Name: Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przez powierzchniowy rezonans plazmonowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę SPR do wykrywania i ilościowego oznaczania toksyn w cytozolu komórek gospodarza. Technika ta umożliwia badanie kinetyki wnikania toksyn i potencjalne projektowanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH R01 AI073783 przyznanego K. Teter. Dziękujemy dr. Shane’owi Masseyowi za pomoc w opracowaniu protokołu frakcjonowania subkomórkowego oraz Helen Burress za krytyczne przeczytanie rękopisu.

1. Przygotowanie digitoniny
<ol>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi dodać 500 μL 100% etanolu i umieścić ją w bloku grzejnym ustawionym na 80 °C na 10 min.</li>
	<li>Rozpuścić 2,5 mg digitoniny w 250 μL podgrzanego etanolu, aby przygotować 1% roztwór zapasowy digitoniny.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór roboczy digitoniny o stężeniu 0,04%, dodać 40 μL roztworu zapasowego digitoniny do 960 μL buforu HCN (50 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 10 mM N-ethylmaleimide oraz koktajl inhibitorów proteaz).</li>
</ol>
2. Intoksykacja i permeabilizacja komórek
Naszą analizę translokacji można zastosować do szeregu toksyn i linii komórkowych. Poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół wykrywania toksyny cholery (CT). Przegląd procedury przedstawiono na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Komórki HeLa wysiewać do płytek 6-dołkowych zawierających 1 mL DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz antybiotyk-antymykotyk, aby po inkubacji nocnej w 37 °C uzyskać gęstość 1x106 komórek/dołek. Aby uzyskać wystarczającą ilość toksyny cytozolowej do powtarzalnej detekcji, dla każdego warunku wymagane są trzy powtórzenia w osobnych dołkach.</li>
	<li>Po inkubacji nocnej zastąpić pożywkę hodowlaną 1 mL DMEM zawierającego 100 ng/mL gangliozydy GM1. Zwiększa to liczbę miejsc wiązania dla CT, ponieważ receptor GM1 dla CT wbuduje się w błonę plazmatyczną komórek eksponowanych na roztwór GM1.</li>
	<li>Po 1 h inkubacji w 37 °C usunąć pożywkę zawierającą GM1 i dwukrotnie przemyć komórki DMEM. Następnie inkubować komórki w 4 °C przez 30 min w 1 mL DMEM zawierającego 1 μg/mL CT.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą toksynę, dwukrotnie przemyć komórki DMEM i inkubować je w 1 mL DMEM w 37 °C przez wybrany odstęp lub odstępy czasu.</li>
	<li>Po każdym okresie pogoni (chase period) przemyć komórki PBS i inkubować każdą dołkę z 250 μL 0,5 mM EDTA w PBS. Pozostawić komórki na 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać je z płytki 6-dołkowej poprzez energiczne triturację za pomocą pipety p1000. Po zebraniu komórek z jednej dołki, połączyć je z komórkami z drugiej, a następnie z trzeciej dołki z tego samego warunku. Do zbierania komórek można również użyć skrobaczek do komórek.</li>
	<li>Połączoną zawiesinę komórkową z trzech powtórzeń (całkowita objętość 750 μL) przenieść do jednej probówki do mikrowirowania i wirować w mikrowirowarce stołowej przez 5 min przy 5,000 x g. Dla wszystkich warunków powinny zostać uzyskane osady komórkowe o zbliżonej wielkości.</li>
	<li>Odlać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 100 μL 0,04% roztworu roboczego digitoniny. Umieścić zawiesinę komórkową na lodzie na 10 min.</li>
	<li>Wirować komórki permeabilizowane digitoniną przy 16,000 x g przez 10 min w mikrowirowarce stołowej. Przenieść frakcję nadsączu zawierającą cytozol do nowej probówki do mikrowirowania, a frakcję osadu zawierającą organelle zachować.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Frakcje nadsączu zawierające cytozol rozcieńza się w buforze HCN do końcowej objętości 1 mL. Objętości próbek wynoszące co najmniej 1 mL są niezbędne, aby zapewnić usunięcie powietrza z pętli próbkowej o pojemności 500 μL przed wtryskiem.</li>
	<li>Frakcje osadu zawierające organelle resuspensuje się w 1 mL buforu HCN zawierającego 1% Triton X-100. Dodanie detergentu jest niezbędne do uwolnienia puli toksyny zamkniętej w błonach.</li>
	<li>Standardy toksyny o stężeniach 100, 10, 1 i 0,1 ng/mL przygotowuje się w buforze HCN.</li>
	<li>Równoległe zestawy frakcji cytozolowych i organellowych przygotowuje się do eksperymentu kontrolnego w celu potwierdzenia rzetelności procedury frakcjonowania. Frakcje uzyskane zgodnie z opisem w sekcji 2 resuspensuje się w 20 μL 4x buforu do próbek (frakcja cytozolowa) lub 120 μL 1x buforu do próbek (frakcja organellowa). Równe objętości każdej frakcji rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu i analizuje metodą Western blot, aby wykazać podział białka cytozolowego do frakcji nadsączu oraz rozpuszczalnego, rezydentnego białka ER do frakcji osadu16-19.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytki SPR
<ol>
	<li>Do eksperymentów SPR wykorzystuje się refraktometr SPR Reichert SR7000.</li>
	<li>W instrumentach SPR umieszcza się szklaną płytkę pozłacaną z samoorganizującą się monowarstwą. Aby aktywować płytkę sensoryczną, należy przepływać nad nią roztwór 0,4 M EDC i 0,1 M NHS w stosunku 1:1 (v:v) przez 10 min przy szybkości przepływu 41 μL/min. Wszystkie kolejne etapy perfuzji będą odbywać się przy tej samej szybkości przepływu.</li>
	<li>Aby usunąć bufor aktywacyjny EDC:NHS, płytkę przemywa się przez 5 min roztworem PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST). Na płytce znajdują się teraz reaktywne wiązania amidowe powstałe w wyniku odblokowania przez roztwór EDC:NHS.</li>
	<li>Nad aktywowaną płytkę sensoryczną przepływa przeciwciało anty-CTA w rozcieńczeniu 1:20 000 w 20 mM octanie sodu (pH 5,5) przez 15 min. Początkowo zaobserwowany zostanie spadek jednostki współczynnika załamania światła (RIU) wynikający ze zmiany pH. Następnie nastąpi wzrost RIU w miarę wiązania przeciwciał przez reaktywne wiązania amidowe na płytce sensorycznej.</li>
	<li>Niezwiązane przeciwciała usuwa się z płytki sensorycznej poprzez 5-minutowe płukanie w PBST. Sygnał RIU generowany przez związane przeciwciała osiągnie plateau i ustabilizuje się, tworząc nową linię bazową.</li>
	<li>Nad płytkę sensoryczną przepływa 1 M etanolaminę (pH 8,5) przez 5 min. Pozwala to na zablokowanie i inaktywację wszystkich pozostałych na płytce sensorycznej niezwiązanych wiązań.</li>
</ol>
5. Analiza próbek metodą SPR
<ol>
	<li>Aby ustalić odczyt bazowy, przepłucz sensor pokryty przeciwciałem roztworem PBST przez 5 min.</li>
	<li>Przepłucz sensor próbką eksperymentalną lub wzorcem toksyny przez 300 sec. Usuń ligand z buforu i przepłucz sensor roztworem PBST przez kolejne 200 sec.</li>
	<li>Po każdym przepłukaniu związaną toksynę usuwa się z sensora poprzez 100 sec płukania roztworem PBST o pH 5.0. Przywróci to sygnał do początkowego odczytu bazowego, co pozwoli na analizę kolejnej próbki na tym samym sensorze.</li>
	<li>Przed załadowaniem nowej próbki przepchnij niewielką ilość powietrza przez pętlę próbkową, aby usunąć pozostałości cieczy z poprzedniej próbki. Stosując procedurę opisaną w punktach 5.2-5.4, przeanalizowano do 12 próbek na jednym slajdzie bez znaczącej utraty sygnału bazowego.</li>
	<li>Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Scrubber 2, a do przygotowania rycin wykorzystano oprogramowanie Igor.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Toksyna krztuśca (PT) jest toksyną typu AB, która przemieszcza się z powierzchni komórki do ER, zanim jej łańcuch A (PTS1) przedostanie się do cytozolu3, 12. Jak pokazano na Rysunku 2, nasz test translokacji oparty na SPR pozwolił wykryć PTS1 w cytozolu zaintoksykowanych komórek CHO. W cytozolu komórek niepoddanych działaniu toksyny nie odnotowano sygnału, co potwierdziło, że przeciwciało anty-PTS1 nie wykazuje reakcji krzyżowej z komponentami cytozolu gospodarza. Frakcja cytozolowa z komórek zaintoksykowanych w obecności brefeldyny A (BfA) również nie wygenerowała sygnału dodatniego. BfA zapobiega transportowi toksyny do miejsca translokacji w ER6-8, 12, 20-25, a tym samym uniemożliwia dostarczenie łańcucha A do cytozolu. Na koniec każdego pomiaru związana toksyna jest usuwana z płytki sensora. Pozwoliło to na przebadanie wielu próbek na jednej płytce sensora, zapewniając tym samym bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych w różnych warunkach doświadczalnych.
CT jest kolejną toksyną typu AB, która translokuje do ER4. Na rysunku 3A w frakcji cytozolowej z komórek HeLa traktowanych CT wykryto CTA1. Podkreśla to, że nasza metodologia działa w przypadku wielu typów komórek i może być zastosowana do każdej toksyny, dla której dostępne jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi A. Nie wykryto sygnału, gdy frakcja cytozolowa z komórek traktowanych CT była przepuszczana przez sensor SPR pokryty przeciwciałem przeciwko CTB (rys. 3B), co dowodzi, że do cytozolu wnika podjednostka CTA1, a nie wiążący się z komórką pentamer CTB. Rysunek 3C pokazuje, że sygnał z frakcji organelli wykracza poza skalę w porównaniu z wyraźnie słabszym sygnałem z frakcji cytozolowej. Jest to zgodne ze znaną niską wydajnością transportu CT do miejsca translokacji w ER6, 7, co z kolei ogranicza ilość toksyny, która może dotrzeć do cytozolu. Co więcej, frakcja organelli zawiera holotoksynę CT oraz CTA1 zlokalizowaną w ER, zatem wynikowy sygnał SPR dla frakcji organelli jest zawyżony ze względu na dodatkową masę pentameru CTB związanego z holotoksyną. W związku z tym nie jest praktyczne przedstawianie danych z frakcji organelli i cytozolowej na tym samym sensorgramie.
Nasz test pozwala na monitorowanie zależnego od czasu gromadzenia się translokowanej toksyny w cytozolu (Rys. 4). Komórki poddano działaniu CT w temperaturze 4 °C, która umożliwia wiązanie toksyny z błoną plazmatyczną, ale zapobiega internalizacji toksyny związanej z komórką. Po usunięciu niezwiązanej toksyny komórki ogrzano do 37 °C. W tej temperaturze może następować zarówno transport toksyny do ER, jak i translokacja łańcucha A do cytozolu. W cytozolu nie wykryto toksyny 15 minut po ogrzaniu do 37 °C. Odzwierciedlało to czas opóźnienia potrzebny na (i) transport holotoksyny do ER; (ii) dysocjację podjednostek A/B w ER; oraz (iii) eksport łańcucha A do cytozolu. Niewielką pulę toksyny cytozolowej wykryto po 30 minutach w 37 °C, a progresywnie większe ilości toksyny cytozolowej po interwałach pogoni wynoszących 45 i 60 minut. Jeszcze wyższe poziomy toksyny cytozolowej odnotowano po 5-godzinnym interwale pogoni17, co dowodzi ciągłego, długotrwałego dostarczania związanej z komórką toksyny do cytozolu gospodarza.
Nasz test może również wykrywać inhibicję translokacji toksyny do cytosolu (Rys. 5). Komórki traktowane 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), chaperonem chemicznym zapobiegającym termicznemu rozfałdowaniu wyizolowanej podjednostki CTA1 (T. Banerjee i K. Teter, niepublikowane obserwacje), wykazywały niski poziom CTA1 w cytosolu w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi. Rozfałdowanie łańcucha A toksyny jest warunkiem koniecznym dla translokacji do cytosolu16-18, zatem indukcyjna stabilizacja CTA1 przez DMSO zapobiegła jego przemieszczaniu się z ER do cytosolu.
Stała szybkości asocjacji (ka) obliczona z eksperymentów SPR jest wprost proporcjonalna do stężenia ligandu w buforze perfuzyjnym14, 15, 26. Zatem możliwe jest określenie stężenia toksyny cytozolowej na podstawie wykresu przedstawiającego wartości ka dla wzorców toksyny w funkcji stężenia toksyny. Procedura ta została wykorzystana do ilościowego określenia blokady translokacji toksyny indukowanej przez DMSO przedstawionej na rysunku 5: krzywa wzorcowa wygenerowana z znanych stężeń toksyny posłużyła do obliczenia cytozolowego stężenia CTA1 wynoszącego 0,3 ng/mL dla komórek nieleczonych i 0,1 ng/mL dla komórek traktowanych DMSO (Rys. 6). Hamowanie rozfałdowania CTA1 przez DMSO spowodowało zatem 3-krotny spadek translokacji CTA1 z ER do cytozolu.
<img alt="Schemat działania biosensora, ilustrujący krok po kroku wiązanie białek i analizę śladu SPR." src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd protokołu. (A) Komórki inkubuje się z toksyną AB w temperaturze 4 °C, która umożliwia wiązanie toksyny z powierzchnią komórki, ale zapobiega jej endocytozie. Podjednostki A i B toksyny przedstawiono odpowiednio czerwonymi i niebieskimi kółkami. (B) Niewiązaną toksynę usuwa się z medium, a komórki ogrzewa się do 37 °C, aby promować endocytozę i transport retrogradny holotoksyny do ER. Dysocjacja holotoksyny zachodzi w ER, co pozwala wyizolowanemu łańcuchowi A przedostać się do cytosolu poprzez kanał(y) białkowe w błonie ER. (C) Komórki traktuje się digitoniną w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej. (D) Wirowanie stosuje się do rozdzielenia komórek na osobne frakcje cytosolowe i organellowe. Cytosol jest wyciskany z komórki przez pory utworzone przez digitoninę i znajduje się w supernatancie. Nienaruszone, związane błoną organelle znajdują się we frakcji osadu. (E) Aby wykryć przetransportowaną pulę łańcucha A toksyny w cytosolu gospodarza, frakcję supernatantu przepuszcza się nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem przeciwko łańcuchowi A.
<img alt="Graf interakcji białka PTS1; analiza sensorgramu; krzywe odpowiedzi zależne od stężenia." src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Detekcja translokacji PTS1 do cytozolu gospodarza. Komórki CHO poddano znakowaniu impulsowemu w 4 °C przez 30 min przy użyciu 1 μg/mL PT. Następnie komórki inkubowano przez 3 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny bez dodatków (intoxicated) lub z dodatkiem 5 μg BfA/mL (+BfA intoxicated). Do rozdzielenia ekstraktów komórkowych na oddzielne frakcje organelli i cytozolu wykorzystano permeabilizację błony plazmatycznej za pomocą digitoniny. Do detekcji puli cytozolowej PTS1 z komórek nieleczonych lub traktowanych BfA użyto sensora SPR pokrytego przeciwciałem anty-PTS1. Standardy PTS1 przepuszczano przez sensor jako kontrole pozytywne, natomiast frakcję cytozolową z komórek niezatrutych przepuszczano przez płytkę sensora jako kontrolę negatywną. Po każdym pomiarze związany materiał próbkowy usuwano z płytki sensora.
<img alt="Wykres przedstawiający oddziaływanie białek w frakcjach cytozolu i organelli w czasie; wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Detekcja translokacji CTA1 do cytozolu gospodarza. Komórki HeLa poddane znakowaniu impulsowemu w 4 °C z użyciem 1 μg/mL CT inkubowano przez 2 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny bez dodatków (intoxicated) lub z dodatkiem 5 μg BfA/mL (+BfA intoxicated). Do rozdziału ekstraktów komórkowych na oddzielne frakcje organelli i cytozolu wykorzystano permeabilizację błony plazmatycznej przy użyciu digitoniny. (A) Frakcje cytozolowe przepuszczano przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. Znane ilości CTA posłużyły jako kontrole pozytywne, natomiast cytozol z komórek niepoddanych działaniu toksyny posłużył jako kontrola negatywna. (B) Frakcję cytozolową z komórek poddanych działaniu toksyny w obecności BfA przepuszczano przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTB. Jako kontrolę pozytywną przez płytkę przepuszczano oczyszczony pentamer CTB. (C) Frakcję organelli solubilizowano w 1% Triton X-100 przed przepuszczeniem przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. W celu porównania przez sensor przepuszczano również frakcję cytozolową (objętość końcowa 1 mL) z tego samego ekstraktu komórkowego oraz standard CTA. We wszystkich panelach związaną próbkę usuwano z sensora na koniec każdego cyklu pomiarowego.
<img alt="Wykres chromatograficzny mikro RIU w funkcji czasu, przedstawiający wpływ stężenia i czasu trwania." src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Kinetyka wnikania CTA1 do cytozolu. Komórki HeLa poddane znakowaniu pulsacyjnemu w 4 °C przy użyciu 1 μg/mL CT inkubowano przez 15, 30, 45 lub 60 min w 37 °C w medium wolnym od toksyny. W celu wykrycia translokowanej puli toksyny, frakcje cytozolowe z komórek permeabilizowanych digitoniną przepuszczano przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. Przez sensor przepuszczano również standardy CTA. Po każdym pomiarze związana próbka była usuwana z płytki sensora.
<img alt="Wykres odpowiedzi wiązania CTA, mikro RIU w funkcji czasu; analiza próbek zainfekowanych i niezatrutych." src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Hamowanie translokacji CTA1 przez DMSO. Komórki HeLa poddane pulsowemu znakowaniu w 4 °C przy użyciu 1 μg/mL CT inkubowano przez 2 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny, bez dodatków (zainfekowane) lub z dodatkiem 10% DMSO (+DMSO zainfekowane). Aby wykryć pulę przelokalizowanej toksyny, frakcje cytozolowe z komórek permeabilizowanych digitoniną przepuszczano nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałami anty-CTA. Standardy CTA (100, 10, 1 oraz 0,1 ng/mL) przepuszczano nad sensorem jako kontrole pozytywne; w celu przeskalowania przedstawiono jedynie standardy 1 i 0,1 ng/mL. Cytozol z komórek niezatrutych posłużył jako kontrola negatywna. Na koniec każdego pomiaru związana próbka była usuwana z płytki sensora.
<img alt="Wykres korelacji szybkości asocjacji (ka) w funkcji stężenia CTA; punkty danych z linią trendu." src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Obliczenie ilości CTA1 w cytozolu. Wartości ka dla standardów CTA z Rysunku 5 przedstawiono w funkcji stężenia toksyny. Otrzymaną krzywą wzorcową wykorzystano do wyznaczenia, na podstawie wartości ka próbek eksperymentalnych z Rysunku 5, stężenia CTA1 w cytozolu komórek nieleczonych oraz leczonych DMSO. Standardy toksyny przedstawiono jako wypełnione koła; cytozol nieleczony jako pusty kwadrat, a cytozol leczony DMSO jako puste koło. Przedstawiono średnie ± zakresy z dwóch niezależnych eksperymentów.

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Porównanie z istniejącą metodologią
Nasze badanie translokacji oparte na SPR stanowi szybką, czułą i ilościową metodę wykrywania dostarczania toksyny do cytozolu gospodarza. Technika ta nie wymaga znakowania radioizotopowego ani innych modyfikacji toksyny i może być zastosowana do każdej toksyny, dla której dostępny jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi A toksyny. Istniejące metody monitorowania przenikania toksyny do cytozolu opierają się również na protokole frakcjonowania subkomórkowego w c...

<table><tbody><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Acros Organics</td><td>61509-0010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Płódkowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Gangliozyd GM1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7641</td><td></td></tr><tr><td>CTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2398</td><td></td></tr><tr><td>PTS1</td><td>List</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>NHS (N-hydroksysukcynimid)</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22981</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td>Medicago</td><td>09-8903-100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CTA</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-80747</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CTB</td><td>Calbiochem</td><td>227040</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PTS1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-57639</td><td></td></tr><tr><td>Refraktometr</td><td>Reichert</td><td>SR7000, SR7000DC</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy z sensorem SPR</td><td>Reichert</td><td>13206060</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Cole-Parmer</td><td>780200C</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Toksyny AB składają się z enzymatycznej podjednostki A oraz wiążącej się z komórką podjednostki B1. Toksyny te są wydzielane do środowiska pozakomórkowego, lecz działają na cele znajdujące się w cytozolu eukariotycznym. Niektóre toksyny AB przemieszczają się za pomocą pęcherzyków transportowych z powierzchni komórki do retikulum endoplazmatycznego (ER), zanim dostaną się do cytozolu2-4. W ER katalityczny łańcuch A oddziela się od reszty toksyny i przechodzi przez kanał białkowy, aby dotrzeć do swojego celu w cytozolu5. Przetransportowany do cytozolu łańcuch A jest trudny do wykrycia, ponieważ transport toksyny do ER jest procesem niezwykle nieefektywnym: większość zinternalizowanej toksyny jest kierowana do lizosomów w celu degradacji, w związku z czym tylko niewielka frakcja toksyny związanej z powierzchnią dociera do aparatu Golgiego i ER6-12.

Aby monitorować translokację toksyny z ER do cytozolu w hodowlach komórkowych, połączyliśmy protokół frakcjonowania subkomórkowego z wysoce czułą metodą detekcji opartą na powierzchniowym rezonansie plazmonowym (SPR)13-15. Błona plazmatyczna komórek traktowanych toksyną jest selektywnie permeabilizowana za pomocą digitoniny, co umożliwia pobranie frakcji cytozolowej, która następnie jest przepuszczana nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem przeciwko łańcuchowi A toksyny. Sensor pokryty przeciwciałami może wychwytywać i wykrywać ilości toksyny cytozolowej rzędu pg/mL. Dzięki temu protokołowi możliwe jest śledzenie kinetyki wnikania toksyny do cytozolu oraz charakteryzacja efektów hamujących proces translokacji. Stężenie toksyny cytozolowej można również obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej wygenerowanej z znanych ilości standardów łańcucha A przepuszczonych nad sensorem. Nasza metoda stanowi szybki, czuły i ilościowy system detekcji, który nie wymaga znakowania radioizotopowego ani innych modyfikacji docelowej toksyny.

W niniejszym raporcie opisujemy, w jaki sposób rezonans plazmonów powierzchniowych jest wykorzystywany do wykrywania przenikania toksyn do cytozolu gospodarza. Ta wysokoczuła metoda pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących zawartości toksyn w cytozolu i może być zastosowana w przypadku wielu rodzajów toksyn.

Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Toksyny AB składają się z enzymatycznej podjednostki A oraz wiążącej się z komórkami podjednostki B1. Toksyny te są wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego, lecz działają na...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie i ilościowe określenie puli toksyny, która przedostaje się do cytozolu. Aby to osiągnąć, toksynę wiąże się najpierw z powierzchnią komórki gospodarza w temperaturze 4°C. Następnie usuwa się niewiązaną toksynę i ogrzewa komórki do 37°C, co umożliwia przemieszczenie się toksyny do systemu endomembran, a następnie do cytozolu gospodarza; po przejściu toksyny do wnętrza komórki stosuje się digitoninę w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej.Ekstrakty komórkowe są rozdzielane na osobne frakcje błonowe i cytozolowe przy użyciu wirowania różnicowego; w końcowym etapie wykorzystuje się powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) do wykrywania i ilościowego określania przenikania toksyny do cytozolu poprzez perfuzję frakcji cytozolowej nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem antytoksynowym. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii toksyn, takie jak wydajność i kinetyka wnikania toksyny do cytozolu, ilość toksyny przedostającej się do cytozolu oraz możliwość hamowania transportu toksyny do cytozolu przez leki. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przygotować komórki HeLa do intoksykacji zgodnie z opisem w protokole pisemnym, po całonocnej inkubacji komórek HeLa.Wymień pożywkę hodowlaną na 1 mL DMEM zawierającego 100 ng/mL gangliozydy GM1 i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Zwiększa to liczbę miejsc wiązania dla toksyny cholery, ponieważ receptor GM1 dla toksyn zostanie wbudowany w błonę plazmatyczną komórek eksponowanych na roztwór GM1.Po jednej godzinie inkubacji usunąć pożywkę z GM i dwukrotnie przemyć komórki DMEM. Następnie dodać 1 ml DMEM zawierającego 1 µg/ml toksyny cholerycznej i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Usunąć pożywkę z toksyną i dwukrotnie przemyć komórki.Następnie inkubować komórki w 1 mL DMEM w temperaturze 37 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu każdego okresu wypłukiwania (chase) przemyć komórki PBS, a następnie inkubować każdą studzienkę z 250 µL 0,5 mM EDTA w PBS. Po 10 minutowej inkubacji w lodzie zebrać komórki z płytki 6-dołkowej poprzez energiczne triturację za pomocą pipety P 1000.Po zebraniu komórek z jednej studni, połącz je z komórkami z drugiej, a następnie z trzeciej studni z tej samej grupy badawczej. Następnie umieść połączoną zawiesinę komórek z trzech powtórzeń w jednej probówce do mikrocentryfugi. Teraz wiruj probówkę w mikrocentryfudze nakładkowej przez pięć minut.Przy 5 000 ×g dla wszystkich warunków powinny zostać otrzymane pellety komórkowe o zbliżonej wielkości. Odrzuć nadsącz, a następnie resuspenduj pellet komórkowy w 100 µl wcześniej przygotowanego i schłodzonego 0,04% roztworu roboczego digitoniny. Umieść zawiesinę komórkową w lodzie na 10 minut, a następnie używając mikrowirówki stołowej, odwiruj komórki przepuszczone przez digitoninę przy 16 000 ×g przez 10 minut.Przenieś frakcję nadsączu zawierającą cytozol do nowej probówki do mikrowirówki, a frakcję osadu zawierającą organelle zachowaj. Standardy toksyny SPR przygotowuje się w stężeniach 110, 1 i 0,1 ng/mL w buforze HCN. Próbki przygotowuje się poprzez rozcieńczenie frakcji nadsączu zawierających cytozol w buforze HCN do końcowej objętości 1 mL. Objętości próbek wynoszące co najmniej 1 mL są niezbędne, aby zapewnić usunięcie powietrza z pętli próbkowej o pojemności 500 µL przed wstrzyknięciem. Frakcje osadu zawierające organelle resuspenduje się w 1 mL buforu HCN zawierającego 1% Triton X 100.Dodanie detergentu jest niezbędne do uwolnienia puli toksyny zamkniętej w błonach. Należy również przygotować równoległe zestawy frakcji cytozolowych i frakcji organ L do eksperymentu kontrolnego w celu potwierdzenia dokładności procedury frakcjonowania; frakcję cytozolową zawiesić ponownie w 20 µL czterokrotnego buforu do próbek, a frakcję organ L w 120 µL jednokrotnego buforu do próbek. Równoważne objętości każdej frakcji należy rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu i poddać analizie Western blot, aby wykazać obecność białka cytozolowego we frakcji nadosadu oraz rozpuszczalnego białka retikulum endoplazmatycznego w frakcji osadu. Aby przygotować płytkę SPR, należy najpierw umieścić w urządzeniu SPR pozłacaną płytkę szklaną z samoporządkującą się monowarstwą.Aktywuj slajd sensoryczny, przepływając roztwór E-D-C-N-H-S nad slajdem przez 10 minut z szybkością przepływu 41 µL/min. We wszystkich kolejnych etapach perfuzji stosujemy tę samą szybkość przepływu. Usuń bufor aktywacyjny E-D-C-N-H-S, płucząc płytkę przez pięć minut w PBS zawierającym 0,05%2020.Płytka zawiera teraz reaktywne wiązania MI w wyniku odblokowania za pomocą roztworu E-D-C-N-H-S. Następnie należy przeprowadzić perfuzję przeciwciała anty-CTA nad aktywowaną płytką sensora w rozcieńczeniu 1:20 000 w 20 millimolarnym octanie sodu przez 15 minut. Ze względu na zmianę pH widoczny będzie początkowy spadek jednostek współczynnika załamania światła, w skrócie RIU.Następnie nastąpi wzrost wartości RIU w miarę wiązania przeciwciała przez amidowe łączniki reaktywne. Z powierzchni płytki sensorycznej należy usunąć niewiązana przeciwciała poprzez pięciominutowe płukanie w roztworze PBST. Sygnał RIU generowany przez związane przeciwciała osiągnie plateau i ustabilizuje się, tworząc nowy sygnał bazowy.Jako ostatni etap przygotowania płytki, przeprowadź PERFUZJĘ jednego molarnego etanolaminy nad płytką sensora przez pięć minut. Pozwala to na zablokowanie i dezaktywację wszystkich niezwiązanych łączników pozostałych na płytce sensora. Sygnał RIU wzrośnie, aby ustalić odczyt bazowy; przeprowadź perfuzję PBST nad pokrytym przeciwciałami sensorem przez pięć minut.Następnie należy przeprowadzić perfuzję próbki doświadczalnej lub wzorca toksyny nad sensorem przez 300 sekund. Należy usunąć ligand z buforu i przeprowadzić perfuzję PBST nad sensorem przez kolejne 200 sekund. Wszelkie toksyny pozostające związane z sensorem są usuwane podczas 102. przemycia PBST o pH 5,0.Doprowadzi to do powrotu sygnału do początkowego odczytu bazowego, co umożliwi przetworzenie kolejnej próbki na tym samym czujniku. Przed załadowaniem nowej próbki należy przepchnąć niewielką ilość powietrza przez pętlę próbkowania, aby usunąć resztki płynu z poprzedniej próbki. Po zakończeniu akwizycji.Dane można analizować za pomocą oprogramowania scrubber two, natomiast oprogramowanie Igor może być wykorzystane do przygotowania rycin. Toksyna krztuśca jest toksyną typu AB, która przemieszcza się z powierzchni komórki do ER przed przedostaniem się jej łańcucha A do cytozolu.Test translokacji oparty na SPR pozwolił wykryć PTs w cytozolu zatrutych komórek CHO. Brak sygnału z cytozolu komórek niezatrutych potwierdził swoistość przeciwciał anty-PTs. Jedno przeciwciało nie wykazywało reakcji krzyżowej z żadnym składnikiem cytozolu gospodarza.Frakcja cytozolu z komórek poddanych intoksykacji w obecności feldenu. A również nie wygenerowała sygnału dodatniego, BFA zapobiega transportowi toksyny do miejsca translokacji w ER, a tym samym dostarczeniu łańcucha H do cytozolu. Choletoina jest inną toksyną typu AB translokującą się do ER.W frakcji cytozolowej komórek HeLa traktowanych CT wykryto podjednostkę CTA1. Podkreśliło to, że opracowana metodologia działa w przypadku wielu typów komórek i może zostać zastosowana do dowolnej toksyny, dla której dostępne jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi. Nie wykryto sygnału podczas perfuzji frakcji cytozolowej z komórek traktowanych CT nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTB, co dowodzi, że w przeciwieństwie do podjednostki CT A1, wiążący się z komórkami PENTAMER CTB nie wnika do cytozolu.Po perfuzji nad czujnikiem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTA. Sygnał z frakcji organelli przekracza skalę w porównaniu do słabszego sygnału z frakcji cytozolowej. Jest to zgodne ze znaną niską wydajnością transportu CT do miejsca translokacji w ER, co z kolei ogranicza ilość toksyny, która może dotrzeć do cytozolu.Można również monitorować zależną od czasu akumulację translokowanej toksyny cytozolowej. Po ekspozycji komórek na CT w temperaturze 4°C, w cytozolu nie wykryto toksyny 15 minut po ogrzaniu do 37°C.Niewielka pula toksyny cytozolowej została wykryta po 30 minutach w temperaturze 37°C, a sukcesywnie większe ilości toksyny cytozolowej odnotowano po 45 i 60 minutach okresu pogoni. Świadczy to o ciągłym, długofalowym dostarczaniu toksyny związanej z komórką do gospodarczego cytozolu. Test ten pozwala również wykryć hamowanie translokacji toksyny do cytozolu; komórki traktowane 10% DMSO wykazywały niski poziom cytozolowej CT1 w porównaniu z nieleczonymi, zainfekowanymi komórkami kontrolnymi, co wskazuje na hamowanie rozfałdowania toksyny.Łańcuch jest warunkiem koniecznym do translokacji do cytozolu, zatem stabilizacja CT A₁ indukowana przez DMSO odpowiednio zapobiegła jego przemieszczaniu się z ER do cytozolu. Aby ilościowo określić indukowaną przez DMSO blokadę translokacji toksyny, wykorzystano krzywą wzorcową wygenerowaną z znanych stężeń toksyny, co pozwoliło obliczyć stężenie CTA₁ w cytozolu wynoszące 0,3 ng/ml dla komórek nieleczonych oraz 0,1 ng/ml dla komórek traktowanych DMSO. Inhibicja rozfałdowania CT A₁ przez DMSO doprowadziła zatem do trzykrotnego zmniejszenia translokacji CTA₁ z ER do cytozolu.Po przeprowadzeniu tej procedury będziemy mogli wykorzystać inne techniki, takie jak testy toksyczności, aby ustanowić bezpośrednią zależność między ilością toksyny obecną w cytozolu a aktywnością toksyny.

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie translokacji toksyn do cytozolu gospodarza za pomocą rezonansu plazmonowego powierzchniowego

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Powierzchniowy rezonans plazmonów do badania oddziaływań biomolekularnych za pomocą chipa czujnika

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Wprowadzono bezetykietowy optyczny biosensor do szybkiego wykrywania bakterii. Bioczujnik oparty jest na nanostrukturalnym porowatym krzemie, który został zaprojektowany tak, aby bezpośrednio wychwytywać docelowe komórki bakteryjne na swojej powierzchni. Używamy przeciwciał monoklonalnych, unieruchomionych na porowatym przetworniku, jako sond wychwytujących. Nasze badania pokazują możliwość zastosowania tych bioczujników do wykrywania niskich stężeń bakterii w ciągu kilku minut bez...

Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

Opisano nowatorskie podejście do budowy elektronicznego języka (eT), które znacznie upraszcza projektowanie i produkcję materiałów detekcyjnych, a także pozwala eT generować ciągłe profile ewolucji i krajobrazy dla próbek w cieczy. Uzyskany eT jest skuteczny w powszechnej analizie białek, takiej jak dyskryminacja.

Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Poznaj metodę SPR do wykrywania i ilościowego oznaczania toksyn w cytozolu komórek gospodarza. Technika ta umożliwia badanie kinetyki wnikania toksyn i potencjalne projektowanie leków.

Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Przeglądaj więcej filmów