Name: TransFLP — metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj metodę TransFLP do szybkiej modyfikacji genetycznej Vibrio cholerae opartą na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP. Technika umożliwia usuwanie genów i integrację sekwencji w genomie bakteryjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragnę podziękować Oldze de Souza Silva za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez grant Swiss National Science Foundation (SNSF) nr 31003A_127029.

Metoda TransFLP (Rysunek 1) została zilustrowana za pomocą trzech różnych podejść: I) delecji dwóch sąsiednich genów kodujących determinanty wirulencji V. cholerae (np. ΔctxAB); II) usunięcia wyspy patogenności (np. ΔVPI-1); oraz III) integracji sekwencji promotora zależnego od polimerazy RNA T7 powyżej genu zainteresowania, co następnie umożliwia jego sztuczną ekspresję w odpowiednim szczepie (np. T7-tfoX) (Rysunek 2).
1. Przygotowanie płatków chityny
<ol>
	<li>Odważ 50-80 mg płatków chityny do standardowej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Można to przygotować w większej ilości. Płatki chityny są dostępne w sprzedaży od firmy Sigma (numer katalogowy C9213).</li>
	<li>Zautoklawuj płatki, pozostawiając otwarte nakrętki probówek.</li>
	<li>Natychmiast zamknij nakrętki po ostygnięciu autoklawu.</li>
	<li>Przechowuj zautoklawowane płatki chityny w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Opcjonalnie: Sztuczna transformacja V. cholerae plazmidem kodującym rekombinazę Flp
<ol>
	<li>Przygotować elektrokompetentne komórki V. cholerae metodami standardowymi11. Alikwoty kompetentnych komórek przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Do elektrokompetentnych komórek V. cholerae dodać 1-2 μl standardowej mini-preparacji plazmidu pBR-flp5 i przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji (szerokość przerwy 0,2 cm).</li>
	<li>Przyłożyć impuls o napięciu 1,6 kV.</li>
	<li>Dodać 0,9 ml pożywki SOC, a następnie delikatnie przenieść komórki do standardowej probówki o pojemności 14 ml. Inkubować bez mieszania przez 2,5 do 3 hr w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wysiać 100 μl oraz 300 μl na płytki LB zawierające 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Oczyścić pojedynczy klon i przechowywać jako stok w glicerolu do przyszłych eksperymentów TransFLP.</li>
</ol>
3. Projektowanie oligonukleotydów i reakcja łańcuchowa polimerazy
<ol>
	<li>Do amplifikacji regionu(ów) DNA zainteresowania oraz kasety antybiotykowej flankowanej sekwencjami FRT za pomocą PCR wymaganych jest co najmniej sześć oligonukleotydów (Rysunek 3). Zaleca się również uwzględnienie pary oligonukleotydów stanowiących primery na zewnątrz wstawionego fragmentu PCR. Pozwala to na sprawdzenie integracji oraz prawidłowego wycięcia kasety oporności na antybiotyk flankowanej sekwencjami FRT (np. przedstawione jako primery „chk-up” i „chk-down” na Rysunkach 3 do 5).</li>
	<li>Oligonukleotydy #2, #3, #4 i #5 należy zaprojektować z należytą starannością. Powinny one zapewniać wystarczający annealing (np. ~28 bp) do matrycy DNA. Matrycą DNA dla primerów #2 i #5 jest genomowe DNA (gDNA), natomiast dla primerów #3 i #4 jest to plazmidowe DNA zawierające sekwencję FRT-Kan-FRT, takie jak pROD1712 oraz pBR-FRT-KAN-FRT (niniejsze badanie) (Rysunek 3A).</li>
	<li>Primery #2 do #5 należy zaprojektować tak, aby umożliwić rozległe parowanie zasad na ich końcach 5' odpowiednio pomiędzy #2 / #3 oraz #4 / #5 (Rysunek 3A, wstawka). Następnie przeprowadza się dwie rundy PCR.</li>
	<li>W ramach 1st rundy PCR należy przeprowadzić trzy niezależne reakcje. Pierwsza z nich posłuży do amplifikacji regionu powyżej (upstream) genu / regionu DNA zainteresowania przy użyciu oligonukleotydów #1 i #2. PCR powinien przynieść fragment o długości co najmniej 500 bp, aby umożliwić rekombinację homologiczną w komórkach. Krótsze fragmenty (~250 bp) mogą być wystarczające8, lecz nie są zalecane.</li>
	<li>Równolegle należy przeprowadzić drugą reakcję PCR, która amplifikuje kasetę antybiotykową flankowaną sekwencjami FRT. W przedstawionych tutaj przykładach stosowano głównie aph (kanR). Do tej reakcji należy użyć oligonukleotydów #3 i #4 (Rysunek 3A).</li>
	<li>Jednocześnie za pomocą PCR należy amplifikować region DNA poniżej (downstream) (trzecia próbka). Fragment PCR powinien również mieć długość co najmniej 500 bp. Reakcję PCR należy przeprowadzić z gDNA jako matrycą oraz oligonukleotydami #5 i #6 (Rysunek 3A).</li>
	<li>Po oczyszczeniu wszystkich trzech fragmentów PCR należy przeprowadzić 2nd rundę PCR. Jako matrycę należy zastosować równą mieszaninę wszystkich trzech fragmentów otrzymanych w pierwszej rundzie. Amplifikacja jest katalizowana przez oligonukleotydy #1 i #6. Otrzymany fragment PCR (Rysunek 3B) służy jako DNA transformacyjne w eksperymencie transformacji naturalnej (Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Naturalna transformacja indukowana chityną
<ol>
	<li>Hodować komórki V. cholerae tlenowo w bogatej pożywce w temperaturze 30 °C, aż osiągną gęstość optyczną przy 600 nm wynoszącą około 0,5.</li>
	<li>Zebrać bakterie poprzez wirowanie. Przemyć osad raz w zdefiniowanej pożywce sztucznej (DASW6) przed resuspensją komórek w 2 objętościach DASW. Dodać 1 ml hodowli do 50-80 mg sterylnych płatków chityny (wyjaśniono w punkcie 1). Jeśli bakterie posiadają plazmid pBR-flp (opcjonalny punkt 2), dodać do hodowli ampicylinę (50 μg/ml). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 16-24 hr bez mieszania.</li>
	<li>Dodać ≥ 200 ng fragmentu uzyskanego z 2nd-rundy PCR (wyjaśniono w punkcie 3). Wymieszać ostrożnie, aby nie odrywać nadmiernie bakterii od powierzchni chityny. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 hr bez mieszania.</li>
	<li>Intensywnie mieszać hodowlę na vortexie przez ≥ 30 sec. Wysiać 100-300 μl na selektywne płytki z podłożem LB (np. płytki LB zawierające kanamycynę lub gentamycynę dla przykładów przedstawionych tutaj). W przypadku bakterii posiadających plazmid pBR-flp użyć płytek z podwójną selekcją, dodając ampicylinę równocześnie z innymi antybiotykami. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 16-24 hr lub do momentu pojawienia się widocznych kolonii.</li>
	<li>Wyizolować pojedyncze transformanty z płytek selektywnych. Transformanty te zastąpiły oryginalny locus chromosomowy fragmentem PCR w wyniku zdarzenia podwójnego crossing-over. Szczepy te można wykorzystać bezpośrednio w dalszych eksperymentach, jeśli usunięcie kasety antybiotykowej nie jest konieczne.</li>
</ol>
5. Usuwanie selektywnej kasety (kaset) poprzez rekombinację Flp
<ol>
	<li>Przeprowadź sztuczną transformację transformantów plazmidem pBR-flp zgodnie z opisem w punkcie 2, jeśli nie zostało to zrobione przed testem transformacji naturalnej.</li>
	<li>Hoduj bakterie na płytkach z agarem LB zawierającym ampicylinę w temperaturze 37 °C przez 16-24 hr. Opcje: zmień temperaturę na 40 °C na 2-3 hr, ponieważ ekspresja flp z plazmidu pBR-flp ulega derepresji w wyższych temperaturach5,10; przenieś bakterie na świeże płytki po ok. 8 hr inkubacji.</li>
	<li>Przeprowadź test wrażliwości na antybiotyki (zademonstrowany tutaj dla kanamycyny; Rysunek 1) poprzez równoległe ponowne wysiewanie kolonii na płytki agarowe z antybiotykiem i bez antybiotyku. Izoluj pojedyncze wrażliwe kolonie. Zamroź klon oporny na ampicylinę jako stok glicerolowy, jeśli zamierzasz dalej modyfikować szczep poprzez inne delecje/insercje za pomocą TransFLP.</li>
</ol>
6. Usuwanie plazmidów
<ol>
	<li>Hodowlę inkubować przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 30 °C. Należy użyć pożywki bogatej bez dodatku antybiotyków.</li>
	<li>Opcjonalnie: Hodować świeżą kulturę przez 3-6 h, rozcieńczając kulturę nocną w stosunku 1:100 w świeżej pożywce bez antybiotyków.</li>
	<li>Rozcieczenia hodowli wysiać metodą wylewną lub kreskową na zwykłe płytki z agarem LB i inkubować w temperaturze 30 °C przez 8-16 h (do momentu pojawienia się widocznych kolonii).</li>
	<li>Przeprowadzić test wrażliwości klonów na ampicylinę, przesiewając klony równolegle na płytki z agarem z antybiotykiem oraz bez antybiotyku (Rysunek 1). Szczep wrażliwy na ampicylinę zamrozić w formie zapasu w glicerolu.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations%3A+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li>
<li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li>
<li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li>
<li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li>
<li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li>
<li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155(2010).</li>
<li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81(2007).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li>
<li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li>
<li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li>
<li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li>
<li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li>
<li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li>
<li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisana powyżej oraz w innych publikacjach5 metoda TransFLP była szeroko stosowana w naszym laboratorium. Możliwe manipulacje genetyczne obejmują między innymi: delecję pojedynczych genów i klastrów genowych, delecję wysp genomicznych (np. VPI-1), insercję sekwencji powyżej genu zainteresowania (np. sekwencji promotorowych) oraz insercję sekwencji na końcu konkretnego genu (np. kodujących znaczniki powinowactwa).
Ważnym warunkiem wstępnym dla TransFLP jest...

<table><tbody><tr><td>Płatki chityny</td><td>Sigma</td><td>C9213</td><td>Wymagane autoklawowanie</td></tr><tr><td>OPCJONALNIE: Mikropulser (w przypadku konieczności wycięcia kasety antybiotykowej przez rekombinazę Flp kodowaną na pBR-flp)</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>Lub porównywalne elektroporatory</td></tr></tbody></table>

transflp — metoda genetycznej modyfikacji vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji flp

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Dostępnych jest kilka metod manipulacji chromosomami bakteryjnymi1-3. Większość tych protokołów opiera się na insercji plazmidów replikujących się warunkowo (np. zawierających replikony zależne od białka pir lub wrażliwe na temperaturę1,2). Plazmidy te są integrowane z chromosomami bakteryjnymi w oparciu o rekombinację zależną od homologii. Takie mutanty insercyjne są często bezpośrednio wykorzystywane w warunkach eksperymentalnych. Alternatywnie można przeprowadzić selekcję w kierunku wycięcia plazmidu, a następnie jego utraty, co w przypadku bakterii Gram-ujemnych często opiera się na kontraselektywnym enzymie lewan-sukrazie kodowanym przez gen sacB4. Wycięcie może albo przywrócić genotyp sprzed insercji, albo doprowadzić do wymiany między chromosomem a kopią zmodyfikowanego genu zakodowaną w plazmidzie. Wadą tej techniki jest to, że jest ona czasochłonna. Plazmid musi zostać najpierw sklonowany; wymaga on transferu horyzontalnego do V. cholerae (najczęściej poprzez kojenie z szczepem donorem E. coli) lub sztucznej transformacji tego ostatniego; ponadto wycięcie plazmidu jest losowe i może albo przywrócić pierwotny genotyp, albo stworzyć pożądaną modyfikację, jeśli nie zostanie zastosowana selekcja pozytywna. Przedstawiamy tutaj metodę szybkiej manipulacji chromosomem(ami) V. cholerae5 (Rysunek 1). Metoda TransFLP opiera się na niedawno odkrytej indukowanej chityną naturalnej kompetencji w tym organizmie6 oraz innych przedstawicielach rodzaju Vibrio, takich jak V. fischeri7. Naturalna kompetencja umożliwia pobieranie wolnego DNA, w tym fragmentów DNA generowanych metodą PCR. Po pobraniu DNA rekombinuje z chromosomem, pod warunkiem obecności minimum 250-500 bp flankujących regionów homologicznych8. Umieszczenie markera selekcyjnego pomiędzy tymi regionami flankującymi pozwala na łatwe wykrycie często występujących transformantów.
Metodę tę można stosować do różnych manipulacji genetycznych V. cholerae oraz potencjalnie innych bakterii naturalnie kompetentnych. Przedstawiamy trzy nowe przykłady tego, co można osiągnąć za pomocą tej metody, uzupełniając nasze wcześniej opublikowane badanie dotyczące delecji pojedynczych genów i dodawania sekwencji znaczników powinowactwa5. W niniejszym protokole TransFLP uwzględniono kilka kroków optymalizacyjnych w stosunku do pierwotnego protokołu naturalnej transformacji indukowanej chityną6. Obejmują one między innymi zastąpienie fragmentów pancerzy krabów komercyjnie dostępnymi płatkami chityny8, wykorzystanie DNA pochodzącego z PCR jako materiału transformującego9 oraz dodanie miejsc docelowych rekombinacji FLP (FRT)5. Miejsca FRT umożliwiają ukierunkowaną ekscyzję markera selekcyjnego opośredniczoną przez rekombinazę Flp10.

Reprezentatywne wyniki trzech przykładów przedstawiono na rycinach 4 do 6. Pierwsze podejście miało na celu usunięcie sąsiednich genów ctxA oraz ctxB. Razem kodują one główny czynnik wirulencji V. cholerae, toksynę choleryczną. Zaprojektowaliśmy oligonukleotydy dla metody TransFLP, zgodnie z powyższym opisem i ryciną 3. Przebadano genotyp szczepu wyjściowego, szczepu pośredniego zawierającego flankowaną sekwencjami FRT kasetę oporności na antybiotyki w oryginal...

Opisano szybką metodę modyfikacji genomu V. cholerae. Modyfikacje te obejmują delecję pojedynczych genów, klastrów genowych i wysp genomicznych, a także integrację krótkich sekwencji (np. elementów promotora lub sekwencji znaczników powinowactwa). Metoda opiera się na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP.

TransFLP — Metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Dostępnych jest kilka metod manipulacji chromosomami bakteryjnymi1-3. Większość tych protokołów opiera się na wprowadzeniu warunkowo replikujących się plazmidów ...

Celem niniejszej procedury jest manipulacja genetyczna vio cray przy użyciu tej szybkiej i wydajnej metody, opartej na naturalnej transformacji i kombinacji flip. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszym kroku odpowiedniego źródła chityny, ponieważ chityna jest naturalnym induktorem transformacji. W drugim kroku generowany jest konstrukt DNA przy użyciu dwóch rund PCR, a następnie przeprowadzana jest transformacja naturalna, co pozwala bakteriom zawierającym plazmid PBR flip na pobranie fragmentu PCR i włączenie go do ich genomów.Następnie stosuje się podwyższenie temperatury w celu indukcji enzymu lipazy kodowanego przez plazmid, co prowadzi do usunięcia kasety oporności na antybiotyki flankowanej przez miejsce docelowe rekombinacji flip (FRT). W ostatnim kroku bakterie są oczyszczane z plazmidu kodującego FLP. Ostatecznie, za pomocą PCR i sekwencjonowania wykazuje się, że manipulacja genetyczna zakończyła się sukcesem.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie plazmidów samobójczych do manipulacji genetycznej vire, jest jej szybkość i wydajność. Należy rozpocząć od odważenia próbek płatków chityny o masie od 50 do 80 mg do standardowych probówek plastikowych o pojemności 1,5 ml, a następnie, pozostawiając nakrętki probówek otwarte, poddać płatki autoklawowaniu. Natychmiast po zakończeniu cyklu autoklawowania należy zamknąć nakrętki i przechowywać zestaw z płatkami w temperaturze pokojowej. Do amplifikacji za pomocą PCR wybranych regionów DNA, a także flankowanej sekwencjami FRT kasety antybiotykowej, wymagane są co najmniej sześć oligonucleotides. Zaleca się również dołączenie pary starterów oligonucleotides poza wstawionym fragmentem PCR.Pozwala to na sprawdzenie integracji oraz prawidłowego wycięcia kasety oporności na antybiotyki flankowanej sekwencjami FRT; należy z uwagą dobrać oligonukleotydy numer dwa, trzy, cztery i pięć. Primery dwa i pięć powinny składać się z co najmniej 28 par zasad, aby umożliwić wystarczające przyłączenie do DNA genomowego, natomiast primery trzy i cztery powinny zostać zaprojektowane z wykorzystaniem plazmidu zawierającego sekwencję FRT w roli matrycy. Primery dwa i pięć należy zaprojektować tak, aby umożliwić rozległe komplementarne parowanie zasad na końcu 5' odpowiednio między primerem dwa a trzy oraz między primerem cztery a pięć.W pierwszej rundzie PCR należy wykorzystać oligonukleotydy pierwszy i drugi do przygotowania pierwszej z trzech jednoczesnych, lecz niezależnych reakcji PCR w celu amplifikacji regionu powyżej (upstream) badanej sekwencji w specjalnie zaprojektowanych konstruktach. Równolegle należy przygotować drugą reakcję PCR, wykorzystując oligonukleotydy trzeci i czwarty, aby amplifikować kasetę antybiotykową flankowaną sekwencjami FRT. W niniejszym doświadczeniu wykorzystano na przykład gen A PH kodujący oporność na kanamycynę.Jednocześnie przeprowadź amplifikację regionu DNA położonego w kierunku 3', przygotowując trzecią reakcję PCR z wykorzystaniem oligonukleotydów pięć i sześć oraz genomowego DNA jako matrycy. Następnie rozpocznij reakcję PCR dla wszystkich trzech próbek. Po oczyszczeniu wszystkich trzech fragmentów PCR użyj mieszaniny zawierającej równe ilości wszystkich trzech fragmentów uzyskanych w pierwszej rundzie jako matrycy do przeprowadzenia drugiej rundy PCR. Amplifikacja ta zostanie skatalizowana przez oligonukleotydy jeden i sześć.Otrzymany fragment PCR będzie służył jako transformujące DNA w eksperymentach dotyczących transformacji naturalnej. Po wyhodowaniu komórek v cholera w medium wzbogaconym tlenowo w temperaturze 30 °C, należy zebrać bakterie poprzez wirowanie w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś kulturę bakteryjną na chitynowe płatki i inkubuj zawiesinę komórek przez noc w temperaturze 30 °C. Następnie ostrożnie wymieszaj co najmniej 200 ng fragmentów pochodzących z drugiej rundy PCR z zawiesiną komórek bakteryjnych. Dbając o to, aby nie odrywać nadmiernie bakterii od powierzchni chityny, inkubuj ten roztwór w temperaturze 30 °C bez ruchu przez kolejny dzień.Następnie energicznie mieszaj kulturę w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s. Dla bakterii zawierających plazmid PBR flip nanieś 100 do 300 µL roztworu komórek na podwójnie selektywne płytki zawierające ampicylinę oraz drugi antybiotyk. Inkubuj kultury komórek bakteryjnych w temperaturze 30 °C do momentu pojawienia się widocznych kolonii. Następnie wyizoluj pojedyncze transformanty z płytek selektywnych.Krok ten rozpocznij od hodowli bakterii na płytkach z agarem LB zawierającym ampicylinę w temperaturze 37°C przez 16 do 24 godzin. W ramach opcjonalnego etapu można zmienić temperaturę na 40°C na dwie do trzech godzin, ponieważ ekspresja flip z plazmidu PBR flip jest derepresowana w wyższych temperaturach. Po kolejnych ośmiu godzinach inkubacji w 37°C przenieś bakterie na świeże płytki.Następnie ogranicz klony równolegle na płytkach agarowych z antybiotykiem i bez antybiotyku, aby przetestować ich wrażliwość na antybiotyk, a następnie wyizoluj pojedynczą powstałą kolonię wrażliwą na antybiotyk. Rozpocznij ten etap od hodowli kultury przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 30 °C w pożywce wzbogaconej bez antybiotyków. Następnego ranka wyhoduj nową kulturę przez trzy do sześciu godzin, rozcieńczając kulturę nocną w stosunku 1:100 w świeżej pożywce bez antybiotyków; po południu wysiej rozcieńczoną kulturę na zwykłe płytki z agarem LB, a następnie inkubuj płytki przez kolejne 8 do 16 godzin w temperaturze 30 °C, aż kolonie staną się widoczne.W tym pierwszym eksperymencie celem było usunięcie sąsiednich genów CTXA i CTXB. Oligonukleotydy do metody trans flip wygenerowano zgodnie z wcześniejszą prezentacją; przetestowano genotyp szczepu rodzicielskiego, szczepu pośredniego zawierającego flankowaną sekwencjami FRT kasetę oporności na antybiotyk zamiast oryginalnego locus DNA C-T-X-A-B oraz szczepu końcowego z delecją C-T-X-A-B, wolnego od kasety oporności. W tym celu przeprowadzono analizę PCR całego genomu, stosując primery, które nie wiązały się z transformującym fragmentem PCR, lecz wyłącznie z DNA chromosomalnym. Fragmenty PCR rozdzielono za pomocą standardowej elektroforezy w żelu agarozowym w celu określenia ich wielkości.W pierwszej ścieżce szczep cholery typu B z całego świata znajdował się na oczekiwanym rozmiarze fragmentu 3 143 par zasad. W drugiej ścieżce fragment PCR pochodzący ze szczepu delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT znajdował się na poziomie 3 162 par zasad.W ścieżce trzeciej fragment delta ctx A B FFR TP CR znajdował się na poziomie 1 769 par zasad w odniesieniu do drabinki 1 KB. W drugim przykładzie, w którym usunięto całą wyspę genomiczną, jako cel eksperymentu wybrano wyspę patogenności Vibrio jeden lub VPI one. Metodę trans flip zmodyfikowano w dwóch krokach.Najpierw integrację genu oporności na kanamycynę poprzedzono wprowadzeniem pojedynczej sekwencji FRT na początku wyspy patogenności (PI) jednej. Następnie przeprowadzono drugą rundę transformacji naturalnej, co pozwoliło na wprowadzenie dodatkowego markera oporności na antybiotyk, a mianowicie oporności na gentamycynę, za którą następowała druga sekwencja FRT na końcu wyspy patogenności. Odpowiednie pary starterów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu, a metodę trans FLP kontynuowano zgodnie z powyższym opisem.Szczepy rodzicielskie, pośrednie i końcowe zostały zweryfikowane za pomocą PCR oczyszczonego DNA genomowego w ścieżce pierwszej. W ścieżce drugiej naniesiono fragment PCR szczepu V cholera typu dzikiego. Naniesiono również fragment PCR otrzymany ze szczepu VPI one FRT can GM FRT.W ścieżce trzeciej przeanalizowano produkt PCR pochodzący ze szczepu delta VPI one FRT. Pary starterów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu. W końcowym szczepie brakuje całego VPI one.W tym trzecim przykładzie sekwencja promotora zależnego od polimerazy RNA T7 została zintegrowana powyżej genu Tfox, głównego regulatora naturalnej transformacji, przy użyciu metody trans flip z niewielką modyfikacją standardowego protokołu. Konsensusowa sekwencja promotora zależnego od RNA T7 została wprowadzona jako nawisy w oligonukleotydach numer cztery i pięć, tak aby ta sekwencja DNA została zachowana w chromosomie. Nawet po wycięciu kasety oporności na antybiotyki, konstrukt został następnie zintegrowany w szczepie V colorized zawierającym polimerazę RNA T7.W tym szczepie ekspresja genu polimerazy RNA T7 była sterowana przez promotor LAC UV5, aby przetestować zależną od polimerazy RNA T7 ekspresję T-Fox. Testy transformacji naturalnej przeprowadzono w podłożu LB. Szczep rodzicielski, pozbawiony promotora zależnego od T7 poprzedzającego gen T-Fox, nie wykazuje zdolności do naturalnej transformacji w tych warunkach ze względu na brak transkrypcji T-Fox w podłożu bogatym i w obecności jego naturalnego induktora, chityny. Fenotyp ten był niezależny od tego, czy polimeraza RNA T7 była sztucznie indukowana za pomocą IPTG, czy nie.Jednakże szczep wygenerowany przez trans-flip, który zawiera promotor zależny od polimerazy RNA T7 powyżej genu kompetencji T Fox, był rzeczywiście naturalnie transformowalny w medium wzbogaconym ze względu na nieszczelność promotora LAC UV5 w medium LB. Wytworzona polimeraza RNA T7 transkrybowała już T FOX z promotora zależnego od polimerazy RNA T7 bez indukcji IPTG. Zainicjowało to naturalną kompetencję i transformację, potwierdzając funkcjonalność zintegrowanej sekwencji promotora zależnego od polimerazy RNA T7.Fenotyp ten został znacznie nasilony poprzez pełną indukcję polimerazy RNA T7 w wyniku dodania IPTG, będącego induktorem promotora lacUV5. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak modyfikować genetycznie V. cholerae, wykorzystując połączenie naturalnej transformacji indukowanej chityną oraz rekombinacji flip. Po opanowaniu ta technika umożliwia usuwanie genów lub wysp genomowych, a także integrowanie sekwencji DNA w sposób celowany w ciągu zaledwie kilku dni.

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

TransFLP — Metoda modyfikacji genetycznej Vibrio cholerae oparta na transformacji naturalnej i rekombinacji FLP

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na...

F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Opisujemy tutaj protokół charakteryzujący interakcje białko-białko pomiędzy dwoma białkami o bardzo różnej ekspresji u żywych Pseudomonas aeruginosa za pomocą pomiarów FLIM-FRET. Protokół obejmuje konstrukcje szczepów bakterii, immobilizację bakterii, procedury obrazowania i analizy danych po obrazowaniu.

Pomiary FLIM-FRET interakcji białko-białko u żywych bakterii.

Opisana metoda przedstawia procedurę, zgodnie z którą mątwka hawajska Euprymna scolopes oraz jej bakteryjny symbiont Vibrio fischeri są hodowane oddzielnie, a następnie łączone w celu umożliwienia specyficznej kolonizacji organu świetlnego mątwy przez bakterie. Opisano metody wykrywania kolonizacji za pomocą luminescencji bakteryjnej oraz poprzez bezpośrednie liczenie kolonii.

Kolonizacja mątwy Euprymna scolopes przez Vibrio fischeri

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Poznaj metodę TransFLP do szybkiej modyfikacji genetycznej Vibrio cholerae opartą na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP. Technika umożliwia usuwanie genów i integrację sekwencji w genomie bakteryjnym.

TransFLP — Metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Przeglądaj więcej filmów