Name: Ilościowe obrazowanie specyficznej dla linii sygnalizacji za pośrednictwem receptora toll-podobnego w monocytach i komórkach dendrytycznych z małych próbek ludzkiej krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj ilościowe obrazowanie sygnalizacji TLR w monocytach i komórkach dendrytycznych z małych próbek krwi. Ta metoda łączy cytometrię przepływową z wysoką rozdzielczością obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992 oraz program NCRR/GCRC M01-RR00125). Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów finansowych i dziękują dr. Markowi Shlomchikowi, dyrektorowi Yale Cell Sorter Core Facility.

1. Izolacja i stymulacja komórek odpornościowych
<ol>
	<li>Pobierz 10-50 ml heparynowanej krwi od zdrowych ochotników po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji bioetycznej (Institutional Review Board). W przypadku badań nad starzeniem się lub patogenezą chorób należy wyraźnie określić kryteria włączenia i wykluczenia dla każdego ochotnika lub pacjenta.</li>
	<li>Wyizoluj mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) człowieka, używając probówek CPT lub Ficoll-Paque Plus zgodnie z instrukcjami producenta (GE Healthcare, NJ); eksperymenty należy przeprowadzić w dniu izolacji7 (Odczynniki, Tabela 1).</li>
	<li>Inkubuj PBMC (3 x 106/probówkę) w probówkach 1,5 ml w 0,6 ml samego medium lub stymuluj je ligandami TLR bądź innymi czynnikami aktywującymi, np. ligandem TLR7/8 R848 (0,6 ml medium plus 0,6 μl 10 mM ligandu TLR7/8 R848, stężenie końcowe 10 μM) w temperaturze 37 °C przez 10-60 min (InvivoGen, CA)9.</li>
</ol>
2. Znakowanie komórek
<ol>
	<li>Oznacz linie komórkowe i inne markery powierzchniowe w zawiesinach żywych komórek przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluorochromami. Oznacz 3 x 106 PBMC przez 20 min w 4 °C w 100 μl PBS/2% FBS w probówce Eppendorf 1,5 ml, stosując koktajl przeciwciał powierzchniowych specyficznych dla linii monocytów lub DC (Tabela 2). Optymalne rozcieńczenia przeciwciał można określić w eksperymentach wstępnych; próbki należy przetwarzać partiami, aby zminimalizować zmienność między partiami odczynników. Dla zapasów przeciwciał od dostawcy o stężeniu 0,1 mg/ml należy użyć 5 μl przeciwciała (rozcieńczenie 1:20). Użyj oddzielnej probówki z komórkami oznaczonymi tylko jednym koniugatem barwnym w celu ustawienia kanałów fluorescencyjnych w urządzeniu.</li>
	<li>Po znakowaniu powierzchniowym utrwal komórki w 4% PFA/PBS przez 10 min w RT. W celu przechowywania do czasu analizy, odwiruj komórki przy 500 x g i resuspenduj je w buforze do zamrażania (90% FBS zawierającym 10% DMSO) w temperaturze -80 °C aż do dnia badania.</li>
	<li>Do oceny przetwarzaj razem partie komórek nieleczonych i stymulowanych od grupy dawców, aby zminimalizować zmienność. W dniu analizy szybko rozmroź komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie odwiruj przy 500x g, aby usunąć bufor do zamrażania.</li>
	<li>Aby przeprowadzić permeabilizację komórek w celu wykrycia wewnątrzkomórkowych cytokin lub innych markerów, resuspenduj zawiesiny komórkowe w 100 μl buforu BD Perm/Wash (BD Biosciences, NJ). Oznacz komponenty sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, np. stosując rozcieńczenie 1:20 przeciwciała króliczego anty-NF-κB (p65) (stężenie końcowe 10 μg/ml, SantaCruz Biotechnology, CA) przez 20 min w RT, odwiruj przy 500 x g, odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w 100 μl buforu BD Perm/Wash zawierającego rozcieńczenie 1:250 przeciwciała koziego anty-króliczego IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) i inkubuj przez 20 min w RT.</li>
	<li>Bezpośrednio przed obrazowaniem wykonaj barwienie kontrastowe jąder za pomocą DAPI (0,2 μg/ml, Invitrogen, CA) lub jodku propidyny (PI; 20 ng/ml, Invitrogen, CA).</li>
</ol>
3. Analiza ImageStream
<ol>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie za pomocą ImageStream na próbkach pogrupowanych w serie, aby zmniejszyć zmienność między próbkami ludzkimi. Ustawienia instrumentu dla mocy laserów były następujące: 200 mW dla 488 nm, 10 mW dla 658 nm oraz 250 mW dla 405 nm.</li>
	<li>Aby przeanalizować pliki z danymi (Ryc. 1), najpierw należy zastosować bramkowanie dla zdarzeń o prawidłowej intensywności PI i wysokim współczynniku kształtu PI (stosunek szerokości do wysokości), aby odróżnić pojedyncze komórki (R1) od debris (niska intensywność PI) lub zdarzeń wielokomórkowych (wysoka intensywność PI i niski współczynnik kształtu). Monocyty znajdują się w bramce dla komórek CD14-dodatnich. mDC znajdują się w bramce dla komórek o wysokiej ekspresji CD11c i niskiej ekspresji CD4 (R2), a także niskiej ekspresji markerów Lin-1 (R3).</li>
	<li>Użyć oprogramowania IDEAS (Amnis, WA) w celu uzyskania skutecznego pomiaru ilościowego stopnia aktywacji każdej komórki. Określić podobieństwo (lub kolokalizację) cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego NF-κB z barwnikiem jądrowym PI, aby wskazać translokację do jądra (R4). Wysoka korelacja lokalizacji NF-κB/PI przekłada się na wysoki wynik podobieństwa i wskazuje stopień aktywacji10.</li>
	<li>Porównać współczynniki podobieństwa między różnymi grupami traktowania lub populacjami pacjentów, aby określić względną wydajność funkcjonalną komórek. Ilościowo ocenić dane między próbkami poprzez statystyczne porównanie wartości bezwzględnych lub różnic krotności. Użyć oprogramowania IDEAS do wyświetlenia obrazów komórek z kluczowych segmentów histogramów populacji (Ryc. 2).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Ilościowo oceniliśmy szlaki sygnalizacyjne w odpowiedzi na modelowy ligand wirusowy, stymulując PBMCs ligandem TLR7/8, R848 (Ryc. 1). W naszych grupach próbek zebraliśmy zarówno obrazy lokalizacji komórkowej, jak i statystyki populacyjne (Ryc. 2). System ImageStream umożliwia nam bezpośrednie bramkowanie podzbiorów komórek z PBMCs oraz obrazowanie odpowiedzi komórek z bramkowanych, ale niesortowanych populacji. W tym przypadku ilościowo określiliśmy wpływ sygnalizacji TLR na lokalizację jądrową NF-κB (p65) w myeloid DCs (mDCs) o fenotypie Lin1-, CD4 dim, CD11c+. W stanie spoczynkowym zaobserwowaliśmy wysoki odsetek niestymulowanych komórek z czynnikiem transkrypcyjnym NF-κB (p65) w cytoplazmie. Po stymulacji komórki traktowane wykazały znacząco wyższy wynik podobieństwa (similarity score) NF-κB (p65) do barwnika jądrowego PI, co wskazuje, że NF-κB (p65) przemieściło się do jądra po stymulacji (mediany wyników podobieństwa wynoszą odpowiednio 1,52 i 3,01, Ryc. 2). Podobne wyniki odnotowano w monocytach stymulowanych TLR59.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający analizę CD4dimCD11c+ i mDC: Lin1-CD11c+; porównanie stymulacji." src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Strategia barwienia i bramkowania w celu ilościowego określenia wpływu stymulacji na ludzkie mDC. Czynnik transkrypcyjny NF-κB reguluje ekspresję licznych genów układu odpornościowego. W niniejszym badaniu zmierzono lokalizację jądrową NF-κB (p65) w mDC pochodzących od jednego reprezentatywnego badanego po stymulacji ligandem TLR7/8. Pojedyncze komórki znajdujące się w płaszczyźnie ostrości zidentyfikowano poprzez bramkowanie zdarzeń dodatnich dla PI o wysokim współczynniku kształtu jądra (R1). mDC (Lin1-, CD4dim, CD11c+) wyodrębniono w bramce R3. Lokalizację jądrową NF-κB (p65) przedstawiono w bramce R4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Analiza cytometryczna, histogram i mikroskopia fluorescencyjna, ekspresja białka, efekt stymulacji R848." src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Translokacja NF-κB w mDCs po stymulacji. Translokacja NF-κB (p65) do jądra komórkowego po stymulacji (R4) przedstawiona jest dla populacji nieleczonych oraz stymulowanych mDCs; mediana wyniku podobieństwa wynosi 1,52 w próbce nieleczonej i 3,01 w próbce stymulowanej (A). Cyfrowe obrazy pozyskane jednocześnie z populacji komórek nieleczonych lub stymulowanych R848 pokazują reprezentatywne komórki oraz intensywność NF-B translokowanego do jądra komórkowego (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.

<ol><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li>
<li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
<li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li>
<li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li>
<li>Kong, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li>
<li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Kluczowymi etapami wykorzystania systemu ImageStream w badaniach translacyjnych są wybór odpowiednich grup porównawczych oraz optymalizacja i walidacja specyficzności przeciwciał. Różnice między grupami badawczymi w zakresie znakowanego celu będą wyraźnie widoczne na histogramach i obrazach komórek. W połączeniu z gruntowną analizą zmian w odpowiednich receptorach i szlakach sygnalizacyjnych, dane te dostarczą cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw dysregulacji odpornościowej w wyspecjalizowanych koho...

ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Indywidualne różnice w statusie immunologicznym determinują reakcje na infekcję i wpływają na ciężkość oraz przebieg choroby. Starzenie się wiąże się ze zwiększoną podatnością na infekcje wirusowe i bakteryjne oraz zmniejszoną odpowiedzią na szczepionki, przy dobrze udokumentowanym spadku odpowiedzi immunologicznej zarówno humoralnej, jak i komórkowej1,2. Niedawno oceniliśmy wpływ starzenia się na receptory Toll-podobne (TLRs), kluczowe komponenty wrodzonego układu odpornościowego, które wykrywają infekcje mikrobowe i uruchamiają przeciwmikrobowe odpowiedzi obronne organizmu3. W dużej kohorcie zdrowych dawców ludzkich wykazaliśmy, że monocyty krwi obwodowej u osób starszych wykazują obniżoną ekspresję i funkcję niektórych receptorów TLR4, a podobny spadek poziomu TLR i odpowiedzi sygnałowych zaobserwowano w komórkach dendrytycznych (DCs) – komórkach prezentujących antygen, które odgrywają kluczową rolę w powiązaniu odporności wrodzonej z adaptacyjną5. Wykazaliśmy również dysregulację TLR3 w makrofagach oraz niższą produkcję IFN przez komórki dendrytyczne od starszych dawców w odpowiedzi na infekcję wirusem zachodniego Nilu6,7.
Kluczem do zrozumienia immunosenescencji oraz do interwencji terapeutycznej jest szczegółowe poznanie konkretnych typów komórek wykazujących odpowiedź oraz mechanizmów transdukcji sygnału. Tradycyjne badania odpowiedzi immunologicznej poprzez obrazowanie komórek pierwotnych i analizę markerów komórkowych za pomocą FACS lub immunoblottingu znacząco poszerzyły naszą wiedzę, jednak badania te są zazwyczaj ograniczone technicznie przez małą objętość próbek dostępnych od pacjentów oraz brak możliwości przeprowadzania złożonych technik laboratoryjnych na wielu próbkach ludzkich. ImageStream łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym cyfrowym obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, co ułatwia badanie wielu populacji komórek jednocześnie w celu efektywnego uchwycenia podatności pacjentów. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie ImageStream w komórkach DC w celu oceny wzrostu fosforylacji i translokacji jądrowej kluczowego czynnika transkrypcyjnego, NF-κB, indukowanego aktywacją TLR7/8, który inicjuje transkrypcję licznych genów krytycznych dla odpowiedzi immunologicznych8. Wykorzystując tę technologię, wykazaliśmy również niedawno wcześniej niezauważoną zmianę w sygnalizacji TLR5 oraz w szlaku NF-κB w monocytach od starszych dawców, co może przyczyniać się do zmienionej reaktywności immunologicznej w procesie starzenia9.

Opisujemy zastosowanie technologii ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), która łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym cyfrowym obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w celu ilościowego określenia mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Nasze badania stanowią wzorzec dla analiz translacyjnych służących do ilościowego określania specyficznych dla linii komórkowych odpowiedzi w małych próbkach pobranych z kohort badanych.

Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Indywidualne różnice w stanie odporności determinują reakcje na infekcję i wpływają na ciężkość oraz przebieg choroby. Starzenie się wiąże się z...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zademonstrowanie wykorzystania technologii analizy strumieni obrazów do ilościowego określania mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Osiąga się to poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej lub pbmc z próbek krwi pobranych od pacjentów lub zdrowych ochotników. Po izolacji komórki są aktywowane, a następnie znakowane fluorescencyjnie.Następnie komórki są ogniskowane hydrodynamicznie, wzbudzane światłem laserowym i obrazowane przy użyciu integracji z opóźnieniem czasowym (TDI). Wykorzystywana jest kamera CCD. Na koniec, przy użyciu cytometru strumieniowego obrazów, pozyskiwane są obrazy oraz przeprowadzana jest kwantyfikacja NF kappa b.Translokację w każdym obrazie komórkowym wykonuje się przy użyciu oprogramowania ideas. Ostatecznie różnice między poszczególnymi grupami badawczymi można określić poprzez analizę wykresów kropkowych, histogramów oraz obrazów komórek. Zaletą strumieniowania obrazów jest połączenie danych faktograficznych z immunofluorescencją.Jesteśmy w stanie badać szlaki sygnalizacyjne komórek w sposób specyficzny dla danej linii komórkowej, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji, zaczynając od niewielkiej próbki krwi. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania badawcze poprzez lokalizację i kwantyfikację pośredników sygnalizacji. Można ją na przykład wykorzystać do badania mediowanej translokacji jądrowej czynników transkrypcyjnych lub do analizy wpływu starzenia się na biologię komórki.Pracownik mojego laboratorium zaprezentuje technikę po wyizolowaniu monocytów krwi obwodowej otrzymanych od ochotników. Resuspender odzyskane PBMC w stężeniu 3 × 10⁶ komórek na 0,6 ml pożywki, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 1,5 ml. Następnie część komórek należy stymulować agentem aktywującym, takim jak TLR8 agonistą R848 pokazanym tutaj, a potem inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37°C przez 10–60 minut w inkubatorze z 5% CO2.Po okresie inkubacji odwiruj komórki przez pięć minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, odlej supernatant, a następnie znakuj komórki koktajlem przeciwciał powierzchniowych specyficznych dla linii monocytów lub komórek DC przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w tym probówki z komórkami znakowanymi pojedynczymi koniugatami barwnymi, które posłużą jako kontrole kompensacji. Następnie utrwal komórki w 4% PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu komórek przez 10 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, resuspenduj PBMC w buforze do mrożenia i przechowuj komórki w temperaturze -80 °C do dnia przeprowadzenia analizy w ramach testu.Szybko rozmroź komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie, po odwirowaniu w celu usunięcia buforu do mrożenia, poddaj je permeabilizacji za pomocą 100 µL buforu do płukania i permeabilizacji BD perm. Następnie inkubuj je z przeciwciałami przeciwko wewnątrzkomórkowym komponentom sygnalizacyjnym, takimi jak przeciwciała anty-NF kappa BP 65 pokazane tutaj, przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu i zebraniu komórek w pellet, resuspenduj je w 100 µL buforu do płukania i permeabilizacji BD perm zawierającego przeciwciała kozie anty-rabbit IgG.Alexa 6 47 i inkubować PBMC przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed obrazowaniem przeprowadzić przeciwbarwienie komórek barwnikiem jądrowym; rozpocząć od włączenia ImageStream, a następnie uruchomić oprogramowanie Inspire. Następnie kliknąć „load default template”, a potem wybrać „initialize fluidics”.Następnie kliknij menu galerii obrazów i wybierz opcję „zaznacz wszystko”. Teraz naciśnij przycisk uruchomienia konfiguracji, aby rozpocząć obrazowanie kulek, a następnie wybierz kanał pola jasnego. Gdy kulki prędkościowe będą w ruchu, kliknij „start all” w zakładce assist, aby skalibrować i przetestować instrument.Po skalibrowaniu systemu ImageStream należy nacisnąć przycisk flush, lock and load, aby wprowadzić najjaśniejszą próbkę do urządzenia. Następnie należy ustawić moc lasera w taki sposób, aby każdy fluorochrom miał maksymalną wartość piksela między 104 000 counts, zgodnie z pomiarami na wykresach kropkowych. Następnie należy ustawić kryteria klasyfikacji komórek.Teraz kliknij „run, acquire”, aby zebrać i zapisać plik z danymi eksperymentnymi. Aby przeanalizować pliki z danymi, otwórz najpierw oprogramowanie analityczne. Utwórz skompensowane pliki obrazów, a następnie zastosuj bramkowanie dla zdarzeń o normalnej intensywności barwnika jądrowego i wysokim współczynniku kształtu (aspect ratio) barwnika jądrowego. Aby odróżnić pojedyncze komórki w bramce R1 od debris lub zdarzeń wielokomórkowych, monocyty lokalizuje się w bramce dla komórek CD14-dodatnich; mieloidalne komórki dendrytyczne, które wykazują wysoką ekspresję CD11c oraz niską ekspresję CD4 i markerów lin1, znajdują się w bramce R3.Na koniec należy użyć oprogramowania IDEAS do określenia kolokalizacji cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego NF kappa B z barwnikiem jądrowym. Wysoka korelacja NF kappa B i barwnika jądrowego, wskazująca na kolokalizację obu markerów, przejawia się wysokim wynikiem podobieństwa i określa stopień aktywacji komórki. Procent zdarzeń o wysokim podobieństwie pomiędzy różnymi grupami badawczymi lub populacjami pacjentów można porównać w celu oceny względnej wydajności funkcjonalnej komórek w programie IDEAS.Następnie można wykorzystać oprogramowanie do wyświetlania obrazów komórek z kluczowych segmentów histogramów populacji. System ImageStream umożliwia bramkowanie podzbiorów komórek bezpośrednio z pbmc oraz obrazowanie odpowiedzi komórkowych z bramkowanych, ale niesortowanych populacji komórek. W niniejszym przypadku określono ilościowo w stanie wyjściowym wpływ sygnalizacji TLR na lokalizację jądrową NF kappa BP 65 w myeloid dcs lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive.Obserwowano wysoki odsetek niepobudzonych komórek z czynnikiem transkrypcyjnym NF kappa BP 65 w cytoplazmie. Po stymulacji ustalono, że komórki poddane działaniu preparatu wykazują znacznie wyższy wynik podobieństwa NF Kappa BP 65 do jądrowego barwnika PI, co wskazuje na translokację NF Kappa BP 65 do jądra komórkowego po stymulacji. Cyfrowe obrazy populacji komórek niepoddanych działaniu czynnika oraz stymulowanych R 8 48, zebrane jednocześnie, przedstawiają reprezentatywne komórki oraz intensywność translokacji NF kappa B do jądra komórkowego. Należy zwrócić uwagę na większą intensywność barwienia NF Kappa B i PI w grupie stymulowanej R 8 48 w porównaniu do komórek niepobudzonych.Zastosowaliśmy tę technikę w badaniach komórek pochodzących od dawców w różnym wieku, wykazując różnice w szlakach aktywacji NF kappa B pośredniczonych przez TLR. Po opanowaniu tej metody, procedurę można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, poza dodatkowym czasem przeznaczonym na analizę obrazów, co pozwala na uzyskanie zarówno wielu obrazów lokalizacji, jak i statystyk populacyjnych. Dodatkowo możemy obrazować odpowiedzi bezpośrednio z wielu populacji komórkowych bez konieczności ich fizycznej separacji. Analiza strumieni obrazów może znaleźć szerokie zastosowanie w badaniu wielu mechanizmów komórkowych i powinna być bardzo wartościowa w badaniach translacyjnych.

quantitative-imaging-lineage-specific-toll-like-receptor-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowa wizualizacja powiązanego z pochodzeniem krwiotwórczym sygnałowania pośredniczonego przez receptor podobny do Toll w monocytach i komórkach dendrytycznych pochodzących z małych próbek krwi człowieka

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

W niniejszym raporcie przedstawiamy etapy barwienia i analizy w badaniu fenotypowania przeprowadzonym na świeżej krwi pełnej w celu zliczenia głównych populacji leukocytów wrodzonych i adaptacyjnych. Kładziemy szczególny nacisk na kwestie związane z wykonywaniem tych procedur w kontekście wieloośrodkowego badania klinicznego.

Wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej

Ten protokół opisuje użycie spektrometrii mas MALDI-TOF na komórkach eukariotycznych. Tutaj ilustrujemy dokładność tej techniki, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.

Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Poznaj ilościowe obrazowanie sygnalizacji TLR w monocytach i komórkach dendrytycznych z małych próbek krwi. Ta metoda łączy cytometrię przepływową z wysoką rozdzielczością obrazowania.

Ilościowe obrazowanie specyficznej dla linii sygnalizacji za pośrednictwem receptora toll-podobnego w monocytach i komórkach dendrytycznych z małych próbek ludzkiej krwi (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Przeglądaj więcej filmów