Przygotowanie budzącej się myszy do rejestracji odpowiedzi neuronalnych i wstrzykiwania znaczników

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi pojedynczych neuronów u budzącej się myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie myszy drogą wziewną izofluranem, umieszczenie zwierzęcia w stereotaktycznej ramie dla gryzoni i odsłonięcie czaszki. Drugim krokiem jest zlokalizowanie interesującego regionu mózgu przy użyciu współrzędnych stereotaktycznych i zaznaczenie tego obszaru w celu wykonania późniejszej kraniotomii.

Następnie do czaszki montuje się wykonany na zamówienie trzpień głowowy, a następnie umieszcza go w uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora w aparacie stereotaksycznym. Ostatnim krokiem jest wykonanie kraniotomii, aby umożliwić wprowadzenie elektrody do mózgu. Po wyzdrowieniu myszy z operacji, zwierzę zostaje unieruchomione w bloku z pianki.

Głowicę mocującą umieszcza się z powrotem w ramionie montażowym i przytwierdza do specjalnie wykonanego aparatu stereotaksycznego, po czym do mózgu można wprowadzić elektrodę z mikropipety. Procedura ta pozwala na izolację pojedynczych jednostek. Silne reakcje na bodźce mogą być rejestrowane z tej samej struktury mózgu przez wiele dni, a uzyskane zapisy mogą służyć do badania projekcji wstępujących lub zstępujących do fizjologicznie zidentyfikowanych obszarów, bez wpływu środków znieczulających na odpowiedzi.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że właściwości odpowiedzi neuronów nie są pod wpływem środków znieczulających. Procedurę tę zaprezentuje Zachary Mako, doktorant z mojego laboratorium. Aby przygotować uchwyt głowy, najpierw należy zmontować niestandardowy trzpień głowy, wiercąc otwór w pręcie ze stali nierdzewnej o długości 15 millimeter i średnicy 3/32 inch. Następnie należy prostopadle wprowadzić do otworu stalowy trzpień sprężynowy o długości 20 millimeter.

Aby stworzyć gwint poprzeczny, należy przygotować jeden koniec pionowego pręta w taki sposób, aby można było wkręcić śrubę nr 1 72, jak pokazano tutaj. Następnie należy przygotować listwę montażową. Ten element aparatury składa się z dłuższej mosiężnej lub aluminiowej listwy o długości około 90 mm i szerokości od 5 do 10 mm oraz krótszej listwy o długości 15 mm, która jest przymocowana do końca dłuższej listwy pod kątem 45 stopni.

Krótszy pręt posiada jedno wycięcie w dolnej części oraz krótszy rowek w poprzek szerokości; należy dopasować słupek głowowy do tych wycięć, tak aby element poprzeczny osiadł w krótszym rowku. Blok montażowy składa się z dwóch dopasowanych do siebie śrubami elementów aluminiowych, tworzących blok o wymiarach około 30 milimetrów na 30 milimetrów na 25 milimetrów z wycięciem na pręt montażowy; należy wsunąć pręt montażowy do wycięcia w bloku montażowym równolegle do powierzchni stołu. Przymocuj blok montażowy do mikromanipulatora w taki sposób, aby pozycję słupka głowowego można było precyzyjnie ustawić wzdłuż linii środkowej i brima.

Na koniec odetnij pręt wolframowy o średnicy 0,01 cala na długość około pięciu milimetrów, zgięte pod kątem 45 stopni około jeden milimetr z końca. Pręt ten służy jako pin uziemiający. Po umieszczeniu zwierzęcia w komorze indukcyjnej z 5% izofluranem, upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, wykonując ucisk palca u nogi i sprawdzając brak reakcji.

Po pełnym znieczuleniu umieść mysz w stereotaktycznym uchwycie do gryzoni z zamontowanym adapterem dla myszy, najpierw wprowadzając zęby do otworu w listwie zgryzowej, a następnie delikatnie dokręcając zacisk nosowy, aż będzie stabilnie osadzony. Aby zapewnić utrzymanie znieczulenia zwierzęcia, nałóż na nos myszy maskę wykonaną z fragmentu rękawiczki lateksowej i podawaj 5% izofluranu, aż częstość oddechów wyniesie około jednego oddechu na sekundę.

Po tym czasie zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5–2%. Następnie unieruchom głowę, ostrożnie wprowadzając pręciki do każdego przewodu słuchowego. Dbając o to, aby nie przebić błony bębenkowej, zamocuj pręciki tak, aby przylegały ściśle, ale nie wnikały zbyt głęboko do przewodów słuchowych. Pod myszą umieść żelową podkładkę grzewczą.

Następnie delikatnie nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu oczu. Użyj do tego małego trymera lub nożyczek z cienkim ostrzem. Usuń włosy z obszaru między uszami aż do oczu.

Następnie należy oczyścić i zdezynfekować skórę głowy za pomocą chlorheksydyny lub preparatu Betadine, a następnie trzykrotnie przepłukać ją alkoholem. Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, od tyłu głowy w stronę oczu. W razie potrzeby zeskrob okostną do krawędzi nacięcia za pomocą skalpela.

Ostrożnie odsunąć pęsetą muskulaturę z tyłu szyi, pozwalając mięśniom na rozrywanie się wzdłuż powięzi, aby zminimalizować krwawienie. Pod tkanką skalpu zastosować gąbkę żelową, aby zredukować wilgoć i zapobiec przesuwaniu się skóry po czaszce. Następnie zwilżyć aplikator z bawełnianym końcem alkoholem izopropylowym i osuszyć powierzchnię czaszki, aby poprawić widoczność punktów orientacyjnych czaszki.

Po przygotowaniu zwierzęcia należy wprowadzić cienką sondę, np. zaostrzony metalowy pręt, do uchwytu elektrody i przymocować go do mikromanipulatora stereotaktycznego. Przesuń sondę w przód i w tył pomiędzy punktami Bregma i Lambda, upewniając się, że współrzędna boczno-przyśrodkowa dla każdej lokalizacji różni się o nie więcej niż 50 µm.

Delikatnie skoryguj położenie głowy, używając w razie potrzeby uchwytów usznych. Sprawdź, czy różnica wysokości grzbietowo-brzusznej w punktach Bgma i Lambda nie przekracza 50 mikronów. W razie potrzeby dostosuj wysokość zacisku nosowego, aby wypoziomować pochylenie czaszki; może być również konieczna regulacja wysokości uchwytów usznych.

Należy skorzystać z atlasu mózgu myszy, aby wyznaczyć współrzędne interesującego celu względem punktu bgma. Do zaznaczenia na czaszce miejsca nad celem, w którym zostanie wykonana kraniotomia, należy użyć tuszu indyjskiego. W pierwszej kolejności czaszkę należy oczyścić, rozprowadzając na jej powierzchni żel do trawienia zębów i szorując przez około 10 sekund.

Następnie przemyć wodą i całkowicie osuszyć. W kolejnym kroku nanieść primer adhezyjny do cementu stomatologicznego na powierzchnię czaszki. Używając aplikatora, rozprowadzić preparat, a następnie za pomocą nowego aplikatora utwardzić adhezję za pomocą jednego cyklu lampy UV.

Zidentyfikuj miejsce oddalone od miejsca docelowego. W celu instalacji pinu uziemiającego użyj końcówki skalpela z mini ostrzem nr 65, aby ostrożnie wywiercić w czaszce niewielki otwór. Na tym etapie otwór powinien być wystarczająco szeroki, aby pomieścić krótki koniec pinu uziemiającego.

Wprowadź pin uziemiający tak, aby opierał się o opony mózgowe. Upewnij się, że pin jest zorientowany tak, aby był skierowany w stronę przeciwną do bgma oraz miejsca mocowania wspornika głowy. Następnie przesuń mikromanipulator tak, aby wspornik głowy znajdował się nad bgma, ledwo dotykając czaszki.

Podstawa trzpienia głownego powinna ściśle przylegać do czaszki. Następnie za pomocą sond sekcyjnych należy nanieść niewielką ilość cementu dentystycznego wokół trzpienia oraz pinu uziemiającego. Dociśnij cement, aby zapewnić dobry kontakt z czaszką.

Następnie utwardź, stosując od trzech do czterech cykli naświetlania lampą UV. Na koniec nałóż drugą warstwę cementu, aby pogrubić podstawę wokół trzpienia głowowego, wypełnić jego rowki i utwardzić całość. Przedtem zlokalizuj znacznik referencyjny kraniotomii, który będzie częściowo przesłonięty przez podkład.

Następnie za pomocą skalpela z mini ostrzem nr 65 wyznacz kwadrat o wymiarach 3 mm na 3 mm wokół tego miejsca. Nanieś kroplę roztworu lidokainy, aby zmniejszyć wrażliwość. Wykonaj teraz wielokrotne nacięcia na każdym boku kwadratu, uważając, aby nie przeciąć kości i nie uszkodzić mózgu.

Gdy płat kostny poluzuje się, użyj czubka skalpela, aby go podważyć, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną. Następnie pokryj ten obszar woskiem kostnym. Po zakończeniu operacji wyłącz izofluran i zwolnij mysz z aparatu stereotaksycznego.

Nanieś lidokainę na odsłoniętą skórę, a następnie zastosuj maść Neosporin, podaj leki przeciwbólowe pooperacyjne zgodnie z zaleceniami weterynarza i umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Po 24 godzinach mysz może zostać wykorzystana do rejestracji elektrofizjologicznej. Rysunek ten pokazuje, że prawidłowa instalacja trzpienia głownego pozwala eksperymentatorowi na rejestrację odpowiedzi pojedynczych i wielu jednostek u czuwającej myszy przez wiele dni.

System unieruchamiający umożliwia stabilne rejestracje elektrofizjologiczne pojedynczych neuronów w mózgu. Z tej samej struktury mózgu przez wiele dni można rejestrować doskonałą izolację pojedynczych jednostek oraz silne odpowiedzi na bodźce. Na przykład, w przypadku wzgórka dolnego myszy w okresie dwóch dni, lewy panel przedstawia rejestracje uzyskane pierwszego dnia, a prawy panel drugiego dnia, w celu oceny projekcji zstępujących z ośrodka słuchowego śródmózgowia do pnia mózgu. Biotynilowany dekstran i amina, wizualizowane przy użyciu Dino Benadine jako chromogenu, mogą zostać wstrzyknięte do wzgórka dolnego myszy, co pokazano tutaj po elektrofizjologicznej identyfikacji właściwości odpowiedzi neuronalnych w miejscu wstrzyknięcia oraz po obróbce tkanki.

Oznakowanie anterogradne w przeciwległym grzbietowym jądrze ślimaka można zwizualizować i nanieść na wykres, co zostało tutaj zaprezentowane. W celu obejrzenia oznakowanych aksonów i zakończeń można również uzyskać mikrofotografie o wyższej rozdzielczości. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak rejestrować właściwości odpowiedzi poszczególnych neuronów oraz wstrzykiwać barwniki lub znaczniki do badań neuroanatomicznych u budzącej się myszy.

Przygotowanie to eliminuje wpływ środków anestetycznych na właściwości odpowiedzi neuronalnych i pozwala na prowadzenie eksperymentów przez wiele dni na tym samym zwierzęciu. Kluczowym elementem procedury jest zapewnienie bezpiecznego zamocowania trzpienia głownego do czaszki oraz odpowiedniego unieruchomienia myszy. Chociaż w tym filmie przedstawiono wykorzystanie tej procedury do rejestracji aktywności pojedynczych neuronów w systemie słuchowym, technikę tę można zastosować do badania innych obszarów mózgu.