Name: Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami hematologicznymi za pomocą technologii przepływu bocznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj szybką metodę wykrywania inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami krwi za pomocą testu przepływu bocznego. Technika ta wykrywa antygeny Aspergillus w surowicy i płynie BAL w ciągu 15 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyrażamy wdzięczność za finansowanie badań dr. Thorntona przekazane przez Pfizer Limited.

1. Pobieranie, przechowywanie i przygotowanie surowicy oraz płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
<ol>
	<li>Pozyskać surowicę z nieprzetworzonych próbek krwi, pozwalając krwi krzepnąć w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać surowicę w formie aliquotów w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Płyny z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) również należy przechowywać w formie aliquotów w temperaturze -20 °C. Uwaga: Przechowywanie surowicy i BAL w formie aliquotów ogranicza możliwość degradacji docelowego antygenu spowodowaną wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem próbek podczas powtarzanych testów.</li>
	<li>Rozmrozić próbki, dokładnie wymieszać próbki surowicy i BAL za pomocą wortexa, a następnie wirować przez 1 min w prędkości 14,000 rpm.</li>
	<li>W przypadku rutynowego badania próbek ludzkiej surowicy, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:1 (v/v) pożywką do hodowli tkankowych (TCM). TCM składa się z pożywki RPMI-1640, 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej, 1% (v/v) roztworu L-glutaminy 200mM oraz azotku sodu (0,02% w/v) jako konserwantu. Pożywkę przygotowuje się z wyprzedzeniem i można ją przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Nanieść 100 μl rozcieńczonej surowicy na test LFD.</li>
	<li>W przypadku ludzkich płynów BAL oraz płynów BAL z modeli zwierzęcych, nanieść 100 μl nierozcieńczonej próbki na test LFD, bez wstępnej obróbki.</li>
	<li>W przypadku surowicy z modeli zwierzęcych, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:2 (v/v) solą fizjologiczną z buforem fosforanowym zawierającą 4% (w/v) EDTA, podgrzewać przez 3 min w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia, wirować przez 5 min w prędkości 14,000 rpm, a następnie nanieść 100 μl nierozcieńczonego supernatantu na urządzenie LFD.</li>
</ol>
2. Naniesienie surowicy i BAL na urządzenie do analizy przepływu bocznego
<ol>
	<li>Przechowywać testy przepływu bocznego w temperaturze pokojowej (23 °C). W tej temperaturze urządzenia są stabilne przez 12 miesięcy. Wyjąć urządzenia z opakowań i umieścić na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego końcówki do pipety nanieść 100 μl wstępnie opracowanego serum lub nieprzetworzonej próbki BAL do otworu wprowadzeniowego urządzenia.</li>
	<li>Pozostawić test do przebiegu przez 15 min w temperaturze pokojowej, po czym należy zapisać wyniki testów. Uwaga: W ciągu kilku sekund będzie widoczna migracja płynu w kierunku membrany nitrocelulozowej w oknie obserwacyjnym na drodze kapilarnej.</li>
</ol>
3. Rejestracja i interpretacja wyników LFD
<ol>
	<li>LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej (oznaczonej literą C na plastikowej obudowie) oraz linii testowej (oznaczonej literą T). Linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu Aspergillus w próbce surowicy lub płynu z BAL. Świadczy to o prawidłowym przebiegu testu.</li>
	<li>Jeśli antygen Aspergillus jest obecny w próbce surowicy lub płynu z BAL, linia testowa pojawi się w ciągu 15min od aplikacji próbki. Ponieważ intensywność linii testowej jest proporcjonalna do ilości antygenu Aspergillus obecnego w próbce, linia testowa może wystąpić jako słabo dodatnia (+), umiarkowanie dodatnia (++) lub silnie dodatnia (+++). Niemniej jednak każda dodatnia linia testowa, niezależnie od intensywności, wskazuje na obecność antygenu Aspergillus w próbce. W przypadku braku antygenu Aspergillus linia testowa nie pojawi się, a wynik zostaje zapisany jako ujemny (-).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne przykłady wyników LFD ujemnych, słabo dodatnich, umiarkowanie dodatnich i silnie dodatnich dla próbek BAL i surowicy przedstawiono na Rysunku 1.
Wyniki testów LFD dodatnich pod kątem antygenu (słabych i silnych) lub testów LFD ujemnych z wykorzystaniem płynu z BAL pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi EORTC/MSG przedstawiono w Tabeli 1. W tabeli tej ujęto odpowiadające im dane kliniczne i mykologiczne (galaktomannan i posiew) oraz wyniki specyficznego testu PCR na Aspergillus opracowanego w St. Bartholomews Hospital8 dla każdego pacjenta. Rozpoznanie choroby oparto na czynnikach gospodarza (neutropenia, przedłużone stosowanie kortykosteroidów, leczenie innymi uznanymi immunosupresantami limfocytów T), kryteriach klinicznych oraz dodatnim wyniku GM dla BAL (zdefiniowanym tutaj jako wartość indeksu GM &gt; 0,8). Zgodnie z wytycznymi EORTC/MSG z 2002 roku10, u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano „prawdopodobną” (possible) IA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GM. Według zrewidowanych (2008) wytycznych EORTC/MSG2, same czynniki gospodarza i dodatni wynik GM lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazywałyby na „prawdopodobną” (possible) inwazyjną infekcję grzybiczą, chyba że towarzyszyłyby im odpowiednio dowody pomocnicze z danych klinicznych i mykologii. U pacjenta 6 zdiagnozowano „wysoce prawdopodobną” (probable) IA zgodnie z wytycznymi z 2002 i 2008 roku ze względu na czynniki gospodarza, główne i poboczne cechy kliniczne oraz dodatni wynik GM. Należy zauważyć, że choć testy LFD ani PCR nie są obecnie zawarte w wytycznych EORTC/MSG, istnieje silna zgodność między tymi dwoma testami a komercyjnym testem na galaktomannan, co wskazuje na obecność antygenu i kwasu nukleinowego Aspergillus w próbkach BAL pacjentów 6 i 12. Dodatkowe wyniki badań wykazujące skuteczność testów LFD i PCR w diagnozowaniu IPA można znaleźć w pracy Johnson et al8.
<img alt="Wyniki testu przepływu bocznego; płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe, surowica; porównanie pozytywnych i negatywnych linii testowych." src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wyniki negatywne (tylko linia kontrolna) i pozytywne (linia kontrolna i testowa) testów LFD z wykorzystaniem surowicy i BAL. Intensywność reakcji linii testowej jest proporcjonalna do stężenia docelowego antygenu w próbkach surowicy i BAL. Reakcje zazwyczaj wahają się od słabych (+) przez umiarkowane (++) do silnych (+++). Bez względu na intensywność linii testowej, wszystkie trzy pozytywne reakcje w surowicy wskazywałyby na inwazyjną aspergilozę płuc ze względu na obecność krążącego antygenu Aspergillus w krwiobiegu. Pozytywne reakcje w BAL (słabe, umiarkowane lub silne) wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nr pacjenta</td>
			<td>Informacje o pacjencie</td>
			<td>Kryteria kliniczne1</td>
			<td>Posiew BAL2</td>
			<td>Wskaźnik GM EIA3</td>
			<td>EORTC / MSG (2002)4</td>
			<td>EORTC / MSG (2008)5</td>
			<td>Wynik PCR Aspergillus</td>
			<td>Wynik LFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>Główne oznaki w TK (guzek i objaw halo) oraz jedno kryterium poboczne</td>
			<td>Ujemny</td>
			<td>0,9 (dodatni)</td>
			<td>Prawdopodobne</td>
			<td>Prawdopodobne</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Słabo dodatni (+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Domniemana wcześniejsza infekcja grzybicza</td>
			<td>Brak głównych, jedno poboczne</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>6,43 (silnie dodatni)</td>
			<td>Możliwe</td>
			<td>Brak</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Silnie dodatni (+++)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>Koagulazo-ujemne Staphylococcus oraz E. coli we krwi</td>
			<td>Brak głównych, dwa poboczne</td>
			<td>Ujemny</td>
			<td>0,25 (ujemny)</td>
			<td>Możliwe</td>
			<td>Brak</td>
			<td>Ujemny</td>
			<td>Ujemny (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>Infekcja klatki piersiowej</td>
			<td>3 kryteria poboczne, w tym nowy naciek oraz wysięk opłucnowy</td>
			<td>Ujemny</td>
			<td>0,16 (ujemny)</td>
			<td>Możliwe</td>
			<td>Brak</td>
			<td>Ujemny</td>
			<td>Ujemny (-)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
1 Guzki lub halo w badaniu tomografii komputerowej sugerują infekcję grzybiczą 
2 Obecność Candida glabrata w płynie z BAL uznaje się za zanieczyszczenie, ponieważ jest to drugi najczęstszy drożdżak izolowany jako element prawidłowej flory człowieka9 
3 Wskaźnik &gt;0,8 w teście GM EIA z płynu BAL wskazuje na zakażenie Aspergillus 
4 Na podstawie kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG z 2002 roku dla „możliwej”, „prawdopodobnej” lub „potwierdzonej” inwazyjnej choroby grzybiczej10 
 5 Na podstawie zaktualizowanych (2008) kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG dla „możliwej”, „prawdopodobnej” lub „potwierdzonej” inwazyjnej choroby grzybiczej2
Tabela 1. Wyniki testów LFD próbek BAL pobranych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową z prawdopodobną IPA oraz od kontrolnych pacjentów z AML (brak dowodów na zakażenie), a także diagnoza zakażenia według EORTC/MSG.

<ol><li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of invasive aspergillosis.</a> Adv. Appl. Microbiol. 70, 187-216 (2010).</li>
<li>De Pauw, B., Walsh, T. J., Donnelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+definitions+of+invasive+fungal+disease+from+the+European+Organization+for+Research+and+Treatment+of+Cancer%2FInvasive+Fungal+Infections+Cooperative+Group+and+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+Mycology+Study+Group+%28EORTC%2FMSG%29+concensus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) concensus group.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 1813-1821 (2008).</li>
<li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+emerging+human+pathogen+Pseudallescheria+boydii+by+using+highly+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking the emerging human pathogen Pseudallescheria boydii by using highly specific monoclonal antibodies.</a> Clin. Vacc. Immunol. 16, 756-764 (2009).</li>
<li>Pickering, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+%281+-%3E+3%29-%CE%B2-D-glucan+assay+for+diagnosis+of+invasive+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a (1 -> 3)-β-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5957-5962 (2005).</li>
<li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immunochromatographic+lateral-flow+device+for+rapid+serodiagnosis+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of an immunochromatographic lateral-flow device for rapid serodiagnosis of invasive aspergillosis.</a> Clin. Vacc. Immunol. 15, 1095-1105 (2008).</li>
<li>Verweij, P. E., Mennink-Kersten, M. A. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+with+galactomannan+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Issues with galactomannan testing.</a> Med. Mycol. 44, 179-183 (2006).</li>
<li>Wiederhold, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lateral+flow+technology+and+galactomannan+and+%281+-%3E+3%29-%CE%B2-D-glucan+assays+for+detection+of+invasive+pulmonary+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of lateral flow technology and galactomannan and (1 -> 3)-β-D-glucan assays for detection of invasive pulmonary aspergillosis.</a> Clin. Vacc. Immunol. 16, 1844-1846 (2009).</li>
<li>Johnson, G. L., Bibby, D., Bustin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Aspergillus+in+broncho-alveolar+lavage+fluid+using+two+biological+assays%3B+evidence+of+active+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Detection of Aspergillus in broncho-alveolar lavage fluid using two biological assays; evidence of active infection.</a> Mycoses. 54, Suppl 2. 130-131 (2011).</li>
<li>Malani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata+fungemia%3A+experience+in+a+tertiary+care+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care centre.</a> Clin. Infect. Dis. 41, 975-981 (2005).</li>
<li>Ascioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infection+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+concensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus.</a> Clin. Infect. Dis. 34, 71-74 (2002).</li>
<li>Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnosis+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Early diagnosis of invasive aspergillosis.</a> Lancet. 355, 423-424 (2000).</li>
<li>Greene, R., Shibuya, K., Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreene%2C+R+%22Aspergillus+fumigatus+and+Aspergillosis%22">Aspergillus fumigatus and Aspergillosis</a>. Latge, J. -P., Steinbach, W. J. , ASM Press. 353-363 (2009).</li>
<li>Klont, R. R., Mennink-Kersten, M. A. S. H., Verweij, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Aspergillus+antigen+detection+in+specimens+other+than+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum samples.</a> Clin. Infect. Dis. 39, 1467-1474 (2004).</li>
<li>Iweala, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+diagnostic+tests%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">HIV diagnostic tests: an overview.</a> Contraception. 70, 141-147 (2004).</li>
<li>Ketema, F., Zeh, C., Edelman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+performance+of+a+rapid%2C+lateral+flow+assay+for+the+detection+of+antibodies+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acquir.+Immune+Defic.+Syndr%22%5BJournal%5D)">Assessment of the performance of a rapid, lateral flow assay for the detection of antibodies to HIV.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 27, 63-70 (2001).</li>
<li>Moody, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+diagnostic+tests+for+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid diagnostic tests for malaria parasites.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 66-78 (2002).</li>
<li>Parkash, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+lateral+flow+test+for+the+detection+of+leprosy+patients+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Performance of a lateral flow test for the detection of leprosy patients in India.</a> J. Med. Microbiol. 57, 130-132 (2008).</li>
<li>Sharma, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lateral-flow+Clostridium+botulinum+neurotoxin+detection+kits+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lateral-flow Clostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3935-3941 (2005).</li>
<li>Smits, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral-flow+assay+for+rapid+serodiagnosis+of+human+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 166-169 (2001).</li>
<li>Faulstich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaulstich%2C+K+%22Lateral+Flow+Immunoassay%22">Lateral Flow Immunoassay</a>. Wong, R., Tse, H. , Humana Press. 157-185 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ostateczną identyfikację IPA można przeprowadzić wyłącznie poprzez wyizolowanie czynnika etiologicznego z próbek biopsyjnych, jednak pobranie odpowiednich próbek jest często niemożliwe u pacjentów w stanie ciężkim, a Aspergillus rzadko udaje się wyizolować z krwi. Mimo znaczącego postępu w wykorzystaniu tomografii komputerowej klatki piersiowej w diagnostyce IPA, cechy sugerujące płucną postać IPA, takie jak objaw „halo” lub „półksiężyca powietrznego”, są albo przejściowe, albo mogą wynikać z artefaktów oddechowych lub innych infekcji grzybiczych11,12. Dlatego dane te uzupełnia się technikami serologicznymi, których celem jest identyfikacja cząsteczek sygnaturowych (GM i β-glukanu) grzybów krążących w surowicy pacjenta lub obecnych w płycie z BAL, plwocinie bądź próbkach moczu13. Chociaż testy te wykazują satysfakcjonującą czułość, brakuje im wystarczającej swoistości lub są podatne na zakłócenia w określonych warunkach1,6.
Przedstawiony tutaj test LFD do wykrywania IPA umożliwia diagnostykę IPA w miejscu opieki nad pacjentem (point-of-care) i wykorzystuje technologię stosowaną dotychczas w testach do wykrywania wirusów, bakterii, pasożytów i toksyn14-19, a przede wszystkim w domowych testach ciążowych, wprowadzonych po raz pierwszy przez Unipath w 1988 roku. W opisanym tutaj teście LFD na Aspergillus, swoiste dla Aspergillus MAb JF5 jest unieruchomione w strefie wychwytu (linia testowa) na porowatej membranie nitrocelulozowej. Jako kontrolę wewnętrzną (linia kontrolna) służy unieruchomiona na membranie w osobnej strefie przeciwciała przeciwko immunoglobulinom mysim. Po dodaniu surowicy lub płynu z BAL do otworu wlotowego, koniugat MAb JF5 ze złotem koloidalnym znajdujący się w podkładce uwalniającej wiąże się z docelowym antygenem, a kompleks ten przemieszcza się następnie wzdłuż porowatej membrany dzięki działaniu kapilarnemu. MAb JF5 unieruchomione w strefie wychwytu wiąże się z kompleksem JF5-złoto koloidalne-antygen, co skutkuje powstaniem czerwonej linii testowej. Każdy niewiązany koniugat JF5-złoto koloidalne wiąże się z kontrolą wewnętrzną, co wskazuje na prawidłowy przebieg analizy. Przejawia się to powstaniem czerwonej linii kontrolnej.
Test jest szybki, jego wykonanie zajmuje tylko 15 minut, jest tani w porównaniu do testów surowicy i BAL opartych na wykrywaniu GM i β-glukanu oraz nie wymaga drogiego sprzętu ani rozbudowanej infrastruktury laboratoryjnej. Co więcej, MAb JF5 nie wykazuje reakcji krzyżowej z lekami ani zanieczyszczeniami, które w testach GM i β-glukanu powodują reakcje fałszywie dodatnie1,4,6. Dodatkową istotną zaletą w stosunku do obecnych testów diagnostycznych jest zdolność LFD do wykrywania aktywności wskazującej na inwazyjny wzrost gatunków Aspergillus.
Krytycznym etapem procedury LFD jest konieczność odczytania wyników 15 min po naniesieniu próbki surowicy lub BAL na urządzenie. Test nie powinien być pozostawiony na dłużej niż 15 min przed zapisaniem wyników, ponieważ może to wpłynąć na interpretację rezultatu. Słaba reakcja nie zostanie wzmocniona poprzez wydłużenie okresu inkubacji. Stwierdzono, że obróbka termiczna surowicy z modeli zwierzęcych infekcji poprawia czułość analizy. Ograniczeniem testu jest jego charakter jakościowy oraz fakt, że opiera się on na subiektywnej ocenie dodatniego wyniku przez operatora. Intensywność linii testowej różni się w zależności od zawartości antygenu w próbkach surowicy i BAL (Rysunek 1). Niemniej jednak każda dodatnia reakcja (ustalona poprzez porównanie z znanymi próbkami ujemnymi) wskazuje na obecność antygenu Aspergillus, a tym samym na infekcję. Aby ograniczyć subiektywizm analiz LFD, dostępne są przenośne urządzenia, które umożliwiają kwantyfikację intensywności linii testowych LFD oraz ustalenie wartości progowych dla detekcji antygenu20.
Przyszłe kierunki rozwoju LFD obejmują jego komercjalizację oraz opracowanie multipleksowego LFD, który umożliwi jednoczesne wykrywanie innych inwazyjnych patogenów grzybiczych przy użyciu wysoce specyficznych MAbs3.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus&lt;/em&gt; LFD</td><td>University of Exeter</td><td></td><td>Dostępne od autora korespondencyjnego na zapytanie</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Biosera</td><td>S9100</td><td>Do przygotowania TCM można użyć innych źródeł płodowej surowicy cielęcej</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPE120-1</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Inwazyjna aspergiloza płucna (IPA) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z nowotworami hematologicznymi oraz u biorców przeszczepów hematopoetycznych komórek macierzystych1. Wykrywanie IPA stanowi ogromne wyzwanie diagnostyczne i wobec braku „złotego standardu” opiera się na kombinacji danych klinicznych oraz, w miarę możliwości, wyników mikrobiologii i histopatologii. Rozpoznanie IPA musi być zgodne z konsensusem Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Nowotworów oraz Grupy Badawczej Mykologii Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (EORTC/MSG), który definiuje inwazyjne grzybice jako „potwierdzone”, „prawdopodobne” i „możliwe”2. Obecnie żadne testy oparte na kwasach nukleinowych nie zostały zewnętrznie zwalidowane do wykrywania IPA, dlatego reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) nie jest uwzględniona w aktualnych kryteriach diagnostycznych EORTC/MSG.
Identyfikacja Aspergillus w skrawkach histologicznych jest problematyczna ze względu na podobieństwo morfologii strzępek do innych inwazyjnych patogenów grzybiczych3, a potwierdzona identyfikacja wymaga wyizolowania czynnika etiologicznego w czystej kulturze. Metody oparte na hodowli zależą od dostępności próbek biopsyjnych, które jednak nie zawsze są możliwe do pobrania u ciężko chorych pacjentów, a w przypadku ich pozyskania nie zawsze dostarczają żywotnych propaguli do hodowli.
Ważną cechą w patogenezie Aspergillus jest angioinwazja, cecha ta stwarza możliwości immunologicznego śledzenia grzyba za pomocą testów wykrywających charakterystyczne cząsteczki sygnatur antygenowych w surowicy i płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Doprowadziło to do opracowania enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego Platelia (GM-EIA), który wykrywa galaktomannan Aspergillus, oraz testu „pan-grzybiczego” (test Fungitell), który wykrywa konserwowany składnik ściany komórkowej grzybów (1 →3)-β-D-glukan, jednak nie w przypadku Mucorales, których ściany komórkowe są pozbawione tego składnika1,4. Kwestie związane z dokładnością tych testów1,4-6 doprowadziły do niedawnego opracowania testów nowej generacji opartych na przeciwciałach monoklonalnych (MAb), które wykrywają markery zastępcze infekcji1,5.
Thornton5 opisał niedawno wytworzenie swoistego dla Aspergillus przeciwciała monoklonalnego (MAb JF5) z wykorzystaniem technologii hybridoma oraz jego zastosowanie w opracowaniu immunochromatograficznego testu przepływu bocznego (LFD) do diagnostyki przy łóżku pacjenta (POC) w przypadku inwazyjnej aspergilozy płuc (IPA). Główną zaletą testu LFD jest zdolność do wykrywania aktywności zakażenia, ponieważ MAb JF5 wiąże się z zewnątrzkomórkowym antygenem glikoproteinowym, który jest wydzielany wyłącznie podczas aktywnego wzrostu grzyba5. Jest to istotna kwestia przy stosowaniu płynów, takich jak płyn z rozszerzonego pobierania z oskrzeli (BAL) do diagnostyki IPA, ponieważ zarodniki Aspergillus są powszechnym składnikiem wdychanego powietrza. Użyteczność urządzenia w diagnostyce IPA została wykazana z wykorzystaniem zwierzęcego modelu zakażenia, w którym test LFD wykazał wyższą czułość i swoistość w porównaniu do testów Platelia GM oraz Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan7.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą procedurę LFD służącą do wykrywania antygenu Aspergillus w ludzkiej surowicy oraz płynach z BAL. Szybkość i dokładność tej metody stanowią nowatorskie, pomocnicze badanie w punkcie opieki (point-of-care), umożliwiające diagnostykę IPA u pacjentów z nowotworami hematologicznymi.

Przedstawiono szybki i dokładny test typu point-of-care w kierunku inwazyjnej aspergilozy płucnej. Wykorzystuje on technologię przepływu bocznego z zastosowaniem specyficznego przeciwciała monoklonalnego, które wiąże antygen Aspergillus wydzielany podczas infekcji płucnych. Analiza jest kompatybilna z surowicą oraz płuczynami z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i stanowi nowy test pomocniczy w diagnostyce choroby.

Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Inwazyjna aspergiloza płucna (IPA) jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z nowotworami hematologicznymi oraz po przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania testu przepływu bocznego do szybkiej detekcji antygenu diagnostycznego Aspergillus w ludzkiej surowicy oraz płynach z BAL. Jest to realizowane poprzez uprzednie naniesienie próbki surowicy lub płynu BAL na port aplikacyjny urządzenia do przepływu bocznego. W drugim kroku należy pozwolić roztworowi na migrację wzdłuż membrany.Kolejnym krokiem jest określenie, czy test jest prawidłowy, poprzez sprawdzenie linii kontroli wewnętrznej. Ostatnim etapem jest interpretacja wyniku testu na podstawie analizy linii testowej. W ostateczności urządzenie do przepływu bocznego jest wykorzystywane do wykrywania obecności antygenu diagnostycznego aspergillus w surowicy lub płynach z BAL.Test LFD na obecność Aspergillus może być stosowany jako badanie pomocnicze w diagnostyce inwazyjnej aspergilozy płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy immunoenzymatyczne na obecność Aspergillus, galaktomannanu i mannanu, test na beta-glukan oraz test PCR na obecność Aspergillus, jest to, że jest to szybki test diagnostyczny typu point-of-care, wymagający minimalnego zaplecza laboratoryjnego i szkolenia. Choć LFD został opracowany do wykrywania gatunków Aspergillus, technologia przepływu bocznego może być zastosowana również do wykrywania innych patogenów zakaźnych, takich jak gatunki Cestosporium, Fusarium i Rhizopus.Wprowadzenie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla tych organizmów sprawia, że wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa. Ponieważ interpretacja wyników LFD wymaga zapoznania się z formatem testu, w celu pobrania surowicy z nieprzetworzonych próbek krwi należy pozwolić krwi skrzepnąć w temperaturze 4 °C; surowicę oraz płyn z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL) należy przechowywać w formie aliquotów w temperaturze -20 °C przed użyciem. Przechowywanie w aliquotach ogranicza potencjał degradacji antygenu docelowego w wyniku wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek podczas powtórnych badań. Aby przygotować próbki surowicy i BAL do badania, rozmrozić próbki w temperaturze pokojowej, a następnie utrzymać je w lodzie; dokładnie wymieszać za pomocą wortexa, a następnie wirować przez jedną minutę przy 14 000 RPM. Do rutynowych badań próbek ludzkich rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:1 z pożywką do hodowli tkankowej; alternatywnie, aby odseparować antygen docelowy od kompleksów immunologicznych surowicy, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:2 w PBS zawierającym 4% EDTA, podgrzewać przez trzy minuty w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia i wirować przez pięć minut przy 14 000 RPM.Płyny z BAL człowieka nie wymagają wstępnej obróbki. Próbka BAL po rozmrożeniu, wymieszaniu w wirówce typu vortex i odwirowaniu stanowi czystą próbkę, którą można nałożyć bezpośrednio na urządzenie do przepływu bocznego. Do celów testowania urządzenia do przepływu bocznego lub LFD są przechowywane w temperaturze pokojowej lub 23 °C, w której pozostają stabilne przez 12 miesięcy.Aby rozpocząć analizę, należy wyjąć urządzenia z opakowań i umieścić je na płaskiej powierzchni. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety należy w ciągu kilku sekund nanieść 100 µL wstępnie przygotowanej surowicy do otworu dozującego urządzenia. Płyn powinien migrować siłami kapilarnymi wzdłuż membrany z octanu celulozy w oknie obserwacyjnym.W ten sam sposób nanieś 100 µL czystej próbki BAL do otworu uwalniającego urządzenia. Pozostaw test na 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym należy odczytać wyniki. Nie należy przekraczać czasu 15 minut przed zapisaniem wyników testu.Ponieważ może to wpłynąć na interpretację wyników, słabej reakcji nie należy wzmacniać poprzez wydłużanie okresu inkubacji. Test LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej oznaczonej literą C na plastikowej obudowie oraz linii testowej oznaczonej literą T. Linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu aspergillus w surowicy lub próbce BAL. Wskazuje to, że test przebiegł prawidłowo, jeśli antygen aspergillus jest obecny w surowicy lub próbce BAL.Linia testowa pojawi się również w ciągu 15 minut od naniesienia próbki. Intensywność reakcji w linii testowej oraz linii Lyme jest proporcjonalna do stężenia docelowego antygenu w próbkach surowicy i VAL. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest interpretacja wyników testu.Wyniki testu LFD należy odczytać po 15 minutach, a wynik testu porównać z przedstawionym tutaj reprezentatywnym przykładem. Na tej rysunku pokazano reprezentatywne przykłady słabych, dodatnich, umiarkowanie dodatnich i silnie dodatnich wyników LFD dla próbek BAL oraz surowicy. Każda dodatnia linia testowa w próbce surowicy, niezależnie od intensywności, wskazywałaby na inwazyjną aspergillozę płucną lub chorobę IPA ze względu na obecność krążącego antygenu Aspergillus w krwiobiegu. Dodatnie reakcje w BAL, niezależnie od intensywności, wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.W przypadku braku antygenu aspergillus linia testowa nie pojawi się, a wynik zostanie zapisany jako ujemny. Tabela ta przedstawia wyniki testów LFD z wykorzystaniem płynów z BAL pobranych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową lub ML, zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi Grupy Badawczej Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Nowotworów oraz Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. W tabeli ujęto odpowiadające im dane kliniczne i psychologiczne, a także wyniki specyficznego testu PCR ASPERIA dla każdego pacjenta.Zgodnie z wytycznymi E-O-R-T-C-M-S-G z 2002 roku, u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano możliwe IPA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GM. Według zrewidowanych wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G z 2008 roku, same czynniki gospodarza i dodatni wynik GM lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazywałyby na możliwe inwazyjne zakażenie grzybicze, chyba że towarzyszyłyby im odpowiednio dowody pomocnicze z danych klinicznych i mikologicznych. U pacjenta sześć zdiagnozowano prawdopodobne IPA według wytycznych z 2002 i 2008 roku ze względu na czynniki gospodarza, główne i poboczne cechy kliniczne oraz dodatni wynik GM.Na koniec należy zauważyć, że mimo iż obecnie ani test LFD, ani test PCR nie są uwzględnione w wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G w próbkach BAL pacjentów numer sześć i 12, istnieje silna zgodność między tymi dwoma metodami a komercyjnym testem galaktomannanowym, co wskazuje na obecność antygenu i kwasu nukleinowego aspergillus po zastosowaniu tej procedury. Równolegle można przeprowadzić inne metody, takie jak enzymatyczny test aminowy Pella Glactomannan, test panf na beta-glukan grzybiczy lub testy PCR na aspergillus, aby potwierdzić inwazyjną chorobę grzybiczą. Należy pamiętać, że praca z ludzkim surowicą krwi i płynami BAL może być niezwykle niebezpieczna, a operatorzy urządzenia powinni być zawsze zaszczepieni przeciwko takim chorobom jak zapalenie wątroby typu B i gruźlica.

detection-invasive-pulmonary-aspergillosis-haematological-malignancy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie inwazyjnego grzybicy płuc spowodowanej przez Aspergillus u pacjentów z chorobami krwi poprzez zastosowanie technologii przepływowej bocznej

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Tutaj opisujemy protokół do określania obciążenia grzybami płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą poprzez ilościowe zabarwienie srebrem zmodyfikowanej metanaminy Gomoriego w przekrojach histologicznych. Zastosowanie tej metody przyniosło porównywalne wyniki przy mniejszej liczbie zwierząt w porównaniu z oceną obciążenia grzybami za pomocą ilościowej reakcji PCR DNA grzyba płuc.

Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

Ten protokół zapewnia szybką i niezawodną metodę ilościowego pomiaru fagocytozy konidiów Aspergillus fumigatus przez ludzkie pierwotne fagocyty za pomocą cytometrii przepływowej i do odróżnienia fagocytozy konidiów od zwykłej adhezji do leukocytów.

Pomiar fagocytozy Aspergillus fumigatus Conidia za pomocą ludzkich leukocytów przy użyciu cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Niniejszy protokół opisuje w pełni zintegrowaną metodę LAMP opartą na chipie mikroprzepływowym, umożliwiającą w ciągu jednej godziny wykrycie w punkcie opieki (point-of-care) 15 patogenów wywołujących infekcje dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii.

Szybka detekcja w miejscu opieki (point-of-care) patogenów wywołujących zakażenia dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Niniejszy protokół opisuje w szczególności ekstrakcję całkowitego IgY z żółtka jaja za pomocą precypitacji glikolem polietylenowym i przekazuje ogólne informacje na temat technologii IgY.

Technologia IgY: Wyodrębnianie przeciwciał kurzych z żółtka jaja poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Poznaj szybką metodę wykrywania inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami krwi za pomocą testu przepływu bocznego. Technika ta wykrywa antygeny Aspergillus w surowicy i płynie BAL w ciągu 15 minut.

Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Przeglądaj więcej filmów