Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zademonstrowanie wykorzystania technologii analizy strumieni obrazów (image stream technology) do ilościowego określenia mechanizmów komórkowych w pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Jest to osiągane poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej (pbmc) z próbek krwi pobranych od pacjentów lub zdrowych ochotników. Po izolacji komórki są aktywowane, a następnie znakowane fluorescencyjnie.

Następnie komórki są ogniskowane hydrodynamicznie, wzbudzane światłem laserowym i obrazowane przy użyciu integracji z opóźnieniem czasowym (TDI). Kamera CCD. Na koniec obrazy są pozyskiwane za pomocą cytometru strumieniowego, a następnie przeprowadzana jest kwantyfikacja NF kappa b.

Translokację na każdym obrazie komórkowym wykonuje się przy użyciu oprogramowania ideas. Ostatecznie różnice między poszczególnymi grupami badawczymi można określić poprzez analizę wykresów kropkowych, histogramów oraz obrazów komórek. Zaletą cytometrii obrazowej jest to, że łączy ona dane analityczne z immunofluorescencją.

Jesteśmy w stanie badać szlaki sygnalizacyjne komórek w sposób specyficzny dla danej linii, zarówno na poziomie pojedynczych komórek, jak i populacji, zaczynając od niewielkiej próbki krwi. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania badawcze poprzez lokalizację i kwantyfikację pośredników sygnalizacji. Może ona na przykład służyć do badania zależnej od działania translokacji jądrowej czynników transparentnych lub do analizy wpływu starzenia się na biologię komórki.

Pracownik z mojego laboratorium zademonstruje technikę po wyizolowaniu mononuklearnych komórek krwi obwodowej uzyskanych od ochotników. Resuspendowane odzyskane PBMC w stężeniu 3×10⁶ komórek na 0,6 ml pożywki, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 1,5 ml. Następnie stymuluj część komórek czynnikiem aktywującym, takim jak TLR8 agonistą R848 pokazanym tutaj, a następnie inkubuj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C przez 10 do 60 minut w inkubatorze z 5% CO₂.

Po okresie inkubacji odwiruj komórki przez pięć minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, odlej nadsącz, a następnie znakuj komórki koktajlem przeciwciał powierzchniowych specyficznych dla linii monocytów lub DC przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w tym probówki z komórkami znakowanymi pojedynczymi koniugatami kolorystycznymi, które posłużą jako kontrole kompensacji. Następnie utrwal komórki w 4% PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu komórek przez 10 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, resuspenduj pbmc w buforze do mrożenia i przechowuj komórki w temperaturze -80 °C do dnia analizy w ramach testu.

Szybko rozmroź komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie, po odwirowaniu w celu usunięcia buforu do mrożenia, poddaj je permeabilizacji za pomocą 100 µL buforu do przemywania i permeabilizacji BD perm. Następnie inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej z przeciwciałami przeciwko wewnątrzkomórkowym komponentom sygnalizacyjnym, takimi jak przeciwciała anty-NF kappa BP 65 pokazane tutaj. Po odwirowaniu i zebraniu osadu resuspenduj komórki w 100 µL buforu do przemywania i permeabilizacji BD perm zawierającego przeciwciała kozie anty-rabbit IgG.

Alexa 6 47 i inkubuj PBMC przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed obrazowaniem przeprowadź przeciwbarwienie komórek barwnikiem jądrowym; rozpocznij od włączenia ImageStream, a następnie uruchom oprogramowanie Inspire. Następnie kliknij „load default template”, a potem wybierz „initialize fluidics”.

Następnie kliknij menu galerii obrazów i zaznacz wszystko. Teraz naciśnij run set up, aby rozpocząć obrazowanie kulek, a następnie wybierz kanał jasnego pola. Gdy kulki szybkościowe (speed beads) będą w ruchu, kliknij start all w zakładce assist, aby skalibrować i przetestować instrument.

Po skalibrowaniu systemu ImageStream należy nacisnąć przycisk „flush, lock and load”, aby wprowadzić do urządzenia próbkę o najwyższej intensywności sygnału. Następnie należy ustawić moc lasera w taki sposób, aby każdy fluorochrom miał maksymalną wartość piksela w zakresie od 104 000 counts, zgodnie z pomiarami na wykresach kropkowych. Na koniec należy zdefiniować kryteria klasyfikacji komórek.

Teraz kliknij „run”, a następnie „acquire”, aby zebrać i zapisać plik z danymi eksperymentu. Aby przeanalizować pliki z danymi, najpierw otwórz oprogramowanie analityczne IDEAS. Stwórz pliki obrazów skompensowanych, a następnie zastosuj bramkowanie dla zdarzeń o normalnej intensywności barwnika jądrowego i wysokim współczynniku kształtu (aspect ratio) barwnika jądrowego. Aby odróżnić pojedyncze komórki w bramce R1 od debris lub zdarzeń wielokomórkowych, monocyty zostaną zidentyfikowane w bramce dla komórek CD14-dodatnich, natomiast mieloidalne komórki dendrytyczne, wykazujące wysoką ekspresję CD11c oraz niską ekspresję CD4 i markerów lin1, znajdują się w bramce R3.

Na koniec należy użyć oprogramowania IDEAS do określenia kolokalizacji cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego NF kappa B z barwnikiem jądrowym. Wysoka korelacja NF kappa B z barwnikiem jądrowym, wskazująca na kolokalizację obu markerów, przejawia się w postaci wysokiego wyniku podobieństwa (similarity score) i wskazuje stopień aktywacji komórki. Procent zdarzeń o wysokim podobieństwie pomiędzy różnymi grupami badawczymi lub populacjami pacjentów można porównać w celu oceny względnej sprawności funkcjonalnej komórek w programie IDEAS.

Następnie można użyć oprogramowania do wyświetlenia obrazów komórek z kluczowych segmentów histogramów populacji. System ImageStream umożliwia bramkowanie podzbiorów komórek bezpośrednio z PBMC oraz obrazowanie odpowiedzi komórkowych z bramkowanych, lecz niesortowanych populacji komórek. W niniejszej pracy określono ilościowo w stanie spoczynkowym wpływ sygnalizacji TLR na lokalizację jądrową NF kappa BP 65 w myeloid DCs lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive.

Zaobserwowano wysoki odsetek niestymulowanych komórek z czynnikiem transkrypcyjnym NF kappa BP 65 w cytoplazmie. Po stymulacji ustalono, że komórki poddane działaniu preparatu wykazują znacznie wyższy wynik podobieństwa NF Kappa BP 65 do barwienia jądrowego PI, co wskazuje na translokację NF Kappa BP 65 do jądra komórkowego po stymulacji. Cyfrowe obrazy zebrane jednocześnie z populacji komórek nieleczonych oraz stymulowanych R 8 48 przedstawiają reprezentatywne komórki oraz intensywność translokacji NF kappa B do jądra komórkowego. Zwrócono uwagę na większą intensywność barwienia NF Kappa B oraz PI w grupie stymulowanej R 8 48 w porównaniu z komórkami nieleczonymi.

Zastosowaliśmy tę technikę na komórkach pochodzących od dawców w różnym wieku i wykazaliśmy różnice w szlakach aktywacji NF kappa B pośredniczonej przez TLR. Po opanowaniu metody, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu jednego dnia, nie licząc dodatkowego czasu na analizę obrazów, co pozwala na uzyskanie zarówno wielu obrazów lokalizacji, jak i statystyk populacyjnych. Ponadto możemy obrazować odpowiedzi bezpośrednio z wielu populacji komórek bez konieczności ich fizycznej separacji. Metoda Image stream może znaleźć szerokie zastosowanie w badaniu licznych mechanizmów komórkowych i powinna być bardzo wartościowa w badaniach translacyjnych.