TransFLP — metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Celem tej procedury jest genetyczne manipulowanie vio cray za pomocą tej szybkiej i wadliwej metody, która opiera się na naturalnej transformacji i kombinacji flip. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw odpowiedniego źródła chityny, ponieważ chityna jest naturalnym induktorem przemiany. W drugim etapie konstrukt DNA jest generowany przy użyciu dwóch rund PCR i przeprowadzana jest jego naturalna transformacja, co pozwala bakteriom zawierającym plazmid PBR na pobranie fragmentu PCR i włączenie go do ich genomów.

Następnie stosuje się przesunięcie temperatury w górę w celu indukowania enzymu lipazy kodowanego plazmidem w celu usunięcia celu rekombinacji odwróconej lub kasety oporności na antybiotyki po bokach miejsca FRT. W ostatnim etapie bakterie są wyleczone z plazmidu kodującego FLP. Ostatecznie PCR i sekwencjonowanie są stosowane w celu wykazania, że manipulacja genetyczna zakończyła się sukcesem.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie plazmidów samobójczych do genetycznej manipulacji wirusem, jest to, że metoda ta jest bardzo szybka i skuteczna. Zacznij od zważenia od 50 do 80 miligramów próbek płatków chityny w standardowych 1,5 mililitrowych plastikowych probówkach, a następnie trzymaj pokrywki probówek otwarte, autoklaw płatków po wywołaniu autoklawu natychmiast zamknij pokrywki i przechowuj zestaw autoklawu w płatkach w temperaturze pokojowej, co najmniej sześć oligonukleotydów jest wymaganych do amplifikacji interesujących regionów DNA, a także kasetę z antybiotykiem po bokach FRT metodą PCR. Zaleca się również dołączenie pary starterów oligonukleotydowych poza wstawionym fragmentem PCR.

Pozwala to na ostrożne sprawdzenie integracji i prawidłowego wycięcia konstrukcji kasety oporności na antybiotyki z flanką FRT, oligonukleotydów numer dwa, trzy, cztery i pięć lat. Startery drugi i piąty powinny zawierać co najmniej 28 par zasad, aby móc wystarczająco przyklęknąć do genomowego DNA i starterów. Trzy i cztery powinny być skonstruowane z FRT can FRT zawierającym plazmid jako szablon projektu starterów drugiego i piątego, aby umożliwić rozległe komplementarne parowanie zasad na pięciu głównych końcach między starterami drugim i trzecim oraz starterami odpowiednio czwartym i piątym.

Teraz, w pierwszej rundzie PCR, użyj oligonukleotydów pierwszego i drugiego, aby przygotować pierwszą z trzech jednoczesnych, ale niezależnych reakcji PCR do amplifikacji regionu poprzedzającego eksperymentalny region będący przedmiotem zainteresowania specjalnie zaprojektowanych konstruktów. Równolegle przygotuj drugą reakcję PCR przy użyciu oligonukleotydów trzeciego i czwartego, aby amplifikować kasetę z antybiotykiem po bokach FRT. Na przykład w tym eksperymencie wykorzystano gen A PH kodujący oporność na kaniny.

Jednocześnie amplifikuj dalszy region DNA, przygotowując trzecią reakcję PCR przy użyciu oligonukleotydów piątego i szóstego oraz genomowego DNA jako matrycy. Następnie rozpocznij reakcję PCR dla wszystkich trzech próbek po oczyszczeniu wszystkich trzech fragmentów PCR, użyj mieszaniny z równymi ilościami wszystkich trzech fragmentów uzyskanych w pierwszej rundzie jako matrycy do przeprowadzenia drugiej rundy PCR. Ta amplifikacja będzie katalizowana przez oligonukleotydy pierwszy i szósty.

Uzyskany w ten sposób fragment PCR posłuży jako transformujące DNA w eksperymentach z naturalną transformacją. Po wyhodowaniu komórek, pożywka wzbogacona tlenowo w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zbierz bakterie przez odwirowanie w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś kulturę bakteryjną na latawiec w płatkach i inkubuj zawiesinę komórkową przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie wymieszaj co najmniej 200 nanogramów fragmentów pochodzących z drugiej rundy PCR z zawiesiną komórek bakteryjnych. Uważając, aby nie odrywać nadmiernie bakterii od powierzchni chityny, a następnie inkubuj ten roztwór w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez ruchu przez kolejny dzień.

Teraz wiruj, hodowla energicznie przez co najmniej 30 sekund dla bakterii, które są siedliskiem plazmidu odwróconego PBR, rozprowadź od 100 do 300 mikrolitrów roztworu komórkowego na podwójnie selektywnych płytkach zawierających ampicylinę. Oprócz innego antybiotyku w płytkach, inkubuj kultury komórek bakteryjnych w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się kolonie. Następnie odizoluj pojedyncze transformanty od płytek selektywnych.

Rozpocznij ten krok od hodowli bakterii na płytkach agarowych LB zawierających ampicylinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Jako opcjonalny krok zmień temperaturę na dwie do trzech godzin na 40 stopni Celsjusza, ponieważ ekspresja odwrócenia z plazmidu odwróconego PBR jest tłumiona w wyższych temperaturach. Po kolejnych ośmiu godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przenieś bakterie na świeże płytki.

Teraz ogranicz klony równolegle na płytkach agarowych zawierających antybiotyki i wolnych od antybiotyków, aby przetestować wrażliwość na antybiotyki, a następnie wyizoluj pojedynczą powstałą kolonię wrażliwą na antybiotyki. Rozpocznij ten krok od wyhodowania kultury przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wzbogacenia pożywki bez antybiotyków. Następnego ranka hoduj nową kulturę przez trzy do sześciu godzin, rozcieńczając nocną kulturę w stosunku 1 do 100 w świeżej pożywce wolnej od antybiotyków w popołudniowej smugi lub rozcieńczeniu płytki kultury na zwykłych płytkach agarowych LB, a następnie inkubuj płytki przez kolejne osiem do 16 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż kolonie będą widoczne.

W tym pierwszym eksperymencie miało na celu usunięcie sąsiednich genów CTXA i CTXB. Oligonukleotydy dla metody trans flip zostały wygenerowane, jak właśnie wykazano, szczep rodzicielski, szczep pośredni zawierający kasetę oporności na antybiotyki po flankach FRT zamiast oryginalnego locus DNA C-T-X-A-B, a końcowy szczep usunięty dla C-T-X-A-B i uwolniony z kasety oporności został przetestowany pod kątem ich genotypu, hurtowy PCR został przeprowadzony w tym eksperymencie przy użyciu starterów, które nie klękały do transformującego fragmentu PCR, ale tylko do chromosomalnego DNA. Fragmenty PCR oddzielono za pomocą standardowej elektroforezy aerożelowej w celu określenia ich wielkości.

Na pierwszym pasie zlokalizowano światowy szczep typu B o oczekiwanej wielkości fragmentu 3 143 par zasad. Na drugim torze fragment PCR pochodzący ze szczepu delta C-T-X-A-B-F-R-T może. FRT znajdował się na 3 162 parach zasad.

A na trzecim pasie fragment delta ctx A B FFR TP CR znajdował się na 1 769 parach zasad w porównaniu z drabinką o jednym KB. W drugim przykładzie, w którym usunięto całą wyspę genomową, jako cel tego eksperymentu wybrano wyspę patogeniczności Vibrio lub wyspę VPI. Metoda trans flip została zmodyfikowana w dwóch etapach.

Po pierwsze, integracja genu oporności na kanamycynę była poprzedzona pojedynczym miejscem FRT na początku pierwszego PI. Następnie przeprowadzono drugą rundę naturalnej transformacji, która pozwoliła na wprowadzenie dodatkowego markera oporności na antybiotyki, a mianowicie oporności na gentamycynę, a następnie drugiego miejsca FRT na końcu wyspy patogenności. Odpowiednie pary starterów są wskazane powyżej każdego obrazu żelu, a metoda trans FLP była kontynuowana, jak właśnie pokazano.

Szczepy rodzicielskie, pośrednie i końcowe zostały zweryfikowane metodą PCR oczyszczonego genomowego DNA na pierwszym torze. Fragment PCR dzikiego szczepu typu V został przetestowany na drugim pasie. Przeprowadzono fragment PCR powstały ze szczepu VPI jeden FRT może GM FRT.

Na trzecim torze przeanalizowano szczep delta VPI jeden produkt PCR pochodzący z FRT. Pary podkładów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu. W ostatnim odkształcie brakuje całego szczepu VPI.

W tym trzecim przykładzie sekwencja promotora zależnego od polimerazy A T siedem RNA została zintegrowana przed lisem Gene T, głównym regulatorem naturalnej transformacji przy użyciu metody trans flip z niewielką modyfikacją w stosunku do standardowego protokołu. Sekwencja konsensusu promotora zależnego od RNA T siedem została włączona jako nawisy do oligonukleotydów numer cztery i numer pięć, tak że ta sekwencja DNA została utrzymana w chromosomie. Nawet po wycięciu kasety oporności na antybiotyki, konstrukt został następnie zintegrowany z polimerazą T 7RNA zawierającą szczep barwiony V.

W tym szczepie ekspresja genu polimerazy T siedem RNA była napędzana przez promotor LAC UV 5 w celu przetestowania zależnej od polimerazy T siedmiu RNA ekspresji T Fox Naturalne testy transformacji przeprowadzono w pożywce LB. Szczep rodzicielski pozbawiony promotora zależnego od T 7 poprzedzającego Gen T Fox nie jest naturalnie przekształcany w tych warunkach z powodu braku transkrypcji T FOX w bogatej pożywce i przy braku jego naturalnego induktora chityny. Ten fenotyp był niezależny od tego, czy polimeraza T 7RNA została sztucznie wywołana przez IPTG, czy nie.

Jednak szczep generowany przez trans flip, który zawiera promotor zależny od polimerazy T seven RNA przed kompetencją Gene T Fox, był rzeczywiście naturalnie przekształcalnym wzbogacaczem ze względu na wyciek promotora LAC UV 5 w pożywce LB. Wyprodukowana polimeraza T seven RNA już dokonała transkrypcji T FOX z promotora zależnego od polimerazy T seven RNA bez indukcji przez IPTG. W ten sposób zainicjowano naturalną kompetencję i transformację potwierdzającą funkcjonalność zintegrowanej sekwencji promotora zależnej od polimerazy T 7RNA.

Fenotyp ten został znacznie wzmocniony przez pełną indukcję polimerazy T 7RNA w wyniku dodania induktora promotora LAC UV 5 IPTG. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak genetycznie manipulować VI za pomocą kombinacji naturalnej transformacji indukowanej chityną i rekombinacji odwracania. Po opanowaniu technika ta pozwala na usunięcie genów lub wysp genomowych, a także na integrację sekwencji DNA w sposób ukierunkowany na miejsce w ciągu zaledwie kilku dni.