Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie i ilościowe oznaczenie puli toksyny, która przedostaje się do cytozolu. Aby to osiągnąć, toksynę najpierw wiąże się z powierzchnią komórki gospodarza w temperaturze 4°C. Następnie usuwa się niezwiązaną toksynę, a komórki ogrzewa się do 37°C, co umożliwia przemieszczanie się toksyny do systemu endomembran, a następnie do cytozolu gospodarza; po przejściu toksyny do wnętrza komórki stosuje się digitoninę w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej.

Ekstrakty komórkowe są rozdzielane na oddzielne frakcje błonowe i cytozolowe za pomocą wirowania różnicowego; w końcowym kroku wykorzystuje się rezonans plazmonowy powierzchniowy (SPR) w celu wykrycia i ilościowego oznaczenia toksyny, która przedostała się do cytozolu, poprzez perfuzję frakcji cytozolowej nad czujnikiem SPR pokrytym przeciwciałem antytoksynowym. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii toksyn, takie jak wydajność i kinetyka wnikania toksyny do cytozolu, ilość toksyny dostającej się do cytozolu oraz możliwość hamowania transportu toksyny do cytozolu przez leki. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przygotować komórki HeLa do intoksykacji zgodnie z opisem w protokole pisemnym, po inkubacji komórek HeLa przez noc.

Wymień medium hodowlane na 1 ml DMEM zawierającego 100 ng/ml gangliozydy GM1 i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Zwiększa to liczbę miejsc wiązania dla toksyny cholerycznej, ponieważ receptor GM1 dla toksyn wbuduje się w błonę komórkową komórek eksponowanych na roztwór GM1.

Po jednej godzinie inkubacji usunąć pożywkę GM1 i dwukrotnie przemyć komórki DMEM. Następnie dodać 1 mL DMEM zawierającego 1 µg/mL toksyny cholerycznej i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Usunąć pożywkę zawierającą toksynę i dwukrotnie przemyć komórki.

Następnie inkubuj komórki w 1 ml DMEM w temperaturze 37 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu każdego okresu pogoni przemyj komórki PBS, a następnie inkubuj każdą studzienkę z 250 µl 0,5 mM EDTA w PBS. Po 10 minutowej inkubacji na lodzie usuń komórki z płytki 6-dołkowej poprzez energiczne pipetowanie za pomocą pipety P 1000.

Po zebraniu komórek z jednej studzienki połącz je z komórkami z drugiej i trzeciej studzienki z tej samej grupy eksperymentalnej. Następnie umieść połączoną zawiesinę komórkową z trzech studzienek powtórzeń w jednej probówce do mikrocentryfugi. Teraz wirować probówkę w mikrocentryfudze nakładkowej przez pięć minut.

Przy 5 000 ×g dla wszystkich warunków powinny zostać uzyskane granulki komórkowe o zbliżonej wielkości. Odrzucić nadsącz, a następnie resuspender granulkę komórkową w 100 µL uprzednio przygotowanego i schłodzonego 0,04% roztworu roboczego digitoniny. Umieścić zawiesinę komórkową na lodzie na 10 minut; używając mikrocentryfugi stołowej, odwirować komórki przepuszczone digitoniną przy 16 000 ×g przez 10 minut.

Przenieś cytozol zawierający frakcję nadsączu do nowej probówki do mikrowirówki i zachowaj frakcję osadu zawierającą organella. Standardy toksyny SPR przygotowuje się w stężeniach 110, 1 oraz 0,1 ng/mL w buforze HCN. Próbki przygotowuje się poprzez rozcieńczenie frakcji nadsączu zawierających cytozol w buforze HCN do końcowej objętości 1 mL. Aby zapewnić usunięcie powietrza z 500 µL pętli próbkowania przed wtryskiem, niezbędne są objętości próbek wynoszące co najmniej 1 mL. Frakcje osadu zawierające organella resuspenduje się w 1 mL buforu HCN zawierającego 1% Triton X 100.

Dodanie detergentu jest niezbędne do uwolnienia puli toksyny zamkniętej w błonie. Należy również przygotować równoległe zestawy frakcji cytozolowych i organ L do eksperymentu kontrolnego w celu potwierdzenia dokładności procedury frakcjonowania; resuspender frakcję cytozolową w 20 µL czterokrotnego buforu do próbek, a frakcję organ L w 120 µL jednokrotnego buforu do próbek. Równoważne objętości każdej frakcji należy rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i poddać analizie Western blot, aby wykazać obecność białka cytozolowego we frakcji nadsączu oraz rozpuszczalnego białka ER w frakcji osadu. Aby przygotować slajd SPR, należy najpierw umieścić w urządzeniu SPR pozłacaną płytkę szklaną z samoorganizującą się monowarstwą.

Aktywuj slajd sensoryczny, przepłukując go roztworem E-D-C-N-H-S przez 10 minut przy szybkości przepływu 41 µL/min. Wszystkie kolejne perfuzje wykonujemy przy tej samej szybkości przepływu. Usuń bufor aktywacyjny E-D-C-N-H-S, myjąc płytkę przez pięć minut w PBS zawierającym 0,05% 2020.

Na płytce znajdują się obecnie reaktywne wiązania MI w wyniku odblokowania ich za pomocą roztworu E-D-C-N-H-S. Następnie przez aktywowaną płytkę sensora należy przepuścić przeciwciało anty-CTA w rozcieńczeniu 1:20 000 w 20 milimolarnym octanie sodu przez 15 minut. Ze względu na zmianę pH zaobserwowany zostanie początkowy spadek jednostki współczynnika załamania, w skrócie RIU.

Następnie nastąpi wzrost RIU w miarę wychwytywania przeciwciał przez reaktywne wiązania amidowe. Z powierzchni płytki sensorycznej należy usunąć niewiążące się przeciwciała, wykonując pięciominutowe płukanie w PBST. Sygnał RIU generowany przez wychwycone przeciwciała osiągnie poziom plateau i ustabilizuje się, tworząc nowy sygnał bazowy.

Jako ostatni etap przygotowania płytki, przeprowadź PERFUZJĘ etanolaminy stężeniem 1 M nad płytką sensoryczną przez pięć minut. Pozwoli to na zablokowanie i dezaktywację wszystkich niezwiązanych łączników pozostałych na płytce sensorycznej. Sygnał RIU wzrośnie; aby ustalić odczyt bazowy, przeprowadź perfuzję PBST nad pokrytą przeciwciałami płytką sensoryczną przez pięć minut.

Następnie należy przepłukać sensor próbką eksperymentalną lub standardem toksyny przez 300 sekund. Usuń ligand z buforu i przepłucz sensor roztworem PBST przez kolejne 200 sekund. Wszelkie toksyny pozostające związane z sensorem są usuwane poprzez płukanie roztworem PBST o pH 5.0.

Doprowadzi to do powrotu sygnału do początkowego odczytu bazowego, co umożliwi analizę kolejnej próbki na tym samym czujniku. Przed załadowaniem nowej próbki należy przepuścić niewielką ilość powietrza przez pętlę próbkową, aby usunąć pozostałości cieczy z poprzedniej próbki. Po zakończeniu akwizycji.

Dane można analizować za pomocą oprogramowania scrubber two, a do przygotowania rycin można wykorzystać oprogramowanie Igor. Toksyna krztuśca jest toksyną typu AB, która przemieszcza się z powierzchni komórki do ER przed tym, jak jej łańcuch A, PTs one, wnika do cytozolu.

Analiza translokacji oparta na SPR pozwoliła wykryć PTs w cytozolu zaintoksykowanych komórek CHO. W cytozolu komórek niezaintoksykowanych nie odnotowano sygnału, co potwierdziło swoistość przeciwciał anty-PTs. Jedno przeciwciało nie wykazało reakcji krzyżowej z komponentami cytozolu gospodarza.

Frakcja cytozolu z komórek poddanych działaniu toksyny w obecności feldenu. A również nie wygenerował sygnału dodatniego; BFA zapobiega transportowi toksyny do miejsca translokacji w ER, a tym samym dostarczeniu łańcucha H do cytozolu. Choletoina jest kolejną toksyną typu AB translokującą do ER.

W frakcji cytozolowej z komórek HeLa traktowanych CT wykryto podjednostkę CT A1. Potwierdziło to, że zastosowana metodologia sprawdza się w przypadku wielu typów komórek i może być wykorzystana dla każdej toksyny, do której dostępny jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi. Nie wykryto sygnału podczas przepływu frakcji cytozolowej z komórek traktowanych CT nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTB, co dowodzi, że w przeciwieństwie do podjednostki CT A1, wiążący komórki PENTAMER CTB nie przedostaje się do cytozolu.

Po przelaniu przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. Sygnał z frakcji organelli wykracza poza skalę w porównaniu z słabszym sygnałem z frakcji cytozolowej. Jest to zgodne ze znaną niską wydajnością transportu CT do miejsca translokacji w ER, co z kolei ogranicza ilość toksyny, która może dotrzeć do cytozolu.

Można również monitorować zależną od czasu akumulację translokowanej toksyny cytozolowej. Po ekspozycji komórek na CT w temperaturze czterech stopni Celsjusza, nie wykryto toksyny w cytozolu 15 minut po ogrzaniu do 37 stopni Celsjusza.

Po 30 minutach w temperaturze 37°C wykryto niewielką pulę toksyny cytozolowej, a po 45 i 60 minutowych odstępach czasu (chase) stwierdzono obecność progresywnie większych ilości toksyny cytozolowej. Dowodzi to ciągłego, długoterminowego dostarczania toksyny związanej z komórką do gospodarza w obrębie cytozolu. Analiza ta pozwala również na wykrycie inhibicji translokacji toksyny do cytozolu; komórki traktowane 10% DMSO wykazywały niskie poziomy CT1 w cytozolu w porównaniu z nietraktowanymi kontrolnymi komórkami z toksyną, co wskazuje na hamowanie rozwijania się toksyny.

Łańcuch jest warunkiem koniecznym dla translokacji do cytozolu, zatem indukowana przez DMSO stabilizacja CTA1 odpowiednio zapobiegła jego przemieszczaniu się z ER do cytozolu. Aby ilościowo określić blokadę translokacji toksyny indukowaną przez DMSO, wykorzystano krzywą wzorcową sporządzoną z znanych stężeń toksyny, aby obliczyć stężenie CTA1 w cytozolu, które wyniosło 0,3 ng/ml dla komórek niepoddanych działaniu DMSO oraz 0,1 ng/ml dla komórek traktowanych DMSO. Inhibicja rozfałdowania CTA1 przez DMSO spowodowała tym samym trzykrotny spadek translokacji CTA1 z ER do cytozolu.

Po zastosowaniu tej procedury będziemy mogli wykorzystać inne techniki, takie jak testy toksyczności, aby ustanowić bezpośredni związek między ilością toksyny obecną w cytosolu a aktywnością toksyny.