Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Niniejszy film prezentuje protokół izolacji i charakterystyki fenotypowej progenitorów hematopoetycznych z wykorzystaniem separacji opartej na koralikach magnetycznych oraz sortowania komórek metodą FACS. W pierwszej kolejności z myszy wypreparowuje się tylną kończynę, kość udową, piszczel oraz rdzeń kręgowy, a następnie poddaje się je homogenizacji w celu uzyskania zawiesiny komórek szpiku kostnego. Następnie populację tę wzbogaca się o komórki wykazujące ekspresję C kit przy użyciu przepływu magnetycznych mikrokoralików.

Analiza cytometryczna wzbogaconej populacji wykazuje, że metoda ta pozwala na uzyskanie wysoko oczyszczonej linii krwiotwórczej, progenitorów oraz hematopoetycznych komórek macierzystych, które mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych in vitro i in vivo. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wypłukiwanie szpiku kostnego, jest możliwość bardziej wydajnego i szybszego odzyskiwania komórek szpiku kostnego. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę stanów zapalnych, autoimmunizacji, niedoborów odporności, chorób degeneracyjnych, zaburzeń metabolicznych oraz immunologicznych modeli nowotworów, ponieważ umożliwia ona charakterystykę fenotypową i funkcjonalną analizę ex vivo progenitorów krwiotwórczych.

Niniejsza metoda może dostarczyć cennych informacji w monitorowaniu hematopoezy w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych. Może być ona również wykorzystywana do badania transdukcji sygnałów w biologii komórki oraz regulowanej rozwojowo ekspresji genów w poszczególnych subpopulacjach komórek progenitorowych. Należy rozpocząć od umieszczenia uśpionej myszy w stalowej kuwecie.

Spryskać brzuch i grzbiet 70% etanolem, aby zebrać kości, które posłużą jako źródło komórek. Za pomocą nożyczek wykonać dwa małe nacięcia w skórze przy tylnych kończynach, a następnie przy pomocy pęsety zwichnąć kość udową; po tym odwrócić mysz grzbietem do góry i rozciąć skórę wzdłużnie. Aby odsłonić kręgosłup, usunąć tkanki nad nim.

Następnie, używając nożyczek z ostrym czubkiem, ostrożnie usuń wszystkie resztki tkanek miękkich z kręgosłupa. Użyj gazy, aby usunąć resztki tkanek miękkich z kości udowej i piszczelowej.

Następnie umieść kości w 50 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej 30 mililitrów suplementowanego medium RPMI. Umieść kilka filtrów sterylnych o rozmiarze cztery piąte w sterylnym moździerzu. Następnie za pomocą pęsety przenieś kości do moździerza i przykryj je kolejną warstwą filtrów, aby stworzyć powierzchnię cierną.

Następnie umieść filtr do oddzielania komórek o rozmiarze oczek 40 µm w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Następnie za pomocą tłuczka rozetrzyj kości, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórkowej. Za pomocą pipety przenieś zawiesinę do filtra komórkowego.

Następnie do moździerza należy dodać 5 mL świeżej, uzupełnionej pożywki RPMI, aby wypłukać i zebrać pozostałe komórki, pipetując roztwór w górę i w dół. Następnie pożywkę RPMI należy przenieść do probówki z filtrem. Powtórz dwa ostatnie kroki, aż homogenizat kości stanie się przejrzysty.

Po przefiltrowaniu roztworu należy przenieść go do nowej probówki o pojemności 50 ml, przefiltrować i powtórzyć proces, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia tkankowe. Odwiruj zawartość probówki z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiratora. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.

Kolejnym krokiem procedury jest charakterystyka fenotypów progenitorów krwiotwórczych. Należy rozpocząć od resuspensji osadu komórkowego z każdej myszy w 15 ml PBS i 2% FBS. Następnie probówkę wirujemy z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usuwamy nadsącz za pomocą aspiracji.

Nie zakłócać osadu. Osad należy zawiesić w 5 mL PBS i 2% FBS, a następnie policzyć komórki za pomocą cytometru hematologicznego. Po określeniu stężenia komórek, przenieść 1 × 10⁵ komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.

Następnie wiruj płytkę z prędkością 500 ×g przez pięć minut. W czasie wirowania przygotuj w PBS i 2% FBS mieszaninę przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko wymienionym tutaj markerom powierzchniowym w celu zabarwienia komórek. Po zakończeniu wirowania usuń nadsącz poprzez odwrócenie płytki i dodaj 50 µL mieszaniny przeciwciał do każdego dołka.

Następnie, używając pipety wielokanałowej, należy pipetować próbki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Inkubować komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C; po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 150 µL PBS z dodatkiem 2% FBS. Następnie wirować płytkę z prędkością 500 ×g przez pięć minut.

Następnie usuń sennę, odwracając płytkę. Dalej, do każdej studni dodaj 50 µL rozcieńczonego w stosunku 1:300 przeciwciała AP przeciwko streptawidynie (rozmiar 7) w PBS z 2% FBS i rozbij skupiska komórek do postaci zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą pipetowania. Inkubuj komórki przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.

Przemyj komórki dwukrotnie 150 µL PBS i 2% FBS. Po odwirowaniu płytki odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 100 µL PBS i 2% FBS, a następnie przeanalizuj próbki metodą cytometrii. W celu posortowania wybranych subpopulacji komórek hematopoetycznych, przeprowadza się wzbogacenie magnetyczne szpiku kostnego w celu wyizolowania komórek pozytywnych. Resuspenduj osad komórkowy z szpiku kostnego pobranego od co najmniej 10 myszy w 1 mL roztworu buforowego zawierającego przeciwciało monoklonalne z zestawu C sprzężone z PC, rozcieńczone w stosunku 1:50.

Po inkubacji inkubować komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsius. Przemyć komórki dwukrotnie 40 mililitrami roztworu buforu. Po wirowaniu ostrożnie usunąć nadosad przez aspirację.

Następnie do osadu dodaj bezpośrednio 50 µL mikrokulek anti A PC na mysz. Wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadź przemywanie po inkubacji i odwirowuj komórki w ten sam sposób co wcześniej. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 4 mL roztworu buforowego. Na każde trzy myszy przygotuj kolumny max LS w polu magnetycznym odpowiedniego separatora max.

Przygotować kolumny, płucząc je czterema litrami roztworu buforowego. Następnie nanieść zawiesinę komórkową i zebrać nieznakowane komórki, które przepłyną przez kolumnę, do probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę roztworem buforowym trzy razy.

Dodaj nowy bufor, gdy rezerwuar kolumny zostanie opróżniony. Po przepłynięciu całego roztworu odrzuć frakcję przepływową, wyjmij kolumny z separatora i umieść każdą z nich na probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Pipetuj 4 ml roztworu buforowego na każdą kolumnę, a następnie natychmiast wypłucz komórki znakowane magnetycznie, naciskając tłok w głąb kolumny.

Wirować probówki z prędkością 500 ×g przez pięć minut. Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą aspiratora. Każdy osad zawiesić w 1 ml roztworu buforowego, a następnie przenieść wszystkie osady do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.

Po wzbogaceniu populacji komórek pozytywnych pod kątem sea kit, należy przeprowadzić barwienie i sortowanie komórek za pomocą FACS. Progenitory hematopoetyczne oraz hematopoetyczne komórki macierzyste z zawiesiny szpiku kostnego, wzbogaconej w komórki pozytywne pod kątem sea kit przy użyciu kulek magnetycznych, a następnie LT HSC i THSC, zostały posortowane zgodnie z ekspresją cząsteczek powierzchniowych, jak opisano w tym filmie. Rysunek ten przedstawia przykład procedury bramkowania elektronicznego w celu oceny wspólnych progenitorów limfoidalnych jako linin.

Należy zidentyfikować komórki z niską ekspresją interleukiny 7 R pozytywnych. Lin minus CD7 pozytywnych, CD1 pozytywnych oraz Lin minus CD7 pozytywnych, CD1 pozytywnych. Wybrać komórki z bramki CD7 pozytywnej.

Wspólne progenitorowe mieloidalne identyfikuje się jako komórki FC gamma R.Low CD 34 dodatnie. Ponadto, z bramkowania dla komórek c-kit dodatnich, progenitorowe granulocytowo-monocytarne identyfikuje się jako komórki FC gamma are high CD 34 dodatnie, natomiast progenitorowe megakariocytowo-erytrocytarne identyfikuje się jako komórki FC gamma are low CD 34 ujemne. Z frakcji LKS, komórki L-T-H-S-C i S-T-H-S-C są identyfikowane odpowiednio jako komórki CD 34 ujemne i CD 34 dodatnie. W ten sposób uzyskuje się dwie wzbogacone i wysoko oczyszczone populacje, które w warunkach fizjologicznych występują w niskiej liczbie, aby zbadać wpływ autoimmunizacji na hematopoezę HSC z grupy kontrolnej oraz z myszy z nieswoistymi zapaleniami jelit.

Zbarwiono przeciwciałami KI 67 oraz DPI, co można zobaczyć tutaj. Komórki w cyklu komórkowym są ledwo wykrywalne, jeśli w ogóle, w kompartym ujemnych pod względem CD 34 hematopoetycznych komórek macierzystych LKS w grupach kontrolnych zdrowych osobników. W przeciwieństwie do tego, liczba tych samych podzbiorów komórek jest znacznie zwiększona podczas IBD, a znaczna liczba HSC jest wykrywana w fazach SG2M cyklu komórkowego.

Sugeruje to, że zapalenie przewlekłe zapośredniczone przez limfocyty T determinuje wejście HSC w cykl komórkowy. Aby ocenić obecność ATP przechowywanego w pęcherzykach, komórki CD 34 negatywne od myszy zdrowych barwiono związkiem wiążącym nukleotydy, chininą; analiza jądrowa za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek wykazała, że w HSC, a nie w GMP, w cytoplazmie widoczne są pęcherzyki pozytywne pod kątem chininy. Aby ustalić, czy HSC reagują na zewnątrzkomórkowe ATP, przeanalizowano odpowiedź wapniową wyizolowanych hematopoetycznych komórek macierzystych obciążonych 4 0 2 i stymulowanych ATP oraz ionomycyną, co przedstawiono tutaj. Ślady wzrostu poziomu wapnia w pojedynczych komórkach wskazują na wzrost stężenia wapnia cytozolowego w LT HSC w wyniku aktywacji receptorów purynergicznych P2.

Po ekspozycji na ATP, ponieważ podwyższenie poziomu wapnia cytozolowego indukuje uwalnianie pęcherzykowego ATP. Ten eksperyment sugeruje, że ATP może regulować własne uwalnianie z HSCs i wykazuje, że procedura ta może być wykorzystana do badań funkcjonalnych HSCs. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować neurone topo stem cells oraz progenitorów zdeterminowanych liniowo do testów funkcjonalnych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak rekonstytucja u niepromieniowanych myszy biorców, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące potencjału rekonstytucyjnego komórek macierzystych krwi oczyszczonych ze stanu C lub środowiska zapalnego.