Name: Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym wieku embrionalnym i noworodkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Naucz się mierzyć ciśnienie w lewej komorze serca u myszy w późnym wieku embrionalnym i noworodkowym przy użyciu ultrasonografii. Ta technika umożliwia precyzyjne pomiary ciśnienia skurczowego w badaniach fizjologii serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana częściowo z grantów NIH HL087653 oraz HL105314. Niektóre z metod zostały opracowane w laboratorium dr. Roberta Mechama w Washington University School of Medicine.

1. System ultradźwiękowy i ciśnieniowy
<ol>
	<li>Uruchom system ultrasonograficzny zgodnie z instrukcjami producenta (Vevo 770, Visualsonics). Napełnij odpowiednią głowicę (wiek E18 - P7 = model 708, wiek &gt; P7 = model 707B) wodą destylowaną i podłącz do systemu ultrasonograficznego. Umieść głowicę w regulowanym uchwycie w orientacji przybliżonej do tej niezbędnej do uzyskania obrazu LV w osi długiej dla myszy zamocowanej na platformie obrazującej, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji.</li>
	<li>System pomiaru ciśnienia składa się z wypełnionego cieczą przetwornika ciśnienia, wzmacniacza mostkowego, systemu akwizycji danych oraz oprogramowania do rejestracji danych (LabChart). Połączenia obejmują trójdrożne kurki, rurki, złącza Luer-lock i kolanka do węży. Strzykawkę o pojemności 20 mL napełnia się 10% roztworem soli fizjologicznej z heparyną do przepłukiwania na jednym końcu. Drugi koniec łączy się z igłą, a korpus strzykawki 3 mL jest modyfikowany w celu wykorzystania go jako obudowy utrzymującej rurkę igły w ramieniu do iniekcji (Rycina 1).</li>
	<li>Zkalibruj system przetwornika ciśnienia za pomocą manometru.</li>
	<li>Zamontuj rurkę igły wraz z obudową w ramieniu do iniekcji systemu ultrasonograficznego. Zamocuj przetwornik ciśnienia w statywie pierścieniowym na wysokości zbliżonej do wysokości platformy obrazującej. Do rurki igły przymocuj igłę odpowiednią dla wieku myszy (wiek E18 - P3 = 30G, wiek &gt; P3 = 25G). Mniejsze igły częściej ulegają zapchaniu, trudniej je wprowadzić przez ścianę klatki piersiowej i charakteryzują się wolniejszym czasem reakcji. Dlatego dla każdego wieku stosuje się największy rozmiar igły, który mieści się w świetle LV.</li>
	<li>Nałóż kopczyk żelu do ultrasonografii na platformę obrazującą i ostrożnie wyrównaj głowicę za pomocą regulowanego uchwytu, tak aby igłę można było wprowadzić bezpośrednio w żel pod środek głowicy obrazującej (Rycina 2). Igła musi znajdować się wystarczająco nisko pod głowicą, aby nie przebić jej osłony, ale wystarczająco blisko, aby mieścić się w głębokości ogniskowej głowicy. W razie potrzeby igłę można wygiąć ręcznie, aby pozostawała w odpowiedniej płaszczyźnie przez całą drogę wprowadzania.</li>
	<li>Zachowując wyrównanie, wycofaj igłę i podnieś głowicę obrazującą, aby umieścić mysz na platformie obrazującej. Przepłucz igłę, aby usunąć ewentualny żel, który mógł dostać się do jej końcówki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Wszystkie metody przedstawione w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC). Z narkozą matki w określonym dniu ciąży (E18) lub myszy noworodkowej (P1 - 20) należy przeprowadzić poprzez ciągłą inhalację 1,5% izofluranu. Do standardowego stożka nosowego można włożyć rurkę, aby dostosować go do małej głowy wczesnej myszy noworodkowej (P1 - 15).</li>
	<li>Przymocuj mysz do platformy obrazowej systemu ultradźwiękowego w pozycji na plecach, tak aby wierzchołek LV był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. W przypadku matek w ciąży nałóż żel ultradźwiękowy, aby monitorować częstotliwość akcji serca za pomocą dołączonego detektora EKG, oraz wprowadź termometr rektalny do kontroli zwrotnej temperatury ciała. Myszy noworodkowe są zbyt małe dla tych detektorów, dlatego częstotliwość akcji serca jest monitorowana podczas pomiarów ciśnienia, a temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej.</li>
	<li>Usuń włosy z brzucha matki w ciąży lub z klatki piersiowej młodej myszy za pomocą kremu do depilacji. Myszy noworodkowe (P1 - 10) nie wymagają usuwania włosów.</li>
	<li>W przypadku matek w ciąży nacinaj brzuch, używając nożyczek sekcyjnych i zakrzywionych pincet. Wyprowadź jeden róg macicy i umieść go na gazie zwilżonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej. Ostrożnie przesuń embrion do właściwej pozycji, aby uzyskać obraz LV w osi długiej przyściannej za pomocą głowicy ultradźwiękowej. Zmierz ciśnienie we wszystkich embrionach po tej stronie przed wyprowadzeniem drugiego rogu macicy. Utrzymuj wszystkie embriony oraz brzuch matki w stanie wilgotnym, okresowo dodając ciepłą sól fizjologiczną.</li>
</ol>
3. Pomiar ciśnienia
<ol>
	<li>Nanieś podgrzany i odgazowany żel do USG na embrion lub noworodka myszy. W przypadku noworodków myszy, które nie zostały poddane depilacji, należy przed nałożeniem głównej ilości żelu wetrzeć niewielką ilość żelu do USG na klatkę piersiową, aby poprawić sprzężenie. Obniż głowicę obrazującą i dostosuj kąt platformy obrazowania, aby uzyskać optymalny widok osi długiej LV w przekroju parasternalnym. Nie zmieniaj kąta nachylenia głowicy, ponieważ spowoduje to utratę osiowości igły.</li>
	<li>Monitorując obraz LV na ekranie USG, powoli wprowadzaj igłę, aż znajdzie się ona w pobliżu dolnej krawędzi głowicy. W razie potrzeby skoryguj położenie igły i głowicy, aby naprawić przesunięcia osiowości. Delikatnie przepłucz igłę solą fizjologiczną. Rozpocznij rejestrację danych ciśnienia i wyzeruj przetwornik ciśnienia za pomocą oprogramowania LabChart. Przetwornik wykazuje dryft w zależności od temperatury i położenia, dlatego ważne jest jego zerowanie bezpośrednio przed pomiarem ciśnienia u każdej myszy.</li>
	<li>Powoli wprowadzaj igłę, aż stanie się ona widoczna na krawędzi obrazu USG, ale nie będzie jeszcze znajdować się w LV. W razie potrzeby skoryguj położenie igły, aby wprowadzić ją do LV w okolicy wierzchołka. Jeśli to konieczne, dostosuj położenie głowicy, aby zachować wyraźny obraz igły. Wprowadź igłę do światła LV (Rycina 3), rejestrując jednocześnie dane ciśnienia i monitorując położenie igły na obrazie USG. Rozpoczęcie pulsacyjnych zapisów z przetwornika ciśnienia potwierdza obecność igły w świetle LV (Rycina 4).</li>
	<li>Jeśli igła wydaje się znajdować w świetle LV, ale zapisy ciśnienia nie mają charakteru pulsacyjnego, przepłucz ją, lekko uderzając w tłok strzykawki, tylko do momentu wykrycia wzrostu ciśnienia (objętość około 5 - 10 μL). Powinno to usunąć wszelkie zatory, które mogą uniemożliwiać dokładny odczyt. Jeśli odczyty ciśnienia nadal nie są pulsacyjne, igła może znajdować się powyżej lub poniżej właściwej płaszczyzny i nie być wprowadzona do światła LV. Cofnij igłę, przepłucz ją solą fizjologiczną i wprowadź ponownie. Jeśli nadal nie uzyskano odczytów pulsacyjnych, przejdź do następnej myszy. Dla każdej myszy używaj nowej igły.</li>
	<li>Pomyślne odczyty ciśnienia można uzyskać u 75% badanych embrionów i noworodków myszy. Każdy odczyt powinien trwać od 5 do 10 minut; dane ciśnienia dla danej myszy nie powinny być uwzględnione, jeśli częstość akcji serca znacząco odbiega od oczekiwanej (Rycina 5A). Częstość akcji serca ma istotny wpływ na pomiary sercowo-naczyniowe, a zmieniona częstość akcji serca świadczy o stresie kardiologicznym. Stres embrionalny występuje zazwyczaj 1 - 1,5 godziny po pierwszym zewnętrznym odsłonięciu macicy, dlatego szybkość działania jest kluczowa przy pomiarach ciśnienia u całego miotu.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wszystkie przedstawione wyniki dotyczą myszy C57BL6J. Zdjęcie igły w świetle LV u myszy P1 pokazano na Rysunku 3. Igła jest niezbędna do przebicia ścian klatki piersiowej i uzyskania dostępu do małego światła LV, lecz znacząco zwiększa czas odpowiedzi systemu ciśnieniowego. Gdy do systemu ręcznie zastosowano przybliżony skokowy wzrost ciśnienia, czas osiągnięcia 67% ciśnienia maksymalnego wyniósł 0,067 s dla samego przewodu (co najprawdopodobniej wskazuje na rzeczywisty czas aplikacji skoku ciśnienia), 0,105 s z igłą 25 G oraz 0,529 s z igłą 30 G. Opóźnienie w osiągnięciu ciśnienia maksymalnego jest widoczne na pełnych zapisach przedstawionych na Rysunkach 4A i 4C. Chociaż czas odpowiedzi jest dłuższy przy użyciu igły 30 G, kształt fali jest lepiej uchwycony w etapach embrionalnym i wczesnym neonatalnym, ponieważ częstotliwość akcji serca u myszy wzrasta wraz z wiekiem5. Mimo tego ograniczenia, ciśnienie skurczowe można obliczyć, przyjmując, że rzeczywiste ciśnienie rozkurczowe (minimalne) LV wynosi zero, a skurczowe (maksymalne) ciśnienie LV jest dwukrotnością średniego ciśnienia LV wyznaczonego z odczytów w stanie ustalonym (Rysunki 4B i 4D)6. Zazwyczaj przyjmuje się, że skurczowe ciśnienia w LV i w tętnicach są sobie równe. Zmierzone częstotliwości akcji serca oraz obliczone ciśnienia LV dla różnych wieku od E18 do P14 przedstawiono na Rysunku 5.
<img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig1.jpg" alt="Schemat układu pomiaru ciśnienia; obejmuje strzykawkę, kranik, przetwornik, połączenie z wzmacniaczem." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rycina 1. Zdjęcie przetwornika ciśnienia z przymocowanymi trójdrożnymi kranikami, męskimi (M) i żeńskimi (F) złączami Luer lock, kolcami do węży, rurkami, strzykawkami i igłą.
<img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig2.jpg" alt="Układ obrazowania ultradźwiękowego z uchwytem sondy, żelem i platformą; wstrzyknięcie igły w diagnostyce medycznej." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 2. Zdjęcie układu służącego do wyrównania igły z sondą obrazującą (A). Platforma obrazująca jest obrócona tak, aby wierzchołek LV myszy był skierowany w stronę ramienia do iniekcji. Sonda jest zamontowana w regulowanym uchwycie w orientacji przybliżonej do tej niezbędnej do uzyskania obrazu osi długiej LV. Obudowa rurki igły jest zamontowana w ramieniu do iniekcji. Igłę wprowadza się w kopczyk żelu ultradźwiękowego na platformie obrazującej, aby określić właściwy kąt oraz pozycję pionową i poziomą względem sondy obrazującej (B).
<img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig3.jpg" alt="Obraz USG tkanek serca, pokazujący ściany jam oraz LV, do analizy kardiologicznej." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 3. Obraz igły (N) wprowadzonej przez ścianę klatki piersiowej (CW) do światła LV u myszy P1. Pasek skali = 0.1 mm.
<img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig4.jpg" alt="Wykresy ciśnienia krwi w funkcji czasu, pokazujące dynamiczne zmiany ciśnienia w wynikach układu eksperymentalnego." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 4. Przykładowe odczyty ciśnienia pulsacyjnego podczas wprowadzania igły do LV myszy w dniu E18 (A) i P14 (C). Występuje opóźnienie w osiągnięciu stanu stacjonarnego ze względu na czas odpowiedzi układu z podłączoną igłą. Powiększone widoki odczytów w stanie stacjonarnym przedstawiono w B i D. Należy zauważyć, że minimalne ciśnienia w LV w dniu E18 są bliskie zeru, jednak pełna fala od zera do ciśnienia maksymalnego nie może zostać zarejestrowana przy wyższych częstotliwościach akcji serca u myszy P14. Średnie ciśnienia są mierzone z odczytów w stanie stacjonarnym i przyjmuje się, że ciśnienie skurczowe w LV = 2 x zmierzone ciśnienie średnie.
<img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig5.jpg" alt="Wykresy słupkowe tętna i ciśnienia; analiza porównawcza w etapach rozwojowych od E18 do P14." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rycina 5. Zmierzone tętno (A) i obliczone ciśnienie skurczowe LV dla myszy w dniach E18 - P14. N = 7 dla E18, 5 dla P1, 22 dla P3, 23 dla P7 i 16 dla P145-7.

<ol><li>Ji, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ventricular+diastolic+function+correlate+with+changes+in+ventricular+myoarchitecture+in+normal+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos.</a> Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).</li>
<li>Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+nonuniformity+of+geometric+and+mechanical+properties+of+mouse+aorta+is+increased+during+postnatal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).</li>
<li>Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+blood+pressure+and+baroreflex+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice.</a> Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).</li>
<li>Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+aortic+diameter+and+compliance+precedes+blood+pressure+increases+in+postnatal+development+of+elastin-insufficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).</li>
<li>Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vessel+elasticity+alters+cardiovascular+structure+and+function+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice.</a> Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).</li>
<li>Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+elastin+to+aortic+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of elastin to aortic development in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).</li>
<li>Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microfibrils+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular microfibrils in development and disease.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).</li>
<li>Li, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease%2C+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).</li>
<li>Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+on+cardiac+function+during+echocardiography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie neonatalnym. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest rozdzielczość czasowa systemu pomiarowego. Sygnał ciśnienia ulega tłumieniu podczas przemieszczania się z LV przez igłę do przetwornika, przez co rejestrowane mogą być jedynie średnie wartości ciśnienia. Tłumienie można zminimalizować, stosując możliwie największą igłę, jednak musi ona mieścić się w świetle LV u myszy w różnym wi...

<table><tbody><tr><td>System ultradźwiękowy o wysokiej rozdzielczości</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>Vevo 770</td><td>Lub inny odpowiedni system ultradźwiękowy</td></tr><tr><td>Wysokoczęstotliwościowe głowice ultradźwiękowe</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>708 i 707B</td><td> </td></tr><tr><td>Platforma obrazowania i ramię do iniekcji</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>Imaging Station 2</td><td>Z EKG i sprzężeniem zwrotnym temperatury platformy</td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>ADInstruments</td><td>MLT 844</td><td> </td></tr><tr><td>Wzmacniacz mostkowy</td><td>ADInstruments</td><td>ML221</td><td> </td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>ADInstruments</td><td>ML866</td><td> </td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rejestracji danych</td><td>ADInstruments</td><td>LabChart</td><td> </td></tr><tr><td>Statyw z obejmą</td><td>Różni</td><td></td><td>Do utrzymania przetwornika ciśnienia podczas pomiarów</td></tr><tr><td>Trójdrożne kurki z połączeniami luer, blokada męska</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-02</td><td> </td></tr><tr><td>Przewody Tygon o wewnętrznej średnicy 1/16&quot;</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408</td><td> </td></tr><tr><td>Złącza luer męskie i żeńskie z kolcem 1/16&quot;</td><td>Cole-Parmer</td><td>45510-50 45510-00</td><td> </td></tr><tr><td>Przewód 24&quot; z łączem luer męskim i żeńskim na każdym końcu</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-60</td><td> </td></tr><tr><td>Strzykawki 3 i 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Igły 30 i 25G</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Długość 1,5 cala</td></tr><tr><td>Manometr Big Ben</td><td>Riester</td><td>1456-100</td><td> </td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Różni</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Różni</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Żel do USG</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>Aquasonic 100</td><td> </td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Measuring Left Ventricular Pressure in Late Embryonic and Neonatal Mice

Ciśnienie krwi znacząco wzrasta podczas rozwoju embrionalnego i ponatalnego u zwierząt kręgowców. U myszy przepływ krwi jest po raz pierwszy wykrywalny około 8,5 dnia embrionalnego (E)1. Skurczowe ciśnienie w lewej komorze (LV) wynosi 2 mmHg w E9,5 oraz 11 mmHg w E14,52. Na tych środkowych etapach rozwoju embrionalnego LV jest wyraźnie widoczna przez ścianę klatki piersiowej, co umożliwia inwazyjne pomiary ciśnienia, ponieważ żebra i skóra nie są w pełni rozwinięte. Między E14,5 a narodzinami (około E21) do obrazowania LV należy stosować metody obrazowania. Po urodzeniu średnie ciśnienie tętnicze wzrasta od 30 do 70 mmHg między 2. a 35. dniem ponatalnym (P)3. Po P20 ciśnienie tętnicze można mierzyć za pomocą cewników półprzewodnikowych (np. Millar lub Scisense). Przed P20 cewniki te są zbyt duże dla rozwijających się tętnic myszy, dlatego ciśnienie tętnicze musi być mierzone za pomocą specjalnie przygotowanych, wyciąganych cewników plastikowych podłączonych do przetworników ciśnienia wypełnionych cieczą3 lub szklanych mikropipet podłączonych do serwomechanicznych przetworników ciśnienia zerującego4.
Nasze ostatnie badania wykazały, że największy wzrost ciśnienia tętniczego u myszy występuje w okresie od późnego embrionalnego do wczesnego postnatalnego5-7. Ten znaczny wzrost ciśnienia tętniczego może wpływać na fenotyp komórek mięśni gładkich (SMC) w rozwijających się tętnicach i wywoływać istotne zdarzenia mechanotransdukcyjne. W przypadku chorób ludzkich, w których właściwości mechaniczne rozwijających się tętnic są upośledzone przez defekty białek macierzy zewnątrzkomórkowej (np. zespół Marfana8 i nadzastawkowe zwężenie aorty9), gwałtowne zmiany ciśnienia tętniczego w tym okresie mogą przyczyniać się do fenotypu i nasilenia choroby poprzez zmiany w sygnałach mechanotransdukcyjnych. Dlatego ważne jest, aby móc mierzyć zmiany ciśnienia tętniczego w późnym okresie embrionalnym i w okresie noworodkowym w mysich modelach ludzkich chorób.
Opisujemy metodę pomiaru ciśnienia w LV u myszy w późnym okresie embrionalnym (E18) oraz we wczesnym okresie postnatalnym (P1 - 20). Igłę połączoną z wypełnionym cieczą przetwornikiem ciśnienia wprowadza się do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego dbano o zachowanie prawidłowej funkcji serca, szczególnie w przypadku myszy w okresie embrionalnym. Przedstawiono reprezentatywne dane oraz omówiono ograniczenia protokołu.

Opisano metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w okresie embrionalnym i neonatalnym. Ciśnienie mierzy się poprzez wprowadzenie igły połączonej z przetwornikiem wypełnionym cieczą do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego należy zadbać o utrzymanie prawidłowej funkcji serca.

Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Ciśnienie krwi wzrasta znacząco podczas rozwoju embrionalnego i postnatalnego u zwierząt kręgowców. U myszy przepływ krwi jest po raz pierwszy wykrywalny...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w późnym stadium embrionalnym oraz w okresie noworodkowym. W pierwszej kolejności przygotowuje się sprzęt. Igłę podłączoną do przetwornika ciśnienia należy wyrównać z sondą ultradźwiękową.Następnie przygotowuje się mysz i wykonuje obrazowanie USG jej LV. Potem igłę wprowadza się do światła LV i rejestruje pomiary ciśnienia pulsacyjnego. Ostatecznie wyniki pokazują ciśnienia skurczowe u myszy w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie neonatalnym z wykorzystaniem tej prowadzonej pod kontrolą USG cewnikowania z wypełnieniem płynem.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemy servo, pomiary bezciśnieniowe czy cewniki w stanie stałym, jest możliwość pomiaru ciśnienia u myszy w późnym okresie embrionalnym i noworodkowym w sposób stabilny i powtarzalny. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ utrzymanie orientacji embrionu w pęcherzyku zarodkowym jest wymagające ze względu na tendencję embrionu do obracania się. W przypadku zastosowania głowicy ultradźwiękowej, w zależności od badanego stadium rozwoju myszy, należy wybrać odpowiednią głowicę i napełnić ją wodą destylowaną.Umieść głowicę w regulowanym uchwycie systemu ultradźwiękowego. Dostosuj uchwyt tak, aby uzyskać widok osi długiej lewej komory (LV) myszy zamocowanej do platformy, z wierzchołkiem LV skierowanym w stronę ramienia do iniekcji. System pomiaru ciśnienia składa się z wypełnionego płynem przetwornika ciśnienia, wzmacniacza mostkowego, systemu akwizycji danych oraz oprogramowania LabChart.Pakiet oprogramowania, a strzykawka o pojemności 20 mililitrów wypełniona 10% roztworem soli fizjologicznej z heparyną służy do przepłukania przewodów. Należy upewnić się, że w przewodach lub nad przetwornikiem nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Przewody do przetwornika są połączone za pomocą kurków trójdrożnych, złączy luer-lock oraz kolców do węży.Skalibruj system przetwornika ciśnienia za pomocą manometru, montując rurkę igłową i obudowę w ramieniu wtryskowym. Zastąp manometr obudową, która utrzyma rurkę przy ramieniu wtryskowym. Obudowa ta jest po prostu zmodyfikowanym korpusem strzykawki o pojemności trzech mililitrów.Zaciśnij przetwornik ciśnienia w uchwycie pierścieniowym. Ustaw go na wysokości zbliżonej do poziomu platformy obrazującej, aby uniknąć zapychania. Do rurki igłowej przymocuj igłę o największej możliwej średnicy i wstrzykuj heparynowaną sól fizjologiczną, aż pojawią się kilka kropel.Ponownie wysuń igłę. Upewnij się, że w przewodach lub nad przetwornikiem nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Następnie nałóż porcję żelu ultradźwiękowego na platformę obrazującą.Obróć igłę w korpusie strzykawki o pojemności 3 mL tak, aby ścięta krawędź igły była skierowana do góry. Następnie, używając regulowanego statywu, ostrożnie wyrównaj sondę w taki sposób, aby igłę można było wprowadzić bezpośrednio do żelu. Pod środkiem sondy obrazującej igła musi znajdować się wystarczająco nisko, aby nie przebić osłony sondy, ale jednocześnie wystarczająco blisko, aby znajdować się w głębokości ogniskowania sondy.W razie potrzeby igłę można zgiąć ręcznie tak, aby pozostawała w odpowiedniej płaszczyźnie przez cały czas przemieszczania. Zachowując osiowość, wycofaj igłę i podnieś głowicę obrazującą, aby umieścić mysz na platformie obrazującej. Wymień igłę przed przystąpieniem do znieczulenia myszy.Znieczulono ciężarną mysz w określonym dniu ciąży lub mysz noworodkową poprzez ciągłą inhalację 1,5% izofluranu; do standardowego stożka nosowego można włożyć rurkę, aby dostosować go do małej głowy wczesnego noworodka myszy. W przypadku myszy noworodkowych unieruchom zwierzę na platformie obrazowej systemu ultradźwiękowego w pozycji leżącej na grzbiecie, tak aby szczyt LV był skierowany w stronę ramienia wtryskowego. W przypadku myszy noworodkowych należy utrzymywać temperaturę ich ciała za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej.Myszki w ciąży wymagają staranniejszego przygotowania. Nanieś żel do USG na kończyny, aby zapewnić sprzężenie z podłączonym detektorem EKG i monitoruj częstotliwość akcji serca. Wprowadź termometr rektalny w celu uzyskania informacji zwrotnej.Kontrola temperatury ciała. Usunąć owłosienie z brzucha za pomocą kremu depilacyjnego i opłukać wodą. Rozciąć brzuch, używając nożyc preparacyjnych i pęsety zakrzywionej.Wyciągnij jeden róg macicy i połóż go na zwilżonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej gaziku. Przez cały czas trwania tej procedury utrzymuj wszystkie embriony oraz brzuch matki w stanie wilgotnym. Po okresowym dodawaniu ciepłej soli fizjologicznej ostrożnie przesuń embrion do odpowiedniej pozycji, aby uzyskać obraz lewej komory (LV) w przekroju podmostkowym wzdłuż długiej osi. Podczas korzystania z sondy ultradźwiękowej można użyć zwiniętego gazika, aby pomóc w utrzymaniu orientacji embrionu.Należy przystąpić do pomiaru ciśnienia we wszystkich zarodkach w jednym rogu macicy, zanim proces zostanie powtórzony w drugim rogu macicy. Rozpocznij od nałożenia uprzednio ogrzanego żelu ultradźwiękowego Degas na embrion lub noworodka myszy. Obniż głowicę obrazującą i dostosuj kąt platformy obrazowej, aby uzyskać optymalny widok osi podłużnej LV w przekroju parasternalnym.Nie należy zmieniać kąta nachylenia głowicy, ponieważ spowoduje to utratę osiowości igły. Monitorując obraz LV na ekranie USG, powoli posuwaj igłę, aż znajdzie się ona w pobliżu dolnej krawędzi głowicy. W razie potrzeby skoryguj położenie igły i głowicy, aby naprawić przesunięcia w osiowości.Obraz z noworodka myszy wykazuje idealną orientację lewej komory (lv), co jest trudne do osiągnięcia w przypadku embrionu. Rozpocznij rejestrację danych ciśnienia. Delikatnie przemyj igłę solą fizjologiczną i zamknij kurek stopowy prowadzący do strzykawki 20 ml oraz do atmosfery.Obserwuj ciśnienie. Zwiększ ustawienia w programie, aby upewnić się, że do igły przykładane jest minimalne ciśnienie. Powoli wysuwaj igłę, aż pojawi się ona na krawędzi obrazu USG, ale nie w jeszcze w lv.W razie potrzeby skoryguj położenie igły, aby wprowadzić ją do LV w okolicy wierzchołka. Jeśli to konieczne, dostosuj pozycję głowicy, aby utrzymać wyraźny obraz igły. Wprowadź igłę do światła LV, rejestrując jednocześnie dane dotyczące ciśnienia i monitorując położenie igły na obrazie USG.Pojawienie się zapisów pulsacyjnych z przetwornika ciśnienia potwierdza położenie igły wewnątrz światła LV. Jeśli igła wydaje się znajdować w świetle LV, ale zapisy ciśnienia nie są pulsacyjne, należy przepłukać igłę, lekko uderzając w tłok strzykawki, aż do momentu wykrycia wzrostu ciśnienia. Przepłukiwanie cieczą musi być minimalne, aby uniknąć zmiany pracy serca podczas pomiarów ciśnienia.Jeśli odczyty ciśnienia nadal nie mają charakteru pulsacyjnego, igła może znajdować się powyżej lub poniżej właściwej płaszczyzny i nie być wprowadzona do światła LV. Wycofaj igłę, przemyj ją solą fizjologiczną i wprowadź ją ponownie.Jeśli nadal nie udaje się uzyskać odczytów tętna, należy przejść do kolejnej myszy, zawsze używając nowej igły dla każdego zwierzęcia. Całą procedurę należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować stres zarodków i noworodków w trakcie trwania eksperymentu. Ciśnienie komorowe u myszy C 57 Black six J mierzono w stadium E 18.Zgodnie z oczekiwaniami ciśnienie wynosiło niemal zero, gdy igła znajdowała się poza LV, natomiast po wprowadzeniu jej do LV u starszej myszy P 14 odnotowano odczyty pulsacyjne. Odczyt ciśnienia był stłumiony, ponieważ wartość ciśnienia była większa, a częstotliwość akcji serca wyższa. Częstotliwość akcji serca określono na podstawie częstotliwości pulsacyjnych odczytów ciśnienia dla różnych wieku od E 18 do P 14.Zmierzono tętno i obliczono skurczowe ciśnienie w LV. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o okresowym nawilżaniu zarodków oraz sprawdzaniu stanu matki. Technika ta umożliwia badaczom fizjologii układu sercowo-naczyniowego analizę zmian ciśnienia tętniczego u rozwijających się myszy.

measuring-left-ventricular-pressure-late-embryonic-neonatal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiar ciśnienia w lewej komorze serca u myszy w późnym okresie embrionalnym i u noworodków

Śmierć płodowa i okołoporodowa jest częstym zjawiskiem podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca. Obrazowanie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji na temat wczesnego rozwoju serca, stanowiąc idealną metodę wykrywania wpływu na strukturę i funkcję serca przed śmiercią.

Echokardiografia płodowa myszy

Specyficzny i szybki protokół do jednoczesnego badania funkcji prawego serca, zapalenia płuc i odpowiedzi immunologicznej jest opisany jako narzędzie do nauki.  Filmy i rysunki opisują fizjologię i techniki mikrodysekcji w zorganizowanym podejściu zespołowym, które można dostosować do stosowania w małych i dużych badaniach.

Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

Ten artykuł zawiera protokół do echokardiograficznej oceny wielkości prawej komory i nadciśnienia płucnego u myszy.  Zastosowania obejmują określanie fenotypu i seryjną ocenę w transgenicznych i indukowanych toksynami mysich modelach kardiomiopatii i chorób naczyń płucnych.

Echokardiograficzna ocena prawego serca u myszy

Dysfunkcja prawej komory (RV) jest kluczowa dla patogenezy chorób sercowo-naczyniowych, jednak dostępne są ograniczone metodologie jej oceny. Ostatnie postępy w obrazowaniu ultrasonograficznym zapewniają nieinwazyjną i dokładną opcję podłużnego badania RV. W tym artykule szczegółowo opisujemy krok po kroku metodę echokardiograficzną wykorzystującą mysi model przeciążenia ciśnienia RV.

Ocena struktury i funkcji prawej komory serca w mysim modelu zwężenia tętnicy płucnej za pomocą echokardiografii przezklatkowej

Niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji i główną przyczyną śmiertelności. Model trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy stosuje się do badania przebudowy komór i dysfunkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Przedstawiono technikę inwazyjnych pomiarów hemodynamicznych u myszy.

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy: model przebudowy po zawale mięśnia sercowego i niewydolności serca

Ten artykuł opisuje pomiar funkcji lewej komory myszy za pomocą analizy ciśnienia/objętości przy różnych częstościach akcji serca.

Cewnikowanie serca u myszy w celu pomiaru zależności objętości ciśnienia: badanie efektu Bowditcha

Ten rękopis opisuje szczegółowy protokół zbierania danych o ciśnieniu i objętości z myszy.

Pomiar pętli głośności ciśnienia w myszy

Poniższy protokół opisuje metodologię pozyskiwania i analizy obrazów echokardiograficznych używanych do uzyskania objętości lewego przedsionka (LAV), średnicy aorty (Ao) i średnicy tętnicy płucnej (PA) u myszy. Technika ta jest nieinwazyjnym, nieterminalnym zabiegiem, który umożliwia ocenę funkcji krążeniowo-oddechowej.

Echokardiografia mysia lewego przedsionka, aorty i tętnicy płucnej

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości u płodu myszy poprawiło rozdzielczość obrazowania i może zapewnić precyzyjną, nieinwazyjną charakterystykę rozwoju serca i wad strukturalnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest przeznaczony do wykonywania echokardiografii płodu u myszy w czasie rzeczywistym in vivo.

Obrazowanie układu sercowo-naczyniowego u płodu myszy za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości (30/45 MHZ)

Tutaj opisujemy i porównujemy dwie pozycje do uzyskania wierzchołkowego widoku czterokomorowego u myszy. Pozycje te umożliwiają ilościowe określenie funkcji prawej komory, zapewniają porównywalne wyniki i mogą być stosowane zamiennie.

Echokardiograficzny pomiar parametrów rozkurczowych prawej komory serca u myszy

Obecny protokół opisuje echokardiograficzną ocenę morfologii, funkcji i przepływu krwi w naczyniach wieńcowych lewej komory serca u 7-dniowych noworodków myszy.

Echokardiograficzna charakterystyka struktury, funkcji i przepływu wieńcowego lewej komory u nowonarodzonych myszy

Naucz się mierzyć ciśnienie w lewej komorze serca u myszy w późnym wieku embrionalnym i noworodkowym przy użyciu ultrasonografii. Ta technika umożliwia precyzyjne pomiary ciśnienia skurczowego w badaniach fizjologii serca.

Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Przeglądaj więcej filmów