Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w późnym stadium embrionalnym oraz w okresie noworodkowym. W pierwszej kolejności przygotowuje się sprzęt. Igłę połączoną z przetwornikiem ciśnienia należy wyrównać z sondą ultradźwiękową.

Następnie przygotowuje się mysz i wykonuje obrazowanie USG jej LV. Potem igłę wprowadza się do światła LV i rejestruje pomiary ciśnienia pulsacyjnego. Ostatecznie wyniki pokazują ciśnienia skurczowe u myszy w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie neonatalnym z wykorzystaniem tej prowadzonej pod kontrolą USG cewnikizacji wypełnionej cieczą.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemy servo, brak pomiarów ciśnienia czy cewniki w stanie stałym, jest możliwość pomiaru ciśnienia u myszy w późnym stadium embrionalnym oraz w okresie neonatalnym w sposób stabilny i powtarzalny. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ utrzymanie orientacji embrionu w pęcherzyku zarodkowym jest wymagające ze względu na tendencję embrionu do rotacji. Przy zastosowaniu głowicy ultradźwiękowej należy wybrać i napełnić wodą destylowaną głowicę odpowiednią dla stadium badanego organizmu myszy.

Umieść głowicę w regulowanym uchwycie systemu ultrasonograficznego. Dostosuj uchwyt tak, aby uzyskać obraz lewej komory (LV) w osi długiej u myszy zamocowanej na platformie, z wierzchołkiem LV skierowanym w stronę ramienia do iniekcji. System pomiaru ciśnienia składa się z wypełnionego płynem przetwornika ciśnienia, wzmacniacza mostkowego, systemu akwizycji danych oraz programu LabChart.

Do przepłukania drenów wykorzystuje się zestaw oprogramowania oraz strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną 10% roztworem soli fizjologicznej z heparyną. Należy upewnić się, że w drenach ani nad przetwornikiem nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Dreny są połączone z przetwornikiem za pomocą trójdrożnych kraników, złączy luer-lock oraz kolanek.

Zkalibrować system przetwornika ciśnienia za pomocą manometru, montując rurkę igłową i obudowę w ramieniu wtryskowym. Zastąpić manometr obudową służącą do przymocowania rurki do ramienia wtryskowego. Obudowa stanowi zmodyfikowany korpus strzykawki o pojemności 3 ml.

Przymocuj przetwornik ciśnienia w pierścieniu. Stań na wysokości zbliżonej do poziomu platformy obrazującej, aby zapobiec zapchaniu. Do rurki igły przymocuj igłę o jak największej możliwej średnicy i wstrzykuj heparynowaną sól fizjologiczną, aż pojawią się kilka kropel.

Ponownie wyjmij igłę. Upewnij się, że w drenie lub nad przetwornikiem nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Teraz nanieś porcję żelu do ultrasonografii na platformę obrazującą.

Obróć igłę w korpusie strzykawki o pojemności 3 ml tak, aby jej ścięta końcówka była skierowana do góry. Następnie, używając regulowanego statywu, ostrożnie ustaw sondę tak, aby igłę można było wprowadzić bezpośrednio do żelu. Pod środkiem sondy obrazującej igła musi znajdować się wystarczająco nisko, aby nie przebić osłony sondy, ale jednocześnie wystarczająco blisko, aby znajdować się w głębokości ogniskowej sondy.

W razie potrzeby igłę można zagiąć ręcznie tak, aby pozostawała w odpowiedniej płaszczyźnie przez cały czas przemieszczania. Zachowując wyrównanie, wycofaj igłę i podnieś sondę obrazującą, aby umieścić mysz na platformie obrazującej. Wymień igłę przed przystąpieniem do znieczulenia myszy.

Ciężarną samicę myszy w określonym dniu ciąży lub mysz noworodkową poddaje się ciągłej inhalacji 1,5% izofluranu; w celu dopasowania do małej głowy noworodka myszy, do standardowego stożka nosowego można wstawić rurkę. W przypadku myszy noworodkowych należy unieruchomić zwierzę na platformie obrazującej systemu ultradźwiękowego w pozycji grzbietnej, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. W przypadku myszy noworodkowych należy utrzymywać temperaturę ich ciała za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej.

Myszy w ciąży wymagają bardziej złożonego przygotowania. Nanieś żel do USG na kończyny, aby zapewnić sprzężenie z podłączonym detektorem EKG i monitoruj częstotliwość akcji serca. Wprowadź termometr rektalny w celu uzyskania informacji zwrotnej.

Kontrola temperatury ciała. Usunąć owłosienie z brzucha za pomocą kremu depilacyjnego i opłukać wodą. Rozciąć brzuch, używając nożyczek sekcyjnych i pęsety zakrzywionej.

Wyciągnij jeden róg macicy i umieść go na gaziku zwilżonym ciepłą solą fizjologiczną. Przez cały czas trwania procedury utrzymuj zarodki oraz jamę brzuszną matki w stanie wilgotnym. Poprzez okresowe dodawanie ciepłej soli fizjologicznej, ostrożnie manipuluj zarodkiem, aby ustawić go w pozycji umożliwiającej uzyskanie widoku długiej osi przymostkowej LV. Do pomocy w utrzymaniu orientacji zarodka podczas badania głowicą ultradźwiękową można wykorzystać zwinięty gazik.

Należy zmierzyć ciśnienie we wszystkich embrionach w jednym rogu macicy, a następnie powtórzyć tę procedurę w drugim rogu macicy. Rozpocznij od nałożenia uprzednio ogrzanego żelu ultradźwiękowego Degas na embrion lub noworodka myszy. Obniż sondę obrazującą i dostosuj kąt platformy obrazującej, aby uzyskać optymalny widok długiej osi LV w projekcji parasternalnej.

Nie należy zmieniać kąta nachylenia głowicy, aby nie utracić osiowości igły. Monitorując obraz LV na ekranie USG, powoli przesuwaj igłę, aż znajdzie się ona w pobliżu dolnej krawędzi głowicy. W razie potrzeby skoryguj położenie igły i głowicy, aby wyeliminować przesunięcia osiowości.

Obraz z noworodka myszy pokazuje idealną orientację dla lv, którą trudno osiągnąć w przypadku zarodka. Rozpocznij rejestrację danych dotyczących ciśnienia. Delikatnie przepłucz igłę solą fizjologiczną i zamknij kranik odcinający dostęp do strzykawki 20 milliliter oraz do atmosfery.

Obserwuj ciśnienie. Zwiększ wartość w programie, aby zapewnić wywarcie minimalnego nacisku na igłę. Powoli wysuwaj igłę, aż stanie się widoczna na krawędzi obrazu ultrasonograficznego, ale nie znajdzie się jeszcze w lv.

W razie potrzeby skoryguj pozycję igły, aby wprowadzić ją do LV w obrębie koniuszka. Jeśli to konieczne, dostosuj położenie głowicy, aby zachować wyraźny obraz igły. Wsuń igłę do światła LV, rejestrując dane dotyczące ciśnienia i monitorując położenie igły na obrazie USG.

Rozpoczęcie rejestracji pulsacyjnego sygnału z przetwornika ciśnienia potwierdza umieszczenie igły w świetle LV. Jeśli wydaje się, że igła znajduje się w świetle LV, lecz rejestracja ciśnienia nie wykazuje pulsacji, należy przepłukać igłę, lekko uderzając w tłok strzykawki, aż do momentu wykrycia wzrostu ciśnienia. Ilość płynu użytego do przepłukania musi być minimalna, aby uniknąć zmiany pracy serca podczas pomiarów ciśnienia.

Jeśli odczyty ciśnienia nadal nie mają charakteru pulsacyjnego, igła może znajdować się powyżej lub poniżej właściwej płaszczyzny i nie być wprowadzona do światła LV. Wycofaj igłę, przepłucz ją solą fizjologiczną i wprowadź ją ponownie.

Jeśli nadal nie udało się uzyskać odczytów pulsacyjnych, należy przejść do kolejnej myszy, zawsze używając nowej igły dla każdego nowego zwierzęcia. Całą procedurę należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować stres embrionów i noworodków w trakcie trwania eksperymentu. Ciśnienie komorowe myszy C 57 Black six J mierzono u myszy w stadium E 18.

Zgodnie z oczekiwaniami ciśnienie wynosiło prawie zero, gdy igła znajdowała się poza lewą komorą (LV), natomiast w przypadku starszej myszy P 14 po wprowadzeniu igły do LV odnotowano odczyty pulsacyjne. Odczyty ciśnienia były stłumione, ponieważ wartość ciśnienia była większa, a częstotliwość akcji serca wyższa. Częstotliwość akcji serca określano na podstawie częstotliwości pulsacyjnych odczytów ciśnienia dla różnych wieku, od E 18 do P 14.

Zmierzono tętno i obliczono skurczowe ciśnienie w lewej komorze (LV). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby okresowo nawilżać zarodki i sprawdzać stan matki. Technika ta otwiera przed badaczami z zakresu fizjologii układu sercowo-naczyniowego drogę do badania zmian ciśnienia krwi u rozwijających się myszy.