Ilościowe obrazowanie specyficznej dla linii sygnalizacji za pośrednictwem receptora toll-podobnego w monocytach i komórkach dendrytycznych z małych próbek ludzkiej krwi

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie wykorzystania technologii strumienia obrazu do ilościowego określenia mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub pbmc z próbek krwi pobranych od pacjentów lub zdrowych ochotników. Po izolacji komórki są aktywowane, a następnie znakowane fluorescencyjnie.

Następnie komórki są skupiane hydrodynamicznie, wzbudzane światłem laserowym i obrazowane w procesie integracji z opóźnieniem czasowym. Kamera CCD. Na koniec wymagane są obrazy za pomocą cytometru strumienia obrazu i oznaczania ilościowego NF kappa b.

Translokacja w każdym obrazie komórkowym odbywa się za pomocą oprogramowania ideas. Ostatecznie różnice między każdą grupą badaną można określić poprzez analizę wykresów punktowych, histogramów i obrazów komórek. Zaletą strumienia obrazu jest to, że łączy fakty i immunofluorescencję.

Jesteśmy w stanie przyjrzeć się szlakom sygnalizacji komórkowej w sposób specyficzny dla linii, zarówno pojedynczej komórki, jak i populacji, zaczynając od tylko małej próbki krwi. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wiedzy poprzez lokalizację i kwantyfikację pośrednich sygnałów. Na przykład, może być wykorzystany do zbadania translokacji jądrowej czynników przezroczystych za pośrednictwem działania lub do przyjrzenia się wpływowi starzenia się na biologię komórki.

Lider pierwszy z mojego laboratorium zademonstruje technikę po wyizolowaniu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej uzyskanych od ludzkich ochotników. Resus ponownie zawiesić odzyskane p BMC w ilości trzy razy od 10 do szóstej komórki na 0,6 mililitra pożywki, a następnie przenieść zawiesinę komórek do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie stymuluj niektóre komórki środkiem aktywującym, takim jak pokazany tutaj TLR eight LA R 8 4 8, a następnie inkubuj wszystkie komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 60 minut w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Po okresie inkubacji osadzać komórki przez pięć minut w temperaturze 500 razy G w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant, znakować komórki koktajlem przeciwciał powierzchniowych specyficznych dla linii monocytów lub DC przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w tym probówki komórek znakowanych jednokolorowymi koniugatami, które mają być użyte jako kontrole kompensacyjne. Następnie utrwal komórki w 4%P-F-A-P-B-S przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu komórek przez 10 minut w temperaturze 500 razy G w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić pbmc w buforze zamrażającym i przechowywać komórki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy zostaną przeanalizowane w dniu testu.

Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie po odwirowaniu w celu usunięcia buforu zamrażającego, przepłukać je 100 mikrolitrami buforu do płukania BD perm. Następnie oznacz przeciwciałami anty wewnątrzkomórkowymi składnikami sygnalizacyjnymi, takimi jak pokazane tutaj przeciwciała anty NF kappa BP 65 przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po granulowaniu komórki Resus zawieszają je w 100 mikrolitrach buforu do płukania BD perm zawierającego kozią anty króliczą IgG.

Alexa 6 47 i inkubuj pbmc przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed obrazowaniem przeciwbarwić komórki barwnikiem jądrowym, zacznij od włączenia strumienia obrazu, a następnie uruchom oprogramowanie inspirujące. Następnie kliknij załaduj domyślny szablon, a następnie wybierz opcję Zainicjuj fluidykę.

Następnie kliknij menu galerii obrazów i zaznacz wszystko. Teraz naciśnij uruchom ustawienie, aby rozpocząć obrazowanie koralików, a następnie wybierz kanał jasnego pola. Po uruchomieniu koralików prędkości kliknij przycisk rozpocznij wszystko pod zakładką pomocy, aby skalibrować i przetestować urządzenie.

Po skalibrowaniu systemu ImageStream naciśnij przycisk flush, lock i load, aby załadować najjaśniejszą próbkę do urządzenia. Następnie ustaw moc lasera tak, aby każdy chrom flory miał maksymalną wartość piksela w zakresie 104 000 zliczeń mierzoną na wykresach punktowych. Następnie ustaw kryteria klasyfikacji komórek.

Teraz kliknij uruchom, pobierz, aby zebrać i zapisać plik danych eksperymentu, aby najpierw przeanalizować pliki danych, otworzyć pomysły. Oprogramowanie analityczne tworzy skompensowane pliki obrazów, a następnie bramkuje zdarzenia o normalnej intensywności barwnika jądrowego i wysokim współczynniku proporcji barwnika jądrowego. Aby odróżnić pojedyncze komórki w bramie R one od szczątków lub zdarzeń wielokomórkowych, monocyty znajdują się w bramie dla komórek CD 14 dodatnich, mieloidalne komórki dendrytyczne, które są wysokie dla CD 11 C i niskie dla CD cztery, a markery lin jeden znajdują się w bramce R trzy.

Na koniec użyj oprogramowania ideas, aby określić kolokalizację cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego NF kappa B z barwnikiem jądrowym. Wysoka korelacja barwnika jądrowego NF kappa B wskazująca na kolokalizację dwóch markerów znajduje odzwierciedlenie w wysokim wyniku podobieństwa i wskazuje na stopień aktywacji komórki. Odsetek zdarzeń o wysokim podobieństwie między różnymi grupami leczonymi lub populacjami pacjentów można porównać w celu oceny względnej wydajności funkcjonalnej pomysłu na komórki.

Oprogramowanie może być następnie wykorzystane do wyświetlenia obrazów komórek z kluczowych segmentów histogramów populacji. ImageStream umożliwia bramkowanie podzbiorów komórek bezpośrednio z pbmc i obrazowanie odpowiedzi komórek z bramkowanych, ale nieposortowanych populacji komórek. Tutaj wpływ sygnalizacji TLR na lokalizację jądrową NF kappa BP 65 w lin jeden, ujemny CD cztery, dim CD 11 C dodatni mieloidalny dcs określono ilościowo na początku badania.

Zaobserwowano wysoki odsetek niestymulowanych komórek z czynnikiem transkrypcyjnym NF kappa BP 65 w cytoplazmie Po stymulacji stwierdzono, że leczone komórki mają znacznie wyższy wynik podobieństwa NF Kappa BP 65 z barwieniem jądrowym PI, co wskazuje, że NF Kappa BP 65 trans znajduje się w jądrze po stymulacji. Cyfrowe obrazy zebrane jednocześnie populacji komórek nieleczonych lub stymulowanych R 8 48 pokazują reprezentatywne komórki i intensywność trans NF kappa B zlokalizowanego w jądrze komórkowym. Zwróć uwagę na jaśniejszą intensywność barwienia NF, Kappa, B i PI w grupie stymulowanej R 8 48 w porównaniu z komórkami nieleczonymi.

Użyliśmy tej techniki na komórkach od dawców w różnym wieku i wykazaliśmy różnice w szlakach aktywacji NF kappa B za pośrednictwem TLR Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu jednego dnia w dodatkowym czasie na analizę obrazu, co pozwala zarówno na kilka obrazów lokalizacyjnych, jak i statystyki populacji. Ponadto możemy obrazować odpowiedzi bezpośrednio z wielu populacji komórek bez fizycznej separacji. Strumień obrazu może być szeroko stosowany do wielu mechanizmów komórkowych i powinien być bardzo cenny w badaniach translacyjnych.