Name: Perfuzja wsteczna i wypełnienie naczyń wieńcowych myszy jako przygotowanie do obrazowania mikrotomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Naucz się perfuzji wstecznej i wypełniania naczyń wieńcowych myszy radiopacznym barwnikiem w celu przygotowania próbek do mikrotomografii komputerowej. Ta technika umożliwia szczegółowe wizualizowanie struktur naczyniowych w badaniach kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Kelly Stevens za przeprowadzenie wstępnych prób protokołu, dr. Michaelowi Simonsowi, dr. Kipowi Hauchowi oraz członkom obu ich laboratoriów za ogólne dyskusje.
Praca ta była wspierana przez granty NIH HL087513 oraz P01 HL094374.

1. Przygotowania przed rozpoczęciem
<ol> 
 <li>Napełnij każdą stronę aparatu do perfuzji ciśnieniowej odpowiednio buforem rozszerzającym naczynia (4mg/L papaweryny + 1g/L adenozy w PBS) lub 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS.</li>
 <li>Przygotuj strzykawkę insulinową o pojemności 1/2cc (z na stałe przymocowaną igłą 29G ½"), napełniając ją 0,1 ml heparyny w stężeniu 1:100 (roztwór stokowy 5000U/ml) i zginając igłę pod kątem ok. 120 stopni, tak aby ścięcie było skierowane do góry. Postąp analogicznie ze strzykawką 1 ml (z igłą 26G ½") napełnioną 0,3 ml nasyconego roztworu KCl.</li>
</ol>
2. Odsłonięcie serca i kaniulacja aorty
<ol>
 <li>Zanurzyć mysz w narkozie, stosując wybrany środek anestetyczny. (Stosujemy przedawkowną mieszaninę Ketaminy/Xylazyny: wtryskiwanie IP 130 mg/kg Ketaminy i 8,8 mg/kg Xylazyny w roztworze soli fizjologicznej).</li>
 <li>Przypiąć zanarkotyzowaną mysz do tacki sekcyjnej stroną brzuszna do góry. Otworzyć jamę brzuszną wykonując nacięcie w linii środkowej i odsunąć skórę, aby odsłonić organy. Przesunąć jelita na bok, aby odsłonić odcinek tylnej żyły głównej (PVC).</li>
 <li>Wstrzyknąć roztwór Heparyny do PVC. Podczas wyciągania igły przykryć otwór po igle aplikatorem z bawełnianym końcem, aby zapobiec wyciekowi, i przytrzymać przez kilka sekund, aż ściana PVC zakrzepnie i zamknie się. Odczekać 2-3 minuty, aż Heparyna rozprowadzi się w krwiobiegu myszy.</li>
 <li>Wypreparować przeponę i klatkę piersiową, aby móc obserwować bijące serce. Powoli wstrzykiwać roztwór KCl do PVC, aż do zatrzymania akcji serca.</li>
 <li>Usunąć wszystkie organy poniżej przepony i wyciąć tylną część ciała myszy, pozostawiając nienaruszony obszar przed przeponą. Usunąć przeponę, uważając, aby przeciąć PVC w pobliżu przepony, tak aby odcinek proksymalny względem serca był łatwy do zlokalizowania w kolejnych krokach.</li>
 <li>Zlokalizować przecięty koniec aorty. Umieścić jeden długi odcinek plecionej nici jedwabnej 6-0 pod aortą, kilka milimetrów przed przeciętym końcem, w taki sposób, aby nić była zagięta z powrotem. Przeciąć tę dłuższą nić na pół, tak aby pod aortą znalazły się dwa odcinki nici. Wprowadzić cewnik angiograficzny do przeciętego końca aorty (Rys. 1A, B) i zawiązać każdą nić podwójnym węzłem, aby utrzymać cewnik na miejscu i zapobiec wyciekowi wynikającemu z przeciwciśnienia w obrębie aorty.</li>
</ol>
3. Perfuzja i wstrzykiwanie Microfil
<ol>
 <li>Podłącz kaniulę do aparatury do perfuzji ciśnieniowej (Rys. 2) i rozpocznij perfuzję naczyń buforem rozszerzającym naczynia (Rys. 1C), pompując aparat perfuzyjny do ciśnienia napędowego 100-110 mmHg. Upewnij się ponownie, że bufor przepływa przez tętnice wieńcowe, sprawdzając, czy ciecz wypływa z PVC. Kontynuuj perfuzję przez co najmniej 3 minuty lub do momentu, gdy ciecz wypływająca z PVC stanie się przejrzysta. (Przejdź do kolejnych kroków podczas trwającej perfuzji).</li>
 <li>Przeprowadź dyssekcję żeber i odchyl (lub usuń) klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Po odsłonięciu uważaj, aby serce nie wyschło, wyciskając krople buforu na organ z nasączonego buforem kawałka gazy. Usuń grasicę, aby odsłonić łuk aorty. Podwiąż trzy główne odgałęzienia aorty za pomocą plecionej nici jedwabnej 6-0, aby zapewnić przekierowanie cieczy przez tętnice wieńcowe, a nie przez te większe naczynia o niskiej oporności (Rys. 1D).</li>
 <li>Perfuduj serce utrwalaczem przez 15 minut, a następnie przepłucz buforem rozszerzającym naczynia przez co najmniej 2 minuty. W międzyczasie podwiąż obie przednie żyły główne, aby zapobiec wyciekowi Microfil z serca po wstrzyknięciu (Rys. 1E). Załóż szwy wokół PVC i aorty, ale nie zaciśnij ich aż do zakończenia napełniania.</li>
 <li>Przygotuj Microfil (zgodnie z tabelą odczynników) i nabierz go do strzykawki 1 ml. Napełnij kuwetę do dyssekcji wystarczającą ilością wody, aby zakryć kaniulę (aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza podczas zmiany rurki perfuzyjnej na strzykawkę z Microfil). Odłącz aparaturę do perfuzji od kaniuli i podłącz przygotowaną strzykawkę z Microfil.</li>
 <li>Wstrzyknij Microfil do aorty, aż widoczne będzie prawidłowe wypełnienie tętnic wieńcowych (Rys. 1F, 3A): najpierw wypełnią się tętnice, a następnie Microfil „przeleje się” do naczyń kapilarnych, a tkanka nabierze barwy Microfil. Po przejściu na stronę żylną hydrofobowa natura Microfil sprawia, że początkowo pojawia się on w postaci niezależnych sfer wypływających z mniejszych naczyń. Kontynuuj wstrzykiwanie Microfil, aż żyły wypełnią się ciągłą kolumną. Pełne wypełnienie będzie widoczne, gdy Microfil będzie ciągły w naczyniach i zacznie wypływać przez PVC.</li>
 <li>Po zakończeniu napełniania szybko zaciśnij szwy, które wcześniej zostały założone wokół PVC i aorty, aby zapobiec wypchnięciu Microfil z naczyń przez elastyczną tkankę serca.</li>
 <li>Przykryj serce mokrą gazą (nasączoną wodą z kuwety do dyssekcji), aby zapobiec jego wysychaniu i pozostaw na około 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aż Microfil spolimeryzuje. Unikaj wywierania jakiegokolwiek zewnętrznego nacisku na serce podczas procesu polimeryzacji, np. podnoszenia lub obracania serca w celu wcześniejszego obejrzenia wypełnionych naczyń z tyłu organu. Może to spowodować wypchnięcie Microfil z niektórych naczyń do bardziej elastycznych obszarów serca, co doprowadzi do przerwania ciągłości Microfil.</li>
 <li>Wyjmij serce i poddaj je dofixacji w 4% PFA przez noc w temperaturze 4°C. Następnie przechowuj w 70% etanolu w 4 °C. Układ naczyniowy serca jest teraz gotowy do obrazowania μCT.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Naczynia, które zostały skutecznie perfundowane preparatem Microfil, będą miały ciągły, nieprzerwany Microfil w całym ich przebiegu (Ryc. 3A). Stopień wypełnienia naczyń wieńcowych można ocenić wizualnie; żyły są zlokalizowane w obrębie osierdzia18 i mogą być łatwo zaobserwowane (Ryc. 3A, grot strzałki); tętnice, które znajdują się bardziej wewnątrzmiąższowo18, są również widoczne przez powierzchnię serca (Ryc. 3A, strzałka). Widoczne jest również wypełnienie kapilar, ponieważ tkanka serca charakteryzuje się bardzo wysoką gęstością naczyń włosowatych, w związku z czym po ich wypełnieniu tkanka serca nabierze koloru Microfilu (Ryc. 3A, gwiazdka). W ten sposób wszelkie sieci naczyniowe, które nie zostały wypełnione, będą zauważalne ze względu na brak Microfilu (Ryc. 3B, C).
Przerwy w Microfil (oznaczone gwiazdkami na Ryc. 3B) często pojawiają się z powodu hydrofobowej natury Microfil, co powoduje jego kurczenie się i prowadzi do powstania „przerw” w wypełnionych naczyniach. Można ograniczyć liczbę tych „przerw”, utrzymując ciśnienie w naczyniach poprzez prawidłowe podwiązanie punktów wyjścia naczyń z serca. Inne przerwy mogą być spowodowane pęcherzykami powietrza w Microfil. Aby zapobiec wprowadzeniu powietrza, należy upewnić się, że cewnik naczyniowy jest całkowicie zanurzony w wodzie podczas przechodzenia z aparatury perfuzyjnej na strzykawkę z Microfil. Jeśli wprowadzony zostanie pęcherzyk powietrza, często można go usunąć, po prostu kontynuując perfuzję Microfil aż do momentu, gdy pęcherzyk zostanie wypchnięty z naczyń wieńcowych.

Sieci naczyniowe mogą nie zostać w pełni wypełnione, jeśli część łożyska naczyniowego zostanie zablokowana (Ryc. 3B, strzałka). Chociaż heparyna hamuje tworzenie się skrzepów krwi, sporadyczne zatory mogą nadal występować z powodu niepełnej perfuzji heparyny przed rozpoczęciem procedury lub z powodu innych, nieznanych czynników. W przypadku wystąpienia zatoru, według naszej wiedzy, nie istnieje metoda usunięcia go w celu całkowitego wypełnienia naczyń. Niepełne wypełnienie może również wynikać ze zbyt niskiego ciśnienia podczas aplikacji, ponieważ Microfil nie zostanie wtłoczony do wszystkich łożysk naczyniowych i sieci kapilarnych (Ryc. 3C). Z kolei zbyt wysokie ciśnienie może spowodować pęknięcie naczyń włosowatych i wydostanie się Microfilu do otaczających tkanek (Ryc. 3D). 
<img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg" alt="Proces perfuzji serca z użyciem rozszerzacza naczyń i kaniuli angiograficznej; schemat z kolejnymi krokami." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd schematu perfuzji Microfil. (A) Aorta i PVC są przecinane mniej więcej na poziomie przepony. (B) W aorcie wstępującej umieszcza się kaniulę angiograficzną. (C) Przez naczynia perfunduje się bufor rozszerzający naczynia, przy użyciu aparatu do perfuzji ciśnieniowej (brak na rysunku), podczas gdy (D) trzy główne odgałęzienia łuku aorty są podwiązywane. (E) Przez tętnice wieńcowe perfunduje się 4% PFA, podczas gdy obie przednie żyły główne (Anterior Vena Cavas) są podwiązywane. (F) Za pomocą strzykawki Microfil jest perfundowany przez tętnice wieńcowe, aż do momentu zaobserwowania jego wypływu z PVC.

<img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig2.jpg" alt="Schemat zestawu do filtracji próżniowej z manometrem, łącznikiem Y i gumowymi korkami dla przepływu cieczy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Aparatura perfuzyjna. Dwie kolby Erlenmeyera, z których każda jest wypełniona buforem do wazodylatacji lub 4% PFA, są połączone i poddane ciśnieniu za pomocą rurek podłączonych do ich bocznych wlewów. System jest poddawany ciśnieniu poprzez ręczne pompowanie gruszki, a do jednej z kolb podłączono manometr, aby umożliwić monitorowanie i utrzymywanie ciśnienia. Małe rurki przechodzą przez gumowe korki i sięgają dna cieczy w każdej kolbie. Ciśnienie wprowadzane przez boczne wlewy wypompowuje ciecz z każdej kolby przez te mniejsze rurki. Rurki łączą się następnie w kranie, który umożliwia przepływ cieczy tylko z jednej kolby na raz.
<img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig3.jpg" alt="Rozwój zarodkowy serca kurczaka, analiza wzorca naczyniowego, obrazy mikroskopowe, badanie anatomiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykłady serc wypełnionych preparatem Microfil. (A) Naczynia dobrze wypełnione będą miały niewiele (lub żadnych) przerw w Microfilu, a tkanka serca będzie zabarwiona na kolor Microfilu ze względu na wypełnione naczynia włosowate (gwiazdka, porównać z C). Zarówno tętnice (strzałka – lewa tętnica zstępująca przednia) jak i żyły (grot strzałki – lewa żyła wieńcowa) są widoczne na powierzchni serca. (B) Serce z przerwami w Microfilu (gwiazdki) oraz zatorami w niektórych naczyniach, które uniemożliwiły pełną penetrację Microfilu. Zablokowane naczynia pozostają czerwone (strzałka), ponieważ krew nie została wypłukana podczas procesu perfuzji. (C) Serce z naczyniami, które zostały wypełnione niecałkowicie. Zauważalny jest brak żółtego zabarwienia tkanki przez Microfil, co wskazuje, że preparat nie przeniknął do naczyń włosowatych. (D) Serce, w którym podczas wypełniania pękły naczynia włosowate, powodując wyciek Microfilu do otaczającej tkanki (strzałka).

<ol><li>Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+to+study+angiogenesis+in+the+context+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases.</a> Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).</li>
<li>Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+vessels+in+mouse+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.</a> Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).</li>
<li>Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+polyurethane-based+material+for+vascular+corrosion+casting+with+improved+physical+and+imaging+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics.</a> Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).</li>
<li>Murakami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+patterns+in+the+rat+pancreas%3A+a+simulative+demonstration+by+injection+replication+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).</li>
<li>Icardo, J. M., Colvee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+course+of+the+coronary+arteries+in+normal+mice+and+in+iv%2Fiv+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice.</a> J. Anat. 199, 473-482 (2001).</li>
<li>Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+architecture+of+myocardial+microcirculation+in+intact+rat+heart%3A+a+study+with+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).</li>
<li>Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microcomputed+tomography+to+study+microvasculature+in+small+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).</li>
<li>Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+vasculature+and+parenchyma+in+intact+rodent+organs+with+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT.</a> Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).</li>
<li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Zagorchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro+computed+tomography+for+vascular+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Angiogenes.+Res%22%5BJournal%5D)">Micro computed tomography for vascular exploration.</a> J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).</li>
<li>Heinzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+microimaging+for+multiscale+analysis+of+large+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks.</a> Neuroimage. 32, 626-636 (2006).</li>
<li>Dedkov, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synectin%2Fsyndecan-4+regulate+coronary+arteriolar+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development.</a> Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).</li>
<li>Gossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+and+hemodynamic+characteristics+of+vasa+vasorum+in+the+walls+of+porcine+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell.+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).</li>
<li>Rodriguez-Porcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+myocardial+microvascular+3D+architecture+in+experimental+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia.</a> Circulation. 102, 2028-2030 (2000).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).</li>
<li>Toyota, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+required+for+coronary+collateral+growth+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat.</a> Circulation. 112, 2108-2113 (2005).</li>
<li>Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+to+distinct+cell+types+differentially+regulates+coronary+artery+and+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development.</a> Development. 135, 3161-3171 (2008).</li>
<li>Cheema, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+microvessel+formation+after+coronary+stenting+and+the+effects+of+SU11218%2C+a+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts--technique+and+applications%3A+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review.</a> Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).</li>
<li>Schneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+3D+visualization+and+quantification+of+murine+bone+and+bone+vasculature+using+micro-computed+tomography+and+vascular+replica%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica.</a> Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).</li>
<li>Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+analysis+of+SEM+images+of+corrosion+casting+using+adaptive+stereo+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching.</a> Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Quintana, L., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuintana%2C+L+%22Optical+projection+tomography+of+vertebrate+embryo+development%22">Optical projection tomography of vertebrate embryo development</a>. , Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).</li>
<li>Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Analysis+of+Vascular+Development+in+the+Mouse+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo.</a> PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).</li>
<li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+density%2C+remodeling%2C+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).</li>
<li>Behm, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Endothelial+Vascular+Cell+Adhesion+Molecule-1+Expression+and+Inflammatory+Cell+Recruitment+During+Vasculogenesis+and+Ischemia-Mediated+Arteriogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis.</a> Circulation. 117, 2902-2911 (2008).</li>
<li>Carr, C. L., Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+perfusion+imaging+with+contrast+echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Cardiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography.</a> Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).</li>
<li>Leong-Poi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Endogenous+and+Therapeutic+Arteriogenesis+by+Contrast+Ultrasound+Molecular+Imaging+of+Integrin+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression.</a> Circulation. 111, 3248-3254 (2005).</li>
<li>Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+Targeted+to+Intercellular+Adhesion+Molecule-1+Bind+to+Activated+Coronary+Artery+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells.</a> Circulation. 98, 1-5 (1998).</li>
<li>Wei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Myocardial+Blood+Flow+With+Ultrasound-Induced+Destruction+of+Microbubbles+Administered+as+a+Constant+Venous+Infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion.</a> Circulation. 97, 473-483 (1998).</li>
<li>Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Magnetic+Resonance+Angiography+of+the+Mouse+Brain%3A+Application+to+Murine+Focal+Cerebral+Ischemia+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models.</a> Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+MR+angiography+of+intratumoral+vasculature+using+a+novel+macromolecular+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).</li>
<li>Nezafat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B1-insensitive+T2+preparation+for+improved+coronary+magnetic+resonance+angiography+at+3+T%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T.</a> Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).</li>
<li>Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+angiography+of+collateral+vessels+in+a+murine+femoral+artery+ligation+model%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model.</a> NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).</li>
<li>Cochet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MR+angiography+and+velocity+measurement+in+mice+coronary+arteries+at+9.4+T%3A+assessment+of+coronary+flow+velocity+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve.</a> Radiology. , 254-441 (2010).</li>
</ol>

Myszy obsługiwano zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego oraz zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals opublikowanymi przez Narodowe Instytuty Zdrowia USA (NIH Publication No. 85-23, wersja z 1996 r.).

Tkanka serca charakteryzuje się bardzo wysokim zapotrzebowaniem metabolicznym, w związku z czym wymaga stałej dostawy składników odżywczych i tlenu z krwi dostarczanej przez naczynia wieńcowe. Choroby naczyń wieńcowych, które prowadzą do pogorszenia ich funkcji w wyniku zwężenia lub zablokowania naczyń, mogą wywołać hipoksję i niedokrwienie tkanek, narażając pacjentów na zawał mięśnia sercowego oraz nieodwracalne uszkodzenie mięśnia serca. Niezbędne jest lepsze zrozumienie stanu chorobowego tych naczyń, a kluczowym eleme...

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD Biosciences</a></td><td>BD-309602</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe 1/2cc z na stałe przymocowanymi igłami 29G &amp;frac12;&amp;rsquo;</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD Biosciences</a></td><td>BD-309306</td><td></td></tr><tr><td>Gazy 2" x 2"</td><td>Med101store.com</td><td>SKU 2208</td><td></td></tr><tr><td>Kaniule dożylne Angiocath 24G &amp;#190;"</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD Biosciences</a></td><td>BD-381112</td><td></td></tr><tr><td>Igły 26G &amp;frac12;"</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD Biosciences</a></td><td>BD-305111</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A9251</td><td>1g/L w PBS do buforu rozszerzającego naczynia (z papaweryną)</td></tr><tr><td>Kleszczyki Graefe kątowe</td><td><a href="http://www.finescience.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fine Science Tools</a></td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką: 6" niesterylne</td><td><a href="http://www.cardinal.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Cardinal Health</a></td><td>C15055-006</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki chirurgiczne</td><td><a href="http://www.finescience.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fine Science Tools</a></td><td>14085-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop sekcyjny i źródło światła</td><td><a href="http://www.nikon.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nikon Instruments</a></td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Taca sekcyjna, 11,5 x 7,5 cala</td><td><a href="http://www.coleparmer.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Cole-Parmer</a></td><td>YO-10915-12</td><td>Wypełniona smołą do unieruchamiania myszy</td></tr><tr><td>Precyzyjne kleszczyki zakrzywione</td><td><a href="http://www.aesculapusa.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aesculap</a></td><td>FD281R</td><td>Wymagane dwie sztuki</td></tr><tr><td>Heparyna, roztwór zapasowy 5000 U/ml</td><td><a href="http://www.apppharma.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> APP Pharmaceuticals</a></td><td>NDC 63323-047-10</td><td>Rozcieńczenie 1:100 w wodzie</td></tr><tr><td>KCl</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>P217</td><td>Roztwór nasycony w H2O</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketaset), roztwór zapasowy 100 mg/ml</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Mieszanka 130 mg/kg masy ciała, z ksylazyną w 0,9% soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Microfil</td><td><a href="http://www.flowtech-inc.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> FlowTech</a></td><td>MV-122 (yellow). Dostępne są również inne opcje kolorystyczne.</td><td>Mieszać 1:1 wagowo z 10% objętościowo czynnika utwardzającego. Przygotować bezpośrednio przed wstrzyknięciem i wymieszać na vortexie, aby zapewnić jednorodność</td></tr><tr><td>Niesterylna nić chirurgiczna: 6-0, pleciony jedwab</td><td><a href="http://www.harvardapparatus.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Harvard Apparatus</a></td><td>723287</td><td></td></tr><tr><td>Papaweryna</td><td><a href="http://www.americanregent.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> American Regent Inc.</a></td><td>NDC 0517-4010-01</td><td>4mg/L w PBS do buforu rozszerzającego naczynia (z adenozyną)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>P6148</td><td>Przygotowany jako roztwór 4%</td></tr><tr><td>Aparat do perfuzji</td><td></td><td></td><td>Patrz rycina 2</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td><a href="http://www.finescience.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fine Science Tools</a></td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Anased), roztwór zapasowy 20 mg/gl</td><td><a href="http://www.lloydlab.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lloyd, Inc.</a></td><td>NADA #139-236</td><td>Mieszanka 8,8 mg/kg masy ciała, z ketaminą w 0,9% soli fizjologicznej</td></tr></tbody></table>

wsteczna perfuzja i wypełnianie naczyń wieńcowych myszy w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Wizualizacja układu naczyniowego staje się coraz ważniejsza dla zrozumienia wielu różnych stanów chorobowych. Chociaż istnieje kilka technik obrazowania naczyń, niewiele z nich pozwala na wizualizację całej sieci naczyniowej przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości umożliwiającej obrazowanie mniejszych naczyń1,2. Ponadto wiele technik odlewania naczyń niszczy otaczającą tkankę, co uniemożliwia dalszą analizę próbki3-5. Jedną z metod pozwalających uniknąć tych problemów jest mikrotomografia komputerowa (μCT). Obrazowanie μCT może być wykonywane z rozdzielczością &lt;10 mikronów, umożliwia tworzenie rekonstrukcji 3D sieci naczyniowej i pozostawia tkankę nienaruszoną do późniejszych analiz (np. histologii i morfometrii)6-11. Jednakże obrazowanie naczyń za pomocą metod μCT ex vivo wymaga wypełnienia naczyń związkiem radiologicznym. W związku z tym dokładne odwzorowanie układu naczyniowego uzyskane za pomocą obrazowania μCT zależy od niezawodnego i całkowitego wypełnienia naczyń. W niniejszym protokole opisujemy technikę wypełniania naczyń wieńcowych myszy w przygotowaniu do obrazowania μCT.
Istnieją dwie dominujące techniki wypełniania naczyń wieńcowych: in vivo poprzez kaniulację i perfuzję wsteczną aorty (lub odgałęzienia łuku aorty) 12-14 oraz ex vivo z wykorzystaniem układu perfuzyjnego Langendorffa 15-17. W niniejszej pracy opisujemy metodę kaniulacji aorty in vivo, która została opracowana specjalnie w celu zapewnienia wypełnienia wszystkich naczyń. Stosujemy niskolepki związek radiokontrastowy o nazwie Microfil, który może przenikać przez najmniejsze naczynia, wypełniając wszystkie kapilary, a także tętniczą i żylną stronę sieci naczyniowej. Naczynia są perfundowane buforem przy użyciu ciśnieniowego systemu perfuzyjnego, a następnie wypełniane preparatem Microfil. Aby zapewnić wypełnienie małych naczyń o wyższym oporze, podwiązujemy duże odgałęzienia odchodzące od aorty, co przekierowuje Microfil do tętnic wieńcowych. Po zakończeniu wypełniania, aby zapobiec wypychaniu Microfilu z niektórych naczyń ze względu na elastyczność tkanki serca, natychmiast po wypełnieniu podwiązujemy dostępne główne punkty wyjścia naczyń. Tym samym nasza technika jest zoptymalizowana pod kątem pełnego wypełnienia i maksymalnego zatrzymania środka wypełniającego, co umożliwia wizualizację kompletnej sieci naczyniowej wieńców – zarówno tętnic, kapilar, jak i żył.

Wizualizacja naczyń wieńcowych ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat chorób układu sercowo-naczyniowego. Opisujemy tutaj metodę perfuzji naczyń wieńcowych myszy radiologicznym silikonem (Microfil) w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową (μCT).

Wsteczna perfuzja i wypełnianie naczyń wieńcowych myszy w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową

Wizualizacja naczyń krwionośnych staje się coraz bardziej istotna dla zrozumienia wielu różnych stanów chorobowych. Chociaż istnieje kilka technik służących do...

Ogólnym celem tej procedury jest wypełnienie naczyń wieńcowych barwnikiem radiologicznym w przygotowaniu do obrazowania za pomocą mikrotomografii komputerowej lub mikro-CT. Najpierw otwiera się jamę brzuszną myszy i przeprowadza kanulację aorty brzusznej. Następnie naczynia są przepłukiwane buforem rozszerzającym naczynia, a potem utrwalaczem AFF.Następnie naczynia zostają podwiązane, aby skierować PERFUSE eight oraz zablokować potencjalne miejsca wycieku. Na koniec tętnice wieńcowe wypełnia się kontrastem radiologicznym. Stopień wypełnienia sieci naczyń wieńcowych można ocenić poprzez analizę wizualną serca lub za pomocą obrazowania i analizy mikro-CT.Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w naczynia wieńcowe, wzorce ich rozgałęzień, a także zatory i inne choroby naczyń wieńcowych, może ona zostać zastosowana również do innych sieci naczyniowych w organizmach, takich jak mózg, nerki czy kończyny dolne. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy ligacji naczyń są trudne do opanowania.Jeśli nie znają Państwo anatomii naczyń, znalezienie i podwiązanie odpowiednich naczyń w otaczającej tkance może być również trudne. Przed rozpoczęciem procedury należy wypełnić jedną stronę aparatu do perfuzji ciśnieniowej buforem rozszerzającym naczynia, a drugą 4% paraformaldehydem w PBS. Następnie należy napełnić strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 CC z igłą 29G o długości pół cala 0,1 ml heparyny w stężeniu 1:100.Następnie zgnij igłę pod kątem około 120 stopni, tak aby ścięcie było skierowane do góry. Na koniec napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 26G o długości pół cala 0,4 ml nasyconego roztworu chlorku potasu, a następnie zgnij igłę pod kątem 120 stopni, tak jak pokazano przed chwilą. Po znieczuleniu myszy i przymocowaniu zwierzęcia stroną brzuszną do góry do tacki sekcyjnej, spryskaj zwierzę etanolem, aż sierść będzie mokra.Następnie otwórz jamę brzuszną, wykonując cięcie pośrodku. Odciągnij skórę, aby odsłonić organy, i przesuń jelita na bok, tak aby dostępna była tylna żyła główna CVA lub PVC. W razie potrzeby usuń tłuszcz lub tkankę łączną, a następnie wstrzyknij przygotowany roztwór heparyny do PVC.Podczas wyciągania igły, należy zakryć otwór po niej aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby zapobiec wyciekowi, i przytrzymać aplikator przez kilka sekund, aż ściana PVC skrzepnie i zostanie zamknięta. Po odczekaniu dwóch do trzech minut, aby heparyna rozprzestrzeniła się w krwiobiegu myszy, należy wypreparować przeponę i klatkę piersiową, tak aby możliwe było uwidocznienie bijącego serca.Następnie powoli wstrzyknij przygotowany roztwór chlorku potasu do PVC, aż do zatrzymania akcji serca. Dalej przetnij PVC w okolicy przepony, aby część bliższa sercu była łatwa do zlokalizowania w kolejnych krokach. Następnie usuń wszystkie narządy znajdujące się poniżej przepony i wyciśnij tylną część myszy.Następnie zlokalizuj przecięty koniec aorty i umieść jeden długi odcinek plecionej jedwabnej nici chirurgicznej 6-0, złożonej w pół, pod aortą, kilka milimetrów przed jej przeciętym końcem. Przetnij ten długi odcinek nici tak, aby pod aortą znalazły się dwie nici. Na koniec wprowadź cewnik do przeciętego końca aorty i zawiąż każdą nić podwójnym węzłem, aby unieruchomić cewnik oraz zapobiec wyciekowi treści spowodowanemu ciśnieniem wstecznym w aorcie.Rozpocznij od podłączenia aparatury do perfuzji ciśnieniowej do cewnika. Następnie napompuj aparat perfuzyjny do ciśnienia napędowego od 100 do 110 mmHg, aby przeprowadzić perfuzję naczyń buforem rozszerzającym naczynia. Upewnij się, że bufor przepływa przez tętnice wieńcowe, potwierdzając, że ciecz wypływa z PVC, i poczekaj, aż ciecz stanie się przejrzysta.Przetnij żebra i odchyl klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Po odsłonięciu organu, za pomocą nasączonej buforem gazy, nanieś kilka kropli buforu na serce, aby zapobiec jego wysuszeniu. Usuń grasicę.Podwiązanie naczyń w celu odsłonięcia łuku aorty jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Lokalizacja naczyń przytwierdzonych do łuku aorty może być bardzo frustrująca dla początkującego, jednak po zrozumieniu anatomii naczyń uczy się ufać, że one tam są, nawet jeśli nie są wyraźnie widoczne przez tkankę tłuszczową i inną tkankę łączną. Zakładanie szwów wymaga cierpliwości i pewnej ręki, lecz jest to umiejętność, która z praktyką staje się łatwiejsza.Następnie, używając plecionego jedwabnego szwu o rozmiarze 6-0, podwiąż trzy główne odgałęzienia aorty, aby upewnić się, że płyn jest kierowany przez tętnice wieńcowe, a nie przez te większe naczynia o niskim oporze. Następnie perfunduj serce utrwalaczem przez 15 minut. Na koniec przemyj naczynia buforem rozszerzającymce przez co najmniej dwie minuty.W międzyczasie, aby zapobiec wyciekowi preparatu Microfill z serca po wstrzyknięciu, podwiąż pierwszą przednią żyłę główną, a następnie podwiąż drugą przednią żyłę główną. Załóż szwy wokół PVC oraz aorty, ale nie zaciśnij ich aż do momentu zakończenia napełniania. Po przygotowaniu preparatu Microfill i nabraniu go do strzykawki o pojemności 1 mL, napełnij tackę sekcyjną wodą tak, aby zakryła cewnik.Teraz odłącz aparat perfuzyjny od cewnika i podłącz strzykawkę z preparatem Microfill. Wstrzyknij Microfill do aorty. Preparat najpierw wypełni tętnice, a następnie przedostanie się do naczyń kapilarnych, co spowoduje zabarwienie tkanki na kolor Microfillu.Zwróć uwagę, że ze względu na hydrofobowy charakter mikro wypełniacza, w momencie wypływu z mniejszych naczyń początkowo pojawia się on w postaci niezależnych sfer. Pełne wypełnienie jest widoczne, gdy mikro wypełniacz tworzy ciągłą strukturę w naczyniach i wypływa przez PVC. Po zakończeniu wypełniania szybko zaciśnij szwy wokół PVC i aorty, aby zapobiec wypchnięciu mikro wypełniacza z naczyń przez elastyczną tkankę serca.Należy unikać wywierania jakiegokolwiek zewnętrznego nacisku na serce podczas procesu polimeryzacji, na przykład poprzez podnoszenie lub obracanie serca w celu wcześniejszego obejrzenia wypełnionych naczyń z jego tylnej części. Następnie należy namoczyć gazę w wodzie z kuwety sekcyjnej i przykryć nią serce, aby zapobiec jego wysychaniu. Pozostawić serce na około jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aż microfill ulegnie spolimeryzowaniu.Na koniec należy wyjąć serce i utrwalić je w 4% PFA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie serce należy przenieść do 70% etanolu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Naczynia, które zostały skutecznie przepłukane preparatem microfill, będą wykazywać ciągłe, nieprzerwane wypełnienie microfill w całym ich przebiegu.Jak pokazano na pierwszej rycinie, stopień wypełnienia naczyń wieńcowych można ocenić wizualnie. Żyły znajdują się powierzchownie i są łatwo dostrzegalne, co wskazuje grot strzałki. Tętnice, położone bardziej wewnątrzmiąższowo, są również widoczne przez powierzchnię serca i zostały tutaj zaznaczone strzałką.Widoczne jest również napełnianie naczyń włosowatych. W tej figurze można zaobserwować obszar o gęstym unaczynieniu włosowatym serca, zaznaczony gwiazdką. Sporadycznie mogą wystąpić zatory uniemożliwiające napełnienie części łożyska naczyniowego.W związku z tym wszelkie sieci naczyniowe, które nie zostaną wypełnione, będą widoczne ze względu na brak microfill, co zaznaczono tutaj strzałką. Mogą wystąpić również dalsze przerwy w microfill, których przykłady oznaczono gwiazdką. Niepełne wypełnienie może również nastąpić, jeśli podczas podawania microfill zastosowano zbyt niskie ciśnienie, przez co microfill nie zostanie wprowadzony do wszystkich sieci kapilarnych.Zwróć uwagę, że tkanka nie przybrała żółtego koloru microfill, co wskazuje na to, że microfill nie wniknął do naczyń włosowatych. Z kolei zbyt duże ciśnienie może spowodować pęknięcie naczyń włosowatych i wydostanie się microfill do otaczającej tkanki, co zaznaczono strzałką. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie wstrzykiwać microfill zbyt szybko ani pod zbyt dużym ciśnieniem, ponieważ naczynia pękną, co zniszczy odlew naczyniowy.Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie procedury mikro-tomografii komputerowej (micro CT). W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania oraz dokładniejszej charakterystyki naczyń i tkanek otaczających można zastosować inne metody, takie jak analiza immunohistochemiczna.

retrograde-perfusion-filling-mouse-coronary-vasculature-as

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Retrogradowa perfuzja i wypełnienie unaczynienia wieńcowego myszy jako przygotowanie do mikrotomografii komputerowej

Wysokoczęstotliwościowe ultradźwięki Dopplera to nowatorska technologia służąca do oceny regionalnej funkcji mięśnia sercowego. Niniejsza praca przedstawia pierwsze dowody wykazujące przydatność tej wszechstronnej platformy obrazowania do wielokrotnego pomiaru odkształcenia mięśnia sercowego, dp/dt oraz niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji (IR) serca mysiego.

Wysokoczęstotliwościowa echokardiografia o wysokiej rozdzielczości: pierwsze dowody na nieinwazyjny, powtarzalny pomiar odkształcenia mięśnia sercowego, kurczliwości i niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji serca myszy

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Pokazujemy tutaj in-vivo wprowadzenie pompy osmotycznej do stałego miejscowego dostarczania leków i tworzenie niedokrwienia kończyn tylnych w modelu mysim. Ponadto unaczynienie kończyn tylnych jest perfundowane za pomocą Microfilu, silikonowego środka nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich, w celu przygotowania do obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT).

Osmotyczne podawanie leków do niedokrwionych kończyn tylnych i perfuzja naczyń krwionośnych za pomocą mikrofilu do obrazowania mikrotomografii komputerowej

Rezerwa przepływu wieńcowego (CFR) jest przydatna do oceny zapotrzebowania tlenu w mięśniu sercowym i oceny ryzyka sercowo-naczyniowego. W badaniu tym ustanowiono krok po kroku metodę echokardiografii dopplerowskiej przezklatkowej (TTDE) do podłużnego monitorowania zmian CFR, mierzonych z tętnicy wieńcowej u myszy, pod eksperymentalnym przeciążeniem ciśnieniowym pasma aorty.

Ultradźwiękowa ocena przepływu w tętnicach wieńcowych i rezerwy przepływu wieńcowego przy użyciu modelu przeciążenia ciśnieniowego u myszy

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię użycia nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu do perfuzji mysiego układu krwionośnego do ilościowego określenia średnicy aorty w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty.

Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Rezerwa przepływu wieńcowego (CFR), jest zdefiniowana jako stosunek maksymalnego przepływu krwi wieńcowej do spoczynkowego przepływu krwi wieńcowej. Przedstawiamy protokół oceny CFR u szczurów za pomocą ultradźwięków, który daje możliwość przewidywania czynników ryzyka sercowo-naczyniowego przy braku obturacyjnej choroby wieńcowej.

Ocena rezerwy przepływu wieńcowego po reperfuzji niedokrwiennej mięśnia sercowego u szczurów

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń mysich kończyn tylnych za pomocą mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej.

Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową

Obecny protokół opisuje zmodyfikowany widok długiej osi przymostkowej dla szybkiej i precyzyjnej lokalizacji lewej przedniej tętnicy zstępującej. Podejście to zostało zaprojektowane tak, aby było prostsze i bardziej przyjazne dla użytkownika, a jednocześnie ułatwiało badanie dynamicznych zmian w rezerwie przepływu wieńcowego po niedokrwieniu mięśnia sercowego i reperfuzji u myszy.

Dynamiczne oceny rezerwy przepływu wieńcowego po reperfuzji niedokrwiennej mięśnia sercowego u myszy

Naucz się perfuzji wstecznej i wypełniania naczyń wieńcowych myszy radiopacznym barwnikiem w celu przygotowania próbek do mikrotomografii komputerowej. Ta technika umożliwia szczegółowe wizualizowanie struktur naczyniowych w badaniach kardiologicznych.

Wsteczna perfuzja i wypełnianie naczyń wieńcowych myszy w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową

Przeglądaj więcej filmów