Name: Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj ocenę odpowiedzi immunologicznej jelit w modelu zapalenia wywołanego DSS u myszy poprzez pomiar aktywności mieloperoksydazy i cytokin prozapalnych. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy immunologiczne w IBD.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest finansowana z grantów Canadian Institutes of Health Research (CIHR) oraz Crohn's and Colitis Foundation of Canada (CCFC).

1. Myszowy model ostrego zapalenia jelita grubego indukowanego DSS
<ol>
	<li>Dodać dekstran siarczan sodu (DSS) do autoklawowanej wody pitnej do pożądanej stężenia końcowego (1-5%) (mas/obj) (np. aby przygotować 5% roztwór DSS, należy dodać 25 g proszku DSS do 500 mL autoklawowanej wody). Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia lub w 4°C do czasu użycia.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przelać roztwór zapasowy DSS do probówek Falcon o pojemności 50 mL (jedna probówka na każdą klatkę). Roztwór zapasowy należy zachować do uzupełniania probówek w razie potrzeby.</li>
	<li>Zastąpić wodę pitną w każdej klatce z myszami roztworem DSS (w probówkach Falcon 50 mL) (Czas trwania zależy od zastosowanego schematu podawania DSS. Na przykład w przypadku samców myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni podajemy 5% roztwór DSS przez łącznie pięć dni). Myszy nie powinny mieć dostępu do żadnego innego źródła wody. Myszom z grupy kontrolnej podaje się autoklawowaną wodę pitną bez DSS.</li>
	<li>Ważić myszy codziennie i zapisywać ilość DSS spożytego w ciągu dnia. Uzupełnić każdą probówkę do 50 mL po odczytaniu poziomu DSS. Służy to pomiarowi przybliżonej objętości DSS spożytej na klatkę i na mysz przez cały czas trwania eksperymentu. W naszych badaniach stosujemy 5% roztwór DSS przez 5 dni u samców myszy C57BL/6. Przy tym konkretnym schemacie DSS znaczny spadek masy ciała, zmiana konsystencji stolca i oznaki krwi w kale są widoczne już w 3. dniu. Podczas podawania DSS myszy wykazują wyraźny spadek masy ciała (około 5-10% masy początkowej w 5. dniu), przy czym spadek masy ciała powyżej 20% masy początkowej wraz z odwodnieniem i biegunką jest istotnym wskaźnikiem fizjologicznym świadczącym o tym, że zwierzę osiągnęło lub zbliża się do punktu końcowego. Jeśli po 5 dniach podawania 5% DSS zwierzę otrzyma dostęp do normalnej wody, wyzdrowieje w ciągu 7 dni. Wszystkie eksperymenty powinny zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki ds. zwierząt i być zgodne z zatwierdzonym Protokołem Wykorzystania Zwierząt (AUP).</li>
	<li>W trakcie trwania eksperymentu można oceniać wskaźnik aktywności choroby (DAI), aby ocenić kliniczny postęp zapalenia jelita grubego. DAI jest łączną punktacją obejmującą spadek masy ciała w porównaniu z masą początkową, konsystencję stolca oraz krwawienie. Punktację definiuje się następująco: spadek masy ciała: 0 (brak spadku), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) i 4 (&gt;20%); konsystencja stolca: 0 (normalna), 2 (stolce luźne) i 4 (biegunka); oraz krwawienie: 0 (brak krwi), 1 (Hemoccult dodatni), 2 (Hemoccult dodatni i widoczne krwawienie w odchodach) i 4 (silne krwawienie, krew wokół odbytu). Punktację DAI można przeprowadzać codziennie podczas leczenia DSS.</li>
	<li>W wybranym punkcie czasowym zważyć i poświęcić myszy. Myszy można uśmiercić poprzez zwichnięcie karku po inhalacji izofluranem lub inną metodą zatwierdzoną przez instytucjonalną pracownię zwierząt.</li>
</ol>
2. Pobranie próbek tkanki okrężnicy
<ol>
	<li>Odsłoń stronę brzuszną zwierzęcia i zwilż okolicę brzucha 70% roztworem etanolu. Na tym etapie zapoznaj się z Tabelą 1 i odnotuj u każdego zwierzęcia wszelkie oznaki krwawienia z odbytnicy (obecność krwi w otworze odbytu) lub wypadania odbytnicy.</li>
	<li>Używając standardowych nożyczek sekcyjnych, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha.</li>
	<li>Zlokalizuj okrężnicę i przetnij ją jak najbliżej granicy kolnorektalnej, aby uwolnić dystalną część okrężnicy.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli wyciągnij całą okrężnicę, oddzielając ją od otaczającej krezki.</li>
	<li>Przetnij okrężnicę na granicy kolnocekalnej, aby uwolnić proksymalny koniec jelita. Kał można usunąć, płucząc okrężnicę sterylnym PBS za pomocą igły do gavage podłączonej do strzykawki 3 lub 5 mL lub ostrożnie wyciskając go za pomocą zakrzywionej pęsety. Wykorzystując całą okrężnicę, oceń stopień uszkodzeń (zob. sekcję 3.1).</li>
	<li>Pobieranie próbek tkanek do analizy histologicznej i innych testów można przeprowadzić poprzez wycięcie fragmentów okrężnicy o długości od 0,5 cm do 1,0 cm, odnotowując obszar, z którego pochodzi próbka (tzn. proksymalny, środkowy lub dystalny).</li>
	<li>Próbki tkanek przeznaczone do testów można umieścić pojedynczo w probówkach typu eppendorf o pojemności 1,5 mL, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać do czasu użycia w temperaturze -70°C.</li>
</ol>
3. Ocena stopnia nasilenia zapalenia jelita grubego
<ol>
	<li>Makroskopową ocenę stopnia nasilenia choroby przeprowadza w punkcie końcowym bezstronny obserwator, korzystając z wcześniej opublikowanego systemu punktacji (Tabela 1).9 Konsystencję kału można ocenić za pomocą pęsety, naciskając na próbkę w celu określenia jej gęstości. Aby ustalić punktację dla krwi w kale, należy zwrócić uwagę na kolor stolca (np. stolec czarny w porównaniu do jasnobrązowego), a następnie potwierdzić wynik testem Hemoccult. Korzystając z systemu punktacji, należy określić wartość dla każdego z parametrów. Końcowy wynik makroskopowy dla każdego zwierzęcia stanowi suma poszczególnych punktów.</li>
	<li>W celu oceny uszkodzeń histologicznych stopnia nasilenia zapalenia jelita grubego należy wyciąć mały fragment (0,5 cm) okrężnicy, umieścić go w kasecie tkankowej i zanurzyć w 10% buforowanym roztworze formaliny. Należy przygotować 5 μm przekroje poprzeczne zatopione w parafinie i zabarwić je hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) zgodnie z odpowiednimi procedurami. Fragmenty okrężnicy mogą być pobrane z części proksymalnej, środkowej lub dystalnej jelita grubego.</li>
	<li>Przekroje tkanki okrężnicy zabarwione H&amp;E są oceniane przez oślepionego obserwatora przy użyciu wcześniej opublikowanego systemu według następujących kryteriów: architektura krypt (prawidłowa, 0 – ciężkie zniekształcenie krypt z utratą całych krypt, 3), stopień nacieku komórek zapalnych (prawidłowy, 0 – gęsty naciek zapalny, 3), pogrubienie mięśniowe (podstawa krypty spoczywa na błonie mięśniowej śluzówki, 0 – wyraźne pogrubienie mięśni, 3), ubytek komórek kubkowych (brak, 0 – obecny, 1) oraz ropień krypt (brak, 0 – obecny, 1).7 Wynik uszkodzeń histologicznych jest sumą poszczególnych punktacji. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do ludzkiej wrzodziejącej colitis, ropnie krypt nie są charakterystyczne dla tego modelu i są rzadko spotykane; równie rzadkie są owrzodzenia mikroskopowe. Jeśli zabarwiono wiele przekrojów okrężnicy, do ustalenia końcowego wyniku dla każdego obszaru należy wykorzystać wyniki histologiczne z podobnych przekrojów (np. wynik histologiczny w okrężnicy proksymalnej w porównaniu z wynikiem histologicznym w okrężnicy dystalnej).</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworów zapasowych odczynników do analiz
<ol>
	<li>Przygotować 50 mM roztwór buforu fosforanowo-potasowego, dodając roztwór B (K2HPO4, 8,7 g fosforanu dwupodstawnego potasu w 1 L dH2O) do roztworu A (KH2PO4, 6,8 g fosforanu jednopodstawnego potasu w 1 L dH2O) aż do uzyskania pH 6,0. Pozostałe roztwory można przechowywać w lodówce (2-8°C) do późniejszego użycia.</li>
	<li>Przygotować bufor bromek heksadecylotrimetylammonium (HTAB), dodając 5 g HTAB do 1 L buforu fosforanowo-potasowego (50 mM, pH=6,0). Delikatnie podgrzać w celu rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze 2-8°C do momentu użycia. W razie potrzeby podgrzać, aby ponownie rozpuścić.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy do homogenizacji tkanek w analizie białek, dodając 10 mL 1M kwasu trys-chlorowodorowego (pH=8,0), 6 mL 5M chlorku sodu i 2 mL Triton X-100 do 182 mL sterylnej wody destylowanej. Triton X-100 jest bardzo lepki w temperaturze pokojowej, dlatego przed użyciem należy go delikatnie ogrzać. Przygotowany bufor do lizy można przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbek do analiz
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek do analizy MPO.
	<ol>
		<li>Wyjąć próbki z temperatury -70°C i umieścić na lodzie. Zważyć każdą próbkę po usunięciu widocznych resztek kału lub tłuszczu za pomocą zgiętej pęsety i umieścić ją w 2mL probówce do mikrocentryfugi Eppendorf Safe-Lock (lub dowolnej probówce kompatybilnej z homogenizatorem). Próbki należy przez cały czas przechowywać na lodzie. Należy pamiętać, aby z każdego powtórzenia biologicznego pobierać podobne fragmenty okrężnicy (np. wyłącznie sekcje dystalne lub wyłącznie sekcje proksymalne).</li>
		<li>Do każdej probówki z próbką dodać kulkę do homogenizacji.</li>
		<li>Dodać odpowiednią ilość buforu HTAB w zależności od masy tkanki. Jeśli masa tkanki jest mniejsza niż 25 mg, dodać bufor w stosunku 12,5mg/mL; jeśli masa tkanki wynosi od 25 do 50 mg, dodać w stosunku 25mg/mL. Jeśli masa tkanki jest większa niż 50 mg, dodać bufor w stosunku 50mg/mL.</li>
		<li>Homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego przez 4 min przy 30 Hz. Powtórzyć czynność, jeśli tkanka nie została w pełni zhomogenizowana.</li>
		<li>Usunąć kulkę do homogenizacji i odwirować roztwór przez 6 min (13400 x g, 4°C).</li>
		<li>Zebrać nadsącz i odrzucić powstały osad. Nadsącz można przechowywać w temperaturze -70°C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek do analizy cytokin.
	<ol>
		<li>Powtórzyć kroki 5.1.1. do 5.1.2.</li>
		<li>Do 10 mL przygotowanego buforu do lizy dodać 50 μl koktajlu inhibitorów proteaz (PIC).</li>
		<li>Do każdej próbki, niezależnie od jej masy, dodać 1 mL roztworu PIC i buforu do lizy.</li>
		<li>Homogenizować przez 5 min przy 30 Hz. Powtórzyć czynność, jeśli tkanka nie została w pełni zhomogenizowana.</li>
		<li>Usunąć kulkę do homogenizacji i odwirować roztwór przez 5 min przy 3300 x g.</li>
		<li>Zebrać nadsącz i odrzucić powstały osad. Nadsącz można przechowywać w temperaturze -70°C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Ilościowe oznaczenie markerów stanu zapalnego
<ol>
	<li>Oznaczenie aktywności MPO
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór dwuchlorku o-dianizydyny (o-dianizydyny), łącząc 16,7 mg dwuchlorku o-dianizydyny, 90 mL dH2O oraz 10 mL buforu fosforanowego potasu. Roztwór ten należy przygotowywać na świeżo do każdego oznaczenia.</li>
		<li>Do płytki 96-dołkowej dodać w trzech powtórzeniach po 7 μL homogenatu tkankowego (przygotowanego w sekcji 5.1).</li>
		<li>Do mieszaniny o-dianizydyny dodać 50 μL rozcieńczonego H2O2 (4 μL 30% H2O2 rozcieńczonego w 96 μL dH2O).</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 200 μL mieszaniny o-dianizydyny zawierającej H2O2 do każdego dołka.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą spektrofotometru. Wykonać trzy pomiary w odstępach 30 sekund.</li>
		<li>Obliczyć aktywność MPO. Aktywność MPO wyraża się w jednostkach (U) MPO/mg tkanki, gdzie jedną jednostkę MPO definiuje się jako ilość potrzebną do rozkładu 1 μmoL H2O2 na minutę w temperaturze pokojowej. Przyjmując, że jedna jednostka (U) MPO = 1 μmoL rozłożonego H2O2, a 1 μmoL H2O2 powoduje zmianę absorbancji o 1,13 x 10-2 nm/min, jednostki MPO w każdej próbce określa się jako zmianę absorbancji [ΔA(t2-t1)]/Δmin x (1,13 x 10-2). Aby uzyskać jednostki na mg tkanki, należy zastosować stosunek tkanka:bufor. Na przykład, jeśli zastosowano stosunek tkanka:bufor wynoszący 50 mg/mL, w 7 μL homogenatu znajduje się 0,35 mg tkanki. Zatem, aby uzyskać jednostki na mg tkanki, należy podzielić jednostki MPO przez 0,35. Poniżej zamieszczono przykładowe obliczenia z wykorzystaniem wartości absorbancji (nm) (przy założeniu, że próbka została dodana w trzech powtórzeniach):</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka</td>
			<td colspan="3">Czas 0 s</td>
			<td colspan="3">Czas 30 s</td>
			<td colspan="3">Czas 60 s</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >A</td>
			<td >1</td>
			<td >2</td>
			<td >3</td>
			<td >1'</td>
			<td >2'</td>
			<td >3'</td>
			<td >1"</td>
			<td >2''</td>
			<td >3"</td>
		</tr >
		<tr >
			<td > </td>
			<td >0.048</td>
			<td >0.048</td>
			<td >0.051</td>
			<td >0.061</td>
			<td >0.061</td>
			<td >0.065</td>
			<td >0.074</td>
			<td >0.073</td>
			<td >0.078</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
<ol class="lroman">
	<li>Średnia w czasie 0 s = (0,048 + 0,048 + 0,051)/3 = 0,049 nm</li>
	<li>Średnia w czasie 30 s = 0,0623 nm</li>
	<li>Średnia w czasie 60 s = 0,075 nm</li>
	<li>Zmiana absorbancji (ΔA) od 0 do 30 s / mg tkanki (przy założeniu stosunku tkanki do buforu 50 mg/mL) = [(0,0623-0,049)/(1,13 x 10-2)]/0,35 = 3,363</li>
	<li>Zmiana absorbancji (ΔA) od 30 do 60 s / mg tkanki = 3,211</li>
	<li>*Aktywność MPO (U/mg tkanki) = średnia z ΔA(0-30) i ΔA(30-60) = 3,287</li>
</ol>
<ol start="2">
	<li>Ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych metodą ELISA
	<ol>
		<li>Poziomy cytokin (IL-1β, IL-6 i TNF-α) określa się przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu do enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA) (Quantikine Murine; R&amp;D Systems).</li>
		<li>Wartości absorbancji z każdego testu ELISA są normalizowane przy użyciu metody Bradforda dla każdego próbki i wyrażone w jednostkach pg/mg białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Podanie odpowiedniego schematu DSS wywoła ostre zapalenie jelita grubego u myszy. W trakcie leczenia DSS wskaźnik DAI może być wykorzystany do oceny i analizy klinicznego postępu choroby. Zwierzęta leczone DSS wykażą znaczną utratę masy ciała w porównaniu z masą początkową, luźne stolce oraz krwawienie z kału (Rycina 1). Po uśmierceniu i badaniu jelita grubego stopień nasilenia zapalenia jest oceniany makroskopowo na podstawie skrócenia długości jelita grubego, krwawienia z jelita, krwawienia z kału, rozluźnienia konsystencji stolca oraz oznak krwawienia z odbytu w porównaniu z grupą kontrolną leczoną wyłącznie wodą (Rycina 2 i Tabela 1). Przekroje poprzeczne próbek tkanki jelita grubego barwione H&amp;E wykażą wyższe oceny histologiczne dla jelit leczonych DSS w porównaniu z kontrolą leczoną wodą (Rycina 3). Aby dalej scharakteryzować zakres stanu zapalnego u myszy leczonych DSS, można ocenić aktywność MPO w homogenizatach próbek tkanki jelita grubego. Jelita leczone DSS wykażą wyższą aktywność MPO w porównaniu z grupą kontrolną (Rycina 4). Dodatkowo wiąże się to ze zwiększonymi poziomami cytokin prozapalnych (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Rycina 5).
<img alt="Wykres wskaźnika aktywności choroby; DSS 5% vs. woda; progresja w dniach; porównanie danych." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Samce myszy C57BL/6 otrzymywały 5% DSS w wodzie pitnej przez 5 dni. Wskaźniki DAI oceniano codziennie dla każdego zwierzęcia i uśredniano dziennie dla każdej grupy (średnia ± SEM, n=4 myszy/grupa).
<img alt="Wykres słupkowy porównujący wyniki makroskopowe; wyniki dla wody oraz traktowania 5% DSS." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Myszy C57BL/6 otrzymywały 5% DSS w wodzie pitnej przez 5 dni. Myszy kontrolne otrzymywały wodę bez DSS. Punktację uszkodzeń makroskopowych/stopień ciężkości choroby oceniano metodą ślepej próby w 5. dniu po indukcji zapalenia jelita grubego za pomocą DSS. Okrężnice wyizolowane od myszy, które otrzymały DSS, wykazują wyższe wyniki uszkodzeń makroskopowych (krwawienie z odbytnicy, wypadanie odbytnicy, biegunka, krwawienie z okrężnicy), co wskazuje na większy stopień ciężkości choroby (średnia ± SEM, n=4 myszy/grupa).
<img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Wyniki zapalenia jelita grubego wywołanego DSS; wykres słupkowy przedstawiający ocenę histologiczną, przekroje tkanek jelita grubego z zapaleniem." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Myszy C57BL/6 otrzymywały 5% roztwór DSS w wodzie pitnej w celu wywołania zapalenia jelita grubego. Myszy kontrolne otrzymywały wodę bez DSS. (A) Ocena histologiczna została przeprowadzona w sposób ślepy na podstawie przekrojów tkanek jelita grubego barwionych H&amp;E, pobranych w 5. dniu po podaniu DSS. (B) Próbki traktowane DSS wykazują większe uszkodzenia histologiczne (większą infiltrację komórkową, większy ubytek komórek kubkowych, większe zniekształcenie/uszkodzenie architektury krypt) w porównaniu do (C) kontroli (średnia ± SEM, n=4 myszy/grupa). Na zdjęciach (B) i (C) gwiazdka (*) oznacza obszar ubytku komórek kubkowych i zniekształcenia architektury krypt; znak kratki (#) oznacza infiltrację komórkową. 
<img alt="Wykres słupkowy aktywności MPO, porównanie stanu zapalnego tkanek, woda vs DSS 5%, wyniki doświadczalne." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4."> 
Rysunek 4. Wszystkie myszy zostały uśpione w 5. dniu po podaniu DSS, a następnie pobrano próbki tkanki okrężnicy w celu oceny aktywności MPO. Ciężkość zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS wiąże się z wyższymi poziomami aktywności MPO w porównaniu z grupami kontrolnymi (średnia ± SEM, n=4 myszy/grupa).
<img alt="Wykres słupkowy poziomów cytokin; IL-1β, IL-6, TNF-α po leczeniu DSS. Porównawcza analiza białek." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5."> 
Rysunek 5. Oprócz wyższych poziomów MPO, ciężkość zapalenia jelita grubego indukowanego DSS wiąże się również ze zwiększonym poziomem cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-6, TNF-α (średnia ± SEM, n=4 myszy/grupa).
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Wynik</td>
			<td >Krwawienie z odbytnicy</td>
			<td >Wypadanie odbytnicy</td>
			<td >Konsystencja stolca</td>
			<td >Krew</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >0</td>
			<td >Brak</td>
			<td >Brak</td>
			<td >Normalna</td>
			<td >Normalna</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td>
			<td >Czerwona</td>
			<td >Objawy wypadania</td>
			<td >Miękki</td>
			<td >Czerwona</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td>
			<td >Ciemnoczerwona</td>
			<td >Wyraźne wypadanie</td>
			<td >Bardzo miękki</td>
			<td >Ciemnoczerwona</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td>
			<td >Krwawienie masywne</td>
			<td >Rozległe wypadanie</td>
			<td >Biegunka</td>
			<td >Czarna</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Makroskopowy wskaźnik nasilenia choroby

<ol><li>Sands, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+symptom+to+diagnosis%3A+clinical+distinctions+among+various+forms+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).</li>
<li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiopathogenesis+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases.</a> World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice%3A+effects+in+CD4%28%2B%29-cell+depleted%2C+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).</li>
<li>Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+acute+murine+dextran+sodium+sulphate+colitis%3A+cytokine+profile+and+dose+dependency%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency.</a> Digestion. 62, 240-248 (2000).</li>
<li>Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+acute+intestinal+inflammation+based+on+myeloperoxidase+activity.+Assessment+of+inflammation+in+rat+and+hamster+models%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models.</a> Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).</li>
<li>Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathologic+study+of+dextran+sulfate+sodium+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis.</a> Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).</li>
<li>Smith, J. W., Castro, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+peroxidase+activity+in+gut+mucosa+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation.</a> Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).</li>
<li>Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vagus+nerve%3A+a+tonic+inhibitory+influence+associated+with+inflammatory+bowel+disease+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model.</a> Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).</li>
<li>Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).</li>
<li>Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+model+of+colitis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview.</a> Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).</li>
<li>Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).</li>
<li>Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+resident+intestinal+flora+in+acute+and+chronic+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice.</a> Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).</li>
<li>Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+enteric+bacteria+induce+and+perpetuate+experimental+colitis+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice.</a> Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).</li>
<li>Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+has+a+key+role+in+pathogenesis+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).</li>
<li>Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+murine+inflammatory+bowel+disease%3A+mucosa+immune+responses+and+protection+by+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance.</a> J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).</li>
<li>Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+occurs+in+severe+combined+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice.</a> Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Zapalenie jelita grubego indukowane DSS jest powszechnie stosowanym chemicznym modelem zapalenia jelit. W tym modelu myszy otrzymują wodę pitną z dodatkiem DSS, który uznaje się za toksyczny dla komórek nabłonka jelitowego, co prowadzi do zaburzenia integralności bariery śluzówkowej.10 Podanie DSS wywołuje ostre zapalenie jelita grubego, które charakteryzuje się luźnymi stolcami, krwawieniem z odbytu oraz naciekiem granulocytów.10 Podczas podawania DSS zapalenie jelita grubego zwykle wiąże się ze zn...

<table><tbody><tr><td>probówka do mikrowirówki Eppendorf Safe-Lock (2 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek absorbancji Biotek EL808 </td><td>BioTek</td><td>EL808</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu, sól sodowa, stopień czystości odczynnikowej (masa cząsteczkowa 36 000–50 000 Da)</td><td>MP Biomedicals</td><td>160110</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 (oprogramowanie)</td><td>BioTek</td><td>Wersja 1.10.8</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadecylotrimetyluamoniu (HTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30% roztwór wodny (masowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Płytka mikrotestowa 96-dołkowa z płaskim dnem</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1581</td><td>Tylko do jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>o-dianizydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-3252</td><td>Wrażliwe na światło. Przechowywać w temperaturze 2-8°C.&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Caledon</td><td>6620-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, jednowodny</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Kule z węglika wolframu do Tissue Lyser II</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie stanu zapalnego jelit w modelu ibd indukowanym przez dss

Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

niespecyficzne zapalne choroby jelit (IBD) obejmują szereg patologii jelitowych, z których najczęstszymi są wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) oraz choroba Crohna (CD). Zarówno UC, jak i CD, w przypadku wystąpienia w jelicie grubym, generują podobny profil objawów, który może obejmować biegunkę, krwawienia z odbytu, ból brzucha oraz utratę masy ciała.1 Chociaż patogeneza IBD pozostaje nieznana, opisuje się ją jako chorobę wieloczynnikową, w której zaangażowane są komponenty zarówno genetyczne, jak i środowiskowe.2
Istnieje wiele zróżnicowanych modeli zwierzęcych zapalenia jelita grubego, które odzwierciedlają kilka cech nieswoistych zapaleń jelit (IBD). Modele zwierzęce zapalenia jelita grubego obejmują zarówno te, w których proces ten rozwija się samoistnie u podatnych szczepów niektórych gatunków, jak i modele wymagające podania określonych stężeń substancji chemicznych indukujących zapalenie, takich jak dekstran siarczan sodu (DSS). Chemicznie indukowane modele zapalenia jelit są najczęściej stosowanymi i najlepiej opisanymi modelami IBD. Podawanie DSS w wodzie pitnej wywołuje ostre lub przewlekłe zapalenie jelita grubego, w zależności od zastosowanego protokołu podania.3 Zwierzęta otrzymujące DSS wykazują utratę masy ciała oraz objawy luźnych stolców lub biegunki, niekiedy z oznakami krwawienia z odbytu.4,5 W niniejszej pracy opisujemy metody, za pomocą których można scharakteryzować rozwój zapalenia jelita grubego oraz wynikającą z niego odpowiedź zapalną po podaniu DSS. Metody te obejmują analizę histologiczną przekrojów jelita grubego barwionych hematoksyliną i eozyną, pomiar cytokin prozapalnych oraz oznaczenie aktywności mieloperoksydazy (MPO), która może służyć jako marker zastępczy stanu zapalnego.6
Zakres odpowiedzi zapalnej w stanie chorobowym można ocenić na podstawie obecności objawów klinicznych lub zmian w histologii tkanki śluzowej. Uszkodzenia histologiczne okrężnicy ocenia się za pomocą systemu punktacji uwzględniającego utratę architektury krypt, naciek komórek zapalnych, pogrubienie mięśni, ubytek komórek kubkowych oraz ropnie krypt.7 Ilościowo poziomy cytokin prozapalnych o właściwościach ostrego stanu zapalnego, takich jak interleukina (IL)-1β, IL-6 i czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α, można oznaczyć za pomocą konwencjonalnych metod ELISA. Ponadto aktywność MPO można zmierzyć za pomocą testu kolorymetrycznego i wykorzystać jako wskaźnik zapalenia.8
W eksperymentalnym zapaleniu jelita grubego ciężkość choroby często koreluje ze wzrostem aktywności MPO oraz wyższym poziomem cytokin prozapalnych. Ciężkość zapalenia oraz uszkodzenia związane z procesami zapalnymi można ocenić poprzez badanie konsystencji i krwistości kału, a także poprzez ocenę stanu histopatologicznego jelita z wykorzystaniem przekrojów tkanki okładnicowej barwionych hematoksyliną i eozyną. Fragmenty tkanki okładnicowej mogą posłużyć do oznaczenia aktywności MPO oraz produkcji cytokin. Wspólnie miary te mogą być wykorzystane do oceny odpowiedzi zapalnej jelit w zwierzęcych modelach eksperymentalnego zapalenia jelita grubego.

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Nieswoiste zapalne choroby jelit (IBD) obejmują szereg patologii jelit, z których najczęstsze to wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) oraz choroba Crohna...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena jelitowej odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez dekstran siarczan sodu poprzez oznaczenie aktywności mieloperoksydazy oraz ilości cytokin prozapalnych produkowanych w odpowiedzi na stan zapalny. W pierwszej kolejności u myszy indukuje się zapalenie jelita grubego wywołane DSS poprzez dodanie roztworu soli DSS do wody pitnej. Następnie ocenia się ciężkość przebiegu zapalenia jelita grubego za pomocą oceny makroskopowej, a następnie usuwa się jelito grube w celu przeprowadzenia dalszych analiz.Wypreparowaną okładnicę dzielone się następnie na trzy części do badania histologicznego, oznaczania ilości cytokin oraz pomiaru aktywności MPO. W końcowym etapie tkankę okładnicy homogenizuje się, a nadfiltr wykorzystuje do określenia aktywności MPO. Ostatecznie zmiany aktywności MPO można określić na podstawie danych absorbancji zebranych przy użyciu spektrofotometru.Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji na temat stanu przewlekłego w różnych modelach nieswoistych zapaleń jelit, takich jak colitis indukowany DSS i TNBS. Ponadto metodę tę można zastosować w odniesieniu do innych organów, np. płuc i wątroby. Przed rozpoczęciem procedury na

investigating-intestinal-inflammation-in-dss-induced-model-of-ibd

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie zapalenia jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Ten film demonstruje technikę generowania chemicznie wywołanego mysiego modelu zapalenia jelita grubego - choroby zapalnej jelit. Mysz może spożywać roztwór siarczanu sodu dekstranu (DSS) przez odpowiedni czas. Po spożyciu DSS uszkadza barierę warstwy śluzu i nabłonka w okrężnicy, umożliwiając drobnoustrojom jelitowym przedostanie się do leżącej poniżej tkanki – gdzie są wyczuwane przez rezydujące komórki odpornościowe, aby pośredniczyć w przesadnej odpowiedzi immunologicznej, powodując stan...

Technika generowania mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem sodu

Ten film demonstruje metodę barwienia hematoksyliny i eozyny (H&amp;E) do oceny uszkodzenia jelita grubego w mysim modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS - choroby zapalnej jelit. Po wyizolowaniu okrężnicy od myszy leczonej DSS i uzyskaniu skrawków tkanki, barwienie H&amp;E skrawków pomaga zidentyfikować uszkodzenia tkanek spowodowane stanem zapalnym.

Barwienie hematoksyliną i eozyną w celu oceny uszkodzenia jelita grubego w zapaleniu jelita grubego wywołanym przez DSS

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Dokładna ocena efektów przeciwzapalnych ma ogromne znaczenie dla oceny potencjalnych nowych leków do leczenia nieswoistych zapaleń jelit. Cyfrowa mikroskopia holograficzna umożliwia ocenę stanu zapalnego w próbkach tkanki mysiej i ludzkiej okrężnicy, a także zautomatyzowaną multimodalną ocenę gojenia się ran nabłonkowych in vitro.

Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu unieważnienia genów związanych z degustacją na odpowiedzi immunologiczne w mysim modelu IBD wywołanym siarczanem dekstranu sodu (DSS).

Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Jared Leadbetter wyjaśnia, dlaczego społeczność mikrobowa w jelitach termitów stanowi doskonały system do badania złożonych interakcji między mikroorganizmami. Omówiono symbiotyczną relację zachodzącą między owadem-gospodarzem a degradującymi lignocelulozę mikrobami jelitowymi, a także przemysłowe zastosowania tych mikroorganizmów w rozkładzie biomasy roślinnej i produkcji biopaliw.

Badanie społeczności mikrobowej w jelicie tylnym termitów – Wywiad

Poznaj ocenę odpowiedzi immunologicznej jelit w modelu zapalenia wywołanego DSS u myszy poprzez pomiar aktywności mieloperoksydazy i cytokin prozapalnych. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy immunologiczne w IBD.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Przeglądaj więcej filmów