Określanie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie aktywności cytotoksycznych limfocytów T poprzez porównanie podejścia opartego na impedancji z wykorzystaniem systemu EXOGEN z testem uwalniania chromu. Pierwszy etap osiąga się poprzez oddzielenie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od krwi pełnej za pomocą fial. Następnie PBMC dodaje się do studzienek wraz z antygenem peptydowym, ludzkim rekombinowanym IL dwa i napromieniowanym PBMC w celu wytworzenia specyficznych dla antygenu limfocytów T CD ośmiu.

Specyficzne dla antygenu limfocyty T CD eight są następnie hodowane wspólnie z komórkami nowotworowymi w obu testach w celu spowodowania śmierci komórek nowotworowych. Uzyskuje się wyniki, które pokazują procentową lizę komórek nowotworowych zarówno przy użyciu metody impedancji, jak i testu uwalniania chromu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu, jest to, że system oparty na impedancji zbiera dane w czasie rzeczywistym i wymaga mniejszej liczby komórek, które nie wymagają żadnego znakowania W przypadku tego protokołu krew od normalnych, zdrowych dawców HLA A z dodatnim wynikiem stanowi źródło pbmc lub komórek jednojądrzastych krwi obwodowej zgodnie z protokołem producenta.

Użyj F call PA plus, aby oddzielić P BMC od krwi. Następnie do płytek sześciodołkowych załaduj około 4 miliony BMC P w dwóch mililitrach pożywki na studzienkę. Do każdego z nich dobrze dodaj peptyd wiążący HLAA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr kultury.

Komórki co drugi dzień, aby pomóc stymulować i rozszerzać limfocyty T. Dodaj świeżą pożywkę uzupełnioną ludzką rekombinowaną IL dwa, aby uzyskać końcowe stężenie 50 jednostek na mililitr. Po tygodniu przygotuj hodowlę autologicznego pbmc, naświetlaj komórki i pulsuj je przez dwie godziny tym samym hla.

Dwa peptydy wiążące w dawce 10 mikrogramów na mililitr restymulują hodowlę, dodając do każdego mililitr napromieniowanego autologicznego PBM CS. Cóż, kontynuuj dodawanie świeżej pożywki uzupełnionej IL dwa co drugi dzień po kolejnym tygodniu, ponownie stymuluj kultury w ten sam sposób po raz drugi. Po kolejnych sześciu dniach w hodowli komórki będą gotowe do użycia.

Przygotuj stację pomiaru impedancji inteligencji do użycia, równoważąc ją do 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej godzinę. Zbierz 75% zlejących się ludzkich komórek nowotworowych za pomocą 0,25% trypsyny i odwirowania. Policz komórki nowotworowe za pomocą hemocytometru i rozpuść je w RPMI.

Pożywka nowotworowa w stężeniu 7 500 komórek na mikrolitr. Następnie program, oprogramowanie agenta Excel skonfiguruje stronę układu z układem studni. Skonfiguruj stronę harmonogramu tak, aby odczytywała impedancję co pięć minut przez okres 40 godzin przez pierwsze 18 godzin, system Xceligent będzie wykonywał tylko odczyty impedancji komórek nowotworowych.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki nowotworowej RPMI na dołek. Zapoznaj się z informacjami na temat EPL, mierząc impedancję w przypadku braku ogniw. Po dodaniu komórek nowotworowych załaduj płytki do tej stacji i zacznij dokonywać odczytów.

Komórki nowotworowe natychmiast zaczną przylegać do EPL. Po około 18 godzinach inkubacji komórki nowotworowe przyłączą się do EPL i podwoją się do 15 000 komórek nowotworowych na studzienkę. W tym czasie zbierz przygotowane limfocyty T przez delikatne skrobanie i wirówkę z mieszaniem.

Limfocyty T rozpuszczają je w pożywkach RPMI z 10% FBS i liczą za pomocą hemocytometru. Gdy gęstość komórek jest znana, przygotuj serię dwukrotnych rozcieńczeń limfocytów T, tak aby po dodaniu 200 mikrolitrów limfocytów T do komórek nowotworowych najwyższe stężenie wynosiło 40 limfocytów T na komórkę nowotworową. Ostatnie rozcieńczenie serii powinno dostarczyć 1,25 limfocytów T na komórkę nowotworową.

Zatrzymaj stację EXOGEN i wyjmij EPL za pomocą pipety. Usunąć pożywkę ze studzienek, a następnie załadować 200 mikrolitrów limfocytów T, wykorzystując wszystkie stężenia z serii rozcieńczeń jako kontrolę ujemną. Użyj czystej pożywki, zwróć EPL do tej stacji i kontynuuj program po zakończeniu testu.

Znormalizuj wyniki. Podczas pracy z ogniwami docelowymi oznaczonymi chromem 51 i chromem 51 należy zawsze przestrzegać instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa radiacyjnego oraz stosować osłonę w celu zmniejszenia narażenia na promieniowanie. Zacznij od pulsowania komórek nowotworowych przez dwie godziny w tempie 1 miliona komórek na mililitr z 10 mikrolitrami na mililitr świeżego chromu 51.

Następnie umyj komórki nowotworowe w 10 mililitrach pożywki RPMI za pomocą 10% FBS, odwiruj komórki i rozpuść je w tym samym podłożu w ilości 1 miliona komórek na mililitr. Następnie do 96-dołkowej okrągłej płyty dennej. Dodaj 100 000 komórek nowotworowych na studzienkę, aby obliczyć spontaniczne uwalnianie.

Nie dodawaj niczego innego do sześciu z tych studzienek do sześciu innych studzienek. Dodaj 100 mikrolitrów Triton X 100, aby przelić komórki, a tym samym obliczyć maksymalne uwalnianie do wszystkich pozostałych studzienek. Dodać limfocyty T do płytki, stosując przygotowaną wcześniej serię rozcieńczeń.

Teraz inkubuj płytki przez pięć godzin i zbierz 50 mikrolitrów próbek supernatantu z każdej z nich, dobrze załaduj próbki na płytkę luma po wysuszeniu płytek w kapturze przez noc w temperaturze pokojowej. Zmierz ich CPM za pomocą limfocytu T z licznikiem gamma i SKBR trzy. Komórki rakowe hodowano na płytkach inteligencji X i mierzono indeks komórek, który jest odzwierciedleniem impedancji płytki, ponieważ limfocyty T nie wymagają przylegania do proliferacji.

Ich wpływ na impedancję był znikomy w ciągu 40-godzinnej hodowli. Komórki rakowe hodowane samodzielnie wykazywały rosnący pomiar impedancji. Jednak dodanie limfocytów T po 18 godzinach zaburza ten trend.

Zdarzenie to wymaga normalizacji oprogramowania po dodaniu limfocytów T i jest dalej badane w następnym eksperymencie. Gdy trzy komórki SK BR były hodowane jednocześnie z różnymi stężeniami limfocytów T, zmniejszenie impedancji było bardzo wyraźnie zależne od dawki limfocytów T, dane zbierano co pięć minut w trzech próbach po 10 godzinach. Wskaźniki komórkowe podążały za wielomianem drugiego rzędu w zakresie limfocytów T, co wskazuje, że stacja Exogen monitoruje śmierć za pośrednictwem limfocytów T CD osiem guzów SK B trzy w czasie rzeczywistym jako spadek indeksu komórkowego w celu określenia, czy zmniejszenie impedancji SK BR trzy przez limfocyty T było specyficzne dla antygenu.

Trzy komórki SK KBR były współhodowane z HLA A, dwoma dodatnimi limfocytami T specyficznymi dla FLU, które nie rozpoznają HER dwóch nowych. Komórki te miały znacznie mniejszą aktywność lityczną, aby dokładniej określić, czy jej dwie nowe specyficzne limfocyty T zabijały w sposób specyficzny dla antygenu, przeciwciało przeciwko szybkiemu ligandowi zostało włączone do kultur CO. Przeciwciało nie zmniejszyło aktywności litycznej dwóch nowych limfocytów T specyficznych dla P 360 9 HER.

Jednak w przypadku limfocytów T, które nie były specyficznie aktywowane kulkami anty CD 3, CD 28, przeciwciało hamowało lizę, aby określić, czy zabijanie odbywało się w sposób zależny od HLA klasy pierwszej. Do kultur ko-kulturowych dodano przeciwciało anty HLA klasy pierwszej lub przeciwciało kontrolne izotypu. Wyniki zdecydowanie potwierdziły tę hipotezę.

Limfocyty T były następnie hodowane wspólnie z innymi komórkami nowotworowymi w stosunku od jednego do pięciu. Jako kontrolę ujemną zastosowano HLA A dwuujemną linię komórek nowotworowych BT 20. Wyniki pokazują, że metoda jest przydatna w przypadku wielu docelowych przylegających komórek nowotworowych.

Hodowle kologiczne dwóch nowych limfocytów T specyficznych dla P 360 9 HER dodano do komórek docelowych znakowanych chromem 51, a następnie przeprowadzono analizę CRA. Test inteligencji wydaje się bardziej czuły do analizy spójności. Zmienność w teście wewnętrznym obliczono jako procentowy współczynnik zmienności przy każdym stosunku komórek od jednego do 40 i od jednego do pięciu.

Mierzono to poniżej 15% przy najniższych proporcjach komórek. Jednak procent CV był wysoki lub nieprzewidywalny. Dodatkowo zbadano zmienność lizy limfocytów T trzech SK BR przez wspólną hodowlę z różnymi liniami limfocytów T specyficznymi dla P 360 9.

Dane zostały wygenerowane w odstępie 30 dni. Testy wykonano w trzech egzemplarzach, a wyniki były bardzo podobne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić aktywność cytotoksycznych limfocytów T za pomocą specyficznych dla antygenu limfocytów T CD ośmiu i komórek nowotworowych przy użyciu podejścia opartego na impedancji.