Badanie mitotycznego punktu kontrolnego poprzez zilustrowanie dynamicznego zachowania białek kinetochoru i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Celem tego eksperymentu jest pokazanie wizualizacji dynamiki białek in vivo i wzorców lokalizacji w żywych zarodkach Drosophila za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie zarodków z utrzymywanych stad Drosophila. Następnie przenieś zarodki na szkiełko, a następnie ręcznie usuń szopy z zarodków do zarodków powlekanych.

A następnie montowany w zorganizowany sposób na wcześniej przygotowanych szkiełkach i w zależności od doświadczenia może być mikrowstrzykiwany odpowiednimi odczynnikami indukującymi punkt kontrolny wrzeciona. Ostatnim krokiem w tej procedurze jest wykonanie obrazowania poklatkowego zarodków za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie, mikroskopia poklatkowa i ogniskowa jest wykorzystywana do pokazania białka punktu kontrolnego wrzeciona, zachowań chromosomów kolokalizacyjnych oraz wpływu czynników indukujących punkty kontrolne w transgenicznych liniach oph związanych z punktami kontrolnymi.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji ME, takie jak wpływ mutacji lub wyczerpania białka punktu kontrolnego wrzeciona poprzez zastosowanie linii genowych na kolokalizację innych składników punktów kontrolnych oraz konsekwencja tego na zdolność punktu kontrolnego zespołu wrzeciona do wydajnego funkcjonowania. Transgeniczne muchy są utrzymywane w temperaturze 25 stopni Celsjusza w plastikowych fiolkach zawierających pokarm dla much, a na wierzchu znajdują się dodatkowe suche drożdże w proszku. Fiolkę wymienia się rutynowo co dwa do trzech tygodni, w zależności od warunków uprawy.

Aby przygotować pokarm dla much, podgrzej odpowiednią ilość mieszanki pokarmu dla much, ciągle mieszając, aby rozpuścić składniki za pomocą pompy perystaltycznej, rozprowadź od ośmiu do 10 mililitrów tego podłoża w postaci zawiesiny do każdej plastikowej fiolki. Gdy zawiesina pokarmowa stwardnieje i osiągnie temperaturę drun, zatkaj każdą fiolkę zatyczką z pianki bawełnianej. Umieść te fiolki z żywnością na tacy, zamknij w plastikowej torbie i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać jaja na małą skalę.

Przenieś około 50 par dwu- lub trzydniowych dorosłych much do fiolki ze świeżym pokarmem dla much, zaopatrzonej w dodatkowy suchy proszek drożdżowy na jej powierzchni w celu złożenia zarodków. Inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza, co w tym przypadku jest temperaturą utrzymywaną przez klimatyzację. W pomieszczeniu co godzinę przenieś muchy do nowego pliku i pozostaw zarodki na 30 minut.

Aby upewnić się, że niektóre z pobranych embrionów szalały w cyklu podziału jądrowego od 8 do 10. Pobranie w pierwszej godzinie jest zwykle odrzucane, ponieważ często zawiera stare zarodki, które zostały zatrzymane w ciałach samic, gdy warunki nie były odpowiednie do nieśności. W związku z tym w tych doświadczeniach zostaną wykorzystane tylko zarodki z transferu w drugiej godzinie.

Do tej procedury używa się szkiełek mikroskopowych i szkiełek nakrywkowych o wymiarach 50 na 22 milimetry. Zacznij od zrobienia szkiełka nakrywkowego i wilgotnym, cienkim pędzlem do pióra lekko zwilż cztery rogi z jednej strony bardzo małą ilością wody. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym.

Napięcie powierzchniowe kapilar spowodowane cienką warstwą cieczy powinno zapobiegać przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego. Nałóż cienki pasek kleju heptanowego na środek szkiełka nakrywkowego. Heptan powinien odparować w ciągu kilku sekund, pozostawiając klej na szkiełku nakrywkowym.

Następnie za pomocą pisaka diamentowego pokrój kolejny szkiełko okładkowe na małe kwadraty o boku około 1,5 milimetra kwadratowego. Podnieś jeden kwadrat i umieść go na jednym końcu paska kleju. Zostanie on wykorzystany do otwarcia końcówki igły, gdy wymagane jest mikrowstrzyknięcie.

Weź kolejny szkiełko mikroskopowe, przyklej do niego dwucentymetrowy kawałek dwustronnej taśmy klejącej i odklej papier okładkowy, aby rozpocząć procedurę powlekania zarodków. Przenieś muchy do fiolki ze świeżą żywnością za pomocą wilgotnej i cienkiej szczoteczki do pisaków. Przenieś około 50 jajek na dwustronną taśmę klejącą na przygotowanym szkiełku.

Użyj odpowiedniej ilości płynu, aby jaja mogły się rozłożyć. Gdy płyn wyparuje, jaja przykleją się do taśmy pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie dotknij jajek kilka razy wzdłuż ich długiej osi zewnętrzną stroną jednej połowy pęsety, aż Corian zostanie złamany i otwarty.

Pozostaw zarodek w skorupie Corianu, aby zapobiec szybkiemu odwodnieniu. Kontynuuj ten proces, aż 10 do 20 jaj zostanie poddanych obróbce. Następnie podnieś zarodki i wyjmij je z muszli Corianu jeden po drugim i delikatnie umieść zarodki w pionowym pasku.

Na pasku kleju. Wyrównaj zarodki długim bokiem przeciwbieżnie do dłuższego boku paska kleju. Umieść zarodki w komorze wysuszającej na trzy do ośmiu minut.

Na koniec przykryj zarodki odpowiednią ilością oleju tenisowego z wolnego oleju, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu przed mikroiniekcją. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest mikropołknięcie. Aby mikrospożycie było tak łatwe i skuteczne, jak to tylko możliwe, należy postępować zgodnie ze specjalnym protokołem niewielkiego przygotowania.

Zarodki muszą być starannie przygotowane, aby były w optymalnym stanie do mikropołknięcia. Igły do mikroiniekcji zarodków są przygotowywane wcześniej. Używając drobnej końcówki ładującej, napełnić igłę jednym do dwóch mikrolitrów odczynnika o odpowiednim stężeniu w buforze do wstrzykiwań.

Zamontuj igłę w uchwycie igły w dwuodwróconym mikroskopie konfokalnym Leica TCSP z rurką ciśnieniową podłączoną do systemu sterowania wtryskiem. Znajdź zarodek poniżej celu 40 razy. Następnie znajdź cień igły bez zmiany płaszczyzny ogniskowej.

Osiąga się to poprzez przesuwanie igły do środka pola widzenia i stopniowe obniżanie jej do prawej płaszczyzny ogniskowej. Przesuń stolik mikroskopu bardzo delikatnie, aby znaleźć mały kwadrat szkiełka nakrywkowego zamontowany na jednym końcu paska kleju. Bardzo delikatnie przesuwaj końcówkę igły, aż dotknie krawędzi małego kwadratowego szkiełka nakrywkowego i delikatnie się otworzy.

Przesuń stolik tak, aby zarodki wróciły do pola widzenia i wybierz zarodek w odpowiednim wieku do wstrzyknięcia. Ostrożnie przesunąć zarodek blisko igły i ponownie wyregulować płaszczyznę ogniskową zarówno dla zarodka, jak i igły. Przenieść zarodek do igły.

Wstrzyknąć kroplę odczynnika w bok zarodka, a następnie odsunąć zarodek. Zdjęcia poklatkowe lub pojedyncze żywe zarodki są zbierane za pomocą systemu odwróconej mikroskopii konfokalnej Leica TCSS SP z obiektywem o 40-krotnym zanurzeniu w oleju. Podczas obrazowania wielu fluoroforów, które mają nakładające się widma i ulegają koekspresji w tym samym zarodku, każda długość fali emisji białka fluorescencyjnego jest zbierana sekwencyjnie.

Obrazy pojawiły się później podczas ustawiania ram czasowych dla obrazowania poklatkowego. Należy wziąć pod uwagę te czynniki. Pojedynczy obraz jest zwykle uzyskiwany jako średnia z dwóch linii skanowania.

Przy średnio dwóch skanach klatek, skanowanie pięciu obrazów o wymiarach 12 na pięć 12 pikseli w trybie skanowania symultanicznego zajmuje co najmniej 6,3 sekundy, a w trybie skanowania sekwencyjnego 15,44 sekundy i uzyskanie dobrego stosunku sygnału do szumu. Otwór otworkowy jest zwykle ustawiony na jedną lub dwie jednostki au lub airy, a moc lasera jest ustawiona na najniższy możliwy poziom, aby uniknąć znacznego wybielania zdjęć. Ten reprezentatywny film poklatkowy pokazuje dynamiczną kinetyczną rekrutację rdzenia CDC 20 i ruch chromosomów u żywych jajników w zarodkach cialnych.

Zdjęcia poklatkowe zostały wykonane z transgenicznego początkowego koksu zarodkowego z ekspresją G-F-P-C-D-C 20, pokazanego na zielono i RFP jego kamienia dwa B pokazanego na czerwono. Podczas cykli podziału jądrowego co 10 sekund pobiera się od siedmiu do ośmiu ramek, a ramka z komórkami już w profazie jest traktowana jako punkt czasu zerowego. Rysunek ten pokazuje, że klatki z filmu poklatkowego G fp CDC 20 można łatwo zaobserwować na kinetyce profazy i prometafazy, jak wskazują białe strzałki na obrazach trzecim i czwartym, i utrzymują się na kursie kinetty metafazy i anafazy, jak zaobserwowano na obrazach piątym i szóstym.

G-F-P-C-D-C 20 jest wyłączony z jądra interfejsu wskazanego przez biały grot strzałki na obrazie pierwszym i wchodzi do jądra przez wczesną profazę, jak pokazano na rysunku drugim. Na obrazach określono morfologie chromatyny od ośmiu do 14 przy użyciu współeksprymowanego histonu RFP dwóch B jako połączonych markerów. Obrazy są wyświetlane w dolnym wierszu.

Korzystając z tego protokołu, można badać punkt kontrolny montażu wrzeciona lub funkcje SAC, manipulując zarodkami za pomocą mikroiniekcji przeciwciał, fluorescencyjnie znakowanych białek lub związków chemicznych będących przedmiotem zainteresowania, które potencjalnie wywołują SAC. W tym przykładzie zarodki są wyposażone w kolchicynę w celu depolimeryzacji mikrotubul, wywołując w ten sposób SACG FP CDC 20 lub GFP MAD. Jako markery progresji cyklu komórkowego wykorzystano dwa sygnały rdzenia kinetycznego.

W górnym panelu ARES wskazuje zatrzymane esci na zdjęciach od 2 do 6. Obszar oznaczony strzałką na pierwszym rysunku wskazuje, że przed leczeniem kolchicyną G-F-P-C-D-C 20 jest wyłączony z jądra późnego interfejsu. Obrazy w środkowym panelu pokazują, że przy braku endogennego MAD, dwa G-F-P-C-D-C 20 oznaczone strzałkami od siedmiu do 12 nadal oscylują w jądrze i na zewnątrz oraz na kursie kinetycznym.

Chociaż cytokineza wydaje się być wadliwa, sugeruje to niewydolną funkcję SAC w zatrzymywaniu komórek w odpowiedzi na leczenie kolchicyną. Przykład nieudanego rozdzielenia jądra potomnego zaobserwowano na rysunku 10. Wreszcie, w dolnym panelu groty strzałek na obrazach od 14 do 18 wskaźnika spoczywały rdzenie kinetyczne z nagromadzonymi białkami fuzyjnymi GFP MA, co sugeruje, że funkcjonalny GFP MA dwa ratuje fenotyp wady worka w zarodku MA dwa.

Grot strzałki na rysunku 13 wskazuje na akumulację GFP MAD two w jądrze późnego interfejsu. Po obejrzeniu tych filmów powinieneś dobrze zrozumieć, jak pobrać dwa zarodki oprogramowania z utrzymania łodyg, ręcznie de koordynator zarodków przed przygotowaniem szkiełek do mikrospożycia wykonując czas in vivo, pozostawiając obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.