Name: Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowanych neuronach oceniana za pomocą odzyskiwania fluorescencji i fotowybielania utraty fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji wstawiania białek neuronalnych do błony komórkowej za pomocą fotowybielania i odzyskiwania fluorescencji w hodowanych neuronach hipokampalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Wellcome Trust oraz ERC za wsparcie finansowe. IMGG jest stypendystą EMBO. KLH jest doktorantem finansowanym przez BBSRC. Dziękujemy Philipowi Rubinowi i Patrickowi Tidballowi za wsparcie techniczne i pomoc w hodowli komórkowej oraz dr. Andrew Doherty za konserwację i pomoc w obsłudze mikroskopów.

1. Hodowla komórkowa, transdukcja wirusowa i ekspresja białek
<ol>
 <li>Hodować neurony hipokampa o wysokiej gęstości z embrionów szczura z 18. dnia rozwoju (E18) na szkiełkach podstawkowych pokrytych poli-L-lizyną przez 14-25 dni in vitro (DIV).</li>
 <li>Od 6 do 24 godzin przed eksperymentami na żywo transdukować komórki atenuowanym wirusem Sindbis zawierającym interesujące białko błonowe, oznakowane super-ecliptic pHluorin (SEP).</li>
 <li>Dodać medium zawierające pseudowiriony bezpośrednio na szkiełko podstawkowe zawierające 1mL medium warunkującego i przenieść do inkubatora hodowlanego. Miano oraz czas ekspresji białka po transdukcji wirusowej będą się różnić w zależności od partii wirusa i powinny zostać określone dla każdej partii przed rozpoczęciem eksperymentów na żywych komórkach.</li>
</ol>
2. Obrazowanie żywych komórek metodą FRAP-FLIP
<ol>
 <li>Przygotowanie sprzętu
 <ol>
 <li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania konfokalnego mikroskopu Zeiss Axiovert LSM 510 META. Aby zminimalizować wahania mocy podczas obrazowania, upewnij się, że mikroskop był włączony przy 100% mocy lasera przez co najmniej 20 min przed rozpoczęciem pomiarów.</li>
 <li>Natychmiast zastąp pożywkę hodowlaną podgrzanym wcześniej (37 °C) roztworem do rejestracji zewnątrzkomórkowej zawierającym 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukozy, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH skorygowane do 7,4 za pomocą NaOH) i umieść komorę na podgrzanym stole (37 °C) mikroskopu Zeiss Axiovert. 
 
 Upewnij się, że osmolarność roztworu do rejestracji zewnątrzkomórkowej jest dostosowana do wartości w granicach 10 mOsM od Twojej pożywki hodowlanej. Przy założeniu, że w czasie trwania eksperymentu nie wystąpi znaczące parowanie, ten roztwór niezależny od CO2 jest odpowiedni do krótkich eksperymentów (&lt;10 h). Zaleca się uzupełnienie go o 1-2 mM wodorowęglanu sodu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Określenie parametrów akwizycji obrazu
 <ol>
 <li>W pierwszej kolejności zidentyfikuj neuron wykazujący ekspresję interesującego białka rekombinowanego i ustaw ostrość.</li>
 <li>Przy użyciu obiektywu olejowego 63X wykonaj obraz całej komórki, stosując wzbudzenie światłem lasera 488 nm przy niskiej mocy lasera. Aby zminimalizować fotobleaching, zastosuj szybką prędkość nominalną (7-9) i niską rozdzielczość pikseli (512-512), utrzymując całkowity czas skanowania &lt;1 s.</li>
 <li>Wybierz fragment dendrytu do obrazowania i powiększ go, aby uchwycić klatkę zawierającą ROI (~1,5-2,5 x zoom optyczny). Jeśli to możliwe, upewnij się, że pole widzenia zawiera kilka wypustek, tak aby można było uzyskać pomiary z dendrytów referencyjnych w celu ustalenia, czy występuje nieswoisty fotobleaching wynikający z akwizycji.</li>
 <li>Dostosuj filtry, pinhole, prędkość skanowania i wzmocnienie detektora, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym wzbudzeniu laserowym, ale z ograniczoną saturacją. Zaleca się dużą średnicę pinhole, aby zmaksymalizować zbieranie fotonów (2 μm jest odpowiednie dla kolców i dendrytów trzeciorzędowych). Wzmocnienie detektora powinno być wystarczająco silne, aby wykrywać niewielkie przyrosty fluorescencji, tak aby pierwsze obrazy, przed fotobleachingiem, nie przekraczały 10% nasyconych pikseli.</li>
 <li>Zapisz tę konfigurację, aby była używana w fazach przed/po fotobleachingu oraz w fazie regeneracji w trakcie eksperymentu.</li>
 <li>Następnie zdefiniuj obszary fotobleachingu; wybierz ROI dla początkowego fotobleachingu oraz obszary flankujące dla późniejszej fazy powtarzalnego fotobleachingu. Upewnij się, że obszary flankujące są wystarczająco szerokie, aby zapobiec regeneracji poprzez dyfuzję między skanami (zazwyczaj 5 μm, patrz Rys. 2).</li>
 <li>Dostosuj parametry bleachingu dla obu ROI fotobleachingu. Początkowy fotobleaching powinien być szybki (0,1-0,5 s) i wymagać od 1 do 5 iteracji, w zależności od zoomu optycznego i objętości ROI. Dla obszarów flankujących wzbudzenie laserowe należy dostosować tak, aby zapewnić ciągły fotobleaching tych obszarów, ale bez uszkodzeń fototoksycznych.</li>
 <li>Jako wytyczną stosujemy 100% wzbudzenia laserowego dla początkowego fotobleachingu i 10% dla fazy powtarzalnego fotobleachingu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Akwizycja obrazu
 <ol>
 <li>Po ustawieniu wszystkich parametrów przeprowadź eksperyment FRAP-FLIP jako sekwencję obrazów time-lapse o zmiennym czasie, zgodnie z poniższymi 4 blokami: 
 
 BLOK 1: 3-10 obrazów bazowych przed bleachingu, przy niskiej mocy lasera, bez opóźnienia czasowego 
 BLOK 2: Fotobleaching centralnego ROI przy pełnej mocy lasera, 1-5 iteracji 
 BLOK 3: 3-10 obrazów regeneracji po bleachingu 
 BLOK 4: Powtarzalny fotobleaching obszarów flankujących przy średniej mocy lasera z przechwytywaniem obrazu w typowym odstępie czasu od 1 do 5 s, w zależności od szybkości regeneracji badanego białka.</li>
 <li>Na koniec zastąp roztwór do rejestracji zewnątrzkomórkowej roztworem buforowanym do pH 6 zawierającym 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukozy, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM MES (aby wygasić fluorescencję) lub uzupełnionym o 50 mM NH4Cl zawierającym 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukozy, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (aby ujawnić białka w wewnątrzkomórkowych magazynach o niskim pH), (patrz Rys. 2).</li>
 <li>Zbierz co najmniej 10 do 20 zestawów danych dla każdego białka rekombinowanego, aby umożliwić analizę statystyczną. Aby uniknąć błędnych wyników, upewnij się, że warunki obrazowania są spójne we wszystkich powtórzeniach. Odrzuć wszelkie zestawy danych, w których zaobserwowano niepełny bleaching, znaczny dryft płaszczyzny ogniskowej lub fototoksyczne uszkodzenie komórek.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
 <li>Otwórz obrazy w programie ImageJ.</li>
 <li>Wyrównaj stosy obrazów, aby uwzględnić niewielkie fluktuacje w płaszczyźnie xy, które mogły wystąpić w trakcie serii czasowej, korzystając z wtyczki Stackreg (plugins → stackreg → transformation: rigid body → &lt;ok&gt;).</li>
 <li>W przypadku obrazów wykonanych konfokalnym mikroskopem Zeiss, użyj wtyczki LSM Toolbox, aby wyeksportować wartości czasu do pliku tekstowego (plugins → LSM Toolbox → Show LSM Toolbox → &lt;apply stamps&gt; → &lt;apply t-stamp&gt;), a następnie zaimportuj te wartości do arkusza analizy.</li>
 <li>Aby zmierzyć fluktuacje fluorescencji podczas eksperymentu FRAP-FLIP, podziel segment poddanego fotowybielaniu na poszczególne regiony pikseli (~20 pikseli) i zmierz średnią fluorescencję tych ROI w każdym punkcie czasowym (F). Aby szybko uzyskać te wartości, zaznacz wiele ROI za pomocą narzędzia analitycznego „ROI Manager” w programie ImageJ (Analyze → Tools → ROI Manager) i odczytaj średnią fluorescencję na piksel, korzystając z polecenia „Plot Z-axis profile” (Image → Stacks → Plot Z-axis profile).</li>
 <li>Powtórz ten krok, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w tle, w regionie niefluorescencyjnym.</li>
 <li>Znormalizuj intensywność fluorescencji w każdym punkcie czasowym, odejmując wartości tła w celu usunięcia szumu eksperymentalnego, a następnie podziel wszystkie wartości przez średnią pomiarową linii bazowej przed fotowybielaniem.</li>
 <li>Zmierz intensywność fluorescencji w sąsiednich dendrytach niepoddanych fotowybielaniu, aby ocenić poziom nieswoistego fotowybielania podczas akwizycji. Korekta o nieswoiste fotowybielanie jest niewskazana przy interpretacji danych „FRAP-FLIP” i należy jej unikać, jeśli to możliwe.</li>
 <li>Aby obliczyć, czy w danym ROI nastąpiła istotna regeneracja, odejmij średnią z ostatnich 5-10 pomiarów sekwencji od średniej z pierwszych 5-10 pomiarów (ΔF) i określ istotność statystyczną. Skategoryzuj ROI regenerujące się i nieregenerujące się, aby ocenić wzorzec egzocytozy (np. miejsca intensywnej egzocytozy – hotspots lub regeneracja kolca względem trzonu).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wynik typowego eksperymentu FRAP-FLIP przedstawiono na Ryc. 2. W tym przypadku neuron wykazujący ekspresję podjednostki GluA2 receptora glutaminianowego typu AMPA, znakowanej SEP, został selektywnie wybielony fotochemicznie wzdłuż odcinka dendrytu. Ryc. 2.A ilustruje obrazowany obszar dendrytu i wskazuje ROI wybrane do fotowybielania (obszary w białych ramkach). Duży obszar w białej ramce został wybielony raz, po czym nastąpiło powtarzalne wybielanie sąsiadujących obszarów w ramkach, zaznaczonych niebieskimi strzałkami dwustronnymi. Czerwona strzałka wskazuje mierzone ROI, przedstawione w dużym powiększeniu na dolnych panelach.
Rys. 2.B przedstawia intensywność fluorescencji w zmierzonym ROI w czasie trwania eksperymentu. W tym przykładzie, po początkowym fotowybieleniu, zarejestrowano minutowy okres regeneracji, aby umożliwić niewybielonym receptorom przedostanie się do ROI poprzez dyfuzję boczną. Gdy regiony flankujące zostaną poddane fotowybieleniu, sygnał fluorescencji z tej wysoce ruchliwej frakcji receptorów zostaje odcięty od regionu centralnego, a receptory znajdujące się wewnątrz tego regionu ulegają rozcieńczeniu. Przyrost fluorescencji (ΔF) obserwowany podczas sekwencji „FLIP” można zatem przypisać insercji SEP-GluA2 w trzonie dendrytycznym. Płukanie niskim pH oraz dodanie pH 7.4 + NH4Cl potwierdzają odpowiednio, że mierzona fluorescencja pochodzi z białek powierzchniowych, i ujawniają proporcję wewnątrzkomórkowych, sekwestrowanych białek w zmierzonym ROI.
W przeciwieństwie do metody FRAP, niniejsza metodologia izoluje powrót fluorescencji wynikający z egzocytozy, co prowadzi do znacznego obniżenia poziomu regeneracji fluorescencji w regionie poddanym fotobleachingowi. Do tej pory nie opracowano wiarygodnego modelu matematycznego do dopasowania i analizy krzywych regeneracji zarejestrowanych przy użyciu tej techniki selektywnego wybielania. Możliwe jest jednak dopasowanie krzywej regeneracji za pomocą funkcji monoeksponencjalnej:
F(t)=As - A0e(-t/τ)
Gdzie F(t) to fluorescencja w czasie t, As to wartość stanu stacjonarnego, A0 to przesunięcie w czasie 0, a τ to stała czasowa. Wzrost regeneracji jest ustalony z określoną szybkością w celu osiągnięcia równowagi, odpowiadającej stanowi stacjonarnemu między insercją a dyfuzją. Co ważne, stała czasowa wyznaczona z tej analizy nie odzwierciedla stałej czasowej egzocytozy i może być stosowana wyłącznie do porównawczych analiz dla pojedynczego białka.
Ponadto oczekiwany wzór powrotu fluorescencji prawdopodobnie zostanie zaobserwowany w subdomenach wzdłuż obszaru poddanego fotoblaknięciu. Analiza małych ROI w obrębie segmentu poddanego fotoblaknięciu może być niezbędna do ujawnienia „gorących punktów” (hotspots) egzocytozy; zaleca się analizowanie obszarów o porównywalnej długości, ponieważ zmienność gęstości tych punktów w obrębie dendrytu wpłynie na obliczoną szybkość.
Rys. 3 przedstawia rozszerzenie tego protokołu, w którym fotowyblaknięcie zastosowano do dużego ROI przekroju z wieloma dendrytami w polu widzenia, a następnie przeprowadzono selektywne, powtarzalne wyblaknięcie tylko jednego dendrytu. Podejście to umożliwia równoległe pozyskiwanie tradycyjnych danych „FRAP” i „FRAP-FLIP”. W tym przykładzie neurony hipokampa zostały zainfekowane podjednostką receptora glutaminianu z klasy kainianowej: SEP-tagged GluK2. Przed obrazowaniem neurony te poddano działaniu cykloheksymidu (2 h przy 200μg/ml), aby zablokować syntezę białek. W związku z tym odzyskiwanie fluorescencji w odpowiednich mierzonych ROI (Rys. 3.B) ujawnia proporcję odzyskiwania wynikającą z dyfuzji bocznej i recyklingu w standardowym dendrycie FRAP w porównaniu z samym recyklingiem w dendrycie poddanym protokołowi „FRAP-FLIP”. Porównując wartości ΔF z krzywych odzyskiwania FRAP i „FRAP-FLIP”, można wywnioskować względne wkłady recyklingu (ΔFrec = 11,05%) w stosunku do dyfuzji bocznej (ΔFdiff = 9,35%). W przeciwieństwie do Rysunku 2, odzyskiwanie nie utrzymuje stałego poziomu, lecz ze względu na zahamowanie syntezy białek wykazuje przejściowy wzrost, a następnie spadek sygnału, co odpowiada wyczerpaniu dostępnej puli receptorów (obserwowany spadek o około 20% w okresie rejestracji).
<img alt="Równowaga statyczna; receptory znakowane SEP; schemat fotoblaknięcia; dyfuzja boczna; proces insercji." src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1. Schemat zasad protokołów FRAP i FRAP-FLIP. Schemat ten ilustruje wyniki standardowego protokołu FRAP w porównaniu z protokołem „FRAP-FLIP” z wykorzystaniem receptorów znakowanych SEP. Odzyskiwanie fluorescencji w tradycyjnym FRAP pokazano po lewej stronie. Zmierzony powrót fluorescencji w centralnym ROI przypisuje się kombinacji dyfuzji bocznej niewybielonych receptorów znakowanych SEP spoza wybielonego ROI oraz wbudowywania receptorów poprzez recykling i/lub egzocytozę de novo do trzonu dendrytu. W przeciwieństwie do tego, powtarzalne wybielanie flankujących ROI przedstawione po prawej stronie pokazuje, jak ten zmodyfikowany protokół „FRAP-FLIP” wycisza odzyskiwanie fluorescencji wynikające z dyfuzji bocznej. W związku z tym każdy zmierzony powrót fluorescencji można przypisać bezpośredniemu wbudowywaniu w ROI.
<img alt="Analiza fotowybielania neuronów; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykres intensywności; wpływ pH." src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rycina 2. Wbudowywanie SEP-GluA2 w błonę plazmatyczną w obrębie trzonu dendrytu
A) Neuron hipokampa wykazujący ekspresję SEP-GluA2, selektywnie wybielony fotochemicznie wzdłuż odcinka dendrytu. Schemat ilustruje obrazowany odcinek dendrytu, natomiast panel w lewym górnym rogu wyróżnia obszary ROI wybrane do wybielania. Duży obszar zaznaczony białą ramką został wybielony raz, po czym nastąpiło powtarzalne wybielanie sąsiadujących obszarów w ramkach, zaznaczonych niebieskimi strzałkami dwukierunkowymi. Ten panel przedstawia dendryt przed wybielaniem fotochemicznym. Czerwona strzałka wskazuje pomiarowy obszar ROI, pokazany w dużym powiększeniu w dolnych panelach. B) przedstawia intensywność fluorescencji w pomiarowym ROI w czasie trwania eksperymentu, wykreśloną jako poziom szarości w ROI (brak normalizacji). Czarna strzałka wyróżnia punkt czasowy początkowego wybielania fotochemicznego, a zielona strzałka wskazuje początek powtarzalnego wybielania. ΔF oznacza wzrost fluorescencji zaobserwowany w okresie regeneracji, wynikający z wbudowania SEP-GluA2 w trzon dendrytu. Następujące po tym przemycia w niskim pH oraz w pH 7,4 + NH4Cl potwierdzają, że odzyskana fluorescencja odnosi się do receptorów eksponowanych na powierzchni.
<img alt="Schemat powrotu fluorescencji i fotoblaknięcia; dyfuzja boczna, analiza recyklingu, test FRAP/FLIP." src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">
Rycina 3. Recykling i dyfuzja boczna w porównaniu z recyklingiem SEP-GluK2 na trzpieniu dendrytu po zastosowaniu cykloheksymidu
A) Neuron hipokampa wykazujący ekspresję SEP-GluK2, poddany selektywnemu fotoblaknięciu z zastosowaniem równoległych protokołów regeneracji FRAP oraz „FRAP-FLIP”, przeprowadzonych w osobnych ROI dendrytów. Neuron ten został poddany wstępnej obróbce cykloheksymidą w celu zablokowania syntezy białek (2 h w stężeniu 200 μg/ml). Schemat przedstawia obrazowany fragment dendrytu, natomiast panel po lewej stronie wyróżnia ROI wybrane do fotoblaknięcia. Duży obszar w białej ramce został poddany jednorazowemu fotoblaknięciu, po czym nastąpiło powtarzalne fotoblaknięcie sąsiednich obszarów w ramkach, wyłącznie w dolnym dendrycie, zaznaczonych niebieskimi strzałkami dwukierunkowymi. Panel ten pokazuje dendryty przed fotoblaknięciem. Czerwone strzałki wskazują ROI przedstawione w dużym powiększeniu w części B), ilustrując regenerację fluorescencji w tradycyjnym protokole FRAP w porównaniu z protokołem „FRAP-FLIP”. Porównanie poziomów intensywności fluorescencji w późnej fazie regeneracji (trzecie panele) wykazuje wkład dyfuzji bocznej i recyklingu w zestawieniu z samym recyklingiem. Część C) przedstawia intensywność fluorescencji w pomierzonych ROI w czasie trwania eksperymentu, wykreśloną jako znormalizowane wartości intensywności. Czarna strzałka zaznacza moment początkowego fotoblaknięcia, a zielona strzałka wskazuje początek powtarzalnego fotoblaknięcia. ΔFrec oznacza przejściową regenerację wynikającą z recyklingu receptorów, określoną dla dendrytu FRAP/FLIP, natomiast ΔF diff mierzy wkład dyfuzji bocznej SEP-GluK2 do trzonu dendrytu w ROI „tylko FRAP”. Po przejściowym wzroście następuje stopniowy spadek sygnału, odpowiadający wyczerpywaniu się dostępnych receptorów w wyniku działania cykloheksymidy. Następujące po tym przemycia w niskim pH oraz w pH 7.4 + NH4Cl potwierdzają, że odzyskana fluorescencja odnosi się do receptorów eksponowanych na powierzchni.

<ol><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+green+outside%3A+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li>
<li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells%3A+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li>
<li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li>
<li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li>
<li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li>
<li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy innowacyjną strategię wizualizacji komponentów transportu białek błony plazmatycznej. Kombinatoryczne podejście łączące techniki fotoblaknięcia z białkami znakowanymi SEP umożliwia selektywną ocenę zdarzeń insercji do błony plazmatycznej. Dzięki ciągłemu fotoblaknięciu białek błonowych w obszarach flankujących podczas procesu regeneracji, metoda „FRAP-FLIP” pozwala ocenić wkład transportu pęcherzykowego w odzyskiwanie fluorescencji. To nowe podejście umożliwia bezpośrednią rejestrację insercji białek do błony, co pozwala na określenie zarówno liczby podkompartmentów, w których zaobserwowano regenerację, jak i amplitudy tej regeneracji (ΔF) w stanie stacjonarnym. Ponadto porównanie metody FRAP z i bez zastosowania FLIP pozwala obliczyć proporcję regeneracji przypisywalną dyfuzji bocznej.
Ponadto, w tym samym eksperymencie, podczas procesu regeneracji można jakościowo ocenić obszary dendrytu, które nie zostały poddane fotowybielaniu i sąsiadują z flankującymi je obszarami wybielonymi; utrata fluorescencji zaobserwowana w tych regionach będzie wynikać z dyfuzji bocznej fotowybielonych receptorów do tych niewybielonych segmentów dendrytu.
Ten protokół selektywnego fotoblakowania może być wykorzystany do badania różnych procesów transportu wewnątrzkomórkowego, takich jak charakterystyka egzocytozy w błonie plazmatycznej w określonych podobszarach (na przykład w dendrytach lub kolcach dendrytycznych) lub ocena wkładu dyfuzji bocznej w stosunku do insercji poprzez prowadzenie równoległych protokołów FRAP i „FRAP-FLIP” wzdłuż sąsiednich dendrytach (Rys. 3).
Należy wyraźnie zaznaczyć, że mimo przedstawienia konkretnych wytycznych, każde laboratorium będzie musiało zoptymalizować parametry obrazowania w zależności od konkretnych preparatów i sprzętu. Co istotne, wszystkie receptory powierzchniowe w ROI muszą zostać poddane fotoblakowaniu, niezależnie od płaszczyzny ogniskowej osi z, jednak bez powodowania istotnych uszkodzeń fototoksycznych lub niespecyficznego fotoblakowania. Użytkownicy powinni zachować ostrożność podczas stosowania tego protokołu w obrębie somy komórki, ponieważ wysoki odsetek wewnątrzkomórkowych przedziałów o stosunkowo niskim pH zazwyczaj skutkuje wysoką fluorescencją tła w tych obszarach. Ponadto, choć wykazaliśmy, w jaki sposób technika ta może być stosowana na różne sposoby, przed rozpoczęciem eksperymentów z selektywnym fotoblakowaniem nowego konstruktu z tagiem SEP, zalecamy przeprowadzenie wstępnej charakterystyki tagowanych receptorów, zgodnie z opisem Ashby i wsp.2.
Podsumowując, metoda ta stanowi potężną i wszechstronną adaptację standardowego protokołu FRAP, umożliwiając ocenę zdarzeń wstawiania w błonie plazmatycznej w czasie zbliżonym do rzeczywistego.

<table><tbody><tr><td>szklane szkiełka nakrywkowe 24mm</td><td>VWR international</td><td>631-0161</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>1mg/ml w buforze boranowym do powlekania szkiełek</td></tr><tr><td>pożywka Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>2% w pożywce do wysiewu i hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>1% w pożywce do wysiewu i hodowli neuronów</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>2mM / 0.8mM w pożywce do wysiewu/hodowli</td></tr><tr><td>surowica konia</td><td>Biosera</td><td>DH-291H</td><td>10% wyłącznie w pożywkach do wysiewu neuronów</td></tr><tr><td>wektor klonujący pSIN ReP5</td><td>Invitrogen</td><td>K75001</td><td>do produkcji wirusa Sindbis</td></tr><tr><td>system konfokalny LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Image J</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>oprogramowanie open access. Wszystkie opisane tutaj wtyczki są dostępne pod adresem &lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Białka błonowe, takie jak receptory i kanały jonowe, podlegają aktywnemu transportowi w neuronach, które są silnie spolaryzowane i złożone morfologicznie. Ten ukierunkowany transport ma fundamentalne znaczenie dla dostarczania, utrzymywania lub usuwania białek synaptycznych.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) jest wrażliwą na pH pochodną eGFP, która była szeroko stosowana w obrazowaniu białek błony plazmatycznej w żywych komórkach1-2. Przy niskim pH protonowanie SEP zmniejsza absorpcję fotonów i eliminuje emisję fluorescencji. Ponieważ większość zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego zachodzi w przedziałach o niskim pH, w których fluorescencja SEP jest wygaszona, sygnał fluorescencyjny z białek znakowanych SEP pochodzi głównie z błony plazmatycznej, gdzie SEP jest wystawiony na środowisko pozakomórkowe o neutralnym pH. Podczas naświetlania o wysokiej intensywności SEP, podobnie jak każdy barwnik fluorescencyjny, ulega nieodwracalnemu uszkodzeniu fotochemicznemu (fotobleachingowi)3-5. Co istotne, ponieważ niskie pH wygasza absorpcję fotonów, tylko SEP eksponowany na powierzchni może ulec fotobleachingowi, podczas gdy SEP wewnątrzkomórkowy nie jest wpływany przez naświetlanie o wysokiej intensywności6-10.
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching – powrót fluorescencji po fotowybielaniu) białek oznakowanych SEP jest wygodną i potężną techniką oceny dynamiki białek w błonie plazmatycznej. Gdy białka znakowane fluorescencyjnie zostaną poddane fotowybielaniu w obszarze zainteresowania (ROI), powrót fluorescencji następuje w wyniku przemieszczania się niewybielonych białek oznakowanych SEP do wybielonego obszaru. Może to zachodzić poprzez dyfuzję boczną i/lub egzocytozę niepoddanych fotowybielaniu receptorów dostarczanych w wyniku syntezy de novo lub recyklingu (patrz Rys. 1). Można określić frakcję białek nieruchomych i ruchomych, a także zbadać mobilność i kinetykę frakcji dyfuzyjnej w warunkach podstawowych oraz stymulowanych, takich jak aplikacja agonisty lub bodźce aktywacji neuronalnej, np. aplikacja NMDA lub KCl8,10.
Opisujemy techniki fotowybielania zaprojektowane do selektywnej wizualizacji powrotu fluorescencji przypisywanego egzocytozie. W skrócie, obszar ROI jest fotowybielany raz, analogicznie do standardowych protokołów FRAP, a następnie, po krótkim czasie regeneracji, następuje powtarzalne wybielanie obszarów przyległych. Ten protokół „FRAP-FLIP”, opracowany w naszym laboratorium, był wykorzystywany do charakterystyki transportu receptorów AMPA w kolcach dendrytycznych10 i może być stosowany w szerokim zakresie badań transportu w celu oceny transportu wewnątrzkomórkowego oraz egzocytozy.

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Białka błonowe, takie jak receptory i kanały jonowe, podlegają aktywnemu transportowi w neuronach, które są silnie spolaryzowane i złożone morfologicznie. To...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wbudowywania białek neuronalnych w błonę plazmatyczną. Osiąga się to poprzez uprzednie zainfekowanie hodowanych neuronów hipokampa wirusem sinus w celu ekspresji badanego białka, które jest znakowane super ecliptic, Florin lub sep. Następnie poddawany jest fotowybielaniu wybrany obszar zainteresowania (ROI).Następnie segmenty flankujące są powtarzalnie wybielane fotochemicznie, podczas gdy oryginalny obszar zainteresowania poddawany jest regeneracji fluorescencji. Na koniec analizowana jest regeneracja fluorescencji w obszarze zainteresowania. Ostatecznie ta adaptacja konwencjonalnych eksperymentów FRAP służy do wykazania wzorca zdarzeń egzocytozy białka docelowego w błonie plazmatycznej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak biotynylacja powierzchniowa czy podawanie przeciwciał, jest możliwość wizualizacji dynamiki zdarzeń wbudowywania w błonę. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące transportu białek, określając miejsce i sposób zachodzenia zdarzeń egzocytozy. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy szukałem alternatywy dla znakowania powierzchniowego, aby móc badać zdarzenia egzocytozy w kolcach dendrytycznych w eksperymentach na żywych komórkach. W celu rozpoczęcia, należy hodować neurony hipokampa o wysokiej gęstości, pochodzące z embrionów szczurów z 18. dnia rozwoju, na szkiełkach podstawkowych pokrytych poli-L-lizyną przez 14 do 25 dni in vitro, rozpoczynając proces od 6 do 24 godzin przed eksperymentem na żywo.Przeprowadź transdukcję komórek wirusem symbis kodującym interesujące białko błonowe, oznaczonym SUP ecliptic fluorine osep. Dodaj pseudowiriony zawierające medium bezpośrednio na szkiełko podstawowe zawierające 1 ml medium kondycjonowanego, a następnie przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli. Aby obrazować komórki, włącz mikroskop konfokalny zes axia vert LSM five 10 meta z 100% mocą lasera na co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem obrazowania.Aby zminimalizować wahania mocy podczas obrazowania oraz wstępnie ogrzać stoлик. Gdy mikroskop będzie gotowy, należy wybrać obiektyw 63x, następnie przenieść szkiełko nakrywkę do komory obrazowania i niezwłocznie wymienić medium hodowlane. Wstępnie ogrzać pozakomórkowy roztwór rejestrujący.Umieść komorę na podgrzanym stoliku mikroskopu. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest zapewnienie, aby stan zdrowotny komórek nie został naruszony podczas procesu rejestracji. Ponieważ protokół ten wymaga intensywnego fotoblaknięcia w celu zapewnienia sukcesu, należy upewnić się, że wszystkie parametry obrazowania zostały zoptymalizowane przed rozpoczęciem eksperymentów na szeroką skalę i przedłożyć szybką akwizycję nad wysoką jakość obrazów.Aby zdefiniować parametry akwizycji obrazu, należy zidentyfikować neuron wykazujący ekspresję badanego białka rekombinowanego i ustawić go w ostrości. Następnie należy przeskanować całą komórkę za pomocą lasera 488 nm przy niskiej mocy, aby zminimalizować fotoblaknięcie.Należy zastosować wysoką prędkość nominalną oraz niską rozdzielczość pikseli, utrzymując całkowity czas skanowania poniżej jednej sekundy. Wybrano fragment dendrytu do obrazowania przy użyciu zoomu optycznego od 1,5 do 2,5.Należy zarejestrować klatkę zawierającą obszar zainteresowania, aby ocenić, czy występuje niespecyficzne fotoblaknięcie. Należy zadbać o to, aby pole widzenia obejmowało kilka wypustek, co umożliwi uzyskanie pomiarów z dendrytów referencyjnych. Korzystając z palety wskaźnika zakresu, należy dostosować parametry obrazowania w taki sposób, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym pobudzeniu laserowym, unikając przy tym nadmiernego nasycenia.Zaleca się stosowanie dużej średnicy otworu pinhole, aby zmaksymalizować zbieranie fotonów. Wzmocnienie detektora powinno być wystarczające do wykrycia niewielkich przyrostów fluorescencji, tak aby pierwsze obrazy przed fotoblaknięciem nie przekraczały 10% nasyconych pikseli. Należy dostosować ostrość, aby zapewnić osiągnięcie płaszczyzny ogniskowej w linii środkowej.Po ustawieniu konfiguracji należy ją zapisać, aby mogła zostać wykorzystana w fazach przed i po rekuperacji w eksperymencie. Następnie należy zdefiniować obszary fotowybielania, wybierając obszar zainteresowania (ROI) dla początkowego fotowybielania oraz obszary flankujące dla następującej po nim fazy powtarzalnego fotowybielania.Podczas wstępnego fotowybielania fotowybielane będą zarówno centralne, jak i flankujące ROI. W przypadku powtarzalnego fotowybielania wybierane są jedynie ROI flankujące. Należy upewnić się, że obszary flankujące są wystarczająco szerokie, aby zapobiec rekuperacji poprzez dyfuzję pomiędzy skanami.Dostosuj parametry wybielania dla obu obszarów zainteresowania (ROI) poddawanych fotowybielaniu. Początkowe fotowybielanie powinno być szybkie, wymagając od jednej do pięciu iteracji, w zależności od zoomu optycznego i objętości ROI. W przypadku obszarów flankujących należy dostosować wzbudzenie laserem tak, aby zapewnić ciągłe fotowybielanie, ale bez powodowania uszkodzeń fototoksycznych. Po ustawieniu parametrów przeprowadź eksperyment FRA flip jako sekwencję obrazów time-lapse o zmijnym czasie, rozpoczynając od wykonania od trzech do 10 obrazów bazowych przed wybielaniem (preble) przy niskiej mocy lasera i bez opóźnienia czasowego.Następnie przeprowadź fotowybielanie centralnego ROI przy pełnej mocy lasera przez jedną do pięciu iteracji. Następnie zarejestruj od trzech do 10 obrazów regeneracji po wybielaniu. Wykonaj powtarzalne fotowybielanie obszarów flankujących przy średniej mocy lasera, rejestrując obrazy w typowym odstępie czasu od jednej do pięciu sekund, w zależności od szybkości regeneracji badanego białka.Na koniec, aby wygasić fluorescencję, należy zastąpić zewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący roztworem rejestrującym buforowanym do pH 6, lub, aby ujawnić białko w wewnątrzkomórkowych magazynach o niskim pH, należy użyć buforu uzupełnionego o 50 mM chlorku amonu. Należy zebrać co najmniej 10 do 20 zestawów danych dla każdego białka rekombinowanego, aby umożliwić analizę statystyczną i uniknąć wyników obarczonych błędem; należy upewnić się, że warunki obrazowania są zachowane we wszystkich powtórzeniach. Aby przeanalizować obrazy, należy je otworzyć.Używając oprogramowania Image J, wyrównaj stosy obrazów, aby uwzględnić niewielkie fluktuacje w płaszczyźnie XY, które mogły wystąpić w trakcie serii czasowej. W przypadku obrazów wykonanych konfokalnym mikroskopem zes, wykorzystaj wtyczkę stack reg do wyrównania, a następnie wtyczkę LSM toolbox, aby wyeksportować wartości czasu do pliku tekstowego; zaimportuj te wartości do arkusza analizy w celu pomiaru fluktuacji fluorescencji. Podczas eksperymentu FRA flip podziel segment fotowybielania na poszczególne obszary pikseli, korzystając z narzędzia analizy image ROI manager w celu wybrania wielu ROI.Następnie należy użyć polecenia plot Z axis profile, aby zmierzyć średnią fluorescencję na piksel w każdym punkcie czasowym. Powtórz ten proces, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji w niefluorescencyjnym obszarze tła. Znormalizuj intensywność fluorescencji w każdym punkcie czasowym poprzez odjęcie wartości tła w celu usunięcia szumu eksperymentalnego, a następnie podziel wszystkie wartości przez średnią pomiarową linii bazowej przed wybielaniem lub wartość bezpośrednio po wybielaniu.Przeanalizuj przebieg regeneracji dla każdego ROI w funkcji czasu, aby obliczyć, czy nastąpiła istotna regeneracja. W danym ROI oblicz deltę F, odejmując średnią z pierwszych pięciu do 10 pomiarów sekwencji regeneracji po fotobleachingu od średniej z ostatnich pięciu do 10 pomiarów. Następnie określ istotność statystyczną delty F i scharakteryzuj ROI regenerujące się oraz nieregenerujące się, aby ocenić wzorzec egzocytozy.Są to punkty intensywnej egzocytozy lub regeneracja kolca w porównaniu z regeneracją szyjki. Ten film przedstawia reprezentatywny wynik typowego eksperymentu FRAP-flip z użyciem kleju SERP. Dwa.Obszar dendrytu zostaje poddany jednorazowemu fotowybielaniu, po którym następuje minutowy okres regeneracji. Następnie rozpoczyna się powtarzalne fotowybielanie obszarów sąsiadujących, co zaznaczono niebieskimi strzałkami. Czerwona strzałka wskazuje niewielki obszar zainteresowania, w którym obserwuje się powrót fluorescencji, przedstawiony w powiększeniu w prawym panelu ekranu.Proces regeneracji jest śledzony na poniższym wykresie, gdzie całkowity wzrost fluorescencji jest oznaczony jako delta F. Wzrost fluorescencji zaobserwowany w tej sekwencji można przypisać wstawieniu glue A two do trzonu dendrytu. Duże zmiany intensywności fluorescencji pod koniec eksperymentu wykazują wpływ niskiego pH oraz przemyć w pH 7.4 z dodatkiem chlorku amonu na sygnał fluorescencji SEP. W tym przykładzie neurony zostały zainfekowane SEP glue K two.W tym przypadku przeprowadzono fotowybielanie dużego ROI z wieloma dendrytami w polu widzenia, a następnie selektywne, powtarzalne fotowybielanie tylko jednego dendrytu. Przed obrazowaniem neurony te poddano działaniu cykloheksymidu przez dwie godziny w celu zablokowania syntezy białek. W związku z tym powrót fluorescencji w odpowiednich mierzonych ROI ujawnia proporcję regeneracji wynikającą z dyfuzji bocznej i recyklingu w standardowym FRAP dendrytu w porównaniu do samego recyklingu w dendrytach poddanych protokołowi FRAP-FLIP.Porównując wartości delta F z krzywych regeneracji FRAP oraz FRAP-flip, można wywnioskować względny udział recyklingu w stosunku do dyfuzji bocznej dzięki inhibicji syntezy białek. Regeneracja wykazuje późniejszy spadek sygnału w miarę wyczerpywania się dostępnej puli receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować, przeprowadzić i przeanalizować udane eksperymenty obrazowania w neuronach.Stosując tę kombinację technik fotoblaknięcia, można zbadać dowody na wbudowanie w błonę badanego białka.

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowanych neuronach oceniana za pomocą odzyskiwania fluorescencji i fotoblanszowania fluorescencji

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Metoda FRAP była wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych zieloną białko fluorescencyjnym (GFP) w hodowlach komórkowych. Zbadaliśmy frakcje mobilne i niemobilne GFP, analizując procent odzysku fluorescencji po fotowybielaniu. W niniejszym badaniu FRAP przeprowadzono w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Poznaj metodę wizualizacji wstawiania białek neuronalnych do błony komórkowej za pomocą fotowybielania i odzyskiwania fluorescencji w hodowanych neuronach hipokampalnych.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowanych neuronach oceniana za pomocą odzyskiwania fluorescencji i fotowybielania utraty fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów