Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wbudowywania białek neuronalnych w błonę plazmatyczną. Osiąga się to poprzez uprzednie zainfekowanie hodowanych neuronów hipokampa wirusem sinus w celu ekspresji badanego białka, które jest znakowane super ecliptic, Florin lub sep. Następnie poddawany jest fotowybielaniu wybrany obszar zainteresowania (ROI).

Następnie segmenty flankujące są powtarzalnie wybielane fotochemicznie, podczas gdy oryginalny obszar zainteresowania poddawany jest regeneracji fluorescencji. Na koniec analizowana jest regeneracja fluorescencji w obszarze zainteresowania. Ostatecznie ta adaptacja konwencjonalnych eksperymentów FRAP służy do wykazania wzorca zdarzeń egzocytozy białka docelowego w błonie plazmatycznej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak biotynylacja powierzchniowa czy podawanie przeciwciał, jest możliwość wizualizacji dynamiki zdarzeń wbudowywania w błonę. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące transportu białek, określając miejsce i sposób zachodzenia zdarzeń egzocytozy. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy szukałem alternatywy dla znakowania powierzchniowego, aby móc badać zdarzenia egzocytozy w kolcach dendrytycznych w eksperymentach na żywych komórkach. W celu rozpoczęcia, należy hodować neurony hipokampa o wysokiej gęstości, pochodzące z embrionów szczurów z 18. dnia rozwoju, na szkiełkach podstawkowych pokrytych poli-L-lizyną przez 14 do 25 dni in vitro, rozpoczynając proces od 6 do 24 godzin przed eksperymentem na żywo.

Przeprowadź transdukcję komórek wirusem symbis kodującym interesujące białko błonowe, oznaczonym SUP ecliptic fluorine osep. Dodaj pseudowiriony zawierające medium bezpośrednio na szkiełko podstawowe zawierające 1 ml medium kondycjonowanego, a następnie przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli. Aby obrazować komórki, włącz mikroskop konfokalny zes axia vert LSM five 10 meta z 100% mocą lasera na co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem obrazowania.

Aby zminimalizować wahania mocy podczas obrazowania oraz wstępnie ogrzać stoлик. Gdy mikroskop będzie gotowy, należy wybrać obiektyw 63x, następnie przenieść szkiełko nakrywkę do komory obrazowania i niezwłocznie wymienić medium hodowlane. Wstępnie ogrzać pozakomórkowy roztwór rejestrujący.

Umieść komorę na podgrzanym stoliku mikroskopu. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest zapewnienie, aby stan zdrowotny komórek nie został naruszony podczas procesu rejestracji. Ponieważ protokół ten wymaga intensywnego fotoblaknięcia w celu zapewnienia sukcesu, należy upewnić się, że wszystkie parametry obrazowania zostały zoptymalizowane przed rozpoczęciem eksperymentów na szeroką skalę i przedłożyć szybką akwizycję nad wysoką jakość obrazów.

Aby zdefiniować parametry akwizycji obrazu, należy zidentyfikować neuron wykazujący ekspresję badanego białka rekombinowanego i ustawić go w ostrości. Następnie należy przeskanować całą komórkę za pomocą lasera 488 nm przy niskiej mocy, aby zminimalizować fotoblaknięcie.

Należy zastosować wysoką prędkość nominalną oraz niską rozdzielczość pikseli, utrzymując całkowity czas skanowania poniżej jednej sekundy. Wybrano fragment dendrytu do obrazowania przy użyciu zoomu optycznego od 1,5 do 2,5.

Należy zarejestrować klatkę zawierającą obszar zainteresowania, aby ocenić, czy występuje niespecyficzne fotoblaknięcie. Należy zadbać o to, aby pole widzenia obejmowało kilka wypustek, co umożliwi uzyskanie pomiarów z dendrytów referencyjnych. Korzystając z palety wskaźnika zakresu, należy dostosować parametry obrazowania w taki sposób, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym pobudzeniu laserowym, unikając przy tym nadmiernego nasycenia.

Zaleca się stosowanie dużej średnicy otworu pinhole, aby zmaksymalizować zbieranie fotonów. Wzmocnienie detektora powinno być wystarczające do wykrycia niewielkich przyrostów fluorescencji, tak aby pierwsze obrazy przed fotoblaknięciem nie przekraczały 10% nasyconych pikseli. Należy dostosować ostrość, aby zapewnić osiągnięcie płaszczyzny ogniskowej w linii środkowej.

Po ustawieniu konfiguracji należy ją zapisać, aby mogła zostać wykorzystana w fazach przed i po rekuperacji w eksperymencie. Następnie należy zdefiniować obszary fotowybielania, wybierając obszar zainteresowania (ROI) dla początkowego fotowybielania oraz obszary flankujące dla następującej po nim fazy powtarzalnego fotowybielania.

Podczas wstępnego fotowybielania fotowybielane będą zarówno centralne, jak i flankujące ROI. W przypadku powtarzalnego fotowybielania wybierane są jedynie ROI flankujące. Należy upewnić się, że obszary flankujące są wystarczająco szerokie, aby zapobiec rekuperacji poprzez dyfuzję pomiędzy skanami.

Dostosuj parametry wybielania dla obu obszarów zainteresowania (ROI) poddawanych fotowybielaniu. Początkowe fotowybielanie powinno być szybkie, wymagając od jednej do pięciu iteracji, w zależności od zoomu optycznego i objętości ROI. W przypadku obszarów flankujących należy dostosować wzbudzenie laserem tak, aby zapewnić ciągłe fotowybielanie, ale bez powodowania uszkodzeń fototoksycznych. Po ustawieniu parametrów przeprowadź eksperyment FRA flip jako sekwencję obrazów time-lapse o zmijnym czasie, rozpoczynając od wykonania od trzech do 10 obrazów bazowych przed wybielaniem (preble) przy niskiej mocy lasera i bez opóźnienia czasowego.

Następnie przeprowadź fotowybielanie centralnego ROI przy pełnej mocy lasera przez jedną do pięciu iteracji. Następnie zarejestruj od trzech do 10 obrazów regeneracji po wybielaniu. Wykonaj powtarzalne fotowybielanie obszarów flankujących przy średniej mocy lasera, rejestrując obrazy w typowym odstępie czasu od jednej do pięciu sekund, w zależności od szybkości regeneracji badanego białka.

Na koniec, aby wygasić fluorescencję, należy zastąpić zewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący roztworem rejestrującym buforowanym do pH 6, lub, aby ujawnić białko w wewnątrzkomórkowych magazynach o niskim pH, należy użyć buforu uzupełnionego o 50 mM chlorku amonu. Należy zebrać co najmniej 10 do 20 zestawów danych dla każdego białka rekombinowanego, aby umożliwić analizę statystyczną i uniknąć wyników obarczonych błędem; należy upewnić się, że warunki obrazowania są zachowane we wszystkich powtórzeniach. Aby przeanalizować obrazy, należy je otworzyć.

Używając oprogramowania Image J, wyrównaj stosy obrazów, aby uwzględnić niewielkie fluktuacje w płaszczyźnie XY, które mogły wystąpić w trakcie serii czasowej. W przypadku obrazów wykonanych konfokalnym mikroskopem zes, wykorzystaj wtyczkę stack reg do wyrównania, a następnie wtyczkę LSM toolbox, aby wyeksportować wartości czasu do pliku tekstowego; zaimportuj te wartości do arkusza analizy w celu pomiaru fluktuacji fluorescencji. Podczas eksperymentu FRA flip podziel segment fotowybielania na poszczególne obszary pikseli, korzystając z narzędzia analizy image ROI manager w celu wybrania wielu ROI.

Następnie należy użyć polecenia plot Z axis profile, aby zmierzyć średnią fluorescencję na piksel w każdym punkcie czasowym. Powtórz ten proces, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji w niefluorescencyjnym obszarze tła. Znormalizuj intensywność fluorescencji w każdym punkcie czasowym poprzez odjęcie wartości tła w celu usunięcia szumu eksperymentalnego, a następnie podziel wszystkie wartości przez średnią pomiarową linii bazowej przed wybielaniem lub wartość bezpośrednio po wybielaniu.

Przeanalizuj przebieg regeneracji dla każdego ROI w funkcji czasu, aby obliczyć, czy nastąpiła istotna regeneracja. W danym ROI oblicz deltę F, odejmując średnią z pierwszych pięciu do 10 pomiarów sekwencji regeneracji po fotobleachingu od średniej z ostatnich pięciu do 10 pomiarów. Następnie określ istotność statystyczną delty F i scharakteryzuj ROI regenerujące się oraz nieregenerujące się, aby ocenić wzorzec egzocytozy.

Są to punkty intensywnej egzocytozy lub regeneracja kolca w porównaniu z regeneracją szyjki. Ten film przedstawia reprezentatywny wynik typowego eksperymentu FRAP-flip z użyciem kleju SERP. Dwa.

Obszar dendrytu zostaje poddany jednorazowemu fotowybielaniu, po którym następuje minutowy okres regeneracji. Następnie rozpoczyna się powtarzalne fotowybielanie obszarów sąsiadujących, co zaznaczono niebieskimi strzałkami. Czerwona strzałka wskazuje niewielki obszar zainteresowania, w którym obserwuje się powrót fluorescencji, przedstawiony w powiększeniu w prawym panelu ekranu.

Proces regeneracji jest śledzony na poniższym wykresie, gdzie całkowity wzrost fluorescencji jest oznaczony jako delta F. Wzrost fluorescencji zaobserwowany w tej sekwencji można przypisać wstawieniu glue A two do trzonu dendrytu. Duże zmiany intensywności fluorescencji pod koniec eksperymentu wykazują wpływ niskiego pH oraz przemyć w pH 7.4 z dodatkiem chlorku amonu na sygnał fluorescencji SEP. W tym przykładzie neurony zostały zainfekowane SEP glue K two.

W tym przypadku przeprowadzono fotowybielanie dużego ROI z wieloma dendrytami w polu widzenia, a następnie selektywne, powtarzalne fotowybielanie tylko jednego dendrytu. Przed obrazowaniem neurony te poddano działaniu cykloheksymidu przez dwie godziny w celu zablokowania syntezy białek. W związku z tym powrót fluorescencji w odpowiednich mierzonych ROI ujawnia proporcję regeneracji wynikającą z dyfuzji bocznej i recyklingu w standardowym FRAP dendrytu w porównaniu do samego recyklingu w dendrytach poddanych protokołowi FRAP-FLIP.

Porównując wartości delta F z krzywych regeneracji FRAP oraz FRAP-flip, można wywnioskować względny udział recyklingu w stosunku do dyfuzji bocznej dzięki inhibicji syntezy białek. Regeneracja wykazuje późniejszy spadek sygnału w miarę wyczerpywania się dostępnej puli receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować, przeprowadzić i przeanalizować udane eksperymenty obrazowania w neuronach.

Stosując tę kombinację technik fotoblaknięcia, można zbadać dowody na wbudowanie w błonę badanego białka.