Name: Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i przodków zaangażowanych w linię rodową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji mysich hematopoetycznych komórek macierzystych z kości szpikowych przy użyciu wzbogacenia magnetycznego c-Kit+ i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką analizę fenotypową progenitorów do badań funkcjonalnych in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa oraz Markusowi Manz za cenne rady. Praca ta była finansowana przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową (Swiss National Science Foundation), Szwajcarską Ligę Przeciwrakową (Swiss Cancer League) oraz Fondazione Ticinese per la RIcerca sul Cancro.

1. Przygotowanie zawiesiny komórek z szpiku kostnego
<ol>
 <li>Uśmierć mysz, umieść zwierzę w stalowej kuwecie i spryskaj brzuch oraz grzbiet 70% etanolem. Pobierz kości udowe, piszczelowe z tylnych kończyn oraz kręgosłup.</li>
 <li>Precyzyjnie usuń wszystkie pozostałości tkanek miękkich z kręgosłupa za pomocą nożyczek o ostrym czubku, a z kości kończyn za pomocą gazy. Przechowuj kości w probówce Falcon 50 mL z 30 mL pożywki RPMI zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), uzupełnionej o 50 μM β-merkaptoetanolu, 100 μM nieessentialnych aminokwasów MEM, 1 mM pirogronianu sodu MEM, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny.</li>
 <li>Wyłóż dno wcześniej wysterylizowanego moździerza sterylnymi filtrami.</li>
 <li>Przenieś kości do moździerza i przykryj je warstwą filtrów, aby stworzyć powierzchnię tarcia.</li>
 <li>Przygotuj probówkę Falcon 50 mL wyposażoną w filtr Falcon.</li>
 <li>Rozdrobnij kości za pomocą tłuczka, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny komórkowej.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę do probówki.</li>
 <li>Dodaj do moździerza 5 mL świeżej kompletnej pożywki RPMI, aby wypłukać i zebrać pozostałe komórki.</li>
 <li>Powtarzaj dwa ostatnie kroki, aż homogenizowane kości będą wyglądać na oczyszczone.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do nowej probówki i przefiltruj ją w celu usunięcia pozostałych fragmentów tkanek.</li>
 <li>Wiruj probówkę z prędkością 1,500 rpm przez 5 min i ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że osad komórkowy nie został naruszony.</li>
</ol>
2. Analiza fenotypowa
<ol>
 <li>Zawiesić ponownie i przemyć komórki od poszczególnych myszy w 15 mL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Wirować probówkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.</li>
 <li>Zawiesić osad w 5 mL PBS i 2% FBS, a następnie policzyć komórki.</li>
 <li>Przenieść 1×106 komórek na dołek do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.</li>
 <li>Wirować płytkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min.</li>
 <li>Przygotować mieszaninę przeciwciał monoklonalnych (mAbs) skierowanych przeciwko następującym markerom powierzchniowym. Rozcieńczyć je w PBS i 2% FBS zgodnie z poniższymi wskazazkami w celu zabarwienia komórek:
 <ul type="disc">
 <li>CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 sprzężone z PE-Cy5 1:200</li>
 <li>c-Kit sprzężone z APC 1:100</li>
 <li>Sca1 sprzężone z biotyną 1:50</li>
 <li>CD34 sprzężone z FITC 1:50</li>
 <li>FcγR sprzężone z PE 1:100</li>
 <li>IL-7R sprzężone z PE-Cy7 1:100</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Usunąć nadsącz i dodać 50 μL mieszaniny mAbs do każdego dołka. Rozbić skupiska do pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować komórki przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie 150 μL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Wirować płytkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i usunąć nadsącz poprzez odwrócenie płytki.</li>
 <li>Rozcieńczyć streptawidynę w PBS i 2% FBS zgodnie z poniższymi wskazazkami w celu zabarwienia komórek:
 <ul type="disc">
 <li>Streptawidyna sprzężona z APC-Cy7 1:300</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Dodać 50 μL roztworu do każdego dołka. Rozbić skupiska do zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować komórki przez 10 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie 150 μL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Wirować płytkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i usunąć nadsącz.</li>
 <li>Zawiesić ponownie komórki w 100 μL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Przeanalizować próbki za pomocą FACS.</li>
</ol>
3. Magnetyczne wzbogacanie populacji komórek c-Kit+
<ol>
 <li>Przygotować roztwór buforowy zawierający PBS, pH 7.2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 2 mM EDTA.</li>
 <li>Resuspendować pellet komórek szpiku kostnego pochodzących z co najmniej 10 myszy w 1 mL roztworu buforowego zawierającego przeciwciało mAb przeciwko c-Kit sprzężone z APC w rozcieńczeniu 1:50.</li>
 <li>Inkubować komórki przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie 40 mL roztworu buforowego.</li>
 <li>Wirować probówkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację. Należy uważać, aby nie naruszyć pelletu.</li>
 <li>Resuspendować pellet komórek i dodać 50 μl Anti-APC MicroBeads bezpośrednio do pelletu dla każdej uśpionej myszy.</li>
 <li>Dokładnie wymieszać i inkubować przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki, dodając 40 mL roztworu buforowego, a następnie wirować z prędkością 1 500 rpm przez 5 min. Całkowicie odessać nadsącz.</li>
 <li>Resuspendować pellet komórek w wielokrotności 4 mL roztworu buforowego na każde trzy uśpione myszy.</li>
 <li>Umieścić kolumny MACS LS w polu magnetycznym odpowiedniego separatora MACS Separator. Stosować jedną kolumnę na każde trzy uśpione myszy.</li>
 <li>Przygotować kolumny poprzez przemycie ich 4 mL roztworu buforowego.</li>
 <li>Nanieść zawiesinę komórkową na kolumny.</li>
 <li>Zebrać nieoznaczone komórki, które przepłynęły przez kolumnę, i przemyć kolumnę 4 mL roztworu buforowego. Etapy płukania wykonać poprzez trzykrotne dodanie 4 mL roztworu buforowego. Dodać nowy bufor, gdy zbiornik kolumny zostanie opróżniony.</li>
 <li>Wyjąć kolumny z separatora i umieścić każdą z nich nad probówką typu Falcon 15 mL.</li>
 <li>Nanieść pipetą 4 mL roztworu buforowego na każdą kolumnę. Bezzwłocznie wypłukać magnetycznie oznaczone komórki, wcisnąć tłok do wnętrza kolumny.</li>
 <li>Wirować probówki z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację.</li>
 <li>Resuspendować każdy pellet w 1 mL roztworu buforowego i zebrać wszystkie pellety do jednej probówki typu Falcon 15 mL.</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek macierzystych krwi oraz progenitorów zdeterminowanych liniowo
<ol>
 <li>Przygotować mieszaninę przeciwciał monoklonalnych (mAbs) skierowanych przeciwko następującym markerom powierzchniowym. Rozcieńczyć je zgodnie z instrukcją w 500 μL PBS i 2% FBS w celu barwienia komórek.
 <ul type="disc">
 <li>CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 sprzężone z PE-Cy5 1:200</li>
 <li>c-Kit sprzężone z APC 1:100</li>
 <li>Sca-1 sprzężone z biotyną 1:50</li>
 <li>CD34 sprzężone z FITC 1:50</li>
 <li>FcγR sprzężone z PE 1:100</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Wirować probówkę z poprzedniej sekcji przy 1,500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację.</li>
 <li>Dodać mieszaninę mAbs do osadu. Rozbić osad do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować komórki przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie 14 mL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 1,500 rpm przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Rozcieńczyć streptawidynę zgodnie z instrukcją w 500 μL PBS i 2% FBS w celu barwienia komórek.
 <ul type="disc">
 <li>Streptawidyna sprzężona z APC-Cy7 1:300</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Dodać roztwór do probówki. Rozbić osad do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować komórki przez 10 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie 14 mL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 1,500 rpm przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Resuspendować komórki w 500 μL PBS i 2% FBS.</li>
 <li>Przenieść i przefiltrować zawiesinę komórkową do nowej probówki 5 mL, aby wyeliminować agregaty komórkowe, które mogą zakłócać procedurę sortowania.</li>
 <li>Dodać 5 μL 7-AAD (użyć w rozcieńczeniu 1:100) do zawiesiny komórkowej, aby wykluczyć martwe komórki 7-AAD+ z sortowanych populacji.</li>
 <li>Posortować komórki za pomocą BD FACSAria zgodnie z następującymi fenotypami:
 <ul type="disc">
 <li>komórki LKS: lin- c-Kit+ Sca-1+</li>
 <li>LT-HSCs: LKS CD34-</li>
 <li>ST-HSCs: LKS CD34+</li>
 <li>GMPs: lin- c-Kit+ Sca-1low FcγRhigh CD34+</li>
 <li>MEPs: lin- c-Kit+ Sca-1low FcγRlow CD34-</li>
 <li>CMPs: lin- c-Kit+ Sca-1low FcγRlow CD34+</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia przykład procedury bramkowania elektronicznego w celu wyznaczenia wspólnych progenitorów limfoidalnych (CLPs) jako komórek Lin-/c-Kitlo/interleukiny (IL)-7R+; komórek Lin-/c-Kit+/Sca-1+ (LKS) oraz Lin-/c-Kit+/Sca-1lo (c-Kit+); z bramy c-Kit+ identyfikowane są wspólne progenitory mieloidalne (CMPs) jako komórki FcγRloCD34+, progenitory granulocytów/monocytów (GMPs) jako komórki FcγRhiCD34+ oraz progenitory megakariocytów/erytrocytów (MEPs) jako komórki FcγRloCD34-; z bramy LKS identyfikowane są odpowiednio LT-HSC i ST-HSC jako komórki CD34- oraz CD34+. Tę zawiesinę komórek szpiku kostnego można wzbogacić w komórki c-Kit+ za pomocą kulek magnetycznych (Ryc. 2); następnie LT-HSC i ST-HSC można wyseparować na podstawie ekspresji CD34, a pozostałe progenitory zgodnie z opisanym powyżej fenotypem.
Komórki HSC można analizować za pomocą konfokalnej mikroskopii obrazowania na żywo, jak pokazano na Ryc. 4, gdzie komórki CD34- barwiono związkiem wiążącym nukleotydy – chinakryną11, a także barwnikiem jądrowym red (DRAQ5). W komórkach HSC, ale nie w GMP, w cytoplazmie widoczne są pęcherzyki dodatnie dla chinakryny12. Ponadto posortowane komórki HSC mogą być wykorzystane w eksperymentach funkcjonalnych, co zademonstrowano na ryc. 5, która przedstawia wzrost stężenia cytosolowego Ca2+ w LT-HSC poprzez aktywację purynergicznych receptorów P2 po ekspozycji na adenozynotrifosforan (ATP) i jonomycynę12.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; sortowanie komórek z użyciem markerów SSC-A, FSC-A, Sca-1, c-Kit; analiza hematopoetyczna." src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywna analiza na wykresach kropkowych komórek Lin- z szpiku kostnego. Procedura bramkowania elektronicznego w cytometrze przepływowym w celu identyfikacji i oceny progenitorów hematopoetycznych oraz HSC z zawiesiny komórek szpiku kostnego barwionych zgodnie z opisem w tekście protokołu.
<img alt="Wzbogacanie komórek c-Kit+, schemat, izolacja szpiku kostnego, separacja kuleczkami, wykorzystanie pola magnetycznego." src="/files/ftp_upload/3736/3736fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat selektywnego wzbogacania komórek c-Kit+ z szpiku kostnego.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; fazy cyklu komórkowego G0, G1, S/G2/M; analiza barwienia Ki67 i DAPI." src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza cyklu komórkowego elektronicznie bramkowanych komórek LKS CD34- HSC u zdrowych kontroli oraz u myszy z IBD, barwionych przeciwciałem przeciwko Ki-67 i DAPI. Komórki utrwalono i permeabilizowano za pomocą buforów Lyse/Fix oraz Perm, a następnie barwiono koniugatem Ki-67 z FITC oraz DAPI w stężeniu 1 μg/ml. Komórki w cyklu są ledwo wykrywalne, jeśli w ogóle, w populacji LKS CD34- HSC zdrowych kontroli12.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna HSC i GMP barwionych chinakryną i DRAQ5 do analizy komórek." src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Konfokalna mikroskopia obrazowania na żywo CD34- HSC i GMP wyselekcjonowanych metodą FACS, barwionych związkiem wiążącym nukleotydy – chinakryną oraz czerwonym barwnikiem jądrowym (DRAQ5). Małe kwadranty przedstawiają pęcherzyki dodatnie pod względem chinakryny, wykryte w cytoplazmie HSC, ale nie w GMP.
<img alt="Wykres sygnalizacji wapniowej, odpowiedzi na ATP i ionomycynę, analiza danych fluorescencji." src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wzrost stężenia Ca2+ w cytozolu w posortowanych komórkach HSC obciążonych Fura-2 i stymulowanych ATP oraz ionomycyną. Przedstawiono zapisy z pojedynczych komórek. Wszystkie komórki reagowały na zewnątrzkomórkowe ATP, wykazując wyraźny wzrost poziomu Ca2+ w cytozolu po dodaniu ATP.

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+units+of+development%2C+units+of+regeneration%2C+and+units+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
<li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2%2Fangiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li>
<li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li>
<li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li>
<li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+%28HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157(2007).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine%2Fparacrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts%3A+contribution+of+vesicular+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li>
<li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li>
<li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li>
<li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda umożliwia szybką i dokładną analizę hematopoezy u poszczególnych myszy (Rysunek 1). Analiza ta w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym w mysich modelach stanu zapalnego, autoimmunizacji, immunodeficyjności, chorób degeneracyjnych, zaburzeń metabolicznych i nowotworów, pozwala na zbadanie wpływu stanów patologicznych na hematopoezę. Rysunek 3 przedstawia analizę aktywności cyklu komórkowego w elektronicznie bramkowanych komórkach LKS CD34- p...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>42401</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100X</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Piwczan sodu</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 40 &amp;mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwiący 7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy i fiksacji</td><td>BD Pharmingen</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do permeabilizacji III</td><td>BD Pharmingen</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>BD Pharmingen</td><td>556026</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>150041</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>150081</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>150031</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>150452</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (6D5)</td><td>eBioscience</td><td>150193</td><td></td></tr><tr><td>Gr1 (RB6-8C5) </td><td>eBioscience</td><td>155931</td><td></td></tr><tr><td>Tre119 (TER-119)</td><td>eBioscience</td><td>155921</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1 (PK136)</td><td>eBioscience</td><td>455941</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit (2B8)</td><td>eBioscience</td><td>171171</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1 (D7)</td><td>eBioscience</td><td>135981</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (RAM34)</td><td>eBioscience</td><td>110341</td><td></td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;R (2.4G2)</td><td>eBioscience</td><td>553145</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki przeciw-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Szpik kostny jest głównym miejscem, w którym w organizmie dorosłego osobnika bytują i różnicują się HSC oraz bardziej dojrzałe komórki progenitorowe linii krwiotwórczych. HSC stanowią niewielką populację komórek pluripotencjalnych, zdolnych do generowania wszystkich linii komórek krwi przez całe życie.1Molekularna analiza homeostazy HSC w szpiku kostnym ma istotne znaczenie dla hematopoezy, onkologii oraz medycyny regeneracyjnej. Opisujemy protokół znakowania przeciwciałami fluorescencyjnymi oraz procedurę bramkowania elektronicznego w cytometrii przepływowej w celu oceny podzbiorów progenitorów hematopoetycznych i rozkładu HSC u poszczególnych myszy (Ryc. 1). Ponadto opisujemy metodę rozległego wzbogacania populacji progenitorów krwiotwórczych, a także długoterminowych (LT) i krótkoterminowych (ST) HSC zdolnych do rekonstrukcji, z połączonych zawiesin komórek szpiku kostnego poprzez magnetyczne wzbogacanie komórek wykazujących ekspresję c-Kit. Otrzymany preparat komórkowy może być wykorzystany do sortowania wybranych subpopulacji do badań in vitro oraz in vivo badania funkcjonalne (Ryc. 2).
Zarówno osteoblasty beleczkowe2,3, jak i śródbłonek zatokowy4 tworzą funkcjonalne nisze wspierające HSC w szpiku kostnym. Kilka mechanizmów w niszy osteoblastycznej, w tym podzbiór osteoblastów N-kadheryna+3 oraz oddziaływanie receptora tyrozynowej kinazy Tie2 eksprymowanego w HSC z jego ligandem angiopoetyną-15, współdziała w określaniu stanu spoczynku HSC. „Hibernacja” w szpiku kostnym jest kluczowa dla ochrony HSC przed replikacją i ewentualnym wyczerpaniem w wyniku nadmiernej aktywności cyklicznej6. Bodźce egzogenne działające na komórki wrodzonego układu odpornościowego, takie jak ligandy receptorów Toll-podobnych7 i interferon-α6, mogą również indukować proliferację i różnicowanie HSC w progenitorów zaangażowanych w konkretne linie komórkowe. Niedawno opisano populację uśpionych mysich HSC w obrębie populacji lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34-8. Sortowanie komórek na podstawie ekspresji CD34 z zawiesiny komórkowej wzbogaconej w progenitorów krwiotwórczych, zgodnie z opisem w niniejszej pracy, pozwala na izolację zarówno spoczynkowych, samoodnawiających się LT-HSC, jak i ST-HSCs9. Podobna procedura oparta na usuwaniu komórek linii pozytywnych i sortowaniu LT-HSC za pomocą przeciwciał przeciwko CD48 i Flk2 została opisana wcześniej10. W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół fenotypowej charakterystyki i analizy cyklu komórkowego ex vivo progenitorów krwiotwórczych, który może być użyteczny w monitorowaniu hematopoezy w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Ponadto opisujemy procedurę sortowania FACS dla HSC, która może być wykorzystana do określenia czynników i mechanizmów regulujących ich samoodnawianie, ekspansję i różnicowanie w badaniach z zakresu biologii komórki i transdukcji sygnałów, a także w transplantologii.

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Szpik kostny jest głównym miejscem, w którym w organizmie dorosłym bytują i różnicują się komórki macierzyste krwi (HSC) oraz bardziej dojrzałe komórki progenitorowe poszczególnych linii krwietwórczych. HSC...

Niniejszy film prezentuje protokół izolacji i charakterystyki fenotypowej progenitorów hematopoetycznych z wykorzystaniem separacji opartej na koralikach magnetycznych oraz sortowania komórek metodą FACS. W pierwszej kolejności z myszy wypreparowuje się tylną kończynę, kość udową, piszczel oraz rdzeń kręgowy, a następnie poddaje się je homogenizacji w celu uzyskania zawiesiny komórek szpiku kostnego. Następnie populację tę wzbogaca się o komórki wykazujące ekspresję C kit przy użyciu przepływu magnetycznych mikrokoralików.Analiza cytometryczna wzbogaconej populacji wykazuje, że metoda ta pozwala na uzyskanie wysoko oczyszczonej linii krwiotwórczej, progenitorów oraz hematopoetycznych komórek macierzystych, które mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych in vitro i in vivo. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wypłukiwanie szpiku kostnego, jest możliwość bardziej wydajnego i szybszego odzyskiwania komórek szpiku kostnego. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę stanów zapalnych, autoimmunizacji, niedoborów odporności, chorób degeneracyjnych, zaburzeń metabolicznych oraz immunologicznych modeli nowotworów, pon

phenotypic-analysis-isolation-murine-hematopoietic-stem-cells-lineage

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza fenotypowa i izolacja murzynczych komórek macierzystych układu krwiotwórczego oraz prądków zaangażowanych w różnicowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Poznaj metodę izolacji mysich hematopoetycznych komórek macierzystych z kości szpikowych przy użyciu wzbogacenia magnetycznego c-Kit+ i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką analizę fenotypową progenitorów do badań funkcjonalnych in vitro i in vivo.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Przeglądaj więcej filmów