Segmentacja i pomiar objętości tkanki tłuszczowej w mysich modelach otyłości z wykorzystaniem komputerowej tomografii rentgenowskiej
4 kwietnia 2012
Analiza zawartości tłuszczu jest rutynowo przeprowadzana w badaniach z wykorzystaniem mysich modeli otyłości. Nowoczesne metody obrazowania i analizy tomografii komputerowej (CT) małych zwierząt umożliwiają szczegółową, podłużną analizę zawartości tłuszczu. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedury krok po kroku dotyczące wykonywania obrazowania CT, analizy oraz wizualizacji u małych zwierząt.
Ogólnym celem tej procedury jest nieinwazyjne obrazowanie, ilościowe określenie i wizualizacja zawartości tłuszczu u żywych myszy. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności badania tomografii komputerowej (CT) myszy. Drugim krokiem procedury jest segmentacja i ilościowe określenie objętości tkanki tłuszczowej w organizmie myszy na podstawie gęstości radiologicznej.
Trzecim krokiem jest wizualizacja danych CT w trzech wymiarach z zaznaczeniem objętości tłuszczu kolorem czerwonym. Ostatecznie wyniki te umożliwiają ilościowe oznaczenie i wizualizację zawartości tłuszczu podczas podłużnych badań in vivo z wykorzystaniem systemu albia X-ray ct wraz z pakietami oprogramowania PMOD oraz vol view. Jedną z kluczowych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza ex vivo, jest to, że pozwala ona na nieinwazyjną i podłużną ocenę tkanki tłuszczowej w modelach chorób u małych zwierząt.
Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ protokół segmentacji i wizualizacji obejmuje kilka etapów, które muszą zostać wykonane sekwencyjnie. Ponadto podczas akwizycji należy zastosować optymalne parametry promieniowania rentgenowskiego. Aby uzyskać najlepszy kontrast tkanki tłuszczowej, należy rozpocząć od znieczulenia wybranych myszy otyłych w komorze indukcyjnej, a następnie przenieść je do maski nosowej.
Utrzymaj znieczulenie podczas obrazowania, umieszczając myszy w standardowym legowisku dla szczurów z kończynami skierowanymi bocznie względem tułowia. Zapewnia to jednorodne obrazowanie CT. Ustaw system CT tak, aby zeskanować obszar o długości 115 mm przy użyciu 600 projekcji.
Ustaw źródło promieniowania rentgenowskiego na 200 µA i 45 kVp, a w celu utwardzenia wiązki zastosuj filtr aluminiowy o grubości 0,5 mm. Równoważna dawka głęboka, jaką mysz otrzyma przy tych ustawieniach, wynosi około 220 mSv, natomiast równoważna dawka powierzchniowa obliczona przez komputer to 357,4 mSv. Do rekonstrukcji obrazu wybierz algorytm FBP, stosując standardowe parametry.
Ostatecznie końcowy obraz składa się z izotropowych wokseli o wielkości 125 mikronów i może być wykorzystany do analizy obrazowej całego zwierzęcia. Analiza obrazu jest przeprowadzana przy użyciu oprogramowania analitycznego PMOD; najpierw program PMOD dokonuje segmentacji obrazów zgodnie z gęstością tkanki, a następnie oblicza objętość tkanki tłuszczowej. Po załadowaniu obrazu należy zmniejszyć jego rozmiar, aby zminimalizować zapotrzebowanie obliczeniowe.
Przejdź do głównej karty widoku, wybierz narzędzia, a następnie redukcję. Ustaw wartości redukcji na dwa dla osi X, dwa dla osi Y oraz dwa dla osi Z, zatwierdź, wybierz zastąp i uruchom proces. Po zakończeniu procesu pojawi się okno z komunikatem.
Aby usunąć elementy łoża i stożka nosowego z obrazów, należy je zamaskować przed analizą VOI. Przejdź do sekcji planes layouts, rotations, mirror 3D markers i wybierz planes and layouts. Zaznacz opcję show plane Z, a następnie przesuń widok do stożka nosowego w płaszczyźnie Z.
Następnie wybierz główną kartę VOI i wybierz opcję rysowania wierzchołków. Narysuj ROI wokół nosa, wykluczając podłoże i stożek nosowy, a następnie wybierz opcję kopiowania faktycznego ROI między sobą. Wykonaj przekrój z elementem stożka nosowego.
W razie potrzeby wklej ROI z bufora na obszar nosa. Użyj polecenia edycji grupy wierzchołków, aby dostosować ROI. Gdy stożki nosowe przestaną być widoczne, usuń ROI i wygeneruj VOI obejmujące obwód ciała zwierzęcia.
Przejdź do narzędzi VOI, a następnie do opcji maskowania i algebry. W wyświetlonym oknie dialogowym wpisz -1000. Następnie kliknij przycisk Mask voxels outside the selected vois.
Gdy pojawi się komunikat „irreversible data operation do you want to continue”, wybierz tak. Następnie przejdź do sekcji planes layouts, rotations, mirror 3D markers, a na koniec do planes and layouts. Wybierz opcję show all planes.
Sprawdź integralność VOI. Gdy VOI będzie poprawna, zapisz ją jako plik do analizy i zmień prefiks nazwy pliku. Następnie przystąp do segmentacji obrazu w celu wyznaczenia całkowitej objętości zwierzęcia.
Zacznij od wybrania opcji narzędzi i zewnętrznych. Następnie zaznacz pole wyboru segmentacji. Wprowadź zakres od -300 do +3 500 i uruchom segmentację.
Następnie wybierz statystyki VOI, które raportują statystyki reprezentujące całkowitą objętość. Zanotuj tę wartość objętości. Teraz przeprowadź segmentację obrazu w celu wyznaczenia objętości tłuszczu, najpierw powracając do niesegmentowanego obrazu masy.
Po drugie, wczytaj zapisany plik z danymi masowymi i zaznacz pole analizy (analyze) w oknie ładowania. Następnie wybierz narzędzia (tools), a potem opcję zewnętrzne (external). Na koniec zaznacz pole wyboru segmentacji (segmentation).
Wprowadź zakres od -200 do -50 i uruchom segmentację. Po zatwierdzeniu wyników wybierz VOI.Statistics. Należy pamiętać, że raportowane statystyki reprezentują objętość tkanki tłuszczowej.
Zapisz wyniki w formacie analizowanym i nadaj unikalny prefiks nazwy pliku. Jeśli jednak pozostała gęstość skóry lub tkanek obwodowych, zastosuj protokół erozji i dylatacji, aby wyeliminować te obszary z analizy VOI. Przed zapisaniem przejdź do narzędzi zewnętrznych (tools external) i zaznacz pole wyboru morfologii w nowym oknie.
Wybierz erozję, a następnie... Dobrze, wróć do pól wyboru morfologicznych i wybierz dylatację i upewnij się, że problem z krawędziami skóry lub gęstością peryferyjną został rozwiązany, a następnie zapisz wyniki. Wykorzystaj pakiet oprogramowania Volvo view w wersji 3.2 do stworzenia renderowanych wizualizacji 3D z segmentowanych obrazów.
Rozpocznij od otwarcia zbioru danych CT zapisanego w formacie analyze. W wyświetlonym oknie pop-up zastosuj ustawienia domyślne, następnie otwórz menu wtyczek (plugins) i w sekcji narzędzi (utility) wybierz opcję scalania wolumenów (merge volumes). Odznacz opcję przeskalowania komponentów (rescale components).
Kliknij przypisz Drugie wejście (assign Second input). Wybierz zsegmentowane dane tkanki tłuszczowej jako drugie wejście i zastosuj ustawienia domyślne w oknie wyskakującym. Następnie uruchom wtyczkę, aby uzyskać powiększony widok myszy badawczej.
Kliknij dwukrotnie okno widoku wolumetrycznego. Powróć do karty kolorów i przezroczystości (color slash opacity). Rozwijane menu komponentów wskazuje, który zestaw danych jest aktualnie edytowany.
Na dole karty znajdują się dwa suwaki. Określają one względną jasność każdego zestawu danych w nakładce, przyjmując wartości od zera do jeden. Aby na przykład zmienić kolor na skalę szarości, należy przejść do sekcji mapowania kolorów skalarnego.
Kliknij dwukrotnie jeden z suwaków i przeciągnij go poza ramkę. Dodaj drugi suwak, klikając w dowolnym miejscu w obszarze suwaków. Ustaw lewy suwak koloru na czarny, a prawy suwak koloru na biały.
Następnie przejdź do pola mapowania przezroczystości skalarnej i utwórz nowy punkt, klikając wewnątrz pola. W oknie znajdą się wówczas łącznie trzy punkty, w tym punkt środkowy. Zmień wartość skalarną na około -3000 i ustaw wartość przezroczystości na zero.
Po prawej stronie okna znajduje się trzeci punkt; należy zmienić jego wartość skalarną na około 32 000, a przezroczystość na 0,25. Pierwszy punkt może znajdować się w dowolnym miejscu po lewej stronie, o ile wartość przezroczystości zostanie ustawiona na zero. Przy ustawionej wartości skalarnej należy przełączyć na komponent drugi, który odpowiada za edycję wyglądu tłuszczu, a następnie zmienić każdy z suwaków kolorów na czerwony, dwukrotnie klikając i przesuwając suwak odcienia H do końca.
Operacja ta nadaje tkance tłuszczowej fałszywy kolor czerwony. Aby utworzyć trójpanelowy film obrotowy wyświetlający obraz CT tkanki tłuszczowej wraz z nałożoną warstwą, najpierw kliknij i przeciągnij myszą obiekt, aby ustawić go w pozycji pionowej plecami do użytkownika. Po drugie, w sekcji wag komponentów (component weights) ustaw wartość komponentu drugiego na zero, tak aby wyświetlany był tylko skan CT. Po trzecie, kliknij review, następnie camera i wybierz liczbę klatek dla filmu obrotowego. Po czwarte, zmień wartość rotacji X na 360 stopni.
W oknie dialogowym wybierz opcję Create. Utwórz nowy folder o nazwie CT i zapisz plik w formacie TIF, co wygeneruje serię obrazów rotacyjnych. Powtórz te kroki dla obrazu tkanki tłuszczowej oraz dla nałożonego obrazu tłuszcz/CT, zapisując ich obrazy rotacyjne we właściwych folderach. Aby stworzyć film z rotacji z uzyskanych obrazów, otwórz program ImageJ i zaimportuj sekwencje obrazów.
Wybierz pierwszy obraz w folderze CT, a pozostałe zostaną zaznaczone automatycznie. Powtórz ten proces dla sekwencji tłuszczowej (fat) i nakładki (overlay) z jednym ze stosów. Pozostaw okno otwarte.
Otwórz menedżera ROI. Znajduje się on w narzędziach analizy (analyze tools), a następnie w menedżerze ROI (ROI manager). Obrysuj obszar ROI wokół badanej myszy, wykluczając niepotrzebne piksele tła. Po zakończeniu kliknij „add” w menedżerze ROI.
Następnie do każdej sekwencji obrazów zastosuj ten sam ROI. Gdy ROI zostanie naniesiony na wszystkie stosy, kliknij prawym przyciskiem myszy. W menu ROI wybierz opcję duplikuj (duplicate), a następnie wybierz. Zaznacz zduplikowany stos.
Pozwala to oddzielić ROI od pozostałej części obrazu. Teraz zamknij większe stosy obrazów i powtórz tę procedurę dla wszystkich trzech sekwencji obrazów. Aby połączyć stosy, użyj polecenia combine, które znajduje się w menu stacks, a następnie w tools.
Wybierz stos CT jako stos pierwszy, a stos tłuszczowy jako stos drugi. Następnie powtórz ten proces, wybierając nowo połączone stosy jako stos pierwszy oraz stos nakładki jako stos drugi.
To kończy proces tworzenia stosu rotacji obrazów składającego się z trzech paneli. Przegląd stosu można uruchomić, wybierając przycisk odtwarzania w lewym dolnym rogu okna obrazu. Następnie należy zapisać go jako plik wideo AVI.
W celu zilustrowania możliwości systemu Alber CT wykorzystano myszy OB/OB. W pomiarach zawartości tkanki tłuszczowej opartych na tomografii komputerowej (CT) porównano je z myszami typu dzikiego C57BL/6. Po lewej stronie przedstawiono całkowitą objętość CT otyłej myszy.
W centrum znajduje się objętość tkanki tłuszczowej zaznaczona na czerwono, a po prawej stronie nałożenie obrazów. Analogiczna analiza zwierząt typu dzikiego wykazuje znaczną różnicę w zawartości tłuszczu w porównaniu z myszą otyłą. Dla każdego zwierzęcia obliczono objętość całkowitą, objętość tkanki tłuszczowej oraz stosunki objętości.
Średni stosunek objętości tkanki tłuszczowej do objętości całkowitej dla grupy typu dzikiego i grupy otyłej wynosił odpowiednio 0,09 i 0,42. Wartości te różniły się istotnie przy wartości P wynoszącej 0,001. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien posiadać solidną wiedzę na temat segmentacji objętości tkanki tłuszczowej w zbiorze danych CT żywej myszy, po opanowaniu opisanej metody.
Wykonanie tej techniki powinno zająć mniej niż 30 minut. Dziękujemy za oglądanie i do zobaczenia następnym razem.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje nieinwazyjną metodę obrazowania i ilościowego oznaczania zawartości tłuszczu u żywych myszy z wykorzystaniem tomografii komputerowej (CT) promieniami rentgenowskimi. Procedura ta umożliwia prowadzenie badań podłużnych w mysich modelach otyłości, co pozwala na lepsze zrozumienie rozkładu i objętości tkanki tłuszczowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Analiza zawartości tłuszczu jest kluczowa w badaniach nad otyłością.
- Tradycyjne metody mogą być inwazyjne i mniej informatywne.
- Postępy w obrazowaniu CT dostarczają szczegółowych informacji o rozkładzie tkanki tłuszczowej.
- Technika ta umożliwia prowadzenie badań podłużnych u żywych osobników.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnego protokołu obrazowania do ilościowego oznaczania zawartości tłuszczu.
- Umożliwienie wizualizacji zawartości tłuszczu w modelach mysich.
- Ułatwienie podłużnych ocen zmian zawartości tłuszczu w czasie.
Zastosowane metody
- Skanowanie myszy w znieczuleniu za pomocą tomografii komputerowej (CT) z użyciem promieni rentgenowskich.
- Segmentacja objętości tkanki tłuszczowej na podstawie gęstości radiologicznej.
- Wizualizacja danych CT w 3D przy użyciu oprogramowania PMOD oraz VolView.
- Protokoły krok po kroku dotyczące analizy obrazu i ilościowego określania objętości.
Główne wyniki
- Skuteczne nieinwazyjne obrazowanie zawartości tłuszczu u żywych myszy.
- Ilościowe dane dotyczące objętości tłuszczu uzyskane poprzez segmentację.
- Wizualizacje 3D skutecznie podkreślają rozkład tłuszczu.
- Metoda wykazuje przewagi nad tradycyjnymi technikami inwazyjnymi.
Wnioski
- Opracowana metoda umożliwia szczegółową analizę zawartości tłuszczu w modelach mysich.
- Wspiera ona badania podłużne, usprawniając badania nad otyłością.
- Technika ta może stanowić cenne narzędzie dla badaczy w tej dziedzinie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy, nieinwazyjny pomiar objętości tkanki tłuszczowej w modelach mysich z wykorzystaniem komputerowej tomografii rentgenowskiej (CT) umożliwia przeprowadzanie rzetelnych badań podłużnych w obszarze chorób metabolicznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w ramach opracowywania terapii otyłości i zespołu metabolicznego. Metoda ta wspiera ciągłość translacyjną, dostarczając powtarzalnych, specyficznych dla poszczególnych regionów danych o ilości tkanki tłuszczowej, które są kluczowe dla podejmowania decyzji na etapie przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek związanych z otyłością w oparciu o postawione hipotezy w modelach otyłości indukowanych genetycznie lub środowiskowo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ilościowe określanie zmian w rozmieszczeniu tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na potencjalne interwencje.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie obiektywnych, ilościowych punktów końcowych dla badań we wczesnej fazie.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, ilościowe testy obrazowania do późniejszego przesiewania związków w modelach chorób metabolicznych.
- Standaryzuje protokoły pomiaru objętości tłuszczu, co poprawia powtarzalność i porównywalność między badaniami.
- Generuje skalowalne zestawy danych wysokotreściowych, odpowiednie do przesiewania i profilowania fenotypowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica przedkliniczne punkty końcowe z klinicznymi modalnościami obrazowania, wspierając translacyjne strategie biomarkerowe.
- Umożliwia podłużne monitorowanie progresji choroby i odpowiedzi terapeutycznej in vivo.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez zapewnienie nieinwazyjnych, powtarzalnych pomiarów w kohortach badawczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten proces obrazowania i segmentacji integruje etapy od wczesnego odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne w obszarze chorób metabolicznych.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza ilościowych, specyficznych dla regionu pomiarów tkanki tłuszczowej do testowania hipotez i analizy szlaków sygnałowych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ustandaryzowane testy obrazowe do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Generuje ilościowe stosunki zawartości tłuszczu i całkowitej objętości, umożliwiając porównania statystyczne między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy przedkliniczne i kliniczne punkty końcowe obrazowania w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy dla zróżnicowanych badań nad metabolizmem i otyłością.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach modeli otyłości.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów ilościowego oznaczania tłuszczu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie niezawodnego, nieinwazyjnego gromadzenia danych podłużnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój projektów dotyczących chorób metabolicznych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obsługi małych zwierząt, anestezji oraz protokołów obrazowania CT.
- Niezbędny jest dostęp do dedykowanych systemów mikro-tomografii komputerowej (X-ray CT) dla małych zwierząt oraz zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu (PMOD, VolView).
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i progów segmentacji pomiędzy zespołami.
- Można wymagać adaptacji metody dla różnych modeli zwierzęcych lub platform obrazowania.
- Ekspozycja na promieniowanie oraz zapotrzebowanie obliczeniowe powinny być zarządzane zgodnie z wymaganiami badania.
![Wizualizacja i kwantyfikacja brązowych i beżowych tkanek tłuszczowych u myszy za pomocą obrazowania [18F]FDG Micro-PET/MR](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-08-31T11%253A09%253A42.000Z&w=384&q=75)
