Name: Izolacja komórek nabłonka sutka z trójwymiarowej kokultury sferoidalnej komórek mieszanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek nabłonka sutka z trójwymiarowych kokultur sferoidalnych w celu analizy wpływu fibroblastów na biologię komórek nabłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Tworzenie trójwymiarowych kokultur
<ol>
	<li>Dzień przed utworzeniem kokultur wyjmij Matrigel z zamrażarki i rozmroź na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>W dniu eksperymentu przygotuj pożywkę do kokultury, która odpowiada pożywce stosowanej dla komórek nabłonkowych (w tym przykładzie pożywka HMEC: pożywka DME/F12 z dodatkiem 10% serum cielęcego, 5 μg/mL insuliny, 1 μg/mL hydrokortyzonu i 1 ng/mL EGF). Przechowuj pożywkę na lodzie przez co najmniej 1 godzinę przed zmieszaniem z Matrigelem.</li>
	<li>Aby rozcieńczyć rozmrożony Matrigel, określ całkowitą pożądaną ilość mieszaniny Matrigel:pożywka (300 μL na studzienkę dla płytek 24-dołkowych) i dodaj połowę tej objętości schłodzonej pożywki HMEC do sterylnej probówki na lodzie. Następnie dodaj do probówki taką samą połowę całkowitej objętości rozmrożonego Matrigelu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1. Przechowuj probówkę na lodzie.</li>
	<li>Nanieś 50 μL mieszaniny Matrigel:pożywka na środek wyznaczonych studzienek na płytce 24-dołkowej i inkubuj przez 10 min w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem i 5% CO2.</li>
	<li>Dodaj do studzienek kolejne 450 μL mieszaniny Matrigel:pożywka i inkubuj przez kolejne 60 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj zawiesinę 1:1 fibroblastów (tutaj h-TERT-unieśmiertelnione fibroblasty gruczołu piersiowego redukcyjnego wykazujące ekspresję GFP) i komórek nabłonkowych (tutaj h-TERT-unieśmiertelniona linia ludzkich komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego wykazująca ekspresję RFP) w stężeniu 0,5 x 105 każdych komórek w 0,5 ml pożywki HMEC.</li>
	<li>Po 60-minutowym etapie inkubacji ostrożnie nanieś zawiesinę komórkową na powierzchnię zestalonego żelu i przenieś kulturę z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Nie zakłócaj kultur przez 2 dni. Po tym czasie pożywkę można wymieniać co 2-3 dni, bardzo ostrożnie aspirując ją z boku studzienki i delikatnie zastępując świeżą pożywką HMEC.</li>
	<li>Codziennie monitoruj tworzenie sferoidów pod mikroskopem. Kultury są zazwyczaj dojrzałe po 10-14 dniach. Wykonaj odpowiednie obrazy za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Rozmiar sferoidów oraz długość wypustek można zmierzyć pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek z kokultur sferoidów
<ol>
	<li>Bardzo delikatnie pipetuj kulturę w górę i w dół 10 razy, używając sterylnej szklanej pipety 2-mL. Alternatywnie, aby pipetować kulturę, można odciąć końcówkę plastikowego tipa do pipety 1000 µl za pomocą nożyczek wysterylizowanych w autoklawie lub poprzez zanurzenie w 70% etanolu. Przenieś kulturę za pomocą szklanej pipety lub odciętego plastikowego tipa do sterylnej probówki wirówkowej 15 ml i wiruj przez 5 min przy 2000 rpm w temperaturze pokojowej. Sferoidy komórkowe osiądą na dnie.</li>
	<li>Użyj sterylnej końcówki pipety Pasteura, aby delikatnie usunąć rozbitą matrycę Matrigel z górnej części wirówki w probówce.</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki HMEC do osadu ze sferoidów, pipetuj w górę i w dół 2-3 razy za pomocą sterylnej szklanej pipety 2 mL, a następnie przenieś kulturę do dołka w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek.</li>
	<li>Pozostaw sferoidy do przyczepienia się do płytki na co najmniej 48 godzin przed zmianą pożywki. Z czasem komórki opuszczą struktury sferoidalne i zaczną rosnąć jako monowarstwy.</li>
	<li>Przeprowadź pasaż kultur komórkowych, gdy komórki osiągną 50% konfluencji. Najpierw przenieś kulturę do naczynia 35 mm (około 2-4 dni), a następnie do naczynia 100 mm (około 3-5 dni). Bezpośrednio przed każdym etapem pasażowania użyj sterylnej pipety Pasteura, aby ręcznie usunąć jak najwięcej pozostałych „sferoidów widm”.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości populacji, używając odpowiednich markerów powierzchniowych komórek, a w razie potrzeby oddziel różne populacje komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Izolowane komórki są teraz gotowe do dalszych analiz zgodnie z potrzebami.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
W trójwymiarowych kokulturach sferoidów fibroblasty z indukowanym wyciszeniem Tiam1 powodują zwiększoną inwazję w macierz komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego (Rycina 1, porównać D, E, F z A, B, C). Fibroblasty z indukowaną nadekspresją Tiam1 powodują zmniejszoną inwazję w macierz linii komórek raka piersi SUM159 (Rycina 1, porównać J, K, L z G, H, I).
Po utworzeniu sferoidów w ko-kulturze, populacje komórek można wyizolować ze sferoidów poprzez ponowne wysianie w warunkach dwuwymiarowych, jak pokazano na Rysunku 2. W zależności od względnych szybkości wzrostu badanych komórek, czyste populacje mogą pojawić się w wyniku seryjnego pasażowania (jak pokazano na Rysunku 3) lub mogą zostać posortowane przy użyciu odpowiednich markerów komórkowych. Po izolacji z 3D ko-kultury, komórki nabłonkowe zachowują właściwości nabyte w wyniku ko-kultury z fibroblastami przez dłuższy czas, co stwarza szerokie możliwości analizy. W niniejszym przykładzie ekspozycja na fibroblasty z niedoborem Tiam1 wywołała zwiększoną migrację w ko-kulturowanych HMEC, która utrzymywała się przez wiele tygodni po izolacji z 3D ko-kultury (Rysunek 4).
<img alt="Porównanie morfologii komórek; pole jasne, fluorescencja GFP, Cherry; technika obrazowania mikroskopowego." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Obrazowanie uformowanych kokultur sferoidów w mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej. Kultury sferoidów utworzono z linii komórkowych nabłonka gruczołów mlekowych oraz fibroblastów i pozostawiono do wzrostu w kulturze na 10-14 dni. A-F: komórki nabłonkowe = HMEC-mCherry. G-L: komórki nabłonkowe = SUM159-mCherry. A-C, G-I: fibroblasty = kontrolne komórki RMF-GFP. D-F: fibroblasty = RMF-GFP z wyciszeniem Tiam1. J-L: fibroblasty = RMF-GFP z nadekspresją Tiam1. Strzałki wskazują wypustki nabłonkowe naciekające macierz.
<img alt="Postępy hodowli komórkowej; mikroskopia w polu jasnym, fluorescencja GFP i Cherry; analiza wzrostu." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Sekwencyjne obrazowanie hodowli pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym po izolacji z hodowli w Matrigelu. Dzień 0 oznacza obrazowanie bezpośrednio po izolacji; dni 1, 2 i 5 wskazują liczbę dni po izolacji. Korona komórek opuszczających sferoid powiększa się z czasem. Ostatecznie pozostaje „widmowy” sferoid z bardzo niewielką liczbą komórek (strzałka). Po usunięciu sferoidów widmowych i pierwszym pasażu pozostaje bardzo mało sferoidów.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej pokazujący ekspresję mCherry/GFP w kolejnych dniach; analiza danych populacji komórkowych." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza cytometrii przepływowej komórek po izolacji z kokultury w Matrigelu. Po dojrzewaniu kokultur sferoidalnych komórki są izolowane z kokultury 3D poprzez pipetowanie i seryjne pasażowanie. Alikwoty próbek są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (w tym przykładzie z wykorzystaniem fluorescencji zielonej i czerwonej w celu zidentyfikowania odpowiednio fibroblastów wykazujących ekspresję GFP oraz komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję mCherry), aby określić względne liczebności populacji komórek nabłonkowych i fibroblastów.
<img alt="Wykres słupkowy; porównanie migracji komórek w ciągu kolejnych tygodni; grupy kontrolna i shT; dane eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Migracja komórek HMECs w układzie Transwell utrzymuje się po izolacji z kokultury w Matrigelu. Po uzyskaniu czystych populacji poprzez hodowlę lub sortowanie komórek metodą fluorescencyjną, komórki można poddać dowolnej analizie. Przedstawiono ocenę migracji komórek HMECs kokultywowanych z fibroblastami kontrolnymi (C) lub fibroblastami z niedoborem Tiam1 (shT) przez perforowane membrany Transwell w 2., 4. i 8. tygodniu po izolacji z kokultury.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).</li>
<li>Li, H., Fan, X., Houghton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment%3A+the+role+of+the+tumor+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer.</a> J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).</li>
<li>Tse, J. C., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+metastasis%3A+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+contribution+of+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment.</a> J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+in+fibroblasts+modulates+the+oncogenic+potential+of+adjacent+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia.</a> Science. 303, 848-851 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tumor-stroma interactions.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).</li>
<li>Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+optimization+of+an+organotypic+assay+system+that+imitates+human+hair+follicle-like+epithelial-mesenchymal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions.</a> Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).</li>
<li>Kilani, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cytotoxicity+of+gemcitabine+in+bladder+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines.</a> Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).</li>
<li>Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fibroblast-tumor+cell+interaction+causes+downregulation+of+RACK1+mRNA+expression+in+breast+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro.</a> Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).</li>
<li>Silzle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+fibroblasts+recruit+blood+monocytes+into+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue.</a> Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).</li>
<li>Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+stimulus+of+lung+fibroblasts+on+lung+cancer+cells+is+impaired+by+the+receptor+for+advanced+glycation+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).</li>
<li>Liu, T., Lin, B., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+promoted+tumor+spheroid+invasion+on+a+microfluidic+3D+co-culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device.</a> Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).</li>
<li>Zengel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+therapy+for+synergic+inhibition+of+tumour+cell+invasion+and+tumour-induced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis.</a> BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterologous+3-D+coculture+model+of+breast+tumor+cells+and+fibroblasts+to+study+tumor-associated+fibroblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation.</a> Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).</li>
<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+spheroids+maintained+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension.</a> Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).</li>
<li>Hirschhaeuser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexpression+of+the+TJ+protein+CLDN1+induces+apoptosis+in+breast+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids.</a> Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).</li>
<li>Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D%2C+tamoxifen+and+beta-estradiol+modulate+breast+cancer+cell+growth+and+interleukin-6+and+metalloproteinase-2+production+in+three-dimensional+co-cultures+of+tumor+cell+spheroids+with+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium.</a> Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).</li>
<li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fibroblast+Tiam1+in+tumor+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis.</a> Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda stanowi proste podejście do analizy wpływu fibroblastów zrębu na komórki nabłonkowe, w tym komórki nowotworowe. Umożliwia ona bezpośrednią interakcję międzykomórkową w kontekście trójwymiarowym, wspieranym przez zewnątrzkomórkową macierz błony podstawnej, jednocześnie pozwalając na łatwe wyodrębnienie komórek z macierzy do dalszych analiz. Metodę tę można zastosować w badaniach zrębu związanego z nowotworem, ponieważ linie fibroblastów mogą być modyfikowane w celu wpływania na wybrane szlaki sy...

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Klasyczne pożywka ciekła Hyclone: DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca Hyclone</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3007303</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>EMD Millipore</td><td>407709</td><td>Rozpuścić w 0,005N HCl; filtr 0,22 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td>Rozpuścić w 50% EtOH; filtr 0,22 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Rozpuścić w 10mM kwasie octowym; filtr 0,22 &amp;#x03BC;M</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Choć ogromne wysiłki poświęcono identyfikacji szlaków sygnalizacyjnych i cząsteczek zaangażowanych w prawidłowe i nowotworowe zachowania komórek1-2, znaczna część tych prac została przeprowadzona z wykorzystaniem klasycznych dwuwymiarowych modeli hodowli komórkowych, które umożliwiają łatwą manipulację komórkami. Stało się jasne, że wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne są pod wpływem sił zewnątrzkomórkowych, w tym wymiarowości i napięcia powierzchniowego komórek3-4. Zastosowano wiele podejść w celu opracowania modeli trójwymiarowych, które dokładniej odzwierciedlają architekturę tkanki biologicznej3. Mimo że modele te uwzględniają wielowymiarowość i naprężenia architektoniczne, badanie wynikających z nich efektów w komórkach jest mniej łatwe niż w dwuwymiarowej hodowli tkankowej ze względu na ograniczenia modeli oraz trudności w izolowaniu komórek do późniejszych analiz.
Coraz powszechniej uznaje się istotną rolę mikrośrodowiska wokół guzów w procesie tumorigennezy i zachowaniu nowotworu4. Zręb guza składa się z wielu typów komórek oraz cząsteczek zewnątrzkomórkowych. W trakcie rozwoju guza zachodzi dwukierunkowa sygnalizacja między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu5. Choć zidentyfikowano niektóre czynniki uczestniczące w koewolucji guza i zrębu, wciąż istnieje potrzeba opracowania prostych technik do systematycznej identyfikacji i badania pełnego spektrum tych sygnałów6. Fibroblasty są najliczniejszym typem komórek w prawidłowych tkankach zrębowych lub tkankach zrębowych związanych z nowotworem i przyczyniają się do odkładania oraz utrzymania błony podstawnej i czynników wzrostu działających w sposób parakrynny7.
Wiele grup badawczych wykorzystywa trójwymiarowe systemy hodowli do badania roli fibroblastów w różnych funkcjach komórkowych, w tym w odpowiedzi nowotworu na terapie, rekrutacji komórek odpornościowych, działaniu cząsteczek sygnałowych, proliferacji, apoptozie, angiogenezie i inwazji8-15. Zoptymalizowaliśmy prostą metodę oceny wpływu fibroblastów gruczołu piersiowego na komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego, wykorzystując dostępny komercyjnie model macierzy zewnątrzkomórkowej do tworzenia trójwymiarowych hodowli mieszanych populacji komórek (ko-kultur)16-22. Wraz z przebiegiem ko-kultury komórki tworzą sferoidy, w których fibroblasty skupiają się wewnątrz, a komórki nabłonkowe znajdują się głównie na zewnątrz sferoidów, tworząc wielokomórkowe wypustki w macierzy. Manipulacje fibroblastami prowadzące do zmiany inwazyjności komórek nabłonkowych można łatwo ilościowo ocenić poprzez zmiany w liczbie i długości wypustek nabłonkowych23. Ponadto opracowaliśmy metodę izolacji komórek nabłonkowych z trójwymiarowej ko-kultury, co ułatwia analizę wpływu kontaktu z fibroblastami na zachowanie komórek nabłonkowych. Stwierdziliśmy, że efekty ko-kultury utrzymują się przez wiele tygodni po izolacji komórek nabłonkowych, co zapewnia wystarczającą ilość czasu na przeprowadzenie wielu testów. Metoda ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Technika ta pozwala na szybką ocenę in vitro modeli komórkowych w wielu warunkach, a uzyskane wyniki można porównać z modelami tkankowymi zwierząt in vivo oraz z ludzkimi próbkami tkanek.

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Choć podjęto ogromne wysiłki w celu zidentyfikowania szlaków sygnalizacyjnych i cząsteczek zaangażowanych w prawidłowe i nowotworowe zachowania komórek1-2, znaczna część tych prac ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pozyskanie komórek nabłonkowych z trójwymiarowych mieszanych kultur tkankowych w celu analizy wpływu fibroblastów zrębu na biologię komórek nabłonkowych. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie utworzenie trójwymiarowych mieszanych kultur steroidowych. Następnie sferoidy są oddzielane od kultury macierzy w celu wyizolowania komórek nabłonkowych po okresie współhodowli.Kolejnym krokiem jest pasażowanie komórek nabłonkowych po kokulturze, aż będą one gotowe do analizy. Ostatecznie wpływ ekspozycji na fibroblasty w kulturze trójwymiarowej na zachowanie komórek nabłonkowych można ocenić poprzez obrazowanie mikroskopowe kultur oraz analizę po kokulturze. W przypadku komórek nabłonkowych będą to, jak pokazano tutaj, obrazowanie fluorescencyjne inwazji macierzy oraz migracja w systemie Transwell. Procedurę zademonstruje Quin, pracownik naukowy z mojego laboratorium, który dzień wcześniej przygotował kokultury.Wyjmij Matrigel z zamrażarki i rozmrażaj go przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C. W dniu eksperymentu umieść pożywkę hodowlaną na lodzie co najmniej na jedną godzinę przed zmieszaniem jej z Matrigelem. Aby rozcieńczyć rozmrożony Matrigel.Do sterylnej probówki umieszczonej na lodzie dodaj połowę objętości lodowatego medium H Mac niezbędnej do kokultury. Następnie, utrzymując probówkę na lodzie, dodaj do niej taką samą połowę całkowitej objętości rozmrożonego matrigelu, aby uzyskać rozcieńczenie jeden do jednego. Następnie nanieś 50 µL mieszaniny medium z matrigelem na środek odpowiednich studni płytki 24-dołkowej i inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem i 5% CO2 przez 10 minut.Następnie należy dodać do dołków dodatkowe 450 µL mieszaniny pożywki z Matrigel i inkubować przez kolejne 60 minut. Podczas drugiej inkubacji przygotuj zawiesinę fibroblastów i komórek nabłonkowych w stosunku jeden do jednego, w stężeniu 0,5 × 10⁵ komórek w każdym 0,5 ml pożywki HM. Po zestaleniu się mieszaniny pożywki z Matrigel, ostrożnie nanieś zawiesinę komórkową na powierzchnię żelu i przenieś hodowlę z powrotem do inkubatora na dwa dni.Wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, bardzo ostrożnie odsysając ją z boku studni i delikatnie zastępując świeżą pożywką HEC; codziennie monitoruj formowanie się sferoidów pod mikroskopem, wykonując w razie potrzeby zdjęcia za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Rozpocznij od dziesięciokrotnego pipetowania hodowli w górę i w dół za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 ml. Następnie przenieś hodowlę szklaną pipetą do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 350 ×g w temperaturze pokojowej; po wirowaniu sferoidy komórkowe osadzą się na dnie probówki.Używając sterylnej końcówki pipety Pasteura, ostrożnie usuń rozbitą żelatynę Matrigel z powierzchni wirówki. Przygotowanie. Następnie dodaj 1 mL medium H mac do osadu, pipetując go w górę i w dół dwa lub trzy razy za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 mL, a następnie przenieś hodowlę do dołka w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Pozostaw steroidy do przytwierdzenia się do płytki przez co najmniej 48 godzin przed wymianą medium.Z czasem komórki opuszczą strukturę sferoidalną i zaczną rosnąć jako monowarstwy; po osiągnięciu przez hodowle komórkowe 50% konfluencji należy je przepasażować zgodnie ze standardowym protokołem do naczynia o średnicy 35 mm na okres od dwóch do czterech dni, a następnie do naczynia o średnicy 100 mm na okres od trzech do pięciu dni przed przystąpieniem do dalszej analizy komórek. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby odessać medium, a następnie ręcznie usuń jak najwięcej pozostałych sferoidów. W trójwymiarowych kokulturach sferoidalnych fibroblasty z wyciszeniem TM1, jak pokazano tutaj na rysunkach D, E i F, indukują zwiększoną inwazję macierzy przez komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego w porównaniu z fibroblastami kontrolnymi na rysunkach A, B i C. Zwróć uwagę na wypustki nabłonkowe naciekające macierz w sferoidach zawierających fibroblasty z wyciszonym TM1, wskazane strzałkami na rysunkach D i F. Fibroblasty z nadekspresją TM1, pokazane tutaj na rysunkach J, K i L, indukowały zmniejszoną inwazję linii komórkowej raka piersi SUM159 w porównaniu z fibroblastami kontrolnymi na rysunkach G, H i I; porównaj brak wypustek nabłonkowych w sferoidach zawierających fibroblasty z nadekspresją TM1 z tymi zawierającymi fibroblasty kontrolne, wskazane strzałkami na rysunkach G i I, po ustaleniu sferoidów kokulturowych.Populacje komórek można izolować ze steroidów poprzez ponowne wysianie w kontekście dwuwymiarowym. Ten kompozyt obrazów przedstawia hodowle w mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej po ich izolacji z hodowli w matrigelu. Dzień zero oznacza obrazowanie bezpośrednio po izolacji, natomiast dni pierwszy, drugi i piąty wskazują liczbę dni po izolacji.Zauważ, jak korona komórek opuszczających ten steroid powiększa się z czasem. Ostatecznie pozostaje „steryd-duch” z niewielką liczbą komórek, co zaznaczono tutaj strzałką. Po usunięciu „duchów” i pasażowaniu pozostaje bardzo niewiele steroidów.Zależnie od względnych tempo wzrostu badanych komórek, populacje czyste mogą powstać w wyniku seryjnych pasażów lub mogą zostać wyselekcjonowane przy użyciu odpowiednich markerów komórkowych. W tym przykładzie próbki są analizowane metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując fluorescencję zieloną i czerwoną odpowiednio do identyfikacji fibroblastów wykazujących ekspresję GFP oraz komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję mCherry, aby określić względne liczebności populacji komórek nabłonkowych i fibroblastów.Po izolacji z hodowli 3D w układzie kokultury, komórki nabłonkowe zachowują właściwości nadane przez kokulturę z fibroblastami przez dłuższy czas, co stwarza szerokie możliwości prowadzenia analiz. W tym przykładzie ekspozycja na fibroblasty z niedoborem TM one indukowala zwiększoną migrację w kokulturowanych komórkach H max, która utrzymywała się przez wiele tygodni po izolacji z kokultury 3D w porównaniu z ekspozycją na fibroblasty kontrolne, oznaczone tutaj jako C po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące wpływu fibroblastów na komórki nabłonkowe można zastosować inne metody, takie jak analiza zmian w ekspresji genów i znaczników epigenetycznych.

isolation-mammary-epithelial-cells-from-three-dimensional-mixed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek nabłonkowych sutka z trójwymiarowej kultury współhodowlanej sferoidalnej komórek mieszanych

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę izolacji komórek nabłonka sutka z trójwymiarowych kokultur sferoidalnych w celu analizy wpływu fibroblastów na biologię komórek nabłonka.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Przeglądaj więcej filmów