Znakowanie immunohistologiczne mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych, tchawicy i mięśniach w ścianie ciała larwy Drosophila
10 listopada 2011
Aby zrozumieć, jak podczas rozwoju osiągane są złożone kształty komórek, takie jak dendryty neuronalne, ważne jest, aby móc dokładnie określić organizację mikrotubul. Tutaj opisujemy solidną metodę znakowania immunohistologicznego w celu zbadania organizacji mikrotubul dendrytycznych dendrytów czuciowych neuronów arboryzacji, tchawicy, mięśni i innych tkanek ściany ciała larw Drosophila.
Ogólnym celem tej procedury jest oznakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych we wczesnym stadium larwy Drosophila. Osiąga się to poprzez najpierw przygwożdżenie larwy w magnetycznej komorze preparyjnej, a następnie szybkie rozcięcie jej na filet larwowy. Następnie, jeszcze w komorze magnetycznej, filet jest natychmiast utrwalany i barwiony immunologicznie.
Ostatnim krokiem jest zamontowanie konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej w tkankach, która może następnie ujawnić rozmieszczenie mikrokanalików w dendrytach dopaminergicznego neuronu czuciowego. Cześć, nazywam się Ol Kareem. Dzisiaj zademonstruję protokół immunohistologicznego znakowania mikrotubul w dendrytach neurosensorycznych, tchawicy i mięśniach w ścianie ciała larwy.
Metoda ta ma na celu zapewnienie wglądu w organizację Myco TL w obwodowych neuronach sensorycznych. Ponadto może być stosowany do badania sieci Myco TL oraz innych typów komórek i tkanek ściany ciała larwalnego Przed rozpoczęciem. Dla powodzenia tego protokołu kluczowe znaczenie ma to, aby utrwalacz był odświeżany bezpośrednio przed rozpoczęciem tego protokołu.
Kluczowe znaczenie ma również tło genetyczne stada. Na przykład, aby zbadać neurony arboryzacji dendrytycznej, wybierz zwierzęta, które wyrażają etykietę w błonach tych neuronów, takie jak wiśnia MCDA lub MCDA, pomarańczowy RA. Za pomocą pętli włosów szybko umyj pierwszą larwę w wodzie, a następnie przenieś ją do komory rozwarstwiającej.
Teraz, aby zbadać brzuszne neurony klastrowe, ustaw larwy grzbietową stroną do góry, a brzuszną stroną na szkle. Aby zbadać neurony klastra grzbietowego, odwróć orientację za pomocą szpilki do owadów, zabezpiecz przedni koniec w pobliżu haczyków ustnych. Umieść szpilkę blisko końca, aby uzyskać najlepsze wyniki.
Mikro, potrójne sieci, a szczególnie te w DDR z czujnikami, ulegną szybkiemu rozpadowi po rozpoczęciu sekcji. Osiągnięcie pierwszego rozbioru i szybkie utrwalenie są kluczowymi czynnikami sukcesu tego protokołu. Odetnij bardzo tylny koniec larwy mikronożyczkami za pomocą kleszczy.
Chwyć tkankę jelitową wystającą z nowego otworu i delikatnie wyciągnij całe jelito. Teraz za pomocą mikronożyczek włóż jedno ostrze do tego samego otworu i przetnij wzdłuż brzusznej linii środkowej w kierunku przedniej. Teraz przypnij teraz wolne tylne rogi i delikatnie rozciągnij filet z larwy, jeśli to konieczne.
Szybkie oczyszczenie pozostałych narządów wewnętrznych. Następnie natychmiast przejdź do utrwalenia. Aby zachować delikatne mikrotubule.
Rozpocząć od zassania wolnego od wapnia buforu HL 3,1 za pomocą pipety, natychmiast wypełniając komorę świeżo przygotowanym utrwalaczem. Używając innej pipety, natychmiast wymień ten rozcieńczony utrwalacz. Ze świeżym utrwalaczem, Wszystkie etapy fiksacji i stania są przeprowadzane w komorze rozwarstwiającej.
Podczas tego procesu należy uważać, aby nie uderzyć w szpilki owadów trzymające lawę, ponieważ ten MEL powoduje uszkodzenie tkanek. Teraz pozwól utrwalaniu postępować bez zakłóceń przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zakończyć utrwalanie. Umyj filet z larwy do czysta sześć razy za pomocą PBST przez 10 minut na pranie.
W ten sposób larwy spłukiwano z utrwalacza przez łącznie jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Mieszanie podczas inkubacji nie jest konieczne i może spowodować niezamierzone uszkodzenie tkanek. Aby przygotować się do barwienia, usuń ostatnie płukanie PBST i zablokuj utrwalony filet, wypełniając komorę 5% surowicą kozią w PBST, zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBST.
Głównymi stosowanymi przeciwciałami są mysie, antyfa, tubulina i szczurze przeciwciała anty CD eight, oba rozcieńczone od 1 do 1000, aby zapobiec wysuszeniu eksperymentu. Umieść komorę w plastikowym pojemniku z wilgotną chusteczką. Inkubować filet w przeciwciałach przez co najmniej 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia należy usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą sześciu płukań PBST przez 10 minut na przemycie, tak jak to miało miejsce w celu usunięcia utrwalacza. Po godzinie płukania PBST dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała rozcieńczony w 5% surowicy koziej w PBST. W tym przykładzie przeciwciała to LOR 4 88, anty mysie IgG i P SI trzy anty szczurze IgG pokrywają komorę od tego momentu do przodu, aby zapobiec fotowybielaniu Fluor four, a następnie inkubować filet w wtórnym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji przeciwciał drugorzędowych należy usunąć niezwiązane przeciwciała zgodnie z tym samym rygorystycznym harmonogramem sześciu płukań w PBST po 10 minut na przemycie. Teraz filet jest gotowy do montażu do szybkiego montażu, zanurz tkankę w małej kropli 80% glicerolu za pomocą kleszczy. Chwyć sam czubek przedniego końca w pobliżu haczyków ustnych i przenieś go na suwak skórką do dołu, uszczelnij boki szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby poprawić oczyszczanie tkanek i uzyskać trwałą, stabilną próbkę.
Górski DPX jak opisano wcześniej, barwienie fluorescencyjne ujawniło, że różne gałęzie w altanie dendrytowej mają różną organizację cytoszkieletu w altanie neuronu DA klasy czwartej od larwy pierwszego stadium rozwojowego, główne gałęzie są dodatnie dla tubuliny. Podczas gdy niektóre cienkie boczne gałęzie nie są zbiorem odcinków szeregowych, podobne barwienie neuronu DA klasy pierwszej, wykonane w filmie, jest bardziej odkrywcze, gdy barwienie immunologiczne tubuliny w otaczających tkankach dokonuje analizy organizacji mikrojajowodów i neuronów. Trudna mysia tubulina przeciwtłuszczowa może być zastąpiona specyficznym dla neuronów mysim antich rozcieńczonym jeden do 1000.
Główne gałęzie neuronów klasy czwartej są fch dodatnie. Podczas gdy niektóre cienkie gałęzie boczne są fch ujemne. Zespół szeregowych odcinków mięśni ściany ciała ujawnił sieci mikrotubul w tej tkance.
Projekcja kilku sekcji konfokalnych przeciętych przez mięśnie ściany ciała i tchawicę wykazała złożone sieci mikrotubul w tych tkankach. Przybliżając zbiór szeregowych odcinków przez tchawicę kończącą się ścianą ciała, mięśnie ujawniły zawiłości organizacji mikrojajowodów. Tak więc połączenie tej procedury z innymi metodami, takimi jak generowanie larw, obwodowych neuronów sensorycznych, genetycznych MX, może odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie mechanizmy kontrolują organizację mikro TL w dendrytach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę znaczenia mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych larw Drosophila we wczesnym stadium rozwoju. Technika ta obejmuje sekcję i barwienie immunologiczne w celu wizualizowania organizacji mikrotubul w różnych tkankach larw.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w rozwoju złożonych kształtów komórek.
- Arboryzacja dendrytów jest niezbędna dla funkcji neuronów.
- Rozumienie organizacji mikrotubul pomaga w badaniu rozwoju neuronów.
- Larwy Drosophila służą jako organizm modelowy w badaniach rozwojowych.
Cel badania
- Opracowanie skutecznej metody badania organizacji mikrotubul.
- Zbadanie dystrybucji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych.
- Wzmocnienie zrozumienia rozwoju neuronów u Drosophila.
Stosowane metody
- Umocowanie larw Drosophila w komorze sekcyjnej magnetycznej.
- Sekcja larw na filet.
- Fiksowanie i barwienie immunologiczne tkanki.
- Użycie konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej do wizualizowania.
Główne wyniki
- Udane zznaczenie mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych.
- Wizualizacja dystrybucji mikrotubul w różnych tkankach larw.
- Demonstracja skuteczności metody w badaniu struktur neuronowych.
- Wkład w zrozumienie roli mikrotubul w rozwoju neuronów.
Wnioski
- Opisana metoda jest niezawodnym podejściem do badania organizacji mikrotubul.
- Zdobyte wglądy mogą wpłynąć na przyszłe badania nad rozwojem neuronów.
- Ta technika może być zastosowana do innych tkanek u larw Drosophila.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate visualization of microtubule organization in complex cell shapes supports target validation in neurodevelopmental and cytoskeletal disease models. This method enables mechanistic de-risking by linking cytoskeletal dynamics to phenotypic outcomes in a genetically tractable system. It provides a disease-relevant system for early discovery screening of compounds affecting neuronal morphology and tissue morphogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking microtubule organization to dendritic branching and neuron morphology.
- Operational Value: Provides a robust immunostaining protocol for functional target validation in sensory neuron models.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by correlating cytoskeletal changes with structural phenotypes in dendrites, tracheae, and muscles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible microtubule labeling for quantitative imaging in fixed larval tissues.
- Scalability: Compatible with high-resolution confocal microscopy for multi-tissue analysis in parallel.
- Screening Support: Prepares validated biological systems for compound screening affecting cytoskeletal integrity and cell shape.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a model to study microtubule-related mechanisms in neurodegeneration and developmental disorders.
- Translational Continuity: Connects cytoskeletal organization in Drosophila to conserved pathways in mammalian neuronal development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables early assessment of compound effects on microtubule networks to prioritize leads with lower biological risk.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening and preclinical validation, particularly for cytoskeletal and neurodevelopmental targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing microtubule distribution in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for assay development in neuronal morphology and tissue shape.
- Analytics: Enables comparison of microtubule intensity, branching patterns, and network integrity across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery efforts linking microtubule dynamics to neuronal degeneration and regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunostaining platform for multiple larval tissues and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in cytoskeletal mechanism.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across labs through fixed dissection and immunostaining parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic data on compound effects in intact tissues.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds modulating cytoskeletal pathways in neurodevelopment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, dissection, and immunostaining techniques.
- Depends on confocal microscopy and antibody validation for specific tubulin isoforms.
- Necessitates standardization of fixation timing and buffer conditions to preserve microtubule integrity.
- Involves adaptation considerations when extending to other developmental stages or mutant backgrounds.
- Limited by the need for rapid dissection and fixation to prevent microtubule degradation in sensitive tissues.
