Tworzenie przejściowych porów błony komórkowej za pomocą standardowej drukarki atramentowej

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie przejściowych porów w błonach komórkowych za pomocą druku atramentowego. Osiąga się to poprzez uprzednią modyfikację standardowej drukarki atramentowej. Drugim krokiem jest opróżnienie i wyczyszczenie standardowego wkładu atramentowego do drukarki, aby umożliwić włożenie atramentu biologicznego.

Następnie interesujące komórki są zawieszane w roztworze znakowanych fluorescencyjnie monomerów aktonów i PBS w celu wytworzenia roztworu biotuszu. Ostatnim krokiem jest wydrukowanie atramentu bio na szkiełkach mikroskopowych za pomocą zmodyfikowanej drukarki i wkładu. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do wykazania, że sprzężone monomery aktyny G Fluor four zostały zinternalizowane przez drukowane komórki przez przejściowe pory błonowe.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu ze standardowymi technikami transfekcji i mikroiniekcji komórek jest to, że ta technika drukowania jest łatwa w użyciu i zapewnia wysoką żywotność komórek. Chociaż technika ta może zapewnić wgląd w genetykę, może być również stosowana w innych dziedzinach nauki, takich jak biofizyka komórki i inżynieria tkankowa w biofizyce komórki. Technika ta może być wykorzystana do łatwego obserwowania cytoszkieletu komórki podczas migracji komórki.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy być w stanie uwidocznić zmiany w ułożeniu cytoszkieletu pod wpływem przyłożonych sił na komórki. Zacznij od odblokowania plastikowych klipsów od dolnej podstawy drukarki, a następnie powoli zdejmij górną plastikową obudowę. Następnie odłącz panel podświetlenia wyświetlacza przycisków od góry drukarki, pozostawiając go podłączonym do płyty głównej drukarki.

Używanie chusteczek Kim i etanolu. Wyczyść wnętrze drukarki, zwłaszcza miejsca, w których spoczywa pojemnik z tuszem i gdzie odbywa się drukowanie. Następnie zlokalizuj zasilający mechanizmy podawania papieru w biurku HP Jet 500.

Znajdują się one tuż pod tacą papieru po lewej stronie przodu i odłącz od płyty głównej. Teraz zlokalizuj mechanizm wykrywania papieru i przymocuj drucianą pętlę do szarej plastikowej dźwigni znajdującej się powyżej i za mechanizmem podawania papieru do drukowania, aby służyła jako uchwyt ręczny, umieść tutaj stolik. Piankowy uchwyt transportowy na 15 probówek wirówkowych jest używany z kilkoma szkiełkami mikroskopowymi przyklejonymi taśmą w obszarze drukowania przed mechanizmem podawania papieru, aby ustawić żądane szkiełka drukarskie na poziomie tuż pod głowicą drukującą wkładu.

Na koniec, aby zachować technikę aseptyczną, umieść drukarkę w okapie z przepływem laminarnym. Zacznij od wyjęcia wkładu z opakowania, pozostawiając taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą. Ustabilizuj korpus wkładu za pomocą zacisku, pozostawiając zieloną górę z dala od wszelkich przeszkód za pomocą ręcznego obrotowego narzędzia tnącego.

Odetnij zieloną pokrywę wkładu, opróżnij pozostałą część atramentu ze zbiornika, a następnie usuń plastikową taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą. Podczas tego procesu woda prawdopodobnie wycieknie z głowicy drukującej, ale nie spowoduje to żadnych szkód dla wkładu. Gdy woda jest czysta, pozostaw wkład do wyschnięcia.

Aby utrzymać czyste środowisko drukowania, zacznij od całkowitego zanurzenia wkładu w zlewce pełnej wody dejonizowanej, a następnie poddaj wkład sonikacji przez 15 minut. Po sonikacji wyjmij wkład i wytrząśnij nadmiar wody. Rozpyl 70% etanolu do wkładu, aby stworzyć bardziej aseptyczne środowisko.

Po zebraniu interesujących komórek odwirować komórki w pięciu mililitrach świeżej pożywki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów przez pięć minut w temperaturze 250 razy G w temperaturze pokojowej. Następnie odessać pożywkę, a następnie ponownie zawiesić komórki jeden razy 10 do piątych komórek na mililitr w świeżo przygotowanym fluorescencyjnym roztworze podstawowym G aktyny Aby stworzyć bio tusz, należy pamiętać, że 250 mikrolitrów bio atramentu drukuje trzy szkiełka nakrywkowe z pokazanym tutaj wzorem linii. Po włączeniu i rozgrzaniu drukarki umieść tutaj żądaną powierzchnię drukowania, na środku wcześniej zmontowanej sceny stosuje się szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry.

Następnie otwórz program do rysowania i wybierz żądany wzór. Teraz odpipetuj około 100 do 120 mikrolitrów zawiesiny ogniw do małego okrągłego dołka na dnie komory wkładu. Wydrukuj plik, gdy drukarka ponownie się nagrzeje, kaseta przesunie się do pozycji gotowości.

Gdy wkład przesunie się nieznacznie na lewo od atramentu, dobrze kapie i tam pozostaje. Pociągnij do góry mechanizm podawania papieru, rozpocznie się drukowanie drutem i drukowaniem. Drukarka będzie drukować na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na środku stolika drukowania za pomocą drukarki HP desk jet 500 z atramentem biologicznym składającym się z zawiesiny komórek fibroblastów w roztworze monomeru G aktyny.

Wewnątrz serii HP 26 ogniwa wkładów atramentowych zostały wydrukowane na szklanych szkiełkach okładkowych mikroskopu. Rysunek ten ilustruje reprezentatywny wynik drukowanych komórek fibroblastów, które wykazują włączone fluorescencyjne monomery aktyny. Wzór ten został wykorzystany na poprzednim rysunku do utworzenia ciągłej linii roztworu drukującego na większości szkiełka mikroskopowego.

Na tym rysunku pokazana jest linia prosta, w której biolink i komórki zostały wzajemnie zdeponowane. Należy zauważyć, że bezpośrednio po wydrukowaniu następuje wzrost fluorescencji tła, ponieważ roztwór biolink, w którym zawieszone są komórki, zawiera wolny nadmiar fluorescencyjnych monomerów aktyny inkubujących komórki przez około 10 minut po wydrukowaniu, co ułatwia przyleganie do szkiełka, umożliwiając wypłukanie nadmiaru roztworu monomeru z podłoża świeżą pożywką wzrostową, znacznie zmniejszając fluorescencję tła. Tutaj reprezentatywny obraz trzech fibroblastów T trzy wydrukowanych w zlokalizowanej strefie drukowania, jak pokazano na tym mikroskopie fluorescencyjnym mikrofotografia komórki wykonana 15 minut po wydrukowaniu pokazuje giin na zielono, jądro na niebiesko i nakładkę zarówno aktyny GI, jak i barwnika jądrowego.

Kolejne dwa obrazy pokazują mikroskopię fluorescencyjną dwóch fibroblastów ułożonych w linię trzy godziny po wydrukowaniu. Ten pierwszy obraz pokazuje znakowane fluorescencyjnie monomery aktyny wewnątrz komórek. Ten drugi obraz jest nakładką kanału fluorescencyjnego z obrazem tła, aby pokazać, że chociaż na slajdzie w lewym dolnym rogu mogą znajdować się pewne zanieczyszczenia, nie fluoryzuje.

Na koniec przedstawiono tutaj grupę kontrolną komórek niedrukowanych inkubowanych przez trzy godziny z fluorescencyjnie znakowanymi monomerami, aby wykazać, że monomery nie mogą przenikać przez błonę komórkową bez przenikania błony przez drukowanie komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kilka wkładów zostało wyczyszczonych i gotowych do użycia, ponieważ zatkanie drukarki jest jednym z problemów, które spowalniają tę technikę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przekonwertować standardową drukarkę biurkową na drukowanie żywych komórek, co pomaga wytworzyć przejściową siłę membrany.