Name: Metody samodzielnego podawania dożylnego w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj techniki chirurgiczne implantacji cewnika do żyły szyjnej u myszy w badaniach samodzielnego podawania dożylnego. Metoda ta umożliwia niezawodne zbieranie danych dotyczących wzmacniania działania substancji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez Canadian Council of Animal Care oraz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill. Badania te były finansowane ze środków przyznanych KG przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

1. Procedury zakwaterowania i aklimatyzacji zwierząt
<ol>
 <li>Samce i samice myszy CD-1 są trzymane z rówieśnikami tej samej płci, do 5 zwierząt na klatkę, w standardowych plastikowych klatkach z podścieleniem beta chip i wkładami gniazdowymi nestlet, z drucianymi pokrywami umożliwiającymi zamocowanie butelek z wodą i pokarmu. Standardowa karma dla myszy oraz woda są dostępne ad libitum w klatkach macierzystych przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
 <li>Myszy są utrzymywane w odwróconym cyklu światło-ciemność (światło zapalone od 22:00 do 10:00).</li>
 <li>Myszyom pozwolono na aklimatyzację w pomieszczeniach do testów IVSA przez jeden tydzień przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych.</li>
</ol>
2. Trening operacyjny
<ol>
 <li>Wszystkie procedury behawioralne, w tym trening z użyciem słodzonego mleka oraz sesje dożylnej samopodaży leku, są przeprowadzane w komorach operantowych o wymiarach 15,9 x 14 x 12,7 cm, wyposażonych w 2 ultrasensytywne dźwignie dla myszy, kubki z dozownikiem (dipper cups), światła stymulujące oraz pompy strzykawkowe mikro-litrowe (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA). Komory są połączone z komputerem za pomocą interfejsu Med Associates Smart CR oraz oprogramowania Med-PC służącego do programowania schematu wzmocnień i zbierania danych. </li>
 <li>Naiwne myszy są habituowane do komór operantowych i uczone naciskania dźwigni za pomocą nagrody w postaci słodzonego mleka (0,1 ml) podawanego w kubku z dozownikiem. Operantny trening z mlekiem przeprowadzany jest w sesjach trwających 1 h przez 5–7 dni. Wykonanie schematu stałego stosunku (FR) na aktywnej dźwigni skutkowało podaniem kubka z dozownikiem oraz zapaleniem światła stymulującego. Roztwór słodzonego mleka składał się z sacharozy (10 mg/ml, ACS Reagent, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, USA) dodanej do pełnotłustego mleka (zawartość tłuszczu 3,25%). Trening operantny z użyciem roztworu słodzonego mleka lub płynnego pokarmu jako wzmocnienia jest powszechną techniką stosowaną w celu ułatwienia reakcji operantnych u myszy 1,2. </li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu do użytku podczas operacji
Wymagany sprzęt - igły o rozmiarach 20, 23 i 26 G, szlifierka, strzykawki 1 cc, rurki Tygon, lutownica, heparyna, antybiotyki i lek przeciwbólowy.
<ol>
 <li>Przygotować igłę do prowadzenia cewnika do żyły szyjnej poprzez zeszlifowanie igły o rozmiarze 20 gauge. Trzon igły szlifuje się za pomocą szlifierki w celu utworzenia wewnątrz kanału prowadzącego dren cewnika do żyły. Należy dokładnie sprawdzić kanał igły pod kątem obecności ewentualnych osadów metalicznych. Wszelkie zanieczyszczenia blokujące kanał należy usunąć za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami. </li>
 <li>Przygotować dwie strzykawki 1-cc do przemywania i sprawdzania drożności cewnika. Przygotować dwie strzykawki, biorąc kawałki rurek Tygon o długości 12 cm i mocując jeden ich koniec do igieł 26 gauge przymocowanych do strzykawek 1 cc, a pozostałe końce rurek naciągając na igły 23 gauge. Jedną strzykawkę należy napełnić 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a drugą roztworem heparynowanym ticarcilliny (33 mg ticarcilliny i 0,3 mg heparyny na 10 ml sterylnej soli fizjologicznej). </li>
 <li>Przygotować nakładki na kaniulę cewnika. Rurkę Tygon naciąga się na igłę 23 gauge i odcina 1 cm od ścięcia igły. Wolny koniec rurki należy stopić, aby utworzyć grubą uszczelkę. Rurkę należy stopić w taki sposób, aby cała nakładka kaniuli była wystarczająco długa, by zmieścić się na kaniuli cewnika, a zamknięty koniec ściśle przylegał do końca kaniuli. Należy pamiętać, że jeśli nakładka będzie zbyt długa, istnieje ryzyko jej zagięcia, a następnie przebicia podczas nakręcania osłon cewnika. Dlatego zaleca się staranne przygotowanie nakładek cewnika, aby zapewnić ich dobre dopasowanie do kaniuli.</li>
 <li>Przygotować wymagane roztwory. Wszystkie odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA).
 <ol class="lalpha">
 <li> Heparynowany roztwór ticarcilliny do przemywania cewnika – rozpuścić 0,33 g ticarcilliny (soli disodowej) i 0,003 g heparyny w 10 ml sterylnej soli fizjologicznej. Codziennie przez cewnik przepłukuje się 0,03 ml roztworu. Roztwór antybiotyku podaje się w celu zapobiegania powstawaniu zakrzepów krwi i infekcjom. </li>
 <li>Amikacyna (antybiotyk) do iniekcji podskórnej – po zabiegu chirurgicznym podaje się jednorazową dawkę podskórnie w dawce 10 mg/kg, aby zapobiec infekcjom pooperacyjnym. </li>
 <li>Ketoprofen (środek przeciwbólowy) do iniekcji podskórnej – po zabiegu chirurgicznym podaje się jednorazową dawkę podskórnie w dawce 5 mg/kg w celu łagodzenia bólu pooperacyjnego. </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Operacja implantacji cewnika
Wymagany sprzęt i odczynniki: izofluran, jałowa sól fizjologiczna, alkohol (70%), strzykawki 1 i 3 cc wypełnione jałową solą fizjologiczną, przystosowane strzykawki 1 cc, roztwory antybiotyków i leków przeciwbólowych przygotowane w sekcji 3 powyżej, kaniule dla myszy (CamCaths, Cambridgeshire, UK), nakładki na kaniule (crystal caps od HRS Scientific, Montreal, Quebec), smar do oczu, 4 cm plastikowy pręcik do uniesienia żyły (można go wykonać z plastikowego patyczka higienicznego), Polysporin, jałowe gaziki i gaza, pęsety zakrzywione i proste, zaciski naczyniowe, precyzyjne nożyczki. 
<img src="/files/ftp_upload/3739/3739step1.jpg" alt="Układ do sterylizacji; narzędzia chirurgiczne, strzykawki na sterylnym blacie podczas przygotowania do procedury medycznej." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/3739/3739step1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Krok 1">
<ol>
 <li>Stosując standardowe techniki aseptyczne, przed operacją sterylizuje się stół chirurgiczny, instrumenty chirurgiczne oraz cewniki. Odpowiednie techniki sterylizacji obejmują autoklawowanie parowe dla instrumentów chirurgicznych i cewników zakupionych od CamCaths. W przypadku końcówek instrumentów chirurgicznych można zastosować sterylizację koralikami szklanymi. Sterylizację tlenkiem etylenu można zastosować przy bardziej delikatnych cewnikach lub materiałach narażonych na stopienie. Bardziej szczegółowy opis aseptycznych technik chirurgicznych u gryzoni znajduje się w załączonych referencjach 1,2. Przygotowanie stołu, instrumentów i stożka nosowego do znieczulenia utrzymującego przedstawiono na zdjęciu. </li>
 <li>Myszy są znieczulane gazem izofluranem, a znieczulenie jest utrzymywane za pomocą rurki oddechowej w systemie odprowadzania gazów. Do obu oczu aplikuje się lubrykant do oczu (Tears Naturale P.M), aby zapobiec ich wysychaniu podczas procedury. Na grzbiecie zwierzęcia i wokół szyi ogala się odpowiedni margines chirurgiczny. Przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć pola operacyjne zostają odizolowane za pomocą sterylnych obłożenia. </li>
 <li>Aby przygotować cewnik do wprowadzenia do prawego przedsionka serca, nadmiar rurki cewnika odcina się 1,2 cm od balonika cewnika. Jest to optymalna długość ustalona dla dorosłych myszy CD-1 w wieku około 8 tygodni i masie ciała 20-25 g. Długość rurki cewnika może wymagać niewielkiej korekty (metodą prób i błędów) w zależności od szczepu, wielkości i wieku myszy. Przed wprowadzeniem do kanyli cewnika podłącza się strzykawkę zawierającą sterylną sól fizjologiczną (sekcja 3.2), a następnie cewnik jest przepłukiwany i sprawdzany pod kątem nieszczelności. Strzykawkę tę należy pozostawić podłączoną do cewnika przez cały czas trwania procedury chirurgicznej. Będzie ona służyć do przepłukiwania cewnika i pobierania krwi w kroku 4.7. </li>
 <li>Po sterylizacji 70% alkoholem wykonuje się nacięcie międzyshapularne o długości 2 cm, zaczynając od połowy grzbietu i kończąc tuż poniżej szyi, aby pomieścić podstawę cewnika. Tkankę łączną należy rozsunąć pęsetą, aby zrobić miejsce na podstawę cewnika pod skórą. </li>
 <li>Kładąc zwierzę na plecach, po przetarciu obszaru 70% alkoholem, wykonuje się drugie, płytkie, ukośne nacięcie o długości 1-2 cm od prawej obojczyka w górę, w stronę żuchwy zwierzęcia. Żyła szyjna znajduje się powierzchownie pod skórą szyi. W ramach przygotowania do wprowadzenia cewnika, rurkę z podstawy cewnika przeciąga się przez nacięcie na grzbiecie i doprowadza w pobliże żyły szyjnej, przeprowadzając rurkę pod skórą tuż nad prawym barkiem. Koniec rurki cewnika zostaje następnie przymocowany do zacisku tętniczego i umieszczony z boku zwierzęcia, aby go ustabilizować. </li>
 <li>Prawą żyłę szyjną lokalizuje się, delikatnie odsuwając powierzchowną tkankę łączną i tłuszczową z nacięcia wokół szyi zwierzęcia. Tkankę łączną wokół żyły rozdziela się za pomocą zakrzywionej pęsety, a następnie żyłę unosi się za pomocą sterylnego plastikowego pręta. Wokół każdego końca żyły zawiązuje się luźne węzły chirurgiczne, a rurkę cewnika przeciąga się przez górny węzeł, zapętlając ją nad nicią szwy, tak aby spoczywała niezacisnięta nad prawym barkiem.</li>
 <li>Przed wprowadzeniem należy zwilżyć zarówno igłę wprowadzającą 20G, jak i żyłę sterylną solą fizjologiczną w celu zmniejszenia tarcia. Igłę trzyma się równolegle do żyły i wprowadza delikatnie w pobliżu dolnej części uniesionej żyły (Uwaga: do żyły musi wejść około 0,5 cm czubka igły). Za pomocą pęsety przesuwa się rurkę cewnika wzdłuż trzonu igły do wnętrza żyły. Opór wskazywałby na to, że rurka znajduje się w tkance łącznej, a nie w żyle. Przez żyłę wtłacza się 0,03 cc soli fizjologicznej, aby upewnić się, że nie ma nieszczelności. Nieszczelności mogą świadczyć o tym, że żyła została przebita lub że położenie rurki cewnika wymaga korekty. 
 Uwaga: Aby sprawdzić, czy rurka znajduje się w żyle, należy spróbować pobrać trochę krwi za pomocą podłączonej strzykawki z solą fizjologiczną. Jeśli krwi nie można pobrać natychmiast, ścianą żyły lub serca może być zablokowany czubek cewnika lub żyła nie została przebita; należy skorygować położenie rurki i spróbować ponownie. Jeśli nadal nie można pobrać krwi, konieczne może być ponowne wprowadzenie igły. </li>
 <li>Aby utrwalić cewnik na miejscu, należy dosunąć balonik cewnika do punktu wprowadzenia i usunąć igłę. Zawiązuje się dolny węzeł, a następnie przyciąga cewnik ściśle do pręta przed zawiązaniem drugiego węzła bezpośrednio nad balonikiem. Ponownie sprawdza się, czy można pobrać krew i w razie potrzeby nieco poluzowuje węzły. Rurkę cewnika chowa się pod skórą i zszywa nacięcie brzuszne wokół szyi zwierzęcia. Do zamkniętego nacięcia aplikuje się Polysporin Heal Fast za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem lub inną maść antybiotykową, najlepiej zawierającą środek przeciwbólowy. </li>
 <li>Kładąc zwierzę na brzuchu, umieszcza się podstawę cewnika pod skórą grzbietu w przygotowanym nacięciu. Należy upewnić się, że nadmiar rurki tworzy minimalną pętlę i jest dobrze ukryty pod podstawą cewnika, aby zminimalizować ryzyko pogryzienia i przebicia go przez zwierzę. Zszywa się nacięcie po obu stronach podstawy cewnika i aplikuje Polysporin Heal Fast za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem.</li>
 <li>Cewnik przepłukuje się 0,03 cc heparynowanego roztworu ticarcilliny za pomocą strzykawki z przymocowaną rurką (sekcja 3.2). Kanulę zamyka się plastikowym kapturkiem, a następnie nakręca białą osłonę cewnika. U niektórych myszy bezpośrednio po operacji krew może wyciekać z cewnika przed założeniem kapturka na kanulę. Ważne jest ponowne przepłukanie zwierzęcia i szybkie założenie kapturka na kanulę, zanim krew zdąży wypłynąć. Zwierzęta muszą być przepłukiwane codziennie w celu utrzymania drożności cewnika. </li>
 <li>Po przetarciu miejsca iniekcji między tylnymi nogami zwierzęcia 70% etanolem, podskórnie wstrzykuje się przeciwbólowy ketoprofen w dawce 5 mg/kg po jednej stronie oraz antybiotyk amikacynę w dawce 10 mg/kg po drugiej stronie.</li>
 <li>Po zaprzestaniu znieczulenia zwierzęta pozostawia się do rekonwalescencji w czystej klatce z łatwym dostępem do jedzenia i wody przez 5 do 7 dni. Myszy powinny być przetrzymane przez noc w ogrzewanej szafce, aby zapobiec pooperacyjnej hipotermii. </li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3739/3739step2.jpg" alt="Schemat wprowadzenia cewnika; kroki dostępu żylnego, przygotowanie igły i strzykawki." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3739/3739step2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Krok 2">
5. Badania behawioralne – dożylna samopodaż
<ol>
 <li>Przed testami behawioralnymi cewniki są przemywane 0,9% sterylną solą fizjologiczną. Następnie myszy są umieszczane w komorach operantowych i podłączane do linii infuzyjnych oraz pomp infuzyjnych. Naciśnięcia dźwigni aktywnej skutkują 3,2 s infuzją 18 μl leku połączoną z zapaleniem światła stymulującego. Po każdym naciśnięciu dźwigni następuje 8 s przerwy (time out), podczas której światło stymulujące pozostaje zapalone.</li>
 <li>Po sesji operantowej cewniki myszy są przemywane roztworem heparynowanej ticarcilliny przed powrotem zwierząt do klatek domowych.</li>
 <li>Myszyom umożliwia się samopodawanie leku podczas 3 kolejnych 2-godzinnych sesji dla każdej dawki. Dawki były podawane w losowej kolejności dla każdej myszy, zgodnie z opisem w następnej sekcji.</li>
 <li>Drożność cewników jest oceniana codziennie poprzez upewnienie się, że zarówno sól fizjologiczna, jak i roztwór antybiotyku mogą zostać przepłukane przez cewnik. Dodatkowo można przeprowadzić test z ketaminą/midazolamem, zgodnie z opisem w załączonej referencji 5. W skrócie, objawy anestezji, takie jak unieruchomienie w ciągu 5 s od infuzji 0,02-0,03 ml ketaminy (15 mg/ml) lub midazolamu (0,75 mg/ml), stanowią dowód drożności cewnika 5.</li>
</ol>

<ol><li>Rocha, B. A., Ator, R., Emmett-Oglesby, M. W., Hen, R. Intravenous Cocaine Self-Administration in Mice Lacking 5-HT1B Receptors. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 57 (3), 407-412 (1997).</li>
<li>Zapata, A., Chefer, V. I., Ator, R., Shippenberg, T. S., Rocha, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+sensitization+and+enhanced+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+after+intravenous+cocaine+self-administration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Behavioural sensitization and enhanced dopamine response in the nucleus accumbens after intravenous cocaine self-administration in mice.</a> European Journal of Neuroscience. 17 (3), 590-596 (2003).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoogstraten-Miller%2C+SL+%22Techniques+in+Aseptic+Rodent+Surgery+Current+Protocols+in+Immunology%22">Techniques in Aseptic Rodent Surgery Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 1.12-1.14 (2001).</li>
<li>Thomsen, M., Caine, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Intravenous+Drug+Self-Administration+in+Rats+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience.+%22%5BJournal%5D)">Chronic Intravenous Drug Self-Administration in Rats and Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. . 9, 20.1-20.40 (2005).</li>
<li>Gill, K. J., Boyle, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+quantitative+trait+loci+for+cocaine+induced+activation+in+the+AcB%2FBcA+series+of+recombinant+congenic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenetics%22%5BJournal%5D)">Confirmation of quantitative trait loci for cocaine induced activation in the AcB/BcA series of recombinant congenic strains.</a> Pharmacogenetics. 13, 329-338 (2003).</li>
<li>Gill, K. J., Boyle, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influences+on+drug-induced+psychomotor+activation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Genetic influences on drug-induced psychomotor activation in mice.</a> Genes, Brain & Behavior. 7, 859-868 (2008).</li>
<li>Boyle, A. E., Gill, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+AXB%2FBXA+recombinant+inbred+lines+of+mice+to+the+locomotor+activating+effects+of+cocaine%3A+A+QTL+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenetics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of AXB/BXA recombinant inbred lines of mice to the locomotor activating effects of cocaine: A QTL analysis.</a> Pharmacogenetics. 11 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Boyle, A. E., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+verification+of+previously+identified+QTLs+for+cocaine-induced+activation+using+a+panel+of+B6.A+chromosome+substitution+strains+%28CSS%29+and+A%2FJxC57Bl%2F6J+F2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">A verification of previously identified QTLs for cocaine-induced activation using a panel of B6.A chromosome substitution strains (CSS) and A/JxC57Bl/6J F2 mice.</a> Psychopharmacology. 207 (2), 325-3234 (2009).</li>
<li>Thomsen, M., Caine, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychomotor+stimulant+effects+of+cocaine+in+rats+and+15+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Psychomotor stimulant effects of cocaine in rats and 15 mouse strains.</a> Experimental and Clinical Psychopharmacology. 19 (5), 321-341 (2011).</li>
<li>Thomsen, M., Caine, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+drug+self-administration+in+mice%3A+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Behavior+genetics%22%5BJournal%5D)">Intravenous drug self-administration in mice: practical considerations.</a> Behavior genetics. 37 (1), 101-118 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Modele zwierzęce nadużywania narkotyków są szczególnie użyteczne w zrozumieniu podłoża genetycznego zachowań związanych z przyjmowaniem substancji psychoaktywnych. Na przykład myszy o różnych profilach genetycznych wykazują dziedziczne różnice w wrażliwości na kokainę 6-8, co pomaga w identyfikacji potencjalnych genów kandydackich pośredniczących w obserwowalnej zmienności fenotypowej 9. Procedury kaniulacji dożylnej opisane w niniejszej pracy były z dużym sukcesem stosowane do badania IVSA leków u różnych szczepów myszy, a także u myszy o różnym tle genetycznym 10.
Procedury przedstawione w tym filmie podkreślają ważne aspekty, na których należy się skoncentrować podczas i po zabiegu kaniulacji, aby uzyskać wiarygodne dane dotyczące dożylnej autopodaży (IVSA). Po pierwsze, kluczowe jest odpowiednie umieszczenie cewnika w prawym przedsionku, aby zapobiec niedrożności cewnika spowodowanej skrzepami krwi. Podczas operacji należy upewnić się, że koniec cewnika nie jest przeszkodzony ani zablokowany przez tkankę serca lub żyły. Po drugie, wymagane jest codzienne przemywanie cewnika zarówno przed, jak i po sesjach operacyjnych, aby zapobiec powstaniu zatorów. Wreszcie, gdy zwierzęta znajdują się w klatkach domowych, kaniula musi być stale zabezpieczona zarówno za pomocą nasadek kaniuli, jak i osłon krystalicznych, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń. Drobne zatory w kaniuli można usunąć za pomocą cienkiej igły o rozmiarze 26 G, jednak wymagane jest codzienne przemywanie roztworem antybiotyku z heparyną, szczególnie w dniach, w których zwierzęta nie są poddawane testom IVSA.
Do przeprowadzenia operacji przeżycia u zwierząt niezbędna jest dobra znajomość technik aseptycznych, analgezji i anestezji. Chociaż niniejszy film nie zastępuje właściwego szkolenia chirurgicznego, może służyć jako przewodnik dla badaczy pragnących opanować techniki niezbędne dla tego paradygmatu.

<table><tbody><tr><td>Sól disodowa tikarcyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5639-1G</td><td>butelka 1 gram</td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M (Smar do oczu)</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>tubka 3,5 gram&lt;br/&gt; Ten smar do oczu można znaleźć w większości aptek. Można zastosować dowolny okulistyczny smar do oczu.</td></tr><tr><td>Kokaina</td><td>Medisca Pharmaceutique</td><td>0723-06</td><td>butelka 1 gram</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Medisca Pharmaceutique</td><td>1754-04</td><td>butelka 25 gram</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Medisca Pharmaceutique</td><td>2519-06</td><td>butelka 1 gram</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>butelka 250 gram</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1751-1G</td><td>butelka 1 gram</td></tr><tr><td>Sól siarczanu amikacyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2324-5G</td><td>butelka 5 gram</td></tr><tr><td>Sacharoza, odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016-500G</td><td>butelka 500 gram</td></tr><tr><td>Standardowe kaniule dla myszy z miękką siatką</td><td>CamCaths</td><td>MIVSA/20/26/BC-1S</td><td>Specyfikacja rurek: 26SWG;0,451;0,254</td></tr><tr><td>Aplikator nakładek Crystal cap</td><td>HRS Scientific</td><td>313CAC</td><td>Jest to biała nakładka na kaniulę.</td></tr><tr><td>Rurki Tygon Micro Bore</td><td>Thomas Scientific</td><td>9561S41</td><td>Specyfikacja rurek (średnica wewnętrzna x zewnętrzna x grubość ścianki w calach): .01 x .03 x .01 </td></tr></tbody></table>

metody dożylnej samopodaży w modelu mysim

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Opracowano modele zwierzęce do badania efektów wzmacniających działania leków, w tym paradygmat dożylnej samopodaży (IVSA). Zalety wykorzystania paradygmatu IVSA do badania właściwości wzmacniających substancji nadużywanych, takich jak kokaina, obejmują fakt, że lek jest podawany samodzielnie przez zwierzę, a nie przez eksperymentatora, możliwość modyfikacji schematu wzmacniania oraz możliwość dokładnego pomiaru ilości spożytego leku, a także czasu i wzorca wstrzykiwań dożylnych. Ponadto dożylna droga podania pozwala uniknąć potencjalnych czynników zakłócających związanych z efektem pierwszego przejścia lub smakiem, a także powoduje szybki wzrost stężenia leku we krwi i mózgu. Jak przedstawiono w tym filmie, dożylną samopodaż można uzyskać bez uprzedniego ograniczenia pokarmowego lub wcześniejszego treningu z lekiem, pod warunkiem starannego umieszczenia cewnika podczas operacji oraz skrupulatnego codziennego płukania i konserwacji cewnika. Procedury eksperymentalne opisane w niniejszej pracy obejmują opis metod utrzymania i aklimatyzacji zwierząt, trening operacyjny z użyciem roztworów słodzonego mleka oraz operację implantacji cewnika.

<img src="/files/ftp_upload/3739/3739fig1.jpg" alt="Dawka kokainy w stosunku do infuzji i spożycia; wykres liniowy; dane z analizy zależności dawka-odpowiedź." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wzorce reakcji w przypadku dożylnej samopodaży leku będą różnić się w zależności od rodzaju leku, zakresu dawek oraz zastosowanej szczepu myszy. Przedstawiony rysunek ukazuje dane dotyczące samopodaży kokainy po pomyślnym przeprowadzeniu zabiegu kaniulacji zgodnie z procedurą opisaną w filmie. Na rysunku przedstawiono średnią liczbę (±SEM) uzyskanych infuzji kokainy oraz średnie spożycie kokainy (mg/kg masy ciała, ±SEM) dla czterech dawek kokainy podawanych w losowej kolejności w schemacie wzmocnienia FR1. Oś abscys: dawka samopodanego leku na jedną infuzję. Oś rzędnych lewa: całkowita liczba uzyskanych infuzji podczas 2-godzinnej sesji operantowej. Oś rzędnych prawa: całkowite spożycie kokainy w mg/kg podczas 2-godzinnej sesji testowej. Wszystkie 13 kaniul pozostało drożnych przez cały czas trwania badania (4 tygodnie). Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) przeprowadzona dla dawek wykazała, że myszy podawały kokainę w sposób zależny od dawki [F (1,12) = 42.8, p&lt;0.05]. Odnotowano wzrost spożycia kokainy na krzywej dawka-odpowiedź [F (3,36) = 29.6, p&lt;0.05], pomimo spadku częstotliwości naciskania dźwigni przy wyższych dawkach. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 3 sesji testowych dla każdej dawki kokainy (±SEM), zebranych u myszy CD-1 (n=13 na dawkę, samce i samice łącznie). Porównania reakcji na dźwignię aktywną (wzmocnioną lekiem) i nieaktywną na całej krzywej dawka-odpowiedź przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA, aby upewnić się, że myszy rozróżniają obie dźwignie. W przypadku myszy CD1 analiza wykazała preferencję dla dźwigni aktywnej [F (1,12) = 10.255, p&lt;0.05] w całym zakresie krzywej dawka-odpowiedź (dane nie zostały tutaj przedstawione).

Paradygmat dożylnej samopodaży (IVSA) jest uważany za złoty standard w badaniu właściwości wzmacniających substancji psychoaktywnych u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne i techniki chirurgiczne niezbędne do uzyskania wiarygodnych danych IVSA. W szczególności podkreślono znaczenie starannego implantowania i utrzymywania cewników.

Metody dożylnej samopodaży w modelu mysim

Opracowano modele zwierzęce do badania efektów wzmacniających działania leków, w tym paradygmat dożylnej samopodaży (IVSA). Zalety...

Witajcie, nazywam się Elizabeth Kotick i reprezentuję laboratorium dr Katherine Gill w jednostce uzależnień McGill University Health Center. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić zabieg cewnikowania niezbędny do prowadzenia badań nad dożylną samopodażą. Zaprezentuję sposób wprowadzania cewnika oraz podzielę się wskazówkami dotyczącymi utrzymania jego drożności.Podczas sesji dożylnej samopodaży nikotyny zwierzęta są podłączone do systemu Tai za pomocą plastikowych przewodów, a infuzje nikotyny są podawane przez dołączone pompy infuzyjne. Komory operacyjne zostały zakupione od firmy Med Associates. Każda komora jest wyposażona w dwie ultrasensytywne dźwignie dla myszy.Przed zabiegiem chirurgicznym należy przygotować kilka elementów, aby umożliwić wprowadzenie cewnika do żyły. Należy przystosować igłę o rozmiarze 20 G, tak aby można było przesunąć rurkę cewnika w dół do wnętrza żyły. Należy zeszlifować około dwóch centymetrów górnej części trzonu igły, tworząc kanał, który posłuży do poprowadzenia rurki cewnika do żyły.Następnie należy przygotować strzykawki do płukania i sprawdzania cewnika. Odcinek rurki o długości 12 centymetrów jest przymocowany jednym końcem do igły 26G strzykawki, natomiast drugi koniec jest naciągnięty na igłę 23G. Aby ułatwić przymocowanie rurki do kaniuli cewnika, będą potrzebne dwie takie strzykawki – jedna wypełniona roztworem T carcin z heparyną, a druga solą fizjologiczną.Na koniec należy przygotować nasadkę do kaniuli cewnika. Kaniulę cewnika należy zabezpieczyć nasadką, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń. Nasadki te wykonuje się poprzez naciągnięcie plastikowej rurki na igły o rozmiarze 23 gauge.Przewód odcina się jeden centymetr od końcówki igły, a otwarty koniec zostaje stopiony w celu uszczelnienia. Przez igłę przepycha się sól fizjologiczną, aby upewnić się, że w zaślepkach nie ma nieszczelności. Cewniki mysie zostały zakupione w firmie Cam Cs w Wielkiej Brytanii. Odcina się nadmiar przewodu z cewnika tak, aby pozostało 1,2 centymetra od końca balonika cewnika.Następnie podłącz strzykawkę z solą fizjologiczną do zewnętrznej metalowej kaniuli cewnika i przemyj układ, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Myszy są znieczulane gazem izofluranowym zmieszanym z tlenem i pozostają pod wpływem znieczulenia przez cały czas trwania operacji. Za pomocą rurki intubacyjnej poziomy tlenu i izofluranu są ustawiane na podstawie masy ciała zwierzęcia i dostosowywane w razie potrzeby w trakcie zabiegu; upewnij się, że zwierzę jest prawidłowo znieczulone, uciskając tylne łapy pęsetą, oraz monitoruj mysz przez cały czas trwania operacji pod kątem niewydolności oddechowej i głębokości znieczulenia.Ponieważ operacja trwa od 20 do 30 minut, należy zastosować lubrykant do oczu w obu oczach. Myszy goli się przed operacją. Przygotowuje się miejsce na podstawę cewnika na grzbiecie zwierzęcia.Delikatnie unieś skórę na grzbiecie zwierzęcia i wykonaj niewielkie podłużne nacięcie w okolicy środkowej łopatki o długości około dwóch centymetrów. Nacięcie powinno rozpoczynać się w połowie grzbietu i sięgać do miejsca tuż poniżej szyi. Rozsuń tkankę łączną, aby zrobić miejsce na podstawę cewnika, a następnie przemyj nacięcie solą fizjologiczną.Delikatnie zbliż do siebie brzegi skóry w miejscu nacięcia i odwróć zwierzę. Prawa żyła szyjna powierzchowna znajduje się płytko pod skórą szyi i można ją odsłonić, wykonując płytkie nacięcie. Wykonaj cięcie ukośne o długości około jednego do dwóch centymetrów, rozciągające się od okolic prawej obojczyka w kierunku żuchwy zwierzęcia.Przewód z podstawy cewnika należy przeprowadzić przez nacięcie brzuszne w okolicy szyi, aby umożliwić jego wprowadzenie do żyły. Przesuń pęsetę pod skórą w okolicy barków i przebij tkankę łączną. Aby dotrzeć do nacięcia na grzbiecie, przeciągnij przewód przez skórę do otworu brzusznego wokół szyi zwierzęcia.Zaciśnij koniec rurki kleszczykami naczyniowymi i pozostaw ją zaciśniętą po prawej stronie zwierzęcia. Przemyj nacięcie solą fizjologiczną, a następnie wyizoluj prawą żyłę szyjną. Bardzo delikatnie usuń każdą tkankę łączną i tłuszczową, która może zasłaniać pole widzenia, i zlokalizuj żyłę.Delikatnie unieś żyłę w górnej części i za pomocą zakrzywionej pincety oddziel tkankę tłuszczową oraz tkankę łączną wokół i pod żyłą. Umieść zakrzywioną pincetę pod żyłą i otwórz ją wolną ręką. Przesuń pod żyłą sterylny plastikowy pręt.Po uniesieniu żyły usuń tyle tkanki tłuszczowej, aby uzyskać wyraźny, niezakłócony widok na naczynie. Okresowo zakraplaj sól fizjologiczną na odsłoniętą żyłę, aby utrzymać jej wilgotność. Przygotuj węzły szewskie wokół żyły, aby móc przymocować cewnik po jego wprowadzeniu do miejsca w okolicy żyły szyjnej.Nałóż szwy pod żyłą na obu końcach i zawiąż na każdym z nich pojedynczy, bardzo luźny węzeł otwarty. Przeciągnij cewnik przez górny węzeł i zapętl go wokół nici chirurgicznej, przekładając resztę przez prawe ramię. Przetłocz sól fizjologiczną przez cewnik, aby dociążyć rurkę, i wprowadź ją do żyły szyjnej.Modyfikowaną igłę o rozmiarze 20G stosuje się do nakłucia żyły; należy zwilżyć zarówno żyłę, jak i igłę solą fizjologiczną, aby zmniejszyć tarcie podczas wprowadzania, a następnie delikatnie odciągnąć plastikową listwę i wprowadzić igłę bliżej dolnej części żyły. Należy to zrobić w stopniu wystarczającym, aby wewnątrz znalazło się pół centymetra igły. Następnie należy nasunąć cewnik wzdłuż igły i wprowadzić go do żyły.Nie powinno być wyczuwalnego oporu. Opór wskazywałby na obecność w tkance łącznej. Aby upewnić się, że cewnik znajduje się w żyle, należy spróbować odciągnąć tłok strzykawki, aby sprawdzić, czy możliwe jest pobranie krwi.Po umieszczeniu rurek należy usunąć igłę i przesunąć balonik cewnika do miejsca wprowadzenia. Zawiązać dolny węzeł i upewnić się, że rurka cewnika przylega ściśle do pręta, a następnie zawiązać drugi węzeł bezpośrednio nad balonikiem. Pozwoli to na stabilne unieruchomienie cewnika.Usuń poprzeczkę i zawiąż drugi węzeł na każdym końcu. Przed zszyciem wprowadź cewnik oraz nici chirurgiczne pod skórę. Użyj klemy tętniczej, aby przeprowadzić igłę przez skórę i zamknąć nacięcie.Liczba szwów będzie różnić się w zależności od wielkości nacięcia. Przy zwierzęciu leżącym na brzuchu umieść podstawę cewnika na grzbiecie zwierzęcia. Nanieś sól fizjologiczną na nacięcie i wsuń podstawę cewnika pod skórę.Należy upewnić się, że dren tworzy minimalną pętlę i znajduje się pod podstawą, aby zminimalizować ryzyko jego przebicia. Przyszyć skórę wokół podstawy cewnika. Liczba szwów będzie zależeć od wielkości nacięcia.Zazwyczaj wystarczające jest wykonanie od trzech do czterech szwów. Należy upewnić się, że z cewnika nadal można pobrać krew. Na koniec należy przemyć cewnik roztworem heparyny, aby zapobiec infekcji oraz tworzeniu się skrzepów krwi.Poluzuj rurkę podłączoną do kaniuli cewnika. Następnie zdejmij rurkę z solą fizjologiczną i szybko zastąp ją rurką z anastylą zawierającą zheparynowany roztwór T Carin. Przepłucz cewnik od 0,03 do 0,05 ccs roztworu.Ponownie poluzuj rurkę podłączoną do kaniuli. Chwyć nasadkę cewnika pęsetą i jednym szybkim ruchem zdejmij rurkę z kaniuli, zastępując ją nasadką cewnika. Krok ten należy wykonać szybko, aby zapobiec cofaniu się krwi.Nakręć białą osłonę cewnika, upewniając się, że osłona jest stabilna i nie przebija końcówki kaniuli. Podaj myszy podskórne zastrzyki z lekiem przeciwbólowym i antybiotykiem. Wstrzyknij lek przeciwbólowy ketoprofen po jednej stronie w dawce 5 mg/kg oraz antybiotyk amikacyna po drugiej stronie w dawce 10 mg/kg.Po przerwaniu znieczulenia należy pozwolić myszy na dojście do siebie w czystej klatce z łatwym dostępem do pożywienia i wody. Wiarygodne dane dotyczące dożylnego samozapodawania można uzyskać, stosując techniki przedstawione w tym filmie. Ważne jest jednak utrzymanie drożności cewnika.Osiąga się to poprzez staranne wprowadzenie cewnika do prawego przedsionka, codzienne płukanie cewnika przed i po sesjach operacyjnych oraz dbanie o to, aby kaniula cewnika była stale zakapturkowana w celu zapobiegania przedostawaniu się zanieczyszczeń.

methods-for-intravenous-self-administration-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody samodzielnego podawania dożylnego w modelu na myszach

Gruntowne testy przedkliniczne leków działających w ośrodkowym układzie nerwowym często obejmują ocenę i porównanie biodystrybucji leku w zależności od konkretnych dróg podania. W niniejszym materiale zaprezentowano na myszach trzy powszechnie stosowane metody podania ogólnoustrojowego (dożylne, dosytnieniowe oraz doustne), a także metodę podania miejscowego (podanie wspomagane konwekcją).

Systemiczne i miejscowe dostarczanie leków w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego w modelach gryzoni

Bezpieczna i humanitarna praca z gryzoniami laboratoryjnymi wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod chwytania i unieruchamiania. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z myszami i szczurami oraz efektywnego podawania im związków chemicznych.

Manualne unieruchamianie i powszechne drogi podawania związków u myszy i szczurów

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

W tym filmie opisujemy metodę wszczepienia cewnika do żyły szyjnej modelu myszy, przez który eksperymentalne środki, takie jak leki i barwniki znacznikowe, mogą być dostarczane dożylnie in vivo. Taki układ po połączeniu z innymi systemami może być również wykorzystywany do monitorowania hemodynamiki i pobierania krwi.

Dożylne wstrzykiwanie środków eksperymentalnych za pomocą cewnika: technika dostarczania środków eksperymentalnych dożylnie przez żyłę szyjną w modelu mysim

Źródło: Kanazawa, T., et al. Nowatorskie metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje donosowe podawanie leków znakowanych radioaktywnie znieczulonej myszy w celu uzyskania dostarczania leku z nosa do mózgu. Wyjaśnia, w jaki sposób leki przenikają przez nabłonek nosa i przemieszczają się szlakami neuronalnymi, aby dotrzeć do mózgu, a także w jaki sposób ruch rzęsek wpływa na zatrzymywanie i usuwanie...

Donosowe podawanie leku myszom za pomocą pipety i odwrotnej kaniulacji w celu dostarczania leku z nosa do mózgu

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Ten protokół krok po kroku przeprowadza wielokrotne dożylne podawanie dawki bolusa i inwazyjne monitorowanie hemodynamiczne u myszy. Badacze mogą wykorzystać ten protokół do przyszłych badań przesiewowych związków terapeutycznych w kierunku nadciśnienia tętniczego płucnego.

Wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa i inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu nadciśnienia tętniczego płucnej myszy wywołanego niedotlenieniem

Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Samopodawanie leku oraz wokalizacje ultradźwiękowe (USV) są wykorzystywane jako oceny behawioralne w badaniach na zwierzętach, lecz rzadko w połączeniu. Celem niniejszego artykułu jest opisanie zalet rejestrowania USV podczas procedur samopodawania leków w celu oceny odpowiedzi afektywnych na doświadczenie związane z przyjmowaniem substancji.

Ocena wokalizacji ultradźwiękowych podczas samopodawania leku u szczurów

Poznaj techniki chirurgiczne implantacji cewnika do żyły szyjnej u myszy w badaniach samodzielnego podawania dożylnego. Metoda ta umożliwia niezawodne zbieranie danych dotyczących wzmacniania działania substancji.

Metody dożylnej samopodaży w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów