Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania testu przepływu bocznego do szybkiego wykrywania antygenu diagnostycznego aspergillus w surowicy ludzkiej oraz w płynach z BAL. Jest to realizowane poprzez uprzednie naniesienie próbki surowicy lub płynu z BAL na port aplikacyjny urządzenia do testu przepływu bocznego. W drugim kroku należy pozwolić roztworowi na migrację wzdłuż membrany.

Kolejnym krokiem jest określenie, czy test jest prawidłowy, poprzez sprawdzenie linii kontroli wewnętrznej. Ostatnim etapem jest interpretacja wyniku testu na podstawie analizy linii testowej. Ostatecznie urządzenie do przepływu bocznego służy do wykrywania obecności antygenu diagnostycznego Aspergillus w surowicy lub płynach z BAL.

Test LFD na obecność aspergillus może być stosowany jako test pomocniczy w diagnostyce inwazyjnej aspergilozy płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy immunoenzymatyczne na aspergillus, galakto-manan, test panf, fundal, oznaczenie beta-glukanu oraz test PCR na aspergillus, jest to, że jest to szybki test diagnostyczny typu point-of-care, wymagający minimalnego zaplecza laboratoryjnego i przeszkolenia. Chociaż LFD został opracowany do wykrywania gatunków aspergillus, technologia przepływu bocznego może być zastosowana również do wykrywania innych patogenów zakaźnych, takich jak gatunki cetosporium, fusarium i riser.

Wprowadzenie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla tych organizmów sprawia, że wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa. Ponieważ interpretacja wyników LFD wymaga zapoznania się z formatem testu. Aby pobrać surowicę z nieprzetworzonych próbek krwi, należy pozwolić krwi skrzepnąć w temperaturze 4°C; surowicę oraz płyn z płukania pęcherzyków płucnych (BAL) należy przechowywać w postaci aliquotów w temperaturze -20°C przed użyciem. Przechowywanie w aliquotach ogranicza ryzyko degradacji antygenu docelowego wskutek wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek podczas powtórnych badań. Aby przygotować próbki surowicy i BAL do badania, rozmrozić próbki w temperaturze pokojowej, a następnie utrzymać je na lodzie. Dokładnie wymieszać za pomocą wortexa, a następnie wirować przez jedną minutę przy 14 000 RPM. W przypadku rutynowych badań próbek ludzkich, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:1 w pożywce do hodowli tkanek. Alternatywnie, aby oddzielić antygen docelowy od kompleksów immunologicznych w surowicy, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:2 w PBS zawierającym 4% EDTA, podgrzewać przez trzy minuty w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia, a następnie wirować przez pięć minut przy 14 000 RPM.

Płyny z BAL pobrane od ludzi nie wymagają wstępnej obróbki. Próbka BAL po rozmrożeniu, wymieszaniu w wirówce i odwirowaniu stanowi czysty preparat, który można nanieść bezpośrednio na urządzenie do testów przepływu bocznego. Do przeprowadzania testów urządzenia do przepływu bocznego (LFD) przechowuje się w temperaturze pokojowej, tj. 23 °C, w której pozostają one stabilne przez 12 miesięcy.

Aby rozpocząć analizę, należy wyjąć urządzenia z opakowań i umieścić je na płaskiej powierzchni. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety nanieść 100 µL wstępnie przygotowanego surowicy do otworu dozującego urządzenia w ciągu kilku sekund. Płyn powinien przemieszczać się siłami kapilarnymi wzdłuż membrany z octanu celulozy w oknie obserwacyjnym.

W ten sam sposób nanieś 100 µL czystej próbki BAL do otworu dozującego urządzenia. Pozostaw test na 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym należy zapisać wyniki badania. Test nie powinien trwać dłużej niż 15 minut przed odczytaniem wyników.

Ponieważ może to wpłynąć na interpretację wyników, słaba reakcja nie zostanie wzmocniona poprzez przedłużenie okresu inkubacji. Test LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej oznaczonej literą C na plastikowej obudowie oraz linii testowej oznaczonej literą T. Linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu aspergillus w surowicy lub próbce BAL. Świadczy to o prawidłowym przebiegu testu w przypadku obecności antygenu aspergillus w surowicy lub próbce BAL.

Linia testowa pojawi się również w ciągu 15 minut od nałożenia próbki. Intensywność reakcji testowej oraz reakcji na boreliozę jest proporcjonalna do stężeń docelowego antygenu w próbkach surowicy i VAL. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest interpretacja wyników testu.

Wyniki LFD należy odczytać po 15 minutach, a wynik testu porównać z przedstawionym tutaj reprezentatywnym przykładem. Na tej rysunku pokazano reprezentatywne przykłady słabych, dodatnich, umiarkowanie dodatnich i silnie dodatnich wyników LFD w próbkach BAL i surowicy. Każda dodatnia linia testowa w próbce surowicy, niezależnie od natężenia, wskazywałaby na inwazyjną aspergilozę płuc lub chorobę IPA ze względu na obecność krążącego antygenu aspergillus w krwiobiegu. Dodatnie reakcje w BAL, niezależnie od natężenia, wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.

W przypadku braku antygenu aspergillus linia testowa nie pojawi się, a wynik zostanie zapisany jako ujemny. Tabela ta przedstawia wyniki testów LFD z wykorzystaniem płynów z BAL pobranych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową lub ML, zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi grupy badawczej European Organization for Research and Treatment of Cancer oraz National Institute of Allergy and Infectious Diseases. W tabeli ujęto odpowiadające im dane kliniczne i psychologiczne, a także wyniki specyficznego testu PCR ASPERIA dla każdego pacjenta.

Zgodnie z wytycznymi E-O-R-T-C-M-S-G z 2002 roku, u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano prawdopodobne IPA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GM. Według zrewidowanych wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G z 2008 roku, same czynniki gospodarza i dodatni wynik GM lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazywałyby na możliwe inwazyjne zakażenie grzybicze, chyba że towarzyszyłyby im odpowiednio dowody wspierające z danych klinicznych i mikologicznych. U pacjenta sześć zdiagnozowano prawdopodobne IPA zgodnie z wytycznymi z 2002 i 2008 roku ze względu na główne i poboczne cechy kliniczne czynników gospodarza oraz dodatni wynik GM.

Na koniec należy zauważyć, że mimo iż obecnie ani test LFD, ani test PCR nie są uwzględnione w wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G dla próbek BAL pacjentów numer sześć i 12, istnieje silna zgodność między tymi dwiema metodami a komercyjnym testem na galaktomannan, co wskazuje na obecność antygenu i kwasów nukleinowych aspergillus po zastosowaniu tej procedury. Równolegle można przeprowadzić inne metody, takie jak enzymatyczny test aminowy na galaktomannan Pella, panf, test na beta-glukan grzybowy lub testy PCR na aspergillus, aby potwierdzić inwazyjną infekcję grzybiczą. Należy pamiętać, że praca z ludzkim surowicą krwi i płynem BAL może być niezwykle niebezpieczna, a operatorzy urządzenia powinni być zawsze zaszczepieni przeciwko takim chorobom jak zapalenie wątroby typu B i gruźlica.