Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie aktywności cytotoksycznych limfocytów T poprzez porównanie metody opartej na impedancji z wykorzystaniem systemu EXOGEN z testem uwalniania chromu. Pierwszy etap polega na wyizolowaniu mononuklearnych komórek krwi obwodowej z krwi pełnej za pomocą fial. Następnie PBMC dodaje się do dołków wraz z antygenem peptydowym, ludzką rekombinowaną IL two oraz napromieniowanymi PBMC w celu wygenerowania antygenowo swoistych limfocytów T CD eight.

Antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 są następnie współhodowane z komórkami nowotworowymi w obu testach w celu wywołania śmierci komórek nowotworowych. Wyniki wskazują procentową lize komórek nowotworowych, wyznaczoną zarówno metodą impedancji, jak i testem uwalniania chromu. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu, jest fakt, że system oparty na impedancji gromadzi dane w czasie rzeczywistym i wymaga mniejszej liczby komórek, które nie muszą być znakowane. W tym protokole krew od zdrowych dawców z dodatnim typem HLA-A2 służy jako źródło PBMC, czyli mononuklearnych komórek krwi obwodowej, pozyskanych zgodnie z protokołem producenta.

Użyj F call PA plus, aby odseparować P BMCs z krwi. Następnie do płytek sześciodołkowych nanieś około 4 milionów P BMCs w 2 mL medium na dołek. Do każdego dołka dodaj peptyd wiążący HLAA dwa do końcowego stężenia 10 µg/mL w kulturze.

Komórki należy przekładać co drugi dzień, aby wspomagać stymulację i ekspansję limfocytów T. Dodać świeże medium uzupełnione o ludzką rekombinowaną IL-2 do stężenia końcowego 50 units per milliliter. Po tygodniu przygotować kulturę autologicznych pbmc, napromieniować komórki i inkubować je przez dwie godziny z tym samym hla.

Kulturę restymuluje się, dodając do każdej z nich 1 ml napromieniowanego autologicznego PBM CS zawierającego dwa peptydy wiążące w stężeniu 10 µg/mL. Należy kontynuować dodawanie świeżego medium uzupełnionego o IL-2 w dni co drugi. Po kolejnym tygodniu kultury należy przeprowadzić drugą restymulację w ten sam sposób. Po dalszych sześciu dniach hodowli komórki będą gotowe do użycia.

Przygotuj stację do pomiaru impedancji inteligentnej do użytku, doprowadzając ją do stanu równowagi w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide przez co najmniej godzinę. Zbierz ludzkie komórki nowotworowe o 75% konfluencji, stosując 0.25% trypsin oraz wirowanie. Policz komórki nowotworowe za pomocą komory licznikowej i zawieś je ponownie w pożywce RPMI.

Medium z komórkami nowotworowymi o stężeniu 7 500 komórek na mikrolitr. W następnym kroku, w oprogramowaniu agenta Excel, skonfigurowano stronę układu z rozmieszczeniem studni. Na stronie harmonogramu ustawiono odczyty impedancji co pięć minut przez okres 40 godzin; przez pierwsze 18 godzin system Xceligent będzie wykonywał odczyty impedancji wyłącznie dla komórek nowotworowych.

Następnie dodaj 100 µL pożywki RPMI do hodowli nowotworowych do każdej studni. Wykonaj pomiar tła na płytkach EPL, mierząc impedancję w obecności samych płytek, bez komórek. Po dodaniu komórek nowotworowych umieść płytki w stacji pomiarowej i rozpocznij rejestrację odczytów.

Komórki nowotworowe natychmiast zaczną przylegać do EPLs. Po około 18 godzinach inkubacji komórki nowotworowe przyłączą się do EPLs, a ich liczba wzrośnie dwukrotnie, osiągając 15 000 komórek nowotworowych na dołek. W tym momencie należy zebrać przygotowane limfocyty T poprzez delikatne zdrapywanie i wirowanie z wytrząsaniem.

Komórki T należy resuspendować w medium RPMI z 10% FBS i policzyć za pomocą hemocytometru. Po ustaleniu gęstości komórek należy przygotować dwukrotny szereg rozcieńczeń komórek T w taki sposób, aby po dodaniu 200 µL komórek T do komórek nowotworowych najwyższe stężenie wynosiło 40 komórek T na jedną komórkę nowotworową. Ostatnie rozcieńczenie w serii powinno zapewniać 1,25 komórki T na jedną komórkę nowotworową.

Wstrzymaj pracę stacji EXOGEN i usuń EPL za pomocą pipety. Usuń medium z dołków, a następnie nanieś 200 µL limfocytów T, stosując wszystkie stężenia z serii rozcieńczeń jako kontrolę negatywną. Użyj czystego medium, przywróć EPL do stacji i kontynuuj program po zakończeniu analizy.

Znormalizuj wyniki. Pracując z chromem 51 oraz komórkami docelowymi znakowanymi chromem 51, zawsze przestrzegaj instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa radiologicznego i stosuj osłony w celu ograniczenia ekspozycji na promieniowanie. Rozpocznij od inkubacji impulsowej komórek nowotworowych przez dwie godziny w stężeniu 1 milion komórek na mililitr, dodając 10 mikrolitrów na mililitr świeżego chromu 51.

Następnie komórki nowotworowe przemyć w 10 mililitrach pożywki RPMI z 10% FBS, odwirować i zawiesić w tej samej pożywce w stężeniu 1 milion komórek na mililitr. Następnie, do płytki 96-dołkowej z półkolistym dnem, dodać 100 000 komórek nowotworowych na dołek w celu obliczenia spontanicznego uwalniania.

Do sześciu z tych studzienek oraz do sześciu kolejnych studzienek nie dodawaj nic więcej. Do wszystkich pozostałych studzienek dodaj 100 µL Triton X 100 w celu lizy komórek, aby obliczyć maksymalne uwalnianie. Do płytki dodaj limfocyty T, korzystając z wcześniej przygotowanego szeregu rozcieńczeń.

Następnie inkubuj płytki przez pięć godzin i pobierz próbki 50 µL supernatantu z każdej z nich. Po wysuszeniu płytek w dygestorium przez noc w temperaturze pokojowej, nanieś próbki na płytkę Luma. Zmierz ich CPM za pomocą licznika gamma dla limfocytów T i komórek raka SKBR3. Komórki nowotworowe hodowano na płytkach xCELLigence i mierzono indeks komórkowy, który odzwierciedla impedancję płytki, ponieważ limfocyty T nie wymagają adhezji do proliferacji.

Ich wpływ na impedancję był pomijalny w ciągu 40 godzin hodowli. Komórki nowotworowe hodowane samodzielnie wykazywały wzrost pomiaru impedancji. Jednak dodanie limfocytów T w 18 godzinie zakłóciło ten trend.

Zdarzenie to wymaga normalizacji oprogramowania po dodaniu limfocytów T i jest dalej badane w kolejnym eksperymencie. Gdy komórki SK BR 3 były hodowane wspólnie z różnymi stężeniami limfocytów T, spadki impedancji były bardzo wyraźnie zależne od dawki limfocytów T; dane zbierano co pięć minut w trzech próbach w 10. godzinie. Indeksy komórkowe wykazały zależność opisaną wielomianem drugiego stopnia w zakresie stężeń limfocytów T, co wskazuje, że stacja Exogen monitoruje w czasie rzeczywistym indukowaną przez limfocyty CD8 śmierć nowotworu SK BR 3 jako spadek indeksu komórkowego, aby ustalić, czy spadki impedancji SK BR 3 wywołane przez limfocyty T były specyficzne dla antygenu.

Trzy komórki SK KBR współhodowano z HLA A2-dodatnimi limfocytami T specyficznymi dla FLU, które nie rozpoznają HER2-neu. Komórki te wykazywały znacznie mniejszą aktywność lityczną. Aby dalej określić, czy limfocyty T specyficzne dla HER2-neu zabijają w sposób swoisty antygenowo, do współhodowli włączono przeciwciało przeciwko ligandowi Fas. Przeciwciało to nie zmniejszyło aktywności litycznej limfocytów T specyficznych dla HER2-neu P360 9.

Jednak w przypadku limfocytów T nieswoiście aktywowanych kuleczkami anty-CD3/CD28, przeciwciało to hamowało lizę, co pozwoliło określić, czy zabijanie następowało w sposób zależny od HLA klasy I. Do kokultur dodano przeciwciało anty-HLA klasy I lub przeciwciało kontrolne izotypowe. Wyniki silnie potwierdziły tę hipotezę.

Następnie limfocyty T poddano kokulturze z innymi komórkami nowotworowymi w stosunku jeden do pięciu. Linia komórek nowotworowych BT 20, wykazująca brak ekspresji HLA-A2, została wykorzystana jako kontrola negatywna. Wyniki wskazują, że metoda ta jest użyteczna w przypadku wielu rodzajów adherentnych komórek nowotworowych.

Współuprawy HER2-specyficznych limfocytów T P360.9 dodano do komórek docelowych znakowanych chromem-51, a następnie przeprowadzono analizę CRA. Test wykazuje większą czułość w analizie spójności. Zmienność wewnątrztestową obliczono jako procentowy współczynnik zmienności dla każdego stosunku komórek w zakresie od 1:40 do 1:5.

Wartość ta wynosiła poniżej 15% przy najniższych stosunkach komórek. Jednakże procentowy współczynnik zmienności (CV) był wysoki lub nieprzewidywalny. Dodatkowo zbadano zmienność lizy komórek T linii SK BR three w kokulturze z różnymi liniami komórek T specyficznych dla P 360 9.

Dane generowano w odstępach 30-dniowych. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki były bardzo zbliżone. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu określania aktywności cytotoksycznych limfocytów T z wykorzystaniem antygenowo swoistych limfocytów T CD8 oraz komórek nowotworowych, stosując metodę opartą na impedancji.