Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami hematologicznymi za pomocą technologii przepływu bocznego

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie zastosowania urządzenia z przepływem bocznym do szybkiego wykrywania antygenu diagnostycznego aspergillus w ludzkiej surowicy i płynach BAL. Osiąga się to poprzez uprzednie nałożenie próbki surowicy lub BAL do portu uwalniającego urządzenia do przepływu bocznego. Drugim krokiem jest umożliwienie migracji roztworu wzdłuż membrany.

Następnym krokiem jest ustalenie, czy test jest ważny, poprzez zbadanie linii kontroli wewnętrznej. Ostatnim krokiem jest interpretacja wyniku testu poprzez zbadanie linii testowej. Ostatecznie urządzenie do przepływu bocznego służy do wykrywania obecności antygenu diagnostycznego aspergillus w surowicy lub płynach BAL.

Aspergillus LFD może być stosowany jako test wspomagający w diagnostyce inwazyjnej aspergilozy płucnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak aspergillus, galacto, test immunologiczny enzymu Manan, panf, test dna oka, test beta glukanu i test aspergillus PCR, jest to, że jest to szybki test diagnostyczny w miejscu opieki, wymagający minimalnego zaplecza laboratoryjnego i szkolenia. Chociaż LFD został opracowany do wykrywania gatunków Aspergillus, technologia przepływu bocznego może być również stosowana do wykrywania innych zakaźnych patogenów, takich jak cetosporium, fusarium i gatunki pionowe.

Dzięki włączeniu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla tych organizmów, wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ interpretacja wyników LFD wymaga zapoznania się z formatem testu: Aby pobrać surowicę z próbek krwi niepoddanych działaniu substancji, umożliwić krzepnięcie krwi w temperaturze czterech stopni Celsjusza surowicy i płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych, lub Płyny BAL powinny być przechowywane jako podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przed użyciem przechowywania, ponieważ podwielokrotności ograniczają możliwość degradacji docelowego antygenu poprzez wielokrotne swobodne przechowywanie próbek podczas powtarzanych badań w celu przygotowania próbek surowicy i BAL do badania, rozmrażać próbki w temperaturze pokojowej, a następnie trzymać na lodzie, dokładnie wymieszać przez wirowanie, a następnie odwirować przez jedną minutę z prędkością 14 000 obr./min W przypadku rutynowych badań próbek ludzkich należy rozcieńczyć surowicę jeden do jednego alternatywnie pożywką do hodowli tkankowej i oddzielić docelowy antygen od kompleksów immunologicznych surowicy. Rozcieńczyć surowicę od jednego do dwóch PBS zawierającym 4% EDTA, podgrzewać przez trzy minuty we wrzącej łaźni wodnej i wirować przez pięć minut z prędkością 14 000 obr./min.

Płyny BAL dla ludzi nie wymagają obróbki wstępnej. Próbka BAL została rozmrożona wirowo, a wirówka jest zgrabną próbką, którą można nałożyć bezpośrednio na urządzenie z przepływem bocznym. Do testów urządzenia z przepływem bocznym lub LFD są przechowywane w temperaturze pokojowej lub 23 stopnie Celsjusza, w której są stabilne przez 12 miesięcy.

Aby rozpocząć test, wyjmij urządzenia z woreczków i umieść je na równej powierzchni. Za pomocą sterylnej końcówki pipety nałóż 100 mikrolitrów wstępnie przetworzonej surowicy do portu uwalniania urządzenia w ciągu kilku sekund. Płyn powinien migrować przez działanie kapilarne wzdłuż membrany azotawo-celulozowej w oknie obserwacyjnym.

W ten sam sposób nałóż 100 mikrolitrów czystej próbki BAL do portu spustowego urządzenia. Pozostawić test na 15 minut w temperaturze pokojowej, w którym to czasie należy zapisać wyniki testu. Test nie powinien być pozostawiony na dłużej niż 15 minut przed zapisaniem wyników.

Ponieważ może to zniekształcić interpretację wyników, tygodniowa reakcja nie zostanie wzmocniona przez wydłużenie okresu inkubacji. LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej oznaczonej literą C na plastikowej obudowie oraz linii testowej oznaczonej literą T. Linia kontrolna powinna zawsze pojawiać się niezależnie od obecności antygenu aspergillus w próbce surowicy lub BAL. Pokazuje to, że test przebiegł prawidłowo, jeśli antygen aspergillus jest obecny w próbce surowicy lub BAL.

Linia testowa pojawi się również w ciągu 15 minut od aplikacji próbki. Intensywność testu, reakcje boreliozy są proporcjonalne do stężeń docelowego antygenu w próbkach surowicy i VAL. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest interpretacja wyników testów.

Wyniki LFD należy odczytać po 15 minutach, a wynik testu porównać z reprezentatywnym przykładem pokazanym tutaj, Pokazane na tym rysunku są reprezentatywne przykłady słabych, dodatnich, umiarkowanie dodatnich i silnych dodatnich wyników LFD z próbkami BAL i surowicy. Każda dodatnia linia testowa w próbce surowicy, niezależnie od intensywności, wskazywałaby na inwazyjną aspergilozę lub chorobę IPA z powodu obecności krążącego antygenu aspergillus w krwiobiegu. Dodatnie reakcje BAL, niezależnie od intensywności, wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennej hyphy w płucach.

W przypadku braku antygenu aspergillus nie pojawi się żadna linia testowa, a wynik jest zapisywany jako negatywny. Poniższa tabela przedstawia wyniki badań LFD z użyciem płynów BAL od pacjentów z ostrą białaczką szpikową lub ML zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Nowotworów oraz Grupy Badawczej Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. W tej tabeli znajdują się odpowiednie dane kliniczne i psychologiczne, a także wyniki testu PCR przeprowadzonego w ramach systemu ASPERIA dla każdego pacjenta.

Zgodnie z wytycznymi E-O-R-T-C-M-S-G z 2002 r., u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano możliwe IPA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GMO. Zgodnie ze zmienionymi wytycznymi E-O-R-T-C-M-S-G z 2008 r., czynniki gospodarza i sama dodatniość GMO lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazują na możliwe inwazyjne zakażenie grzybicze, chyba że towarzyszą im dowody potwierdzające z odpowiednio danych klinicznych i mikologii. U szóstego pacjenta zdiagnozowano prawdopodobną IPA zgodnie z wytycznymi z 2002 i 2008 r. ze względu na czynniki gospodarza, główne i drobne cechy kliniczne oraz dodatni wynik GM.

Na koniec należy zauważyć, że chociaż ani test LFD, ani test PCR nie są obecnie uwzględnione w wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G w próbkach BAL pacjentów szóstego i 12, istnieje silna zgodność między tymi dwoma testami a komercyjnym testem gala manin wskazującym na obecność antygenu aspergillus i kwasu nukleinowego Po tej procedurze. Inne metody, takie jak test aminowy enzymu Pella Glactomannan , panf, test beta-glukanu grzybów lub testy PCR aspergillus mogą być wykonywane równolegle w celu potwierdzenia inwazyjnej choroby grzybiczej. Nie zapominaj, że praca z ludzką surowicą krwi i płynami BAL może być niezwykle niebezpieczna, a operatorzy urządzenia powinni zawsze być zaszczepieni przeciwko chorobom takim jak wirusowe zapalenie wątroby typu B i gruźlica.