Przygotowanie wybudzonej myszy do rejestrowania odpowiedzi neuronalnych i wstrzykiwania znaczników

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie odpowiedzi pojedynczych neuronów u obudzonej myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie myszy za pomocą inhalacji fluoru, umieszczenie myszy w stereotaktycznej ramie gryzonia i odsłonięcie czaszki. Drugim krokiem jest zlokalizowanie interesującego obszaru mózgu za pomocą współrzędnych stereotaktycznych i oznaczenie tego obszaru do późniejszej kraniotomii.

Następnie na czaszce montowany jest wykonany na zamówienie słupek na głowę, a słupek głowy umieszcza się w belce montażowej, która jest przymocowana do mikromanipulatora na aparacie stereotaktycznym. Ostatnim krokiem jest wykonanie kraniotomii, aby umożliwić wprowadzenie elektrody do mózgu. Gdy mysz dojdzie do siebie po operacji, mysz jest unieruchomiona w bloku piankowym.

Słupek głowy jest umieszczany z powrotem w belce montażowej i przymocowany do specjalnie wykonanego aparatu stereotaktycznego, a elektroda mikropipety może być wprowadzona do mózgu. Ta procedura pozwala na izolację pojedynczych jednostek. Silne reakcje na bodźce mogą być rejestrowane z tej samej struktury mózgu przez wiele dni, a ślady mogą być wykorzystywane do badania wznoszących się lub opadających projekcji do fizjologicznie zidentyfikowanych regionów lub bez wpływu na reakcje za pomocą środków znieczulających.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że środki znieczulające nie wpływają na właściwości odpowiedzi neuronów. Demonstruje tę procedurę Zachary Mako, doktorant z mojego laboratorium Aby przygotować zagłówek, najpierw zmontuj niestandardowy słupek główny, wiercąc otwór w 15-milimetrowym, trzech ponad 32-calowym pręcie ze stali nierdzewnej. Następnie włóż prostopadle do otworu 20-milimetrowy kołek rolkowy ze stali nierdzewnej.

Aby utworzyć kran krzyżowy, jeden koniec pręta pionowego akceptuje o numerze 1 72, jak pokazano tutaj. Następnie przygotuj listwę montażową. Ten element aparatu składa się z dłuższego mosiężnego lub aluminiowego pręta o długości około 90 milimetrów i szerokości od pięciu do 10 milimetrów oraz krótszego pręta o długości 15 milimetrów, który jest przymocowany do końca długiego pręta pod kątem 45 stopni.

Krótsza prowadnica ma jeden rowek wycięty w dnie i krótszy rowek na całej szerokości, dopasuj słupek górny do tych rowków, a poprzeczka zagnieździła się w krótszym rowku. Blok montażowy to dwa kawałki aluminium połączone ze sobą, aby utworzyć blok o wymiarach około 30 milimetrów na 30 milimetrów na 25 milimetrów z wycięciem do przytrzymania listwy montażowej, włóż listwę montażową do wycięcia w bloku montażowym równolegle do powierzchni stołu. Przymocuj blok montażowy do mikromanipulatora, aby pozycja słupka głównego mogła być dokładnie umieszczona wzdłuż linii środkowej i brimy.

Na koniec przytnij pręt wolframowy o średnicy 0,01 cala do około pięciu milimetrów długości z około jednym milimetrem zgiętym pod kątem 45 stopni. Ten pręt służy jako kołek uziemiający. Po umieszczeniu zwierzęcia w komorze indukcyjnej z 5% lodem fluoru, upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, wykonując szczypanie palca u nogi i sprawdzając, czy nie ma reakcji.

Po całkowitym znieczuleniu umieść mysz w ramce stereotaktycznej gryzonia wyposażonej w adapter myszy, najpierw umieszczając zęby w otworze pręta gryzowego i delikatnie dokręcając zacisk nosowy, aż będzie dobrze dopasowany. Aby upewnić się, że zwierzę pozostaje znieczulone. Umieść maskę na twarz wykonaną z kawałka lateksowej rękawiczki na nosie myszy i utrzymuj 5% izofluoru, aż częstość oddechów wyniesie około jednego oddechu na sekundę.

Po tym czasie zmniejsz zawartość fluoru do 1,5 do 2%Teraz zabezpiecz głowę, delikatnie umieszczając nauszniki w każdym przewodzie słuchowym. Uważając, aby nie przebić błony bębenkowej, zamocuj paski uszne tak, aby były dobrze dopasowane, ale nie wnikały zbyt głęboko w kanały słuchowe. Umieść żelową poduszkę grzewczą pod myszką.

Następnie delikatnie nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Używaj za pomocą małej golarki lub cienkich nożyczek. Usuń włosy spomiędzy uszu aż do oczu.

Teraz oczyść i wysterylizuj skórę głowy za pomocą peelingu chlorheksydyny lub betadynyny, a następnie trzykrotnie spłucz ją alkoholem. Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od tyłu głowy do oczu. W razie potrzeby zeskrobać okostną do krawędzi nacięcia skalpelem.

Ostrożnie cofnij mięśnie z tyłu szyi za pomocą kleszczy, pozwalając mięśniowi rozerwać się wzdłuż pasków, aby zminimalizować krwawienie. Nałóż piankę żelową pod tkankę skóry głowy, aby zminimalizować wilgoć i zapobiec przesuwaniu się skóry po czaszce. Następnie zwilż aplikator z bawełnianą końcówką alkoholem o profilu izop i osusz powierzchnię czaszki, aby poprawić wizualizację punktów orientacyjnych czaszki.

Gdy zwierzę jest już przygotowane, włóż drobny punkt. Sondę, taką jak zaostrzony metalowy pręt, umieść w uchwycie elektrody i przymocuj ją do stereotaktycznego mikromanipulatora. Przesuwaj sondę do przodu i do tyłu między bgma a Lambda, upewniając się, że boczna współrzędna przyśrodkowa dla każdej lokalizacji różni się o nie więcej niż 50 mikronów.

W razie potrzeby delikatnie zmień położenie głowy za pomocą nauszników. Sprawdź, czy wysokość grzbietowa brzuszna w Bgma i Lambda różni się nie więcej niż 50 mikronów. Dostosuj wysokość nosa clamp, aby wyrównać nachylenie czaszki w razie potrzeby, może być również konieczne wyregulowanie wysokości nausznika.

Użyj atlasu mózgu myszy, aby zidentyfikować współrzędne interesującego obiektu względem bgma. Użyj atramentu indyjskiego, aby zaznaczyć czaszkę nad celem, w którym zostanie wykonana kraniotomia. Najpierw oczyść czaszkę, rozprowadzając żel do wytrawiania zębów na powierzchni i szorując przez około 10 sekund.

Następnie umyj wodą i całkowicie wysusz. Następnie nałóż adhezyjny podkład pod cement dentystyczny na powierzchnię czaszki. Za pomocą aplikatora użyj nowego aplikatora, aby rozprowadzić klej, utwardź klej jednym cyklem pistoletu do światła UV.

Zidentyfikuj lokalizację dystalną w stosunku do miejsca docelowego. Do montażu kołka uziemiającego użyj końcówki mini skalpela z ostrzem numer 65, aby ostrożnie wywiercić mały otwór w czaszce. W tym momencie otwór powinien być wystarczająco szeroki, aby zmieścił się krótki koniec kołka uziemiającego.

Włóż kołek uziemiający tak, aby spoczywał na oponach mózgowych. Upewnij się, że kołek jest ustawiony tak, aby był skierowany w stronę przeciwną do bgma i miejsca mocowania słupka głównego. Teraz przesuń mikromanipulator tak, aby słupek głowy znajdował się nad bgma, dotykając tylko czaszki.

Podstawa słupka głowy powinna leżeć płasko na czaszce. Następnie użyj sond preparacyjnych, aby nałożyć niewielką ilość cementu dentystycznego wokół słupka głowicy i kołka uziemiającego. Dociśnij cement, aby zapewnić dobry kontakt z czaszką.

Następnie utwardź w trzech do czterech cyklach z pistoletu do światła UV. Na koniec nałóż drugą rundę cementu, aby zbudować podstawę wokół słupka głowicy i zakryj rowki słupka głowicy i utwardź nas. Przed pierwszym zlokalizuj znak odniesienia kraniotomii, który będzie częściowo zasłonięty przez podkład.

Następnie użyj mini skalpela z ostrzem numer 65, aby zaznaczyć kwadrat o wymiarach trzy milimetry na trzy milimetry wokół tego miejsca. Zastosuj kroplę roztworu lidokainy, aby zmniejszyć wrażliwość. Teraz zrób wiele punktów po każdej stronie kwadratu, uważając, aby nie przeciąć kości i nie wbić się w mózg.

Gdy płat kostny poluzuje się, użyj końcówki skalpela, aby go podważyć, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną. Następnie przykryj obszar woskiem kostnym. Po zakończeniu operacji wyłącz iso fluor i uwolnij mysz z ramki stereotaktycznej.

Nałóż lidokainę na odsłoniętą skórę, a następnie namaść neo zarodniki, podaj znieczulenie pooperacyjne zgodnie ze wskazaniami lekarza weterynarii i zwróć mysz do klatki domowej. Po 24 godzinach mysz może być używana do zapisów elektrofizjologicznych. Rysunek ten pokazuje, że udana instalacja słupka głównego pozwala eksperymentatorowi rejestrować pojedyncze i wielopunktowe odpowiedzi z obudzonej myszy przez wiele dni.

System przytrzymywania pozwala na stabilne zapisy elektrofizjologiczne pojedynczych neuronów w mózgu. Doskonała izolacja pojedynczych jednostek i silne reakcje na bodźce mogą być rejestrowane z tej samej struktury mózgu przez wiele dni. Na przykład w wzgórku dolnym myszy w okresie dwóch dni, lewy panel pokazuje nagrania uzyskane od pierwszego dnia, a prawy panel w drugim dniu w celu oceny zstępujących projekcji ze słuchowego śródmózgowia do słuchowego pnia mózgu, biotynylowanych, dextra i aminowych wizualizowanych za pomocą Dino Benadine, ponieważ chromogen może być wstrzykiwany do dolnego wzgórka myszy jak widać tutaj po elektrofizjologicznej identyfikacji właściwości odpowiedzi neuronalnej w miejscu wstrzyknięcia i po przetworzeniu tkanki.

Znakowanie następcze w przeciwległym grzbietowym jądrze ślimaka można zwizualizować i wykreślić, jak pokazano tutaj, jak pokazano tutaj. Można również uzyskać mikrofotografie fotograficzne w wyższej rozdzielczości, aby zobaczyć bardziej wyraźnie oznaczone aksony i zakończenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować właściwości odpowiedzi z poszczególnych neuronów i wstrzykiwać barwniki lub znaczniki do badań neuroanatomicznych u obudzonej myszy.

Preparat ten eliminuje wpływ środków znieczulających na właściwości odpowiedzi neuronalnej i pozwala na przeprowadzanie wielodniowych eksperymentów na tym samym zwierzęciu. Kluczem do zabiegu jest upewnienie się, że sztyca głowy jest bezpiecznie przymocowana do czaszki, a mysz jest dobrze unieruchomiona. Podczas gdy ten film zilustrował, jak wykorzystać tę procedurę do nagrywania z pojedynczych neuronów w układzie słuchowym, inne obszary mózgu mogą być badane za pomocą tej techniki.