Name: Określanie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny aktywności cytotoksycznej limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym za pomocą systemu xCELLigence. Ta technika impedancyjna oferuje większą czułość i mniejsze zapotrzebowanie na komórki niż klasyczny test uwalniania Cr51.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana z grantów przyznanych Keithowi L. Knutsonowi przez fundację Susan G. Komen for the Cure oraz NIH/NCI 9R01 CA152045 i P50-CA116201.

<ol><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li>
<li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor%2C+viral+peptide+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li>
<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li>
<li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li>
<li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li>
<li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+a+HER-2%2Fneu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2%2Fneu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li>
<li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta%2FTNF%28alpha%29-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li>
<li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li>
<li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Roche Diagnostics.

Limfocyty T CD8 są istotne dla adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, ponieważ potrafią bezpośrednio niszczyć zakażone lub nowotworowe komórki4. Choć istnieje kilka metod pomiaru liczby antygenowo swoistych limfocytów T CD8 (np. ELIspot, tetramery, cytometria przepływowa), często pomocne jest ustalenie, czy komórki te są funkcjonalnie cytotoksyczne3. Najbardziej rozpoznawalnym testem do oceny funkcji cytotoksycznej jest CRA, który uznaje się za metodę referencyjną (gold standard)4. Głównymi ograniczeniami CRA są: (1) konieczność użycia substancji promieniotwórczych, (2) brak czułości, (3) brak informacji mechanistycznych, (4) zapotrzebowanie na dużą liczbę komórek oraz (5) pracochłonne przygotowanie. Dlatego w ciągu ostatniej dekady pojawiło się zainteresowanie wdrożeniem nowych strategii w celu zminimalizowania tych ograniczeń. Nowsze podejścia obejmują metody mierzące uwalnianie kaspazy4, aktywność esterazy BLT5 oraz ekspresję powierzchniową CD1076. Niniejszy artykuł sugeruje, że test oparty na impedancji, przeprowadzany w systemie Roche xCelligence, może być również przydatny jako alternatywa dla CRA. Możliwość zastosowania podejścia opartego na impedancji wynika z obserwacji, że limfocyty T, które nie przylegają ściśle do powierzchni, nie wydają się mieć dużego wpływu na impedancję, co eliminuje obawy dotyczące bezpośredniego zakłócania pomiaru przez limfocyty T. Przewiduje się, że nakład pracy wymagany przy użyciu systemu pomiaru impedancji będzie znacznie mniejszy, przede wszystkim ze względu na wyeliminowanie kwestii regulacyjnych związanych z użyciem radioaktywności. Jedyną istotną wadą systemu opartego na impedancji jest konieczność poniesienia wydatku rzędu 50 000 do 60 000 USD na zakup urządzenia xCelligence. Jednak urządzenie xCelligence eliminuje potrzebę posiadania licznika promieniowania i jest znacznie bardziej wszechstronne, gdyż jest użyteczne do oceny odpowiedzi komórkowej na leki i migracji, oprócz badania cytotoksyczności limfocytów T 8.
Obserwacje wskazujące na to, że spadek impedancji komórek nowotworowych jest zależny od dawki, co przedstawiono na Rysunku 2, przy stosunkowo stromym nachyleniu zgodnym z prostą wtórną funkcją kwadratową, sugerują, że test ten mógłby zostać wykorzystany w testach rozcieńczeń ograniczających (LDAs) do szacowania częstotliwości występowania komórek cytotoksycznych9. Jedną z zalet podejścia opartego na impedancji jest fakt, że wymagana liczba limfocytów T i komórek nowotworowych jest mniejsza niż w przypadku CRA, co potencjalnie zwiększa wykonalność LDA. Na przykład w CRA, przy stosunku 1:40, w każdej studzience wysiewa się 1 x 105 komórek nowotworowych, co wymaga 4 x 106 całkowitej liczby limfocytów T na studzinkę. Natomiast w teście opartym na impedancji potrzebnych jest tylko 1,5 x 104 komórek nowotworowych na studzinkę, co zużywa jedynie 6 x 105 całkowitej liczby limfocytów T na studzinkę. Zatem test oparty na impedancji wykorzystuje o 85% mniej limfocytów T i komórek nowotworowych. Ta redukcja sugeruje, że system oparty na impedancji mógłby zostać przystosowany do monitorowania immunologicznego w badaniach klinicznych u ludzi, gdzie objętość pobranej krwi może być ograniczona. Ponadto, podczas gdy CRA ogranicza się do jednego punktu czasowego, test oparty na impedancji gromadzi ciągłe dane w czasie rzeczywistym, co pozwala użytkownikowi porównać wiele punktów czasowych lizy w tym samym eksperymencie przy minimalnym dodatkowym nakładzie pracy i komórek. Obliczenia częstotliwości mogłyby zostać potencjalnie połączone z innymi strategiami, które nie mierzą funkcji, takimi jak analizy tetramerów, aby ustalić stosunek funkcjonalnych cytotoksycznych limfocytów T do całkowitej liczby antygenowo swoistych limfocytów T CD810. Jedną z najatrakcyjniejszych cech podejścia opartego na impedancji jest to, że w przeciwieństwie do większości innych testów, cytotoksyczność może być monitorowana w czasie rzeczywistym, co potencjalnie ułatwia badanie interakcji komórkowych z użyciem inhibitorów lub przeciwciał. Kolejną zaletą jest to, że metoda ta może być odpowiednia dla komórek nowotworowych opornych na znakowanie. Wreszcie, ponieważ niezabite komórki nowotworowe nie są znakowane i pozostają sterylne, możliwe jest ich dalszey odzyskanie i badanie komórek opornych na działanie limfocytów T.
Podsumowując, choć oba systemy dostarczają danych o niszczeniu nowotworu w odpowiedzi na specyficzne limfocyty T, test oparty na impedancji jest czulszy niż metoda CRA i stanowi bardziej elastyczną platformę.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Stosowane do izolacji PBMC z krwi </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych </td></tr><tr><td>wołowia surowica płodowa </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych </td></tr><tr><td>Ludzka IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>Do stymulacji wzrostu limfocytów T </td></tr><tr><td>Ludzki interferon gamma </td><td>Nauki o komórce</td><td>CR2026</td><td>Do stymulacji ekspresji MHC w komórkach nowotworowych </td></tr><tr><td>peptyd HER-2/neu p369-377 </td><td>Jednostka syntezy peptydów Mayo Clinic</td><td>sekwencja aminokwasowa KIFGSLAFL</td><td>Wiąże się z HLA-A2 </td></tr><tr><td>Peptyd p58-66 wirusa grypy </td><td>Jednostka syntezy peptydów Mayo Clinic</td><td>sekwencja aminokwasowa GILGFVFTL</td><td>Wiąże się z HLA-A2 </td></tr><tr><td>Kule Dynabeads przeciw CD3/CD28 dla ludzi </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>Do nieswoistej aktywacji i ekspansji limfocytów T </td></tr><tr><td>Chrom -51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>odczynnik do znakowania CRA </td></tr><tr><td>Płytka E-plate </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Grupa Roche</a></td><td>05469830001</td><td>dla urządzenia do pomiaru impedancji xCelligence </td></tr><tr><td>Płytka Luma 96-dołkowa </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Do pomiaru radioaktywności w liczniku Top Count NXT. </td></tr><tr><td>Stacja xCelligence RTCA DP </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Applied Science</a></td><td>RTCA DP</td><td>jednostka impedancji </td></tr><tr><td>Top Count NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>Scyntylacja &amp;amp; Luminometr </td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko ligandowi Fas</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>W celu blokowania oddziaływań Fas-ligand Fas</td></tr><tr><td>przeciwciało HLA-A2 BB7.2</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>Do blokowania HLA klasy I</td></tr><tr><td>IgG2b mysie, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>Kontrola izotypowa dla HLA klasy I</td></tr><tr><td>linia nowotworowa SKBR3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>Gruczolak naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>linia nowotworowa MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Gruczolakorak</td></tr><tr><td>linia nowotworowa HCC1419</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>Pierwotny rak przewodowy</td></tr><tr><td>linia nowotworowa BT20</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>Rak</td></tr></tbody></table>

wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów t cd8 specyficznych dla her2neu poprzez porównanie testu uwalniania cr51 z systemem xcelligence

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoksyczne limfocyty T CD8 stanowią podgrupę limfocytów T zdolnych do indukowania śmierci zakażonych lub nowotworowych komórek gospodarza1. Komórki te wykazują ekspresję wyspecjalizowanego receptora, zwanego receptorem limfocytów T (TCR), który potrafi rozpoznać specyficzny peptyd antygenowy związany z cząsteczkami HLA klasy I2. Rozpoznanie zakażonych komórek lub komórek nowotworowych poprzez ich cząsteczkę HLA klasy I prowadzi do produkcji cząsteczek litycznych, takich jak granzymy i perforyna, co skutkuje śmiercią komórki docelowej. Choć określanie częstości występowania antygenowo swoistych limfocytów T CD8 za pomocą takich testów jak ELIspot czy cytometria przepływowa jest przydatne, pomocne jest również ustalenie siły odpowiedzi limfocytów T CD8 przy użyciu testów cytotoksyczności3. Najbardziej znanym testem do oceny funkcji cytotoksycznej jest test uwalniania chromu (Chromium Release Assay, CRA), który uznaje się za metodę standardową 4. CRA posiada szereg ograniczeń, w tym narażenie komórek na promieniowanie gamma, brak powtarzalności oraz wymóg zastosowania dużej liczby komórek. W ciągu ostatniej dekady pojawiło się zainteresowanie przyjęciem nowych strategii w celu przezwyciężenia tych ograniczeń. Nowsze podejścia obejmują metody mierzące uwalnianie kaspaz 4, aktywność esterazy BLT 5 oraz ekspresję powierzchniową CD107 6. W niniejszej pracy zbadano test oparty na impedancji, z wykorzystaniem systemu Roche xCelligence, pod kątem jego potencjału jako alternatywy dla CRA. Impedancja, czyli opór przeciwko prądowi elektrycznemu, występuje, gdy adherentne komórki nowotworowe wiążą się z płytkami elektrod. Komórki nowotworowe odrywają się po zostaniu zabite, co prowadzi do zmniejszenia impedancji elektrycznej, co może być mierzone przez system xCelligence. Możliwość adaptacji podejścia opartego na impedancji do oceny zabijania zapośredniczonego przez komórki opiera się na obserwacji, że limfocyty T nie przylegają ściśle do większości powierzchni i nie wydają się mieć dużego wpływu na impedancję, co niweluje obawy dotyczące bezpośredniego zakłócania pomiaru przez limfocyty T. Wyniki pokazują, że test oparty na impedancji może wykrywać zmiany w poziomach antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T CD8 z większą czułością w porównaniu ze standardowym CRA. Na podstawie tych wyników podejścia oparte na impedancji mogą być dobrymi alternatywami dla CRA lub innych metod mających na celu pomiar funkcjonalności cytotoksycznych limfocytów T CD8.

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Cytotoksyczne limfocy T CD8 stanowią podgrupę limfocytów T zdolnych do indukowania śmierci zainfekowanych lub nowotworowych komórek gospodarza1. Komórki te wykazują ekspresję...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest określenie aktywności cytotoksycznych limfocytów T poprzez porównanie metody opartej na impedancji z wykorzystaniem systemu EXOGEN z testem uwalniania chromu. Pierwszy etap polega na oddzieleniu mononuklearnych komórek krwi obwodowej od krwi pełnej za pomocą fiolek. Następnie PBMC dodaje się do dołków wraz z antygenem peptydowym, ludzką rekombinowaną IL-2 oraz napromieniowanymi PBMC w celu wytworzenia antygenowo swoistych limfocytów T CD8+.Antygenowo swoiste limfocyty T CD8 są następnie współhodowane z komórkami nowotworowymi w obu testach w celu wywołania śmierci komórek nowotworowych. Wyniki wykazują procentową lize komórek nowotworowych przy użyciu zarówno metody impedancyjnej, jak i testu uwalniania chromu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu, jest to, że system oparty na impedancji gromadzi dane w czasie rzeczywistym i wymaga mniejszej liczby komórek, które nie wymagają żadnego znakowania. W tym protokole krew od zdrowych dawców HLA-A2 dodatnich służy jako źródło PBMC (mononuklearnych komórek krwi obwodowej) zgodnie z protokołem producenta.Użyj F call PA plus do oddzielenia P BMCs od krwi. Następnie do płytek 6-dołkowych wlej około 4 milionów P BMCs w 2 ml pożywki na każdy dołek. Do każdego dołka dodaj peptyd wiążący HLAA dwa, aby uzyskać końcowe stężenie 10 µg/ml w kulturze.Komórki należy hodować w dniach naprzemiennych, aby stymulować i powiększać populację limfocytów T. Należy dodać świeżą pożywkę uzupełnioną o ludzką rekombinowaną IL-2 do stężenia końcowego 50 units per milliliter. Po jednym tygodniu należy przygotować kulturę autologicznych PBMC, naświetlić komórki i inkubować je przez dwie godziny z tym samym HLA.Dwa peptydy wiążące w stężeniu 10 µg/mL stymulują ponownie hodowlę poprzez dodanie 1 mL napromieniowanego autologicznego PBM CS do każdej z nich. Należy kontynuować dodawanie świeżej pożywki uzupełnionej o IL-2 w dniach naprzemiennych; po kolejnym tygodniu należy ponownie stymulować hodowle w ten sam sposób. Po kolejnych sześciu dniach hodowli komórki będą gotowe do użycia.Przygotuj stację do pomiaru impedancji inteligentnej poprzez inkubację w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej godzinę. Zbierz ludzkie komórki nowotworowe przy 75% konfluencji, używając 0,25% trypsyny i wirowania. Policz komórki nowotworowe za pomocą komory licznikowej (hemo-cytometru) i zawieś je w medium RPMI.Pożywka z nowotworem o stężeniu 7 500 komórek na mikrolitr. W następnym programie, za pomocą oprogramowania Excel agent, skonfigurowano stronę układu z rozmieszczeniem studni. Na stronie harmonogramu ustawiono pomiary impedancji co pięć minut przez okres 40 godzin; przez pierwsze 18 godzin system Xceligent będzie mierzył impedancję wyłącznie komórek nowotworowych.Następnie dodaj 100 µL pożywki RPMI do hodowli komórek nowotworowych na każdą studzienkę. Wykonaj pomiar tła dla wykorzystywanych EPL, mierząc impedancję w obecności samych elektrod, bez komórek. Po dodaniu komórek nowotworowych umieść płytki w stacji pomiarowej i rozpocznij rejestrację odczytów.Komórki nowotworowe natychmiast zaczną przylegać do EPL. Po około 18 godzinach inkubacji komórki nowotworowe przyłączą się do EPL i ich liczba w każdej studzience podwoi się do 15 000. W tym czasie należy zebrać przygotowane limfocyty T, stosując delikatne skrobanie oraz wirowanie z mieszaniem.Komórki T resuspenduj w podłożu RPMI z 10% FBS i policz je za pomocą komory countingowej. Po ustaleniu gęstości komórek przygotuj dwukrotny szereg rozcieńczeń komórek T w taki sposób, aby po dodaniu 200 µL komórek T do komórek nowotworowych, najwyższa koncentracja wynosiła 40 komórek T na jedną komórkę nowotworową. Ostatnie rozcieńczenie w serii powinno zapewnić 1,25 komórki T na jedną komórkę nowotworową.Wstrzymaj pracę stacji EXOGEN i usuń EPL za pomocą pipety. Usuń medium z dołków, a następnie nanieś 200 µL limfocytów T we wszystkich stężeniach z serii rozcieńczeń jako kontrolę negatywną. Użyj czystego medium, przywróć EPL do stacji i kontynuuj program po zakończeniu analizy.Znormalizuj wyniki. Podczas pracy z chromem 51 oraz komórkami docelowymi znakowanymi chromem 51 zawsze przestrzegaj instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa radiologicznego i stosuj osłony w celu ograniczenia ekspozycji na promieniowanie. Rozpocznij od inkubacji impulsem komórek nowotworowych przez dwie godziny w stężeniu 1 milion komórek na mililitr z dodatkiem 10 mikrolitrów na mililitr świeżego chromu 51.Następnie komórki nowotworowe przemyć w 10 ml pożywki RPMI z 10% FBS, odwirować i zawiesić w tej samej pożywce w stężeniu 1 milion komórek na ml. Następnie do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem dodać 100 000 komórek nowotworowych na dołek, aby obliczyć spontaniczne uwalnianie.Do sześciu z tych studni oraz do kolejnych sześciu studni nie dodawaj niczego więcej. Do wszystkich pozostałych studni dodaj 100 µL Triton X 100 w celu lizy komórek, aby obliczyć maksymalne uwalnianie. Do płytki dodaj limfocyty T, korzystając z wcześniej przygotowanej serii rozcieńczeń.Następnie inkubuj płytki przez pięć godzin i pobierz próbki 50 µL supernatantu z każdej z nich, a następnie nanieś próbki na płytkę Luma po wysuszeniu płytek w dygestorium przez noc w temperaturze pokojowej. Zmierz ich CPM za pomocą licznika gamma dla limfocytów T oraz komórek raka SKBR3. Komórki nowotworowe hodowano na płytkach xCELLigence i mierzono indeks komórkowy, który jest odzwierciedleniem impedancji płytki, ponieważ limfocyty T do proliferacji nie wymagają adhezji.Ich wpływ na impedancję był pomijalny podczas 40-godzinnej hodowli. Komórki nowotworowe hodowane samodzielnie wykazywały wzrost wartości impedancji. Jednakże dodanie limfocytów T w 18. godzinie przerywa ten trend.Zdarzenie to wymaga normalizacji oprogramowania po dodaniu limfocytów T i jest dalej badane w kolejnym eksperymencie. Podczas kokultury komórek SK BR 3 z różnymi stężeniami limfocytów T, spadki impedancji były wyraźnie zależne od dawki limfocytów T; dane zbierano co pięć minut w trzech próbach w 10. godzinie. Wskaźniki komórkowe (cell indices) wykazywały zależność opisaną wielomianem drugiego stopnia w zakresie stężeń limfocytów T, co wskazuje, że stacja Exogen monitoruje w czasie rzeczywistym śmierć guzów SK BR 3 indukowaną przez limfocyty T CD8 jako spadek wskaźnika komórkowego, aby określić, czy spadki impedancji SK BR 3 wywołane przez limfocyty T były swoiste antygenowo.Trzy linie komórkowe SK KBR współhodowano z HLA A2-dodatnimi T-komórkami specyficznymi dla FLU, które nie rozpoznają HER2-neu. Komórki te wykazywały znacznie mniejszą aktywność lityczną. Aby dalej ustalić, czy T-komórki specyficzne dla HER2-neu zabijają w sposób swoisty dla antygenu, do współhodowli wprowadzono przeciwciało przeciwko Fas ligand. Przeciwciało to nie zmniejszyło aktywności litycznej T-komórek specyficznych dla HER2-neu P 360 9.Jednak w przypadku limfocytów T niespecyficznie aktywowanych za pomocą kulek anty-CD3/CD28, przeciwciało to hamowało lizę, co pozwoliło ustalić, czy zabijanie odbywało się w sposób zależny od HLA klasy I. Do kokultur dodano przeciwciało anty-HLA klasy I lub przeciwciało kontrolne izotypowe. Wyniki zdecydowanie potwierdziły tę hipotezę.Następnie limfocyty T poddano kokulturze z innymi komórkami nowotworowymi w stosunku jeden do pięciu. Jako kontrolę negatywną wykorzystano linię komórek nowotworowych BT 20, która jest negatywna pod kątem HLA A2. Wyniki wykazują, że metoda ta jest użyteczna w przypadku wielu rodzajów adhezyjnych komórek nowotworowych.Współhodowle HER2-specyficznych limfocytów T P360-9 dodano do komórek docelowych znakowanych chromem 51, a następnie przeprowadzono analizę CRA. Test odpornościowy wydaje się być bardziej czuły w analizie spójności. Zmienność wewnątrztestową obliczono jako procentowy współczynnik zmienności dla każdego stosunku komórek w zakresie od 1:40 do 1:5.Wartość ta wynosiła poniżej 15% przy najniższych stosunkach komórek. Jednakże procentowy współczynnik zmienności (CV) był wysoki lub nieprzewidywalny. Dodatkowo zbadano zmienność lizy komórek T linii SK BR 3 w kokulturze z różnymi liniami komórek T specyficznych dla P 360 9.Dane generowano w odstępach 30 dni. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki były bardzo zbliżone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak określać aktywność limfocytów T cytotoksycznych z wykorzystaniem antygenowo specyficznych limfocytów T CD8 i komórek nowotworowych, stosując metodę opartą na impedancji.

determining-optimal-cytotoxic-activity-human-her2neu-specific-cd8-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Określanie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek CD8 T specyficznych dla Her2neu przez porównanie testu uwalniania Cr51 do systemu xCELLigence

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę oceny aktywności cytotoksycznej limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym za pomocą systemu xCELLigence. Ta technika impedancyjna oferuje większą czułość i mniejsze zapotrzebowanie na komórki niż klasyczny test uwalniania Cr51.

Określanie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence (Wideo) | JoVE Journal

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Przeglądaj więcej filmów