Name: Badanie mitotycznego punktu kontrolnego poprzez zilustrowanie dynamicznego zachowania białek kinetochoru i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Poznaj dynamikę białek punktu kontrolnego wrzeciona w żywych zarodkach Drosophila przy użyciu mikroskopii konfokalnej time-lapse. Ta metoda umożliwia badanie lokalizacji białek kinetochoru i ruchu chromosomów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Protokół ten został opracowany w ramach grantu Wellcome Trust. Dziękujemy pani Maureen Sinclair za wieloletnie utrzymywanie szczepów muszek i przygotowywanie pożywki dla muszek. Chcielibyśmy również podziękować panu Michaelowi Aitchisonowi za pomoc i wsparcie techniczne przy opracowywaniu tego protokołu.

1. Muchy transgeniczne i ich utrzymanie
<ol>
 <li>Muchy transgeniczne wykorzystane w tej demonstracji: Ubq-gfp-Cdc20 (II), Ubq-rfp-His2B (X*); Ubq-gfp-Cdc20 (II*), Ubq-gfp-Cdc20 (II*); muchy transgeniczne mad2EY(III*) oraz Ubq-gfp-Cdc20 zostały wcześniej wytworzone w laboratorium przy użyciu standardowej metody transgenezy za pośrednictwem elementu P10,11, a Ubq-rfp-His2B jest uprzejmym darem od Yohannsa Belaïche z UMR 144 CNRS/Institute Curie w Paryżu we Francji. Zostały one wprowadzone do tła mutantów Mad2 za pomocą standardowej genetyki Drosophila. Oryginalna linia mutantów mad2EY została zakupiona z centrum zasobów Bloomington. W niniejszym protokole nie będziemy omawiać procedury hodowli transformantów. 
 Uwaga: * oznacza numer chromosomu.</li>
 <li>Utrzymanie: Muchy transgeniczne utrzymywano w temperaturze 25 °C w plastikowych fiolkach zawierających pożywkę dla much z dodatkowym suchym proszkiem drożdżowym na wierzchu. Fiolki wymieniano rutynowo co 3-4 tygodnie, w zależności od warunków wzrostu (Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki dla much (skala laboratoryjna)
<ol>
 <li>Odpowiednią ilość mieszaniny pożywki dla muszek podgrzano przy ciągłym mieszaniu w celu rozpuszczenia składników.</li>
 <li>Około 8-10 ml tej pożywki w formie zawiesiny rozdzielono do plastikowych fiolek (średnica 2,5 cm x długość 8 cm) za pomocą pompy perystaltycznej firmy Jencons Scientific Ltd.</li>
 <li>Po zastygnięciu i ochłodzeniu zawiesiny pożywki do temperatury pokojowej, fiolki zamknięto korkiem z pianki bawełnianej. Fiolki z pożywką umieszczono w tacy, którą następnie szczelnie zamknięto w plastikowej torebce i przechowywano w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.</li>
</ol>
3. Pobieranie jaj w małej skali
<ol>
 <li>Około 50 par 2-3 dniowych dorosłych much przeniesiono w temperaturze 25 °C do świeżych fiolek z pożywką, na której powierzchni naniesiono dodatkowo suchy proszek drożdżowy, w celu złożenia embrionów.</li>
 <li>Następnie muchy przenoszono do świeżych fiolek co godzinę, pozostawiając embriony w fiolce na 30 minut, aby upewnić się, że część zebranych embrionów znajduje się w stadium 8-10 cyklu podziału jądra, kiedy jądra stopniowo migrują do kory i organizują się w pojedynczą warstwę. Materiał zebrany w pierwszej godzinie jest zazwyczaj odrzucany, ponieważ często zawiera starsze embriony, które pozostały w ciałach samic, gdy warunki nie były odpowiednie do składania jaj.</li>
</ol>
4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i przedmiotowych
<ol>
 <li>Wyjąć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 x 22 mm i za pomocą wilgotnego, cienkiego pędzla lekko zwilżyć niewielką ilością wody cztery narożniki jednej z jego stron, a następnie położyć je na szkiełku przedmiotowym w taki sposób, aby nakrywka nie przesuwała się pod wpływem napięcia powierzchniowego kapilarnego wywołanego cienką warstwą cieczy.</li>
 <li>Nanieść cienki pasek kleju w heptanie przez środek szkiełka nakrywkiego; heptan powinien odparować w ciągu kilku sekund, pozostawiając klej na nakrywce.</li>
 <li>Za pomocą rylca diamentowego pociąć inne szkiełko nakrywkowe na małe kwadraty (~1,5 mm2), podnieść jeden z nich i umieścić go na jednym końcu paska kleju (służy to do otwierania końcówki igły w przypadku konieczności mikroiniekcji), a pozostałe zachować do późniejszego użycia.</li>
 <li>Wziąć kolejne szkiełko przedmiotowe, przykleić do niego kawałek dwustronnej taśmy klejącej o długości około 2 cm i odkleić papier ochronny (patrz Rycina 2A i B).</li>
</ol>
5. Dechorionizacja zarodków
<ol>
 <li>Przenieś muchy do nowej fiolki z pożywką i za pomocą zwilżonego cienkiego pędzelka przenieś około 50 jaj na dwustronną taśmę klejącą na szkiełku, używając odpowiedniej ilości płynu, aby umożliwić rozprowadzenie jaj. Po odparowaniu płynu jaja przykleją się do taśmy.</li>
 <li>Pod mikroskopem stereotypowym kilkakrotnie dotknij jaj wzdłuż ich długiej osi, używając zewnętrznej strony jednej z odnóg pęsety, delikatnie aż do przerwania i otwarcia chorionu, pozostawiając jednak embrion w skorupce chorionu, aby zapobiec szybkiemu odwodnieniu. Kontynuuj ten proces, aż zostanie przygotowanych 10-20 jaj (w zależności od liczby jaj wymaganych do pojedynczego eksperymentu).</li>
 <li>Następnie embriony można podnieść, wyjąć ze skorupki chorionu i delikatnie układać pojedynczo na pasku kleju. Jaja można układać i wyrównywać tak, aby długa strona embrionu była równoległa lub antyrównoległa do długiej strony paska kleju, w zależności od tego, czy mają zostać poddane mikroiniekcji.</li>
 <li>Embriony można natychmiast przykryć odpowiednią ilością oleju Voltalef 10S (mieszanina oleju Holocarbon 700 i oleju 27 w stosunku 5:1, Sigma), aby zapobiec dalszemu wysychaniu przed niezwłocznym obrazowaniem, lub umieścić w komorze osuszającej na 3-8 minut w celu ich dalszego odwodnienia, w zależności od wilgotności pomieszczenia i celu eksperymentu. Odwodnione embriony należy przykryć olejem 10S, jeśli jest to odpowiednie, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu w przypadku konieczności wykonania mikroiniekcji. (Patrz Ryc. 2C, D i E).</li>
</ol>
6. Obrazowanie embrionów
<ol>
 <li>Obrazy z serii czasowej (time-lapse) lub pojedyncze zdjęcia żywych embrionów są pozyskiwane przy użyciu odwróconego systemu mikroskopii konfokalnej Leica TCS SP2 z obiektywem imersyjnym olejowym HCX PL APO CS 40X 1.25 (w zależności od celu eksperymentu można stosować obiektywy 60 lub 100X; im większe powiększenie, tym silniejszy efekt fotobleachingu).</li>
 <li>W przypadku obrazowania wielu fluoroforów o nakładających się widmach, które są koekspresjonowane w tym samym embrionie, długości fal emisji każdego białka fluorescencyjnego były rejestrowane sekwencyjnie. Długości fal wzbudzenia i emisji dostępne w systemie Leica TCS SP2 to: GFP, λEx: 488 nm i λEm: 500-600 nm; RFP, λEx: 543 nm i λEm: 555-700 nm.</li>
 <li>Pojedynczy obraz uzyskiwano zazwyczaj jako średnią z 2 linii skanowania przy średniej z 2 skanów klatek. Skanowanie obrazu o wymiarach 512x512 pikseli trwa minimum 6,3 sekundy w trybie skanowania jednoczesnego i 15,44 sekundy w trybie skanowania sekwencyjnego, co zapewnia korzystny stosunek sygnału do szumu. Czasy te należy uwzględnić podczas ustalania odstępów czasowych dla pozyskiwania obrazów time-lapse.</li>
 <li>Otwór pinhole był zazwyczaj ustawiony na 1-2 AU (jednostka Airy'ego), a moc lasera dostosowywano do najniższego możliwego poziomu, aby uniknąć istotnego fotobleachingu.</li>
</ol>
7. Wywołanie SAC poprzez mikroiniekcję odpowiednich odczynników do embrionów
<ol>
 <li>Przygotować igłę przed eksperymentem. Preferujemy wyciąganie igieł z sylikonyzowanych kapilar szklanych (GC-100-10, Harvard) przy użyciu wypalacza mikropipet (Sutter Instrument, Model: P-97) z parametrami: heat = 600, pull = 90, vel = 70, del = 150.</li>
 <li>Wypełnić igłę od tyłu 1-2 ml odczynnika o odpowiednim stężeniu w buforze do iniekcji, używając precyzyjnej końcówki do ładowania (20 μl Eppendorf lot: W215818J).</li>
 <li>Zamontować igłę w uchwycie na igłę w mikroskopie, podłączając rurkę ciśnieniową do systemu sterowania iniekcją Eppendorf.</li>
 <li>Znaleźć embrion pod obiektywem 40X i zlokalizować cień igły bez zmiany płaszczyzny ogniskowania, przesuwając igłę do centrum pola widzenia i stopniowo obniżając ją do właściwej płaszczyzny ogniskowej.</li>
 <li>Ostrożnie odsunąć embrion, aby odnaleźć mały kwadrat z rozbitego szkiełka nakrywkowego, zamontowany wcześniej na jednym końcu paska kleju. Bardzo delikatnie przesuwać końcówkę igły, aż dotknie ona krawędzi małego kwadratowego szkiełka nakrywkowego i delikatnie go przebije.</li>
 <li>Przesunąć embriony z powrotem do pola widzenia i wybrać embrion w odpowiednim wieku do iniekcji. Zazwyczaj wykonuję iniekcję embrionu w cyklu podziału jądrowego 5-7, ponieważ następuje to przed migracją jąder na zewnątrz do kory. Stadia cyklu podziału jądrowego można określić przed iniekcją poprzez szybkie skanowanie sygnałów fluorescencyjnych GFP-Cdc20 lub sygnału jądrowego RFP-Histone 2B9.</li>
 <li>Ostrożnie przesunąć embrion w pobliże igły i ponownie ustawić płaszczyznę ogniskowania zarówno dla embrionu, jak i igły. Wprowadzić igłę do embrionu, wstrzyknąć kroplę odczynnika w pożądane miejsce i odsunąć embrion (lub postępować zgodnie z instrukcją systemu mikroiniekcji). Iniekcję embrionu można przeprowadzić od strony tylnej lub bocznej, w zależności od celu eksperymentu.</li>
 <li>Po iniekcji embrion jest gotowy do obrazowania w odpowiednim czasie. (Patrz Rysunek 2F i G)</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Materiały do eksperymentu z drożdżami z szklaną lamellką, szkiełkiem podstawowym, pęsetą, skalpelem, taśmą, probówkami, kolbą." src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wymagane materiały: a. cienki pędzelek, b. mały kwadratowy pojemnik z potłuczonego szkła, c. lamellka 22 x 50 mm, d. szkiełko podstawowe, e. dwustronna taśma klejąca, f. proszek z suchych drożdży w probówce z otworami w zakrętce, g. granulat drożdżowy stosowany do utrzymania much, h. fiolka z pożywką dla much, i. połowa pęsety używanej do dechorionacji embrionów, j. pęseta, k. pojemnik z płynnym klejem heptanowym (kolba miarowa).
<img alt="Schemat mikroiniekcji zarodków przedstawiający konfigurację, rozmieszczenie zdechorionowanych zarodków, zastosowanie oleju oraz przygotowanie igły." src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematy przedstawiają przygotowanie szkiełek nakrywkowych i przedmiotowych w kroku 4, dechorionację zarodków w kroku 5 oraz przygotowanie igły do mikroiniekcji w kroku 7. A. Górny obrazek pokazuje szkiełko nakrywkowe z paskiem kleju heptanowego w poprzek środka oraz małym kwadratem z rozbitego szkiełka nakrywkowego przyklejonym do jednego z końców. Dolny obrazek przedstawia szkiełko przedmiotowe z cienką warstwą wody w czterech narożnikach służącą do utrzymania szkiełka nakrywkowego. Powodem zastosowania szkiełka przedmiotowego do podtrzymania szkiełka nakrywkowego jest zachowanie w przybliżeniu tej samej odległości ogniskowej, jaka występuje przy użyciu dwustronnej taśmy klejącej na szkiełkach, co pozwala uniknąć ponownego ustawiania ostrości mikroskopu podczas preparowania i przenoszenia zarodków między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym. B. Szkiełko przedmiotowe z krótkim odcinkiem dwustronnej taśmy Scotch przyklejonej przed zdjęciem papierowej osłony, użyte do dechorionacji zarodka. C. Obrazek po lewej przedstawia zarodki z nienaruszonymi otoczkami chorionowymi z zaznaczonymi końcami przednim i tylnym; obrazek po prawej pokazuje zarodki w rozbitych otoczkach chorionowych przed ich przeniesieniem na szkiełko nakrywkowe z paskiem kleju. D &amp; E. Schematy przedstawiające dwa sposoby przenoszenia, rozmieszczania i wyrównywania zdechorionowanych zarodków na paskach kleju. Zarodki zostały przykryte olejem 10S po odpowiednim czasie przesychania. F &amp; G. Schematy pokazujące sposób otwierania końcówki igły i jej pozycjonowania w celu wykonania iniekcji.
Pojedyncze obrazy lub obrazy z serii czasowej uzyskane w opisanych powyżej eksperymentach mogą być bezpośrednio analizowane przy użyciu oprogramowania Leica lub zapisane w plikach .TIF jako format otwarty, dostępny do dalszej kwantyfikacji lub analiz edycyjnych z wykorzystaniem innych popularnych programów do analizy obrazu, takich jak Image J, Photoshop, MetaMorph itp. Poniżej omówiono dwa przykłady ilustrujące tę procedurę:
Przykład 1: Film typu time-lapse (Rysunek 3) przedstawia dynamiczny rekrutowanie GFP-Cdc20 do kinetochorów oraz ruch chromosomów w żywych embrionach syncytialnych Drosophila. Obszar zainteresowania z oryginalnych obrazów sekwencji time-lapse został wyznaczony/zredagowany i przekonwertowany automatycznie w trybie wsadowym przy użyciu oprogramowania Photoshop. Film zmontowano przy użyciu oprogramowania QuickTime.
<img alt="Sekwencja faz mitozy, ekspresja GFP-Cdc20, wizualizacja DNA; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Film time-lapse przedstawiający dynamiczną rekrutację GFP-Cdc20 do kinetochorów oraz ruch chromosomów w żywych embrionach syncytialnych Drosophila. (A) Obrazy time-lapse zostały wykonane z transgenicznego embrionu syncytialnego koekspresującego białka fuzyjne GFP-Cdc20 (kolor zielony) i RFP-Histone 2B (kolor czerwony) i zarejestrowane przy użyciu konfokalnego systemu Leica TCS SP2 w temperaturze 18 °C podczas cykli podziału jądrowego 7-8. Klatki były pobierane co 10 sekund. Klatkę z komórkami będącymi już w profazie przyjęto za punkt czasowy zero10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić film do Rysunku 3A</a>. (B) GFP-Cdc20 można łatwo zaobserwować w kinetochorach w profazie i prometafazie (B3 i 4, białe strzałki), a białko to utrzymuje się w kinetochorach w metafazie i anafazie (B5 i 6, białe strzałki). GFP-Cdc20 jest wykluczone z jądra w interfazie (biała grot strzałki), wnikając do jądra we wczesnej profazie. Morfologię chromatyny określono przy użyciu koekspresowanego His2BmRFP jako markerów (B8-14). Paski = 5mm.
Przykład 2: Funkcje SAC można badać poprzez manipulację zarodkami za pomocą mikroiniekcji przeciwciał, białek znakowanych fluorescencyjnie lub interesujących związków chemicznych, które potencjalnie wyzwalają SAC. Przykładem jest iniekcja kolchicyny w celu depolimeryzacji mikrotubul, co wywołuje SAC, jak pokazano na Ryc. 410.
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna wykazująca GFP-Cdc20 i GFP-Mad2 w komórkach drożdży mad2 traktowanych kolchicyną." src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Mad2 jest niezbędny dla funkcji SAC wywołanej kolchicyną10. Zarodki gfp-cdc20; mad2+/+, gfp-cdc20; mad2EY (mutant null mad2-/-) oraz gfp-mad2; mad2EY zostały poddane działaniu kolchicyny za pomocą mikroiniekcji. Obrazy konfokalne time-lapse wykonano przed (01, 07 i 13) lub po iniekcji (02-06, górne panele; 08-12, środkowe panele; 14-18, dolne panele). Sygnały GFP-Cdc20 (panele górny i środkowy) lub GFP-Mad2 (panel dolny) w kinetochorach posłużyły jako markery progresji cyklu komórkowego. Panel górny: strzałki wskazują zablokowane kinetochory w 02-06. Obszar zaznaczony strzałką w 01 wskazuje, że przed traktowaniem kolchicyną GFP-Cdc20 jest wykluczony z jądra w późnej interfazie. Panel środkowy: w przypadku braku endogennego Mad2 sygnały GFP-Cdc20 nadal oscylują wewnątrz i na zewnątrz jądra oraz pojawiają się i znikają w kinetochorach, mimo że cytokineza wydaje się być zaburzona (co jest oczekiwane w zarodkach pozbawionych mikrotubul w obecności kolchicyny, wskazane strzałkami w 07-12), co sugeruje brak funkcji SAC w zatrzymywaniu komórek w odpowiedzi na traktowanie kolchicyną. Separacja jąder potomnych nie powiodła się na obrazie 10. Panel dolny: groty strzałek w 14-18 wskazują zablokowane kinetochory z nagromadzonymi białkami fuzyjnymi GFP-Mad2, co sugeruje funkcjonalność GFP-Mad2 w ratowaniu fenotypu defektu SAC w zarodku mutanta Mad2. Grot strzałki w 13 wskazuje akumulację GFP-Mad2 w jądrze w późnej interfazie. Skala=5mm. Do zarodków wstrzyknięto mikroiniekcyjnie objętość odpowiadającą ~1% objętości jaja z roztworu zapasowego kolchicyny 100mg/ml w 1 x PBS.

<ol><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li>
<li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy%2C+chromosomal+missegregation%2C+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li>
<li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+a+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li>
<li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC%2FC+inhibition+by+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li>
<li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li>
<li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+binding+of+p31%28comet%29+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li>
<li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC%2Fcyclosome+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li>
<li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein%2Fdynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li>
<li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li>
<li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li>
<li>Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaress%2C+RE+%22DNA+cloning%3A+A+practical+approach%22">DNA cloning: A practical approach</a>. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).</li>
<li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li>
<li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC%2FC%3A+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li>
<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+Fzy%2FCdc20+and+Fzr%2FCdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382(2009).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503(2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest ogólną metodą obrazowania zarodków syncytialnych muszki za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS SP2; można go zmodyfikować tak, aby dostosować go do innych systemów mikroskopowych, a także zaadaptować do badania funkcji innych genów z wykorzystaniem zarodków syncytialnych Drosophila. Wykorzystaliśmy ten protokół do badania wielu aspektów punktu kontrolnego montażu wrzeciona, dynamiki białek oraz proteolizy białek, używając much transgenicznych lub przeciwciał poliklonalnych w celu wizualizacji lokalizacji białek w próbkach żywych lub utrwalonych4,6,12-14.
W przypadku zbierania niewielkiej liczby jaj (~10 - 100) najprościej jest utrzymywać muchy w fiolkach ze świeżą pożywką. Pozwala to uniknąć kłopotów z przygotowywaniem dodatkowych szalek z agarem z soku jabłkowego oraz komór do zbierania jaj, jak opisano w innych publikacjach15,16. Dodanie małego kwadratu potłuczonego szkła okrywek na jednym końcu paska kleju na okrywce znacznie ułatwia otwarcie igły i ustalenie objętości iniekcji poprzez regulację ustawień systemu mikroiniekcyjnego podczas zanurzenia igły w oleju 10S. Stopień wysuszenia zarodka jest kluczowy dla sukcesu iniekcji w celu uniknięcia wycieków i utrzymania żywotności zarodków, szczególnie w eksperymentach wymagających długiego czasu lub podczas hodowli transformantów po iniekcji. Nie istnieje jednak jedna uniwersalna zasada określająca dokładny czas wymaganego wysuszania. Zmienia się on w zależności od konkretnego eksperymentu, ilości wstrzykniętego roztworu oraz wilgotności środowiska pracy.
Funkcje konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania można manipulować poprzez mikroiniekcję specyficznych inhibitorów białek, przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwko konkretnemu białkowi, mRNA lub peptydów znakowanych fluorescencyjnie w warunkach typu dzikiego lub w tle mutacji genetycznych. Wiele z tych linii mutantów lub linii transgenicznych znakowanych GFP jest publicznie dostępnych w centrach zasobów Drosophila, a większość z nich jest wymieniona w bazie Flybase (<a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/</a>) i można ich szukać online.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Niezbędny sprzęt i odczynniki:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o przesłanie tekstu źródłowego (jove_content), który należy przetłumaczyć. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi.&quot;&gt;&lt;silny&gt;System obrazowania konfokalnego:&lt;/strong&gt; System obrazowania opisany w niniejszym protokole to inwertowany konfokalny mikroskop skaningowy z laserem Leica TCS SP2. Opisana metoda jest odpowiednia, być może po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji, również dla innych systemów obrazowania.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy, który należy przetłumaczyć.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Mikroskop stereoskopowy:&lt;/strong&gt; Używamy mikroskopu Olympus SZX7 z obiektywem DF PLAPO 1X-4.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy, który należy przetłumaczyć. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przygotowania rzetelnego przekładu na język polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i precyzji terminologicznej.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Ekstraktor igieł:&lt;/strong&gt; Wypalarka/brązowa wypalarka mikropipet (firmy Sutter Instrument, model: P-97).&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy przetłumaczyć materiały na język polski, zachowując ścisłą dokładność terminologiczną, akademicki rejestr oraz naturalną strukturę protokołów badawczych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;System do mikroiniekcji:&lt;/strong&gt; Opisano system mikroiniekcji firmy Eppendorf, jednak można zastosować każdy inny odpowiedni system.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy (jove_content), który należy przetłumaczyć. Jestem gotowy do wykonania tłumaczenia zgodnie z Twoimi szczegółowymi wytycznymi dotyczącymi rejestru naukowego, terminologii i stylu protokołów laboratoryjnych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Dystrybutor pożywki dla muszek:&lt;/strong&gt; Pompa perystaltyczna Jencons Scientific Ltd.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Odczynniki:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Mączka kukurydziana</td><td>SUMA, Wielka Brytania</td><td></td><td>100,0 g</td></tr><tr><td>Brązowy cukier</td><td>Billington&amp;#8217;s, UK</td><td></td><td>50,0 g</td></tr><tr><td>Drożdże suche</td><td>DCL YEAST Ltd. UK</td><td></td><td>25,0 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>106556</td><td>12,5 g</td></tr><tr><td> Kwas sorbowy</td><td>BDH, VWR International Ltd. UK</td><td>8829310</td><td>0,4 g</td></tr><tr><td>Kwas benzoesowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>1019599</td><td>2,9 g</td></tr><tr><td>Nipagin (metylo-4-hydroksybenzoesan)</td><td>BDH, VWR International Ltd. UK</td><td>K35969015</td><td>0,9 g</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;do 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Składniki pożywki dla much.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do przetłumaczenia. Oczekuję na treść z JoVE, którą mam przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.&quot;&gt;Oleje Holocarbon 700 oraz 27 zakupione w firmie Sigma.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Prosimy o przesłanie treści źródłowej do tłumaczenia. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego przekładu materiałów JoVE na język polski, zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji naukowej i terminologii specjalistycznej.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Drożdże suche:&lt;/strong&gt; Thomas Allison, Wielka Brytania.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o przesłanie treści źródłowej (angielskiej), którą należy przetłumaczyć. Gdy tylko otrzymam tekst, przygotuję profesjonalne tłumaczenie na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji naukowej i terminologii specjalistycznej JoVE.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Przygotowanie kleju heptanowego:&lt;/strong&gt; Odciąć około 1,5 metra dwustronnej taśmy Scotch, umieścić ją w probówce Falcon o pojemności 15 ml z 5 ml heptanu i inkubować w rotatorze przez 3–5 godzin lub przez noc. Po tym czasie podzielić roztwór na 4 równe alikwoty w probówkach wirówkowych Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 min z dużą prędkością w wirówce stołowej w celu usunięcia zanieczyszczeń. Roztwór kleju w heptanie przechowywać w kolbie miarowej o pojemności 10 ml do późniejszego użycia. Wytrzymałość kleju będzie różnić się w zależności od stężenia i ilości użytego kleju. Zazwyczaj cieńsza warstwa kleju pozwala uzyskać niższy poziom szumu tła podczas obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;szkiełko nakrywkowe:&lt;/em&gt; BDH, VWR International Ltd. UK&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Przedmiot szkiełko:&lt;/em&gt; BDH, VWR International Ltd. UK&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Kapiilary szklane silikonizowane:&lt;/em&gt; GC-100-10, Harvard&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Precyzyjny końcówka do nakładania:&lt;/em&gt; 20&amp;mu;lot eppendorf: W215818J&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pinceta&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pędzel w formie cienkiego pisaka&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych drosophila

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Mechanizm punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC) jest aktywnym sygnałem monitorującym interakcję między kinetochorami chromosomów a mikrotubulami wrzeciona, aby zapobiec rozpoczęciu anafazy do momentu prawidłowego połączenia chromosomów. Komórki wykorzystują ten mechanizm w celu zapobiegania aneuploidii lub niestabilności genomicznej, a w konsekwencji nowotworom oraz innym ludzkim schorzeniom, takim jak wady rozwojowe czy choroba Alzheimera.1Zidentyfikowano szereg komponentów SAC, takich jak Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod i kinaza Aurora B, z których wszystkie są dynamicznymi białkami kinetochorowymi.2Dowody sugerują, że to w kinetochorze inicjowany jest sygnał SAC. Głównym celem regulacyjnym SAC jest Cdc20. Cdc20 jest jednym z niezbędnych komponentów APC/C (Anafaza Ppromowanie Człożony lub Caktywatory cyklosomów3 i jest również dynamicznym białkiem kinetochoru4-6Po aktywacji SAC hamuje aktywność APC/C, aby zapobiec degradacji dwóch kluczowych substratów – cykliny B oraz sekuryny – co w konsekwencji zapobiega przejściu z metafazy do anafazy.7,8Dokładny mechanizm inicjacji i składania sygnału SAC na kinetochorach oraz jego przekazywania do kompleksu APC/C w celu zahamowania jego funkcji wciąż pozostaje niejasny.
Drosophila jest niezwykle podatnym systemem eksperymentalnym; jest to organizm znacznie prostszy i lepiej poznany niż człowiek, a jednocześnie dzielący z nim fundamentalne procesy. Jest on prawdopodobnie jednym z najlepszych organizmów do badań z zakresu obrazowania biologicznego w żywych komórkach, zwłaszcza do wizualizacji zdarzeń mitotycznych w przestrzeni i czasie, ponieważ wczesny embrion przechodzi przez 13 szybkich, synchronicznych cykli podziałów jądrowych (8-10 minut na każdy cykl w 25 °C) i stopniowo organizuje jądra w pojedynczej warstwie bezpośrednio pod korą9.
W niniejszym materiale przedstawiam metodę obrazowania biologicznego z wykorzystaniem transgenicznych muszek Drosophila wykazujących ekspresję GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) lub jego wariantów ukierunkowanych na białka zainteresowania oraz konfokalnego systemu skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS SP2 w celu zbadania funkcji SAC u muszek, posługując się jako przykładem obrazami białek fuzyjnych GFP niektórych komponentów SAC, takich jak Cdc20 i Mad2.

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Mechanizm punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC) jest aktywnym sygnałem, który monitoruje interakcję między kinetochorami chromosomów a wrzecionem...

Celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie wizualizacji dynamiki białek in vivo oraz wzorców ich lokalizacji w żywych embrionach Drosophila za pomocą konfokalnej mikroskopii time-lapse. W pierwszej kolejności pobiera się embriony z utrzymywanych linii Drosophila. Następnie embriony przenosi się na szkiełko podstawowe, a potem ręcznie usuwa się z nich otoczki, aby uzyskać odsłonięte embriony.Następnie próbki są w sposób uporządkowany montowane na wcześniej przygotowanych szkiełkach i, w zależności od eksperymentu, mogą zostać poddane mikroiniekcji odpowiednich odczynników indukujących punkt kontrolny wrzeciona. Ostatnim krokiem w tej procedurze jest wykonanie obrazowania poklatkowego embrionów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. W końcowej fazie mikroskopia poklatkowa i ogniskowa służą do wykazania białek punktu kontrolnego wrzeciona, kolokalizacji zachowań chromosomów oraz wpływu czynników indukujących punkt kontrolny w transgenicznych liniach oph związanych z punktem kontrolnym.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji ME, takie jak wpływ mutacji lub deplecji białek punktu kontrolnego wrzeciona (przy użyciu linii genicznych) na kolokalizację pozostałych komponentów punktu kontrolnego oraz konsekwencje tego zjawiska dla zdolności punktu kontrolnego montażu wrzeciona do efektywnego funkcjonowania. Muchy transgeniczne utrzymuje się w temperaturze 25 °C w plastikowych fiolkach zawierających pożywkę dla much, z dodatkowym suchym proszkiem drożdżowym na wierzchu. Fiolki są rutynowo wymieniane co dwa do trzech tygodni, w zależności od warunków hodowli.Aby przygotować pożywkę dla muszek, podgrzać odpowiednią ilość mieszanki pożywki przy ciągłym mieszaniu w celu rozpuszczenia składników, używając pompy perystaltycznej, a następnie rozdzielić od 8 do 10 ml tej pożywki w formie zawiesiny do każdej plastikowej probówki. Gdy zawiesina pożywki stężeje i osiągnie temperaturę pokojową, każdą probówkę zamknąć watowanym korkiem. Umieścić probówki z pożywką w tacy, szczelnie zamknąć w plastikowym worku i przechowywać w temperaturze 4°C w celu zbierania jaj na małą skalę.Przenieś około 50 par dorosłych much w wieku od dwóch do trzech dni do świełej fiolki z pożywką, na której powierzchni należy umieścić dodatkowy suchy proszek drożdżowy w celu umożliwienia składania zarodków. Inkubuj w temperaturze 25 °C, która w tym przypadku jest utrzymywana przez klimatyzację pomieszczenia. Co godzinę przenoś muchy do nowej fiolki, pozostawiając zarodki na 30 minut.Aby upewnić się, że część zebranych embrionów znajdowała się w okolicach ósmego do dziesiątego cyklu podziału jądra. Materiał zebrany w pierwszej godzinie jest zazwyczaj odrzucany, ponieważ często zawiera starsze embriony, które pozostały w ciałach samic w czasie, gdy warunki nie były odpowiednie do składania jaj. W związku z tym w niniejszych eksperymentach wykorzystane zostaną wyłącznie embriony z transferów dokonanych od drugiej godziny wzwyż.W tej procedurze wykorzystuje się szkiełka podstawowe oraz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 50 by 22 milimetr. Należy rozpocząć od wzięcia szkiełka nakrywkowego i za pomocą wilgotnego, cienkiego pędzla lekko zwilżyć niewielką ilością wody cztery narożniki jednej z jego stron. Następnie należy położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.Napięcie powierzchniowe kapilarne wywołane przez cienką warstwę cieczy powinno zapobiegać przesuwaniu się szkiełka nakrywki. Nanieś cienki pasek kleju w heptanie przez środek szkiełka nakrywki. Heptan powinien odparować w ciągu kilku sekund, pozostawiając klej na szkiełku nakrywce.Następnie za pomocą rylca diamentowego należy pociąć kolejną lamellkę na małe kwadraty o boku około 1.5 mm. Jeden kwadrat należy podnieść i umieścić na jednym końcu paska kleju. Będzie on służyć do otwierania końcówki igły w przypadku konieczności przeprowadzenia mikroiniekcji.Należy wziąć kolejne szkiełko przedmiotowe, przykleić do niego dwucentymetrowy kawałek dwustronnej taśmy klejącej i odkleić papier ochronny, aby rozpocząć procedurę powlekania embrionów. Przenosi się muchy do nowej fiolki z pożywką za pomocą wilgotnego i cienkiego pędzelka. Na dwustronną taśmę klejącą na przygotowanym szkiełku przenosi się około 50 jaj.Użyć odpowiedniej ilości cieczy, aby umożliwić rozprowadzenie jaj. Po odparowaniu cieczy jaja przylgną do taśmy pod mikroskopem stereoskopowym. Delikatnie dotykać jaj kilka razy wzdłuż ich długiej osi zewnętrzną stroną jednej z okładzin pęsety, aż chorion zostanie przerwany i otwarty.Pozostaw zarodek w skorupce Corian, aby zapobiec szybkiemu odwodnieniu. Kontynuuj ten proces, aż zostanie opracowanych od 10 do 20 jaj. Następnie wyjmij zarodki ze skorupki Corian pojedynczo i delikatnie przenieś je na pionowy pasek.Na pasku klejącym. Ustaw zarodki tak, aby ich dłuższy bok był antyrównoległy do dłuższego boku paska klejącego. Umieść zarodki w komorze do wysuszania na czas od trzech do ośmiu minut.Na koniec pokryć zarodki odpowiednią ilością oleju mineralnego, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu przed mikroiniekcją. Mikroiniekcja jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Aby maksymalnie ułatwić i usprawnić proces mikroiniekcji, należy ściśle przestrzegać protokołu przygotowania slajdów.Zarodki muszą zostać starannie przygotowane, aby znajdowały się w optymalnym stanie do mikroiniekcji. Igły do mikroiniekcji zarodków należy przygotować wcześniej. Używając cienkiej końcówki do ładowania, należy napełnić igłę od 1 do 2 µL odczynnika o odpowiednim stężeniu w buforze do iniekcji.Zamocuj igłę w uchwycie do igieł w odwróconym mikroskopie konfokalnym Leica TCSP dwa, z rurką ciśnieniową podłączoną do systemu sterowania wtryskiem. Znajdź embrion przy użyciu obiektywu 40x. Następnie, bez zmiany płaszczyzny ogniskowania, zlokalizuj cień igły.Osiąga się to poprzez przesunięcie igły do centrum pola widzenia i stopniowe obniżanie jej do prawej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuń stoлик mikroskopu, aby zlokalizować mały kwadrat szkiełka nakrywki, zamontowany uprzednio na jednym końcu paska kleju. Bardzo delikatnie przesuwaj końcówkę igły, aż dotknie ona krawędzi małego kwadratowego szkiełka nakrywki i delikatnie je rozbije.Przesuń stolik, aby zarodki ponownie znalazły się w polu widzenia, i wybierz zarodek w odpowiednim wieku do iniekcji. Ostrożnie przesuń zarodek blisko igły i ponownie ustaw płaszczyznę ogniskowania zarówno dla zarodka, jak i dla igły. Wprowadź zarodek do igły.Wstrzyknij kroplę odczynnika w bok embrionu, a następnie odsuń embrion. Obrazy z odstupami czasowymi lub pojedyncze obrazy żywych embrionów są rejestrowane przy użyciu odwróconego systemu mikroskopii konfokalnej Leica TCSS SP z obiektywem imersyjnym olejowym 40x. W przypadku obrazowania wielu fluoroforów o nakładających się widmach, które są współwyrażane w tym samym embrionie, długość fali emisji każdego białka fluorescencyjnego jest rejestrowana sekwencyjnie.Obrazy pojawiły się później podczas ustawiania ram czasowych dla obrazowania poklatkowego. Należy wziąć pod uwagę te czynniki. Pojedynczy obraz jest zazwyczaj uzyskiwany jako średnia z dwóch linii skanowania.Przy średnio dwóch skanowaniach klatki, skanowanie obrazu o rozmiarze 512 na 512 pikseli w trybie skanowania jednoczesnego trwa minimum 6,3 sekundy, a w trybie skanowania sekwencyjnego 15,44 sekundy, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu. Pinhole jest zazwyczaj ustawiony na 1 do 2 au (jednostek Airy'ego), a moc lasera jest dostosowana do najniższego możliwego poziomu, aby uniknąć istotnego fotobielenia. Ten reprezentatywny film poklatkowy przedstawia dynamiczną rekrutację rdzenia kinetycznego CDC 20 oraz ruch chromosomów w żywych embrionach ophis cial.Obrazy z serii czasowej zostały wykonane z zarodka transgenicznego wykazującego koekspresję G-F-P-C-D-C 20, widocznego w kolorze zielonym, oraz RFP his stone two B, widocznego w kolorze czerwonym. Podczas cykli podziału jądra wykonano od siedmiu do ośmiu klatek co 10 sekund, a klatkę z komórkami znajdującymi się już w profazie przyjęto jako punkt zerowy. Rysunek ten przedstawia klatki z filmu z serii czasowej; G fp CDC 20 jest wyraźnie widoczny w kinetochorach w profazie i prometafazie, co wskazują białe strzałki odpowiednio na obrazach trzy i cztery, a następnie utrzymuje się w kinetochorach w metafazie i anafazie, co zaobserwowano odpowiednio na obrazach pięć i sześć.G-F-P-C-D-C 20 jest wykluczony z jądra interfazowego wskazanego białą grotą strzałki na obrazie pierwszym i wnika do jądra we wczesnej profazie, jak pokazano na obrazie drugim. Na obrazach od ósmego do czternastego morfologię chromatyny określono przy użyciu współwyrażonego RFP histone two B jako zlewanych markerów. Obrazy przedstawiono w dolnym rzędzie.Korzystając z niniejszego protokołu, funkcje punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC) można badać poprzez manipulację zarodkami za pomocą mikroiniekcji przeciwciał, białek znakowanych fluorescencyjnie lub interesujących związków chemicznych, które potencjalnie aktywują SAC. W tym przykładzie zarodki poddano działaniu kolchicyny w celu depolimeryzacji mikrotubul, wywołując tym samym SACG FP CDC 20 lub GFP MAD. Jako markery postępu cyklu komórkowego wykorzystano dwa kinetyczne sygnały rdzenia.Na górnym panelu ARES wskazują na zatrzymane esci na obrazach od drugiego do szóstego. Obszar zaznaczony strzałką na pierwszym obrazie wskazuje, że przed traktowaniem kolchicyną G-F-P-C-D-C 20 jest wykluczony z jądra w późnej interfazie. Obrazy na środkowym panelu pokazują, że w przypadku braku endogennego MAD dwa G-F-P-C-D-C 20, wskazane strzałkami na obrazach od siódmego do dwunastego, nadal oscylują wewnątrz i na zewnątrz jądra oraz włączają się i wyłączają w przebiegu kinetycznym.Choć cytokineza wydaje się być zaburzona, sugeruje to niewydolność funkcji SAC w zatrzymywaniu komórek w odpowiedzi na traktowanie kolchicyną. Przykład niepowodzenia separacji jąder potomnych widoczny jest na obrazie 10. W końcu, w dolnym panelu groty strzałek na obrazach od 14 do 18 wskazują spoczywające rdzenie kinetyczne z nagromadzonymi białkami fuzyjnymi GFP MA two, co sugeruje, że funkcjonalne GFP MA two niweluje fenotyp defektu sac w embrionie mutanty MA two.Grot strzałki na obrazie 13 wskazuje akumulację GFP MAD 2 w jądrze w późnej fazie interfazy. Po obejrzeniu tych materiałów wideo powinni Państwo dobrze rozumieć, jak pozyskiwać embriony z utrzymywanych szypułek, manualnie oddzielać embriony przed przygotowaniem preparatów do mikroiniekcji oraz przeprowadzać obrazowanie czasu rzeczywistego in vivo przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

studying-mitotic-checkpoint-illustrating-dynamic-kinetochore-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez ilustrowanie dynamicznego zachowania białek kinetchoru i ruchu chromosomów w żywych Drosophila zarodkach syncytialnych

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Poznaj dynamikę białek punktu kontrolnego wrzeciona w żywych zarodkach Drosophila przy użyciu mikroskopii konfokalnej time-lapse. Ta metoda umożliwia badanie lokalizacji białek kinetochoru i ruchu chromosomów w czasie rzeczywistym.

Badanie mitotycznego punktu kontrolnego poprzez zilustrowanie dynamicznego zachowania białek kinetochoru i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów