Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie komórek nabłonkowych z trójwymiarowych mieszanych kultur tkankowych w celu analizy wpływu fibroblastów zmieniowych na biologię komórek nabłonkowych. Osiąga się to poprzez uprzednie ustanowienie trójwymiarowych mieszanych kokultur steroidowych. Następnie sferoidy są oddzielane od kultury macierzy w celu wyizolowania komórek nabłonkowych po kokulturze.

Kolejnym krokiem jest pasażowanie komórek nabłonkowych po kokulturze, aż będą one gotowe do analizy. Ostatecznie wpływ ekspozycji na fibroblasty w hodowli trójwymiarowej na zachowanie komórek nabłonkowych można ocenić poprzez obrazowanie mikroskopowe hodowli oraz analizę po kokulturze. Komórki nabłonkowe, takie jak obrazowanie fluorescencyjne inwazji macierzy i migracja w systemie Transwell, jak pokazano tutaj. Procedurę zademonstruje Quin, współpracownik naukowy z mojego laboratorium, który dzień wcześniej przygotował kokultury.

Wyjmij Matrigel z zamrażarki i rozmrażaj go na lodzie w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. W dniu eksperymentu umieść pożywkę hodowlaną na lodzie co najmniej na godzinę przed wymieszaniem jej z Matrigelem. Aby rozcieńczyć rozmrożony Matrigel.

Do sterylnej probówki umieszczonej w lodzie wlać połowę objętości lodowatego pożywki H Mac niezbędnej do kokultury. Następnie, nadal utrzymując probówkę w lodzie, dodać do niej taką samą objętość rozmrożonego matrigelu, aby uzyskać rozcieńczenie jeden do jednego. Następnie na środek wyznaczonych dołków płytki 24-dołkowej nanieść 50 µL mieszaniny matrigelu z pożywką i inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C w warunkach zwiększonej wilgotności i 5% CO2 przez 10 minut.

Następnie do dołków należy dodać kolejne 450 µL mieszaniny pożywki z Matrigel i inkubować przez kolejne 60 minut. Podczas drugiej inkubacji należy przygotować zawiesinę fibroblastów i komórek nabłonkowych w stosunku jeden do jednego, w stężeniu 0,5 × 10⁵ komórek w każdych 0,5 ml pożywki HM. Po zestaleniu mieszaniny pożywki z Matrigel, należy delikatnie nanieść zawiesinę komórek na powierzchnię żelu i przenieść kulturę do inkubatora na dwa dni.

Wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, bardzo delikatnie odsysając ją z boku dołka i ostrożnie zastępując świeżą pożywką HEC; codziennie monitoruj tworzenie się sferoidów pod mikroskopem, wykonując w razie potrzeby obrazy w świetle przechodzącym lub fluorescencyjnym. Rozpocznij od 10-krotnego pipetowania kultury w górę i w dół za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 ml. Następnie przenieś kulturę szklaną pipetą do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 350 ×g w temperaturze pokojowej; po wirowaniu sferoid komórkowy osiądzie na dnie probówki.

Za pomocą sterylnej końcówki pipety Pasteura ostrożnie usuń rozbity żel Matrigel z powierzchni wirówki. Przygotowanie. Następnie dodaj 1 mL pożywki H mac do osadu steroidowego, pipetuj w górę i w dół dwa do trzech razy za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 mL, a następnie przenieś kulturę do studni 24-dołkowej płytki hodowlanej. Pozostaw steroid do przytwierdzenia do podłoża na co najmniej 48 h przed wymianą pożywki.

Z czasem komórki opuszczą strukturę sferoidów i będą rosły jako monowarstwy; po osiągnięciu przez hodowle komórkowe 50% konfluencji należy je przepasażować zgodnie ze standardowym protokołem do szalki 35 mm na dwa do czterech dni, a następnie przepasażować do szalki 100 mm na trzy do pięciu dni przed dalszą analizą komórek. Należy użyć sterylnej pipety Pasteura, aby odessać medium, a następnie ręcznie usunąć jak najwięcej pozostałych sferoidów. W trójwymiarowych kokulturach sferoidów fibroblasty z wprowadzoną ciszą genową TM1, przedstawione tutaj na rysunkach D, E i F, indukują zwiększoną inwazję macierzy przez komórki nabłonka piersi w porównaniu do fibroblastów kontrolnych na rysunkach A, B i C. Należy zwrócić uwagę na projekcje nabłonka naciekające macierz w sferoidach zawierających fibroblasty z wyciszonym genem TM1, co wskazano strzałkami na rysunkach D i F. Fibroblasty z wprowadzoną nadekspresją TM1, pokazane tutaj na rysunkach J, K i L, indukowały zmniejszoną inwazję linii komórkowej raka piersi SUM159 w porównaniu do fibroblastów kontrolnych na rysunkach G, H i I. Po ustanowieniu sferoidów kokultury należy porównać brak projekcji nabłonka w sferoidach zawierających fibroblasty z modyfikacją TM1 z tymi zawierającymi fibroblasty kontrolne, wskazanymi strzałkami na rysunkach G i I.

Populacje komórek można wyizolować ze steroidów poprzez ponowne wysianie w układzie dwuwymiarowym. Ten kompozyt obrazów przedstawia hodowle w mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej po ich izolacji z hodowli w matrigelu. Dzień zero oznacza obrazowanie bezpośrednio po izolacji, natomiast dni pierwszy, drugi i piąty wskazują liczbę dni po izolacji.

Zwróć uwagę, że korona komórek opuszczających ten steryd powiększa się w czasie. Ostatecznie pozostaje steryd widmo z bardzo niewielką liczbą komórek, co zostało tutaj zaznaczone strzałką. Po usunięciu sterydów widm i pasażu pozostaje bardzo niewiele sterydów.

W zależności od względnych szybkości wzrostu badanych komórek, czyste populacje mogą powstać w wyniku seryjnych pasażowań lub mogą zostać wyizolowane poprzez sortowanie z użyciem odpowiednich markerów komórkowych. W niniejszym przykładzie próbki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, z wykorzystaniem fluorescencji zielonej i czerwonej do identyfikacji odpowiednio fibroblastów wykazujących ekspresję GFP oraz komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję mCherry, w celu określenia względnych populacji komórek nabłonkowych i fibroblastów.

Po izolacji z 3D co-culture, komórki nabłonkowe zachowują właściwości nadane przez ko-kulturę z fibroblastami przez dłuższy czas, co stwarza szerokie możliwości analizy. W tym przykładzie ekspozycja na fibroblasty z niedoborem TM one indukowala zwiększoną migrację w ko-kulturowanych H max, która utrzymywała się przez wiele tygodni po izolacji z 3D co-culture w porównaniu do ekspozycji na fibroblasty kontrolne, oznaczone tutaj jako C po zastosowaniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące wpływu fibroblastów na komórki nabłonkowe można zastosować inne metody, takie jak analiza zmian w ekspresji genów i znaczników epigenetycznych.