TransFLP — Metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Celem niniejszej procedury jest modyfikacja genetyczna vio cray przy użyciu tej szybkiej i wydajnej metody, opartej na naturalnej transformacji i kombinacji flip. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie odpowiedniego źródła chityny, ponieważ chityna jest naturalnym induktorem transformacji. W drugim kroku generowany jest konstrukt DNA za pomocą dwóch rund PCR, a następnie przeprowadzana jest naturalna transformacja, która pozwala bakteriom zawierającym plazmid PBR flip na pobranie fragmentu PCR i włączenie go do ich genomów.

Następnie stosuje się podwyższenie temperatury, aby indukować ekspresję enzymu lipazy kodowanego przez plazmid w celu usunięcia kasety oporności na antybiotyki flankowanej przez miejsce docelowe rekombinacji flip (FRT). W ostatnim kroku bakterie są oczyszczane z plazmidu kodującego FLP. Ostatecznie, za pomocą PCR i sekwencjonowania wykazuje się, że manipulacja genetyczna zakończyła się sukcesem.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie plazmidów samobójczych do manipulacji genetycznej wirusów, jest jej wysoka szybkość i wydajność. Należy rozpocząć od odważenia próbek płatków chityny o masie od 50 do 80 mg do standardowych plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml, a następnie, pozostawiając nakrętki probówek otwarte, poddać płatki autoklawowaniu; natychmiast po zakończeniu pracy autoklawu należy zamknąć nakrętki i przechowywać zestaw z płatkami w temperaturze pokojowej. Do amplifikacji wybranych regionów DNA oraz flankowanej przez sekwencje FRT kasety antybiotykowej metodą PCR wymagane są co najmniej sześć oligonucleotydów. Zaleca się również dołączenie pary starterów oligonucleotydowych poza obrębem wstawianego fragmentu PCR.

Pozwala to na sprawdzenie integracji oraz prawidłowej ekscyzji kasety oporności na antybiotyki flankowanej sekwencjami FRT; należy z należytą starannością dobrać oligonukleotydy numer dwa, trzy, cztery i pięć. Primery dwa i pięć powinny składać się z co najmniej 28 par zasad, aby umożliwić wystarczające przyłączenie do DNA genomowego, natomiast primery trzy i cztery powinny zostać zaprojektowane z wykorzystaniem plazmidu zawierającego sekwencję FRT jako matrycy. Primery dwa i pięć należy zaprojektować tak, aby umożliwić rozległe komplementarne parowanie zasad na końcu 5' odpowiednio między primerami dwa a trzy oraz czterem a pięć.

W pierwszej rundzie PCR należy użyć oligonukleotydów jeden i dwa, aby przygotować pierwszą z trzech równoległych, lecz niezależnych reakcji PCR w celu amplifikacji regionu położonego powyżej eksperymentalnego obszaru zainteresowania w specjalnie zaprojektowanych konstruktach. Równocześnie należy przygotować drugą reakcję PCR, wykorzystując oligonukleotydy trzy i cztery, aby amplifikować kasetę antybiotykową flankowaną sekwencjami FRT. Na przykład w niniejszym eksperymencie wykorzystano gen A PH kodujący odporność na kanamycynę.

Jednocześnie przeprowadź amplifikację regionu DNA położonego poniżej, przygotowując trzecią reakcję PCR z użyciem oligonukleotydów pięć i sześć oraz genomowego DNA jako matrycy. Następnie rozpocznij reakcję PCR dla wszystkich trzech próbek. Po oczyszczeniu wszystkich trzech fragmentów PCR użyj mieszaniny zawierającej równe ilości wszystkich trzech fragmentów uzyskanych w pierwszej rundzie jako matrycy do przeprowadzenia drugiej rundy PCR. Amplifikacja ta będzie katalizowana przez oligonukleotydy jeden i sześć.

Otrzymany fragment PCR posłuży jako DNA transformujące w eksperymentach dotyczących transformacji naturalnej. Po wyhodowaniu komórek v cholera w medium wzbogaconym tlenowo w temperaturze 30°C, bakterie należy zebrać poprzez wirowanie w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś kulturę bakteryjną na chitynowe płatki i inkubuj zawiesinę komórek przez noc w temperaturze 30 °C. Następnie ostrożnie wymieszaj co najmniej 200 ng fragmentów pochodzących z drugiej rundy PCR z zawiesiną komórek bakteryjnych. Uważając, aby nie odczepić nadmiernie bakterii od powierzchni chityny, inkubuj ten roztwór w temperaturze 30 °C bez ruchu przez kolejny dzień.

Następnie energicznie mieszaj kulturę w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 sekund. W przypadku bakterii zawierających plazmid PBR flip, roznieś 100 do 300 µL roztworu komórek na podwójnie selektywne płytki zawierające ampicylinę oraz drugi antybiotyk. Inkubuj kultury komórek bakteryjnych w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się widocznych kolonii. Następnie wyizoluj pojedyncze transformanty z płytek selektywnych.

Krok ten należy rozpocząć od hodowli bakterii na płytkach z agarem LB zawierającym ampicylinę w temperaturze 37 °C przez 16 do 24 godzin. Opcjonalnie można zmienić temperaturę na 40 °C na dwie do trzech godzin, ponieważ ekspresja flip z plazmidu PBR flip jest derepresowana w wyższych temperaturach. Po kolejnych ośmiu godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C należy przenieść bakterie na świeże płytki.

Następnie należy równolegle ograniczyć klony na płytkach agarowych z antybiotykiem i bez antybiotyku, aby przetestować ich wrażliwość na antybiotyk, a następnie wyizolować pojedynczą powstałą kolonię wrażliwą na antybiotyk. Należy rozpocząć ten etap od hodowania kultury przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 30 °C w pożywce wzbogaconej bez antybiotyków. Następnego ranka należy hodować nową kulturę przez trzy do sześciu godzin, rozcieńczając kulturę nocną w stosunku 1:100 w świeżej pożywce bez antybiotyków, a po południu wysiać metodą smugową lub wylać rozcieńczenie kultury na zwykłe płytki z agarem LB, a następnie inkubować płytki przez kolejne 8 do 16 godzin w temperaturze 30 °C, aż pojawią się widoczne kolonie.

W tym pierwszym doświadczeniu, mającym na celu usunięcie sąsiednich genów CTXA i CTXB, oligonukleotydy do metody trans flip wygenerowano w sposób przedstawiony wcześniej. Przebadano genotyp szczepu rodzicielskiego, szczepu pośredniego zawierającego flankowaną sekwencjami FRT kasetę oporności na antybiotyki zamiast oryginalnego locus DNA C-T-X-A-B oraz szczepu końcowego z delecją C-T-X-A-B i bez kasety oporności. W tym celu przeprowadzono analizę PCR z użyciem starterów, które nie wiązały się z transformującym fragmentem PCR, lecz wyłącznie z DNA chromosomalnym. Fragmenty PCR rozdzielono za pomocą standardowej elektroforezy w żelu agarozowym w celu określenia ich wielkości.

W pierwszej ścieżce szczep bakterii cholery typu B z całego świata znajdował się na oczekiwanym rozmiarze fragmentu wynoszącym 3 143 pary zasad. W drugiej ścieżce fragment PCR pochodzący ze szczepu delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT znajdował się na poziomie 3 162 par zasad.

W ścieżce trzeciej fragment delta ctx A B FFR TP CR znajdował się na poziomie 1, 769 par zasad w odniesieniu do drabinki 1 KB. W drugim przykładzie, w którym usunięto całą wyspę genomiczną, jako cel eksperymentu wybrano wyspę patogenności Vibrio 1 lub VPI 1. Metodę trans flip zmodyfikowano w dwóch etapach.

W pierwszej kolejności integracja genu oporności na kanamycynę została poprzedzona wprowadzeniem pojedynczego miejsca FRT na początku wyspy patogenności (PI) jednej. Następnie przeprowadzono drugą rundę transformacji naturalnej, co pozwoliło na wstawienie dodatkowego markera oporności na antybiotyk, a mianowicie oporności na gentamycynę, za którą następowało drugie miejsce FRT na końcu wyspy patogenności. Odpowiednie pary starterów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu, a metodę trans FLP kontynuowano zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Szczepy rodzicielskie, pośrednie i końcowe zostały zweryfikowane za pomocą PCR oczyszczonego DNA genomowego w ścieżce pierwszej. Fragment PCR szczepu dzikiego typu V cholera został przeprowadzony w ścieżce drugiej. Przeprowadzono analizę fragmentu PCR pochodzącego ze szczepu VPI one FRT can GM FRT.

W ścieżce trzeciej przeanalizowano produkt PCR pochodzący ze szczepu delta VPI one FRT. Pary starterów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu. W końcowym szczepie brakuje całego VPI one.

W tym trzecim przykładzie sekwencja promotora zależnego od polimerazy RNA T7 została zintegrowana powyżej genu Tfox, głównego regulatora naturalnej transformacji, przy użyciu metody trans-flip z niewielką modyfikacją standardowego protokołu. Konsensusowa sekwencja promotora zależnego od polimerazy RNA T7 została wprowadzona jako nawisy w oligonukleotydach numer cztery i numer pięć, tak aby sekwencja DNA ta została zachowana w chromosomie. Po wycięciu kasety oporności na antybiotyki, konstrukt zintegrowano następnie w szczepie V colorized zawierającym polimerazę RNA T7.

W tym szczepie ekspresja genu polimerazy RNA T7 była sterowana przez promotor LAC UV5, aby przetestować zależną od polimerazy RNA T7 ekspresję T-Fox. Testy naturalnej transformacji przeprowadzono w medium LB. Szczep rodzicielski, pozbawiony promotora zależnego od T7 poprzedzającego gen T-Fox, nie ulega naturalnej transformacji w tych warunkach ze względu na brak transkrypcji T-Fox w medium bogatym i wobec braku jego naturalnego induktora, chityny. Fenotyp ten był niezależny od tego, czy polimeraza RNA T7 była sztucznie indukowana za pomocą IPTG, czy nie.

Jednakże szczep wygenerowany przez trans flip, który zawiera promotor zależny od polimerazy RNA T7 powyżej genu kompetencji T Fox, był rzeczywiście naturalnie transformowalny w medium wzbogaconym z powodu nieszczelności promotora LAC UV5 w medium LB. Wytworzona polimeraza RNA T7 transkrybowała już T FOX z promotora zależnego od polimerazy RNA T7 bez indukcji za pomocą IPTG. Zainicjowało to naturalną kompetencję i transformację, potwierdzając funkcjonalność zintegrowanej sekwencji promotora zależnego od polimerazy RNA T7.

Fenotyp ten został znacznie nasilony poprzez pełną indukcję polimerazy RNA T7 dzięki dodaniu IPTG, induktora promotora lacUV5. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat genetycznej manipulacji V. cholerae przy użyciu kombinacji naturalnej transformacji indukowanej chityną oraz rekombinacji flip. Po opanowaniu ta technika pozwala na usuwanie genów lub wysp genomicznych, a także na integrowanie sekwencji DNA w sposób celowany w ciągu zaledwie kilku dni.