Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie wizualizacji dynamiki białek in vivo oraz wzorców ich lokalizacji w żywych embrionach Drosophila za pomocą konfokalnej mikroskopii time-lapse. W pierwszej kolejności pobiera się embriony z utrzymywanych linii Drosophila. Następnie embriony przenosi się na szkiełko podstawowe, a potem ręcznie usuwa się z nich otoczki, aby uzyskać odsłonięte embriony.

Następnie próbki są w sposób uporządkowany montowane na wcześniej przygotowanych szkiełkach i, w zależności od eksperymentu, mogą zostać poddane mikroiniekcji odpowiednich odczynników indukujących punkt kontrolny wrzeciona. Ostatnim krokiem w tej procedurze jest wykonanie obrazowania poklatkowego embrionów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. W końcowej fazie mikroskopia poklatkowa i ogniskowa służą do wykazania białek punktu kontrolnego wrzeciona, kolokalizacji zachowań chromosomów oraz wpływu czynników indukujących punkt kontrolny w transgenicznych liniach oph związanych z punktem kontrolnym.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji ME, takie jak wpływ mutacji lub deplecji białek punktu kontrolnego wrzeciona (przy użyciu linii genicznych) na kolokalizację pozostałych komponentów punktu kontrolnego oraz konsekwencje tego zjawiska dla zdolności punktu kontrolnego montażu wrzeciona do efektywnego funkcjonowania. Muchy transgeniczne utrzymuje się w temperaturze 25 °C w plastikowych fiolkach zawierających pożywkę dla much, z dodatkowym suchym proszkiem drożdżowym na wierzchu. Fiolki są rutynowo wymieniane co dwa do trzech tygodni, w zależności od warunków hodowli.

Aby przygotować pożywkę dla muszek, podgrzać odpowiednią ilość mieszanki pożywki przy ciągłym mieszaniu w celu rozpuszczenia składników, używając pompy perystaltycznej, a następnie rozdzielić od 8 do 10 ml tej pożywki w formie zawiesiny do każdej plastikowej probówki. Gdy zawiesina pożywki stężeje i osiągnie temperaturę pokojową, każdą probówkę zamknąć watowanym korkiem. Umieścić probówki z pożywką w tacy, szczelnie zamknąć w plastikowym worku i przechowywać w temperaturze 4°C w celu zbierania jaj na małą skalę.

Przenieś około 50 par dorosłych much w wieku od dwóch do trzech dni do świełej fiolki z pożywką, na której powierzchni należy umieścić dodatkowy suchy proszek drożdżowy w celu umożliwienia składania zarodków. Inkubuj w temperaturze 25 °C, która w tym przypadku jest utrzymywana przez klimatyzację pomieszczenia. Co godzinę przenoś muchy do nowej fiolki, pozostawiając zarodki na 30 minut.

Aby upewnić się, że część zebranych embrionów znajdowała się w okolicach ósmego do dziesiątego cyklu podziału jądra. Materiał zebrany w pierwszej godzinie jest zazwyczaj odrzucany, ponieważ często zawiera starsze embriony, które pozostały w ciałach samic w czasie, gdy warunki nie były odpowiednie do składania jaj. W związku z tym w niniejszych eksperymentach wykorzystane zostaną wyłącznie embriony z transferów dokonanych od drugiej godziny wzwyż.

W tej procedurze wykorzystuje się szkiełka podstawowe oraz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 50 by 22 milimetr. Należy rozpocząć od wzięcia szkiełka nakrywkowego i za pomocą wilgotnego, cienkiego pędzla lekko zwilżyć niewielką ilością wody cztery narożniki jednej z jego stron. Następnie należy położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.

Napięcie powierzchniowe kapilarne wywołane przez cienką warstwę cieczy powinno zapobiegać przesuwaniu się szkiełka nakrywki. Nanieś cienki pasek kleju w heptanie przez środek szkiełka nakrywki. Heptan powinien odparować w ciągu kilku sekund, pozostawiając klej na szkiełku nakrywce.

Następnie za pomocą rylca diamentowego należy pociąć kolejną lamellkę na małe kwadraty o boku około 1.5 mm. Jeden kwadrat należy podnieść i umieścić na jednym końcu paska kleju. Będzie on służyć do otwierania końcówki igły w przypadku konieczności przeprowadzenia mikroiniekcji.

Należy wziąć kolejne szkiełko przedmiotowe, przykleić do niego dwucentymetrowy kawałek dwustronnej taśmy klejącej i odkleić papier ochronny, aby rozpocząć procedurę powlekania embrionów. Przenosi się muchy do nowej fiolki z pożywką za pomocą wilgotnego i cienkiego pędzelka. Na dwustronną taśmę klejącą na przygotowanym szkiełku przenosi się około 50 jaj.

Użyć odpowiedniej ilości cieczy, aby umożliwić rozprowadzenie jaj. Po odparowaniu cieczy jaja przylgną do taśmy pod mikroskopem stereoskopowym. Delikatnie dotykać jaj kilka razy wzdłuż ich długiej osi zewnętrzną stroną jednej z okładzin pęsety, aż chorion zostanie przerwany i otwarty.

Pozostaw zarodek w skorupce Corian, aby zapobiec szybkiemu odwodnieniu. Kontynuuj ten proces, aż zostanie opracowanych od 10 do 20 jaj. Następnie wyjmij zarodki ze skorupki Corian pojedynczo i delikatnie przenieś je na pionowy pasek.

Na pasku klejącym. Ustaw zarodki tak, aby ich dłuższy bok był antyrównoległy do dłuższego boku paska klejącego. Umieść zarodki w komorze do wysuszania na czas od trzech do ośmiu minut.

Na koniec pokryć zarodki odpowiednią ilością oleju mineralnego, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu przed mikroiniekcją. Mikroiniekcja jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Aby maksymalnie ułatwić i usprawnić proces mikroiniekcji, należy ściśle przestrzegać protokołu przygotowania slajdów.

Zarodki muszą zostać starannie przygotowane, aby znajdowały się w optymalnym stanie do mikroiniekcji. Igły do mikroiniekcji zarodków należy przygotować wcześniej. Używając cienkiej końcówki do ładowania, należy napełnić igłę od 1 do 2 µL odczynnika o odpowiednim stężeniu w buforze do iniekcji.

Zamocuj igłę w uchwycie do igieł w odwróconym mikroskopie konfokalnym Leica TCSP dwa, z rurką ciśnieniową podłączoną do systemu sterowania wtryskiem. Znajdź embrion przy użyciu obiektywu 40x. Następnie, bez zmiany płaszczyzny ogniskowania, zlokalizuj cień igły.

Osiąga się to poprzez przesunięcie igły do centrum pola widzenia i stopniowe obniżanie jej do prawej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuń stoлик mikroskopu, aby zlokalizować mały kwadrat szkiełka nakrywki, zamontowany uprzednio na jednym końcu paska kleju. Bardzo delikatnie przesuwaj końcówkę igły, aż dotknie ona krawędzi małego kwadratowego szkiełka nakrywki i delikatnie je rozbije.

Przesuń stolik, aby zarodki ponownie znalazły się w polu widzenia, i wybierz zarodek w odpowiednim wieku do iniekcji. Ostrożnie przesuń zarodek blisko igły i ponownie ustaw płaszczyznę ogniskowania zarówno dla zarodka, jak i dla igły. Wprowadź zarodek do igły.

Wstrzyknij kroplę odczynnika w bok embrionu, a następnie odsuń embrion. Obrazy z odstupami czasowymi lub pojedyncze obrazy żywych embrionów są rejestrowane przy użyciu odwróconego systemu mikroskopii konfokalnej Leica TCSS SP z obiektywem imersyjnym olejowym 40x. W przypadku obrazowania wielu fluoroforów o nakładających się widmach, które są współwyrażane w tym samym embrionie, długość fali emisji każdego białka fluorescencyjnego jest rejestrowana sekwencyjnie.

Obrazy pojawiły się później podczas ustawiania ram czasowych dla obrazowania poklatkowego. Należy wziąć pod uwagę te czynniki. Pojedynczy obraz jest zazwyczaj uzyskiwany jako średnia z dwóch linii skanowania.

Przy średnio dwóch skanowaniach klatki, skanowanie obrazu o rozmiarze 512 na 512 pikseli w trybie skanowania jednoczesnego trwa minimum 6,3 sekundy, a w trybie skanowania sekwencyjnego 15,44 sekundy, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu. Pinhole jest zazwyczaj ustawiony na 1 do 2 au (jednostek Airy'ego), a moc lasera jest dostosowana do najniższego możliwego poziomu, aby uniknąć istotnego fotobielenia. Ten reprezentatywny film poklatkowy przedstawia dynamiczną rekrutację rdzenia kinetycznego CDC 20 oraz ruch chromosomów w żywych embrionach ophis cial.

Obrazy z serii czasowej zostały wykonane z zarodka transgenicznego wykazującego koekspresję G-F-P-C-D-C 20, widocznego w kolorze zielonym, oraz RFP his stone two B, widocznego w kolorze czerwonym. Podczas cykli podziału jądra wykonano od siedmiu do ośmiu klatek co 10 sekund, a klatkę z komórkami znajdującymi się już w profazie przyjęto jako punkt zerowy. Rysunek ten przedstawia klatki z filmu z serii czasowej; G fp CDC 20 jest wyraźnie widoczny w kinetochorach w profazie i prometafazie, co wskazują białe strzałki odpowiednio na obrazach trzy i cztery, a następnie utrzymuje się w kinetochorach w metafazie i anafazie, co zaobserwowano odpowiednio na obrazach pięć i sześć.

G-F-P-C-D-C 20 jest wykluczony z jądra interfazowego wskazanego białą grotą strzałki na obrazie pierwszym i wnika do jądra we wczesnej profazie, jak pokazano na obrazie drugim. Na obrazach od ósmego do czternastego morfologię chromatyny określono przy użyciu współwyrażonego RFP histone two B jako zlewanych markerów. Obrazy przedstawiono w dolnym rzędzie.

Korzystając z niniejszego protokołu, funkcje punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC) można badać poprzez manipulację zarodkami za pomocą mikroiniekcji przeciwciał, białek znakowanych fluorescencyjnie lub interesujących związków chemicznych, które potencjalnie aktywują SAC. W tym przykładzie zarodki poddano działaniu kolchicyny w celu depolimeryzacji mikrotubul, wywołując tym samym SACG FP CDC 20 lub GFP MAD. Jako markery postępu cyklu komórkowego wykorzystano dwa kinetyczne sygnały rdzenia.

Na górnym panelu ARES wskazują na zatrzymane esci na obrazach od drugiego do szóstego. Obszar zaznaczony strzałką na pierwszym obrazie wskazuje, że przed traktowaniem kolchicyną G-F-P-C-D-C 20 jest wykluczony z jądra w późnej interfazie. Obrazy na środkowym panelu pokazują, że w przypadku braku endogennego MAD dwa G-F-P-C-D-C 20, wskazane strzałkami na obrazach od siódmego do dwunastego, nadal oscylują wewnątrz i na zewnątrz jądra oraz włączają się i wyłączają w przebiegu kinetycznym.

Choć cytokineza wydaje się być zaburzona, sugeruje to niewydolność funkcji SAC w zatrzymywaniu komórek w odpowiedzi na traktowanie kolchicyną. Przykład niepowodzenia separacji jąder potomnych widoczny jest na obrazie 10. W końcu, w dolnym panelu groty strzałek na obrazach od 14 do 18 wskazują spoczywające rdzenie kinetyczne z nagromadzonymi białkami fuzyjnymi GFP MA two, co sugeruje, że funkcjonalne GFP MA two niweluje fenotyp defektu sac w embrionie mutanty MA two.

Grot strzałki na obrazie 13 wskazuje akumulację GFP MAD 2 w jądrze w późnej fazie interfazy. Po obejrzeniu tych materiałów wideo powinni Państwo dobrze rozumieć, jak pozyskiwać embriony z utrzymywanych szypułek, manualnie oddzielać embriony przed przygotowaniem preparatów do mikroiniekcji oraz przeprowadzać obrazowanie czasu rzeczywistego in vivo przy użyciu mikroskopii konfokalnej.