny w otaczających tkankach utrudnia analizę organizacji mikrotubul w neuronach. Przeciwciała mysie przeciwko alfa-tubulinie można zastąpić neuronowo-specyficznymi przeciwciałami mysimi w rozcieńczeniu 1:1000.Główne odgałęzienia neuronów klasy czwartej są fch dodatnie. Natomiast niektóre cienkie odgałęzienia boczne są fch ujemne. Zestaw seryjnych przekrojów mięśni ściany ciała ujawnił sieci mikrotubul w tej tkance.Projekcja kilku przekrojów konfokalnych wykonanych przez mięśnie ściany ciała i tchawki ukazała złożone sieci mikrotubul w tych tkankach. Powiększenie zespołu przekrojów seryjnych przez zakończenie tchawki w mięśniach ściany ciała ujawniło zawiłości organizacji mikrotubularnej. Zatem połączenie tej procedury z innymi metodami, takimi jak generowanie genetycznych MXs obwodowych neuronów sensorycznych larw, może odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jakie mechanizmy kontrolują organizację micro TL w dendrytach.

immunohistological-labeling-microtubules-sensory-neuron-dendrites

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Immunohistologiczne oznakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych, tchówkach i mięśniach w ścianie ciała larw Drosophila

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Ten film demonstruje szczegółowy protokół barwienia immunologicznego do wizualizacji defektów fenotypowych w ciałach grzybów zmutowanych mózgów Drosophila. Protokół polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko Fas2, białku biorącemu udział w prowadzeniu aksonów, które ułatwia prawidłowy rozwój morfologiczny i funkcjonalny ciała grzyba.

Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Opisujemy technikę sekcji, która zachowuje architekturę połączenia nerwowo-mięśniowego i umożliwia szczegółowe badanie immunocytochemiczne neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila.

Rozwarstwienie i immunohistochemia dorosłej nogi Drosophila w celu wykrycia zmian w połączeniu nerwowo-mięśniowym dla zidentyfikowanego neuronu ruchowego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj metodę znakowania mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych larw Drosophila za pomocą immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie organizacji mikrotubul w tkankach ciała larwy.

Znakowanie immunohistologiczne mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych, tchawicy i mięśniach w ścianie ciała larwy Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Przeglądaj więcej filmów