Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Eksperymentalne modele nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone wrodzone i nabyte reakcje immunologiczne związane z patogenezą. Korzystając z oceny histologicznej, kwantyfikacji cytokin prozapalnych i aktywności mieloperoksydazy, można zacząć oceniać te reakcje obserwowane w nieswoistym zapaleniu jelit.

Ogólnym celem tej procedury jest ocena jelitowej odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez siarczan dekstronu sodu poprzez określenie ilości aktywności peroksydazy mielo i cytokin prozapalnych wytwarzanych w odpowiedzi na stan zapalny. Pierwsze zapalenie jelita grubego DSS jest wywoływane u myszy poprzez wprowadzenie roztworu DSS SALT do wody pitnej. Następnie nasilenie choroby zapalenia jelita grubego ocenia się za pomocą makroskopowej punktacji, a okrężnica jest usuwana w celu dalszej analizy.

Wypreparowana okrężnica jest następnie dzielona na trzy części w celu histologii, ilościowego określenia cytokin i aktywności NPO. Na koniec tkanka okrężnicy jest homogenizowana, a supernatant jest używany do określenia aktywności MPO. Ostatecznie zmiany w aktywności MPO można określić na podstawie danych absorbancji zebranych za pomocą spektrofotometru.

Metoda ta może zapewnić wgląd w przewlekłe informacje o różnych modelach nieswoistych zapaleń jelit, takich jak zapalenie jelita grubego wywołane przez DSS i TNBS. Ponadto można zastosować tę metodę w innych narządach, takich jak płuca i wątroba Przed rozpoczęciem zabiegu. Zastąp wodę pitną w każdej klatce myszy roztworem DSS, aby wywołać stan zapalny.

Podaj myszom kontrolnym autoklaw wodę pitną bez DSS. Następnie, w dniu eksperymentu, należy wyciąć okrężnicę, jak to wcześniej wykazano w artykule JoVE autorstwa Whithama Williamsa i Williamsa. Ostrożnie wyciśnij kał z całej okrężnicy za pomocą wygiętej pęsety, zbierając go do papieru wagowego, spłukując tkankę sterylnym PBS.

Oceń stolec, używając pary kleszczy do naciskania na kał, aby określić jego konsystencję w celu określenia wyniku krwi w kale. Zwróć uwagę na kolor kału i dalej weryfikuj ocenę za pomocą testu hemokultycznego, który polega na rozsmarowaniu stolca na papierze hemokultystycznym, dodaniu wywoływacza, a następnie zanotowaniu koloru niebieskiego oznacza pozytywny wynik testu kału na obecność krwi. Następnie skorzystaj z tej tabeli, aby określić wartość dla każdego z warunków.

Następnie, zachowując orientację proksymalną do dystalnej okrężnicy, pokrój okrężnicę na trzy równe części. Następnie pobierz fragmenty próbki z proksymalnego i środkowego odcinka okrężnicy i umieść próbki w pojedynczych 1,5-mililitrowych probówkach eph. Aby ocenić histologiczne uszkodzenie nasilenia zapalenia jelita grubego, użyj najbardziej dystalnego odcinka tkanki okrężnicy i wytnij mały fragment o długości od pół do jednego centymetra.

Umieść fragment w kasecie na tkanki i zanurz kasetę w buforowanym 10% roztworze formaliny. Następnie, po przygotowaniu zatopionych w parafinie przekrojów fragmentów tkanki, wybarwić skrawki hematyną eoiną w celu nacinania przez zaślepionego obserwatora. Na koniec zamroź próbki z proksymalnego i środkowego odcinka kolonu w ciekłym azocie i przechowuj je do czasu użycia w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza.

Po wyjęciu próbek jelita grubego z przechowywania w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza, umieść je na lodzie. Następnie za pomocą zgiętych kleszczyków usuń wszelkie widoczne odchody lub tłuszcz i umieść je w pojedynczych dwumililitrowych probówkach odpowiednich do użycia w homogenizatorze. Następnie należy określić i zapisać masę każdej próbki.

Następnie dodaj kulki homogenizatora do każdej probówki z próbką, a następnie dodaj odpowiednią ilość buforu H tab do probówki zgodnie z wagą tkanki, jak właśnie określono, zdysocjuj fragmenty za pomocą homogenizatora tkankowego przez cztery minuty przy 30 hercach. Na koniec odwiruj roztwór komórek przez sześć minut w temperaturze 13, 400 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant do świeżej probówki, a następnie upewnić się, że kulka homogenizacyjna jest w stanie wyrzucić powstałą osadkę.

Supernatant może być następnie przechowywany w temperaturze minus 70 do czasu użycia. Rozpocznij ten etap od dodania siedmiu mikrolitrów wcześniej przygotowanego homogenatu tkankowego w trzech powtórzeniach do płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego nadtlenku wodoru do świeżo przygotowanego jodu OD Dion.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny nadtlenku wodoru do każdej ze studzienek. Teraz zmierz absorbancję 550 nanometrów za pomocą spektrofotometru, wykonując trzy odczyty w 32. odstępach czasu. Następnie, korzystając z danych dotyczących absorbancji, masy tkanki i objętości buforu, oblicz aktywność NPO w homogenatach, jak pokazano w tym obliczeniu próbki.

W czasie trwania leczenia DSS wskaźnik aktywności choroby może być wykorzystany do oceny i oceny postępu klinicznego choroby. Zwierzęta leczone DSS wykazują znaczną utratę masy ciała w porównaniu z ich początkową masą, luźne stolce i krwawienie z kału. Im bardziej treściwe niż systemy makroskopowe, tym wyższy wskaźnik aktywności choroby.

Po złożeniu w ofierze i zbadaniu okrężnicy myszy, którym podawano 5% DSS w wodzie pitnej przez pięć dni, nasilenie zapalenia jelita grubego na podstawie makroskopowej oceny skrócenia długości okrężnicy, krwawienia z okrężnicy, krwawienia z kału, rozluźnienia konsystencji stolca i objawów krwawienia z odbytu dla tego reprezentatywnego eksperymentu stwierdzono, że jest około pięć razy gorsze niż w grupie kontrolnej traktowanej tylko wodą, jak wykazano w tych przekrojach danych leczonych DSS Próbki tkanki okrężnicy, takie same jak H i E, mają wyższe wyniki histologiczne niż kontrole poddane działaniu wody. W tym przypadku normalną architekturę i brak nacieku komórkowego można było zauważyć w obszarze wskazanym gwiazdką w tym barwionym przekroju h i e pobranym od zwierzęcia kontrolnego, które otrzymywało tylko wodę. Teraz porównaj to barwienie h i e próbki od zwierzęcia poddanego działaniu DSS z poprzednim rysunkiem.

Okrężnica tego zwierzęcia wykazuje więcej uszkodzeń histologicznych, o czym świadczy większa infiltracja komórkowa, na co wskazuje znak funta, oraz większe zubożenie komórek kubkowych i większe zniekształcenia. Uszkodzenie architektury krypty K oznaczone gwiazdką. Aby dokładniej scharakteryzować zakres nasilenia choroby u myszy leczonych DSS, aktywność NPO, zastępczy marker stanu zapalnego można ocenić na podstawie homogenizowanych próbek tkanki okrężnicy.

Zgodnie z oczekiwaniami, okrężnice leczone DSS mają wyższą aktywność NPO niż grupy kontrolne. Ponadto nasilenie zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS jest związane ze zwiększonym poziomem cytokin prozapalnych, takich jak IL one, beta, IL six i TNF alfa. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że aktywność MPO może z czasem ulec zmniejszeniu.

Dlatego test MPO powinien być jednym z pierwszych testów wykonywanych przy określaniu nasilenia zapalenia jelit.