Name: Uproszczona technika wycinania in situ rogówki i patroszenia tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Naucz się uproszczonej techniki wycinania rogówki i patroszenia siatkówki z ludzkiego gałki ocznej. Metoda zachowuje jakość tkanek do transplantacji i badań, minimalizując uszkodzenia struktur okularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została częściowo sfinansowana z grantów Regione Veneto (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 oraz Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). Autorzy dziękują dr. C. Griffonemu za podsumowanie danych z lat 2009/2010 dotyczących wykorzystania ludzkich gałek ocznych.

1. Wycięcie rogówki z gałek ocznych in situ
<ol>
 <li>Włącz szafę z laminarnym przepływem powietrza około 15 minut przed użyciem. Oczyść komorę z laminarnym przepływem powietrza, używając 70% alkoholu izopropylowego. Załóż odzież ochronną, taką jak czepka chirurgiczna i maseczka. Umyj dłonie i przedramiona, a następnie osusz je za pomocą sterylnego ręcznika. Załóż sterylne rękawiczki oraz fartuch lub rękawy, stosując technikę aseptyczną. </li>
 <li>Przygotuj pole sterylne, kładąc aseptycznie sterytelną tackę na narzędzia. Zweryfikuj, czy narzędzia są sterylne. Otwórz sterylny zestaw narzędzi i przełóż go na pole sterylne, unikając zanieczyszczenia. </li>
 <li>Ułóż wszystkie materiały i narzędzia sterylne (Tabela 2) wraz z słoikami zawierającymi gałki oczne tak, aby znajdowały się one przy krawędzi pola sterylnego dla łatwiejszego dostępu. </li>
 <li>Oznacz słoiki wcześniej przygotowanym medium do konserwacji/przechowywania, zgodnie z Tabela 3, i ustaw je na powierzchni komory z laminarnym przepływem powietrza wraz z I-PVP (jodopowid논em), tiosiarczanem sodu i sterylnym roztworem soli PBS (bufor solny z fosforanem). </li>
 <li>Pozostaw tkanki oczne i roztwory do osiągnięcia normalnej temperatury pokojowej, ponieważ są one przechowywane w lodówkach w temperaturze 4 °C. Unikaj wielokrotnych cykli ogrzewania i chłodzenia. Połóży pokrywki od roztworów i słoików z oczami stroną wewnętrzną do góry obok odpowiednich słoików. </li>
 <li>Wyjmij gazy i gąbki ze słoika z okiem za pomocą sterylnej pęsety. Zanurz gałkę w sterylnym I-PVP 0,5% na 2 minuty w celu odkażenia gałek ocznych. Połóż dwie pęsety na pokrywie sterylnej tacki, poza polem sterylnym. Przenieś gałkę do tiosiarczanu sodu 0,1% na 1 minutę, używając drugiej pary sterylnych pęset. Tą samą pęsetą przenieś gałkę do słoika zawierającego sterylny roztwór soli (PBS) i pozostaw ją do czasu operacji. Powtórz tę samą procedurę dla drugiej gałki ocznej od tego samego dawcy. </li>
 <li>Pracując pod komorą z laminarnym przepływem powietrza, owiń gałkę sterylną gazą (bandażami), pozostawiając niezasłoniętą rogówkę oraz około 5 mm twardówki od rogówki. Gałkę oczną można po prostu trzymać w dłoni, wywierając odpowiedni nacisk. Tkanka powinna pozostawać wilgotna przez cały czas trwania operacji. </li>
 <li>Użyj pęsety wraz z nożyczkami, aby usunąć ewentualne pozostałości spojówki. Narzędzia użyte do powyższej operacji przechowuj oddzielnie od innych instrumentów. Użyj ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie twardówki w odległości 3-4 mm od regionu limbusa, a następnie rozszerz nacięcie o 360°, unikając perforacji tkanki naczyniowej pod nią lub spowodowania jakiejkolwiek deformacji normalnej krzywizny rogówki. Wykonaj cztery duże nacięcia, pozostawiając cztery małe przerwy, aby uniknąć wycieku ciała szklistego. Wszystkie cztery przerwy należy wyciąć tak, aby nie usunąć żadnej innej tkanki. </li>
 <li>Obecność małych blaszek twardówki może utrudniać cięcie, dlatego należy upewnić się, że wycięcie twardówki zostało ukończone za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych. Operację tę należy przeprowadzić bez uszkodzenia błony naczyniowej, siatkówki i ciała szklistego. </li>
 <li>Sprawdź nacięcie, aby upewnić się, że jest kompletne. Jeśli nacięcie zostało wykonane prawidłowo, pierścień rogówkowo-twardówkowy przylega do ciał rzęsistych tylko w punkcie odpowiadającym rogówce. </li>
 <li>Połóż owiniętą gałkę oczną blisko środka pola sterylnego. Dokończ usuwanie rogówki, używając pęsety do unieruchomienia pierścienia twardówki, a ręką używaną do wycięcia odciągnij ciało rzęsiste i błonę naczyniową w dół i w stronę przeciwną do guzika rogówkowo-twardówkowego. </li>
 <li>Delikatnie oddziel wszelkie pozostałe zrosty od guzika rogówkowo-twardówkowego. Nie ciągnij pierścienia rogówkowo-twardówkowego w sposób, który mógłby spowodować napięcie poprzeczne rogówki, ani nie dopuść do jego opadnięcia z powrotem do przedniej komory. </li>
 <li>Gęstość komórek endotelialnych rogówki sprawdza się za pomocą roztworu hipotonicznego, a śmiertelność komórek sprawdza się za pomocą barwienia błękitem trypanu przez około 1 min, a następnie komórki są liczone pod mikroskopem optycznym i mierzone jako komórki/mm2. Przednia komora powinna być skierowana w stronę pokrywki, a tylna w stronę dna płytki Petriego. Gęstość komórek endotelialnych można liczyć ręcznie, używając siatki w obiektywie przy powiększeniu 100X. Minimalna akceptowalna liczba komórek do transplantacji we Włoszech wynosi 2200 komórek endotelialnych/mm2. </li>
 <li>Przenieś pierścień rogówkowo-twardówkowy za pomocą kleszczyków rogówkowych do wcześniej przygotowanego medium do przechowywania rogówek utrzymywanego w RT (temperaturze pokojowej), jak pokazano w Tabela 3. </li>
 <li>Zbadaj tylną komorę pod kątem obecności naturalnej soczewki krystalicznej. Jeśli twardówka jest przygotowana, usuń z gałki wszystkie pozostałości naczyniówki i ciała szklistego. Ostrożnie rozwiń i zwróć pozostały segment tylny do odpowiedniego słoika z okiem, stosując technikę aseptyczną. Powtórz procedurę dla drugiej gałki, używając nowych narzędzi. Zamocuj rogówkę kleszczykami rogówkowymi i przechowuj w medium do przechowywania (hodowla organów) w temperaturze 31 °C. Wycięta rogówka, jak pokazano na Rysunek 1a, może być następnie użyta do keratoplastyki lub badań.</li>
 <li>Utylizuj zbędne materiały i odpady biologiczne w odpowiednich pojemnikach na odpady. Po zakończeniu pracy oczyść obszar roboczy za pomocą sprayu z 70% alkoholu izopropylowego. </li>
 <li>Jeśli po 28 dniach rogówka zachowuje wszystkie parametry oceny [takie jak morfologia, liczba komórek, przejrzystość, grubość i testy mikrobiologiczne – bakteryjne i grzybicze przy użyciu instrumentu Bactec 9240 (Becton Dickinson, Mediolan, Włochy)], może zostać przetransportowana do szpitali przy użyciu medium transportowego opisanego w Tabela 4. Rogówka powinna zostać przeniesiona z medium do przechowywania do medium transportowego w szafie z laminarnym przepływem powietrza. </li>
 <li>Ponieważ podczas przechowywania rogówka staje się grubsza niż jej zwykły rozmiar wymagany do transplantacji, banki oczu stosują środki przeciwobrzękowe w celu zmniejszenia grubości. Używamy 6% dekstranu T500, aby przywrócić rogówce normalny rozmiar w medium transportowym. Chociaż można by użyć dekstranu T500 w stężeniu 4-8%, stężenie 6% sprawdziło się u nas najlepiej. Ułatwia to chirurgom transplantację rogówki natychmiast po jej otrzymaniu. </li>
</ol>
2. Ewisceracja siatkówki z gałki ocznej po wycięciu rogówki
<ol>
 <li> Po wycięciu rogówka zostaje wybrana do transplantacji lub badań na podstawie jej morfologii oraz gęstości komórek śródbłonka, a następnie umieszczona w medium do przechowywania lub konserwacji w temperaturze 31 °C. Pozostała część gałki ocznej jest następnie przetwarzana do dalszych zastosowań, takich jak izolacja twardówki do celów chirurgicznych, siatkówki do badań itp.</li>
 <li> Przed wycięciem siatkówki należy upewnić się, że gałka oczna jest nienaruszona i usunięto jedynie rogówkę wraz z fragmentem twardówki. W przypadku wycieku żelatynowatego ciała szklistego usunięcie tkanki siatkówki staje się utrudnione.</li>
 <li> Jeśli dawca ma mniej niż 65 lat, twardówka po badaniach serologicznych jest przechowywana w sterylnym PBS do celów chirurgicznych. W takim przypadku twardówki się nie przecina, usuwa jedynie ciało szkliste i konserwuje całą twardówkę.</li>
 <li> Aby wyciąć siatkówkę, należy wykonać małe nacięcie od strony rogówkowej twardówki w kierunku nerwu wzrokowego, używając sterylnej pęsety i nożyczek. Trzymając fragment twardówki pęsetą, należy przecinać ją nożyczkami prosto w stronę nerwu wzrokowego, usuwając ją fragment po fragmencie, aby uniknąć uszkodzenia ciała szklistego.</li>
 <li> Blaszki naczyniówkowe powinny zostać oddzielone od twardówki, ponieważ są ze sobą zrośnięte. Przetnij całą twardówkę, aby odsłonić tkankę naczyniówki. Po całkowitym przecięciu twardówki należy oddzielić ją wraz z pozostałością ciała szklistego, przecinając w pobliżu nerwu wzrokowego. Widoczna będzie cała kula ciała szklistego pokryta naczyniówką, jak pokazano na Rysunku 2a.</li>
 <li> Używając dwóch sterylnych pęset, delikatnie usuń warstwę naczyniówki, chwytając ją jedną pęsetą i odrywając drugą. Alternatywnie warstwę naczyniówki można usunąć nożyczkami, jednak należy tego unikać, aby nie uszkodzić siatkówki. Usuwaj warstwę naczyniówki częściowo, przecinając ją w celu ułatwienia usunięcia.</li>
 <li> Po usunięciu warstwy naczyniówki wyraźnie widoczna będzie przezroczysta warstwa siatkówki, jak pokazano na Rysunku 2b. Warstwa naczyniówki posiada wewnętrzną błonęr Bruchową, którą również można by usunąć, jednak trudno ją zidentyfikować gołym okiem.</li>
 <li> W podobny sposób, używając dwóch pęset, usuń warstwę siatkówki, jak pokazano na Rysunku 2c. Łatwiej jest wyizolować dużą ilość siatkówki, jeśli zostanie ona wycięta w pobliżu nerwu wzrokowego. Wszystkie warstwy oka są teraz widoczne, jak pokazano na Rysunku 2d.</li>
 <li> Po usunięciu tkanki siatkówki może ona zostać wykorzystana do różnych celów, dlatego kolejne kroki i warunki konserwacji mogą się odpowiednio różnić. Na przykład tkankę siatkówki można umieścić w probówkach zawierających odczynniki do stabilizacji RNA (takie jak RNAlater) lub bufor lizujący (do ekstrakcji RNA lub DNA), dispazę/trypsynę (do izolacji komórek) lub roztwory utrwalające (przed zatopieniem tkanek w parafinie lub OCT do immunohistochemii).</li>
 <li> Uporządkuj cały obszar roboczy i oczyść go za pomocą sprayu z 70% alkoholu izopropylowego.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Brzeg rogówkowo-twardówkowy widoczny na Rysunku 1a to prawidłowo wycięta rogówka z wymaganym marginesem twardówki i odpowiednią morfologią śródbłonka; tego rodzaju rogówka jest zazwyczaj stosowana w keratoplastyce penetrującej. Jeśli przedni stroma wyciętej rogówki jest uszkodzona i występuje zmętnienie, rogówka może zostać wykorzystana do keratoplastyki śródbłonkowej / tylnej keratoplastyki warstwowej (śródbłonek wraz z częścią stromy). Natomiast w przypadku uszkodzenia warstwy śródbłonka lub gdy gęstość komórek śródbłonka wynosi &lt; 2200 cells /mm2 (standard włoski), rogówka może zostać użyta do przedniej keratoplastyki warstwowej (nabłonek wraz z częścią przedniej stromy). Jeśli liczba komórek śródbłonka jest mniejsza od wymaganej, rogówka może posłużyć do przedniej keratoplastyki warstwowej lub do celów badawczych; natomiast jeśli rogówka jest całkowicie uszkodzona, może zostać wykorzystana w badaniach, jak pokazano na Rysunkach 1b, 3b i 3c, lub zutylizowana. Przyczyną uszkodzeń może być niewłaściwa obsługa tkanki, wcześniejsze operacje zaćmy prowadzące do blizn w stromie lub błonie Descemeta, urazy fizyczne w trakcie życia pacjenta itp. Dlatego konieczne jest sprawdzenie każdej tkanki za pomocą lampy szczelinowej, a następnie pod mikroskopem optycznym w celu wykrycia drobnych blizn, fałdów lub odwarstwień. Rogówkę zazwyczaj przechowuje się w dwóch różnych warunkach: w kulturze organowej (około 31 °C), co jest powszechne w krajach europejskich, lub w warunkach hipotermicznych (około 4 °C), stosowanych zazwyczaj w USA. Stosujemy kulturę organową, ponieważ pomaga ona w regeneracji uszkodzonych komórek nabłonkowych, rewitalizacji komórek śródbłonka przy długim czasie po śmierci, pozwala na 4-tygodniowy okres przechowywania, co zapewnia odpowiednie okno czasowe na zaplanowanie operacji oraz wystarczający czas na badania mikrobiologiczne (bakteryjne i grzybicze) oraz serologiczne itp. Rogówka może być dobrze zachowana w medium transportowym przez 7 dni.
Twardówkę można wycinać fragment po fragmencie, zapewniając ostrożne usunięcie wszystkich blaszek naczyniówkowych. Ciecz szklista może wyciekać w momencie gwałtownego przecięcia nerwu wzrokowego, naczyniówki lub siatkówki, jak pokazano na Rysunku 4. Siatkówki wycinane do analizy RNA powinny zostać zakonserwowane w roztworze RNAlater natychmiast po wycięciu tkanek. Zazwyczaj wycina się fragment naczyniówki i warstwy siatkówki o wymiarach 1X1 cm, który po 24-godzinnym przechowywaniu w RNAlater w temperaturze 4 °C jest mrożony w temperaturze -80 °C w nowych probówkach Eppendorf (probówki safe-lock, 2 ml) do czasu użycia lub wysyłki w suchym lodzie. Tkankę siatkówki należy wycinać za pomocą dwóch pincet w pobliżu nerwu wzrokowego, z dala od tęczówki lub brzegu rzęskowego, aby uniknąć zanieczyszczenia innymi strukturami pigmentowymi; należy ją niezwłocznie przenieść do pojemnika konserwującego, ponieważ RNA staje się niestabilne podczas wydobywania siatkówki.
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="Porównanie konserwacji rogówki, pierścień twardówki i wygięta rogówka, wynik eksperymentu biologicznego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Porównanie rogówki o dobrej i złej jakości: a) Prawidłowo wycięta rogówka. Taka rogówka jest zazwyczaj przechowywana w hodowli organów przez 4 tygodnie. Przed transportem do szpitala przeprowadza się badanie mikrobiologiczne (z użyciem urządzenia Bactec 9240) i morfologiczne (barwienie komórek błękitem trypanowym w celu określenia śmiertelności komórek oraz obserwacja komórek pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 100X) (Rycina 3a); b) wygięta rogówka, co w konsekwencji prowadzi do odrzucenia przeszczepu z powodu licznych fałdów błony Descemeta i znacznego uszkodzenia komórek śródbłonka, ocenianego za pomocą lampy szczelinowej. Taka rogówka jest zazwyczaj wykorzystywana do celów badawczych lub odrzucana.
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="Schemat sekcji oka przedstawiający anatomię twardówki, rąbka naczyniówki, siatkówki, nerwu wzrokowego i ciała szklistego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Metoda zapewniająca precyzyjne wycięcie tkanki siatkówki. a) Oddzielenie twardówki od gałki ocznej przy użyciu sterylnych nożyczek o długości 24 mm z zakrzywionym lub tępym końcem 95 mm oraz sterylnej pęsety 100 mm 11X2 z ząbkami 0,70 mm. Twardówkę należy przecinać, przytrzymując jedną stronę pęsetą i prowadząc cięcie nożyczkami w linii prostej w kierunku nerwu wzrokowego. W ten sposób warstwa naczyniówki stanie się łatwo widoczna; b) Przy użyciu dwóch sterylnych pęset 100 mm 11X2 z ząbkami 0,70 mm naczyniówkę usuwa się poprzez rozdzieranie, co odsłania znajdującą się pod nią przezroczystą warstwę siatkówki; c) Przezroczystą warstwę siatkówki wycina się bardzo ostrożnie w pobliżu nerwu wzrokowego, unikając wypłynięcia ciała szklistego, używając tych samych pęset. Obie pęsety powinny trzymać przeciwległe brzegi siatkówki, a tkankę należy delikatnie usuwać, zaczynając od okolic nerwu wzrokowego i przesuwając się w stronę rogówki, aby uzyskać odpowiednią ilość materiału. Tkankę można pociąć na fragmenty o różnych rozmiarach i wykorzystać w eksperymentach analitycznych; d) Na tym rysunku przedstawiono różne warstwy oka po usunięciu rogówki. W pierwszej kolejności usuwa się naczyniówkę, a następnie siatkówkę, tak aby nie uszkodzić pozostałych części oka. 
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="Zdjęcia mikroskopowe przedstawiające odwarstwienie komórek śródbłonka i fałdy jatrogenne w próbkach tkanek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Porównanie różnych typów gęstości i morfologii komórek widocznych przy 100-krotnym powiększeniu mikroskopu optycznego. a) Dobra gęstość komórek śródbłonka (&gt;2200 cells / mm2) i morfologia (mniejszy polimorfizm, niska degeneracja, brak dystrofii i 0% śmiertelności) w rogówce odpowiedniej do transplantacji; b) Słaba gęstość komórek śródbłonka (około 1200 – 1400 cells / mm2) i morfologia (bardzo wysoki polimorfizm i degeneracja komórek) wraz z całkowitą śmiertelnością na poziomie około 30-40%, zaobserwowane po barwieniu błękitem trypanu; c) Część komórek śródbłonka jest uszkodzona wskutek odwarstwienia płata śródbłonka podczas pobierania rogówki z gałki ocznej. Potwierdza to obserwacja śmiertelności komórek w obszarze zabarwionym błękitem trypanu; d) Fałdy błony Descemeta powstają w wyniku niewłaściwego obchodzenia się z rogówką, np. poprzez zginanie, wywieranie poprzecznego napięcia rogówki lub intensywne używanie narzędzi podczas wycięcia. Rycina przedstawia grube, rozwinięte fałdy jatrogenne znajdujące się pomiędzy obwódką a strefą optyczną rogówki.
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="Schemat sekcji oka, z zaznaczoną ciałem szklistym, podkreślający anatomię i wykrywanie zanieczyszczeń." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Uszkodzenia tkanek naczyniówki i siatkówki podczas wycinania rogówki prowadzą w konsekwencji do wycieku ciała szklistego. Siatkówka miesza się z ciałem szklistym, co utrudnia wycięcie tkanki dobrej jakości bez zanieczyszczeń.
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="Tabela aktywności chirurgicznej; dane dotyczące keratoplastyki i endokeratoplastyki; analiza trendów 2009-2010." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Podsumowanie zakresu czynności wykonywanych z wykorzystaniem ludzkich gałek ocznych w latach 2009 i 2010 w Fondazione Banca Degli Occhi (Wenecja, Włochy). Około 60% tkanek wykorzystano do transplantacji, co pozostawiło znaczną liczbę gałek ocznych (około 40%) do badań naukowych i medycznych. 
<img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="Schemat anatomii oka; opisane części, w tym rogówka i twardówka, ilustrujące budowę ludzkiego oka." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina uzupełniająca 1"> 
Rycina uzupełniająca 1. Anatomia ludzkiego oka5. Na tej rycinie zaznaczono poszczególne części ludzkiego oka, co pozwala na dokładne określenie położenia tkanek.

<ol><li>Fay, A. Diseases of the visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFay%2C+A+%22Cecil+Medicine%22">Cecil Medicine</a>. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).</li>
<li>Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+in+Limbal+Stem+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents in Limbal Stem Cell Biology.</a> Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).</li>
<li>Pharm, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Eye%3A+The+physiology+of+human+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Britannica+educational+publishing%22%5BJournal%5D)">The Eye: The physiology of human perception.</a> Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).</li>
<li>Lang, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLang%2C+G+%22Ophthalmology%3A+A+pocket+textbook+atlas%22">Ophthalmology: A pocket textbook atlas</a>. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.</li>
<li>Liesbeth, P. els <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Culture%3A+The+method+of+choice+for+preservation+of+human+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).</li>
<li>Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).</li>
<li>Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555(2010).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Mouse+Eye+for+a+Whole+Mount+of+the+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (48), e2563(2011).</li>
<li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evisceration+of+Mouse+Vitreous+and+Retina+for+Proteomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses.</a> J. Vis. Exp. (50), e2795(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów.

Zarówno prawidłowe wycięcie, jak i odpowiednia konserwacja tkanek rogówki i siatkówki są kluczowe, ponieważ niewielkie defekty, takie jak uszkodzenie śródbłonka lub duża liczba fałdów Descemeta, mogą prowadzić do odrzucenia przeszczepu rogówki, natomiast zmiany temperatury lub niewłaściwa obsługa mogą naruszyć integralność tkanek siatkówki. Celem niniejszej pracy jest pokazanie, w jaki sposób można optymalnie wyizolować tkankę rogówki i siatkówki, nie powodując uszkodzeń ani zmian, które mogłyby utrudnić ich wykorzystani...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały do wycięcia rogówki i siatkówki.</td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel z osłoną</td><td>Ostrze rozmiar 15</td><td>Swann-Morton</td><td></td></tr><tr><td>Jałowe gaziki</td><td>5 cm X 5 cm, 8-warstwowe, 5 szt.</td><td>Artsana</td><td></td></tr><tr><td>Jałowy jednorazowy ręcznik medyczny</td><td>35 X 50 cm</td><td>U.Jet</td><td></td></tr><tr><td>Jałowe nożyczki</td><td>Ostrza 24 mm / długość całkowita 95 mm, zakrzywione, tępe</td><td>e.janach</td><td></td></tr><tr><td>Jałowa pęseta</td><td>Stal nierdzewna -100 mm 11 X 2, ząbki 0,70 mm</td><td>e.janach</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do rogówki &amp;#8211; jednorazowy wyrób medyczny</td><td></td><td>NIIOS (Hippocratech)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>100 ml PBS [10x] w 900 ml d/w (woda destylowana)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>1 gm tiosiarczanu sodu w 1 litrze PBS [1x]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>I-PVP</td><td>5 gm I-PVP w 1 litrze d/w</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Tabela opisuje materiały użyte do wycięcia rogówki i siatkówki oraz firmy, od których zostały pozyskane. </td></tr><tr><td colspan="4">Materiały do medium do przechowywania (2000 ml).</td></tr><tr><td>MEM (1X) płynny</td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td>1mM (10ml/l)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-032</td><td>2mM (10ml/l)</td></tr><tr><td>Antybiotyk/antybiotyk-antymykotyk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-20ML</td><td>10ml/l</td></tr><tr><td>Surowica z noworodka cielęcia</td><td>Invitrogen</td><td>26010-74</td><td>2% (20 ml/l)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 3. &lt;/strong&gt;Materiały do medium do przechowywania.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Przygotowanie medium do przechowywania&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Wszystkie składniki w określonych powyżej stężeniach dodać do słoika i dokładnie wymieszać. Przefiltrować za pomocą filtra o rozmiarze porów 0,2 mikrona (Millipore, Mediolan, Włochy) przy użyciu pompy perystaltycznej. Medium przechowywać w butelkach w temperaturze pokojowej (RT).</td></tr><tr><td colspan="4">Materiały do medium transportowego (2000 ml).</td></tr><tr><td>MEM (1X) płynny </td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td>1mM (10 ml/l)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-032</td><td>2mM (10 ml/l)</td></tr><tr><td>Surowica z noworodka cielęcia</td><td>Invitrogen</td><td>26010-74</td><td>2% (20 ml/l)</td></tr><tr><td>Dekstran t500</td><td>Pharmacosmos</td><td>551005004007</td><td>6% (60 gm/litr)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 4.&lt;/strong&gt; Materiały do medium transportowego.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Przygotowanie medium transportowego&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Dodać 6% dekstranu do ok. 1,5 litra MEM i pozostawić na noc. Dodać pozostałe składniki do medium i przefiltrować za pomocą filtra 0,2 mikrona (Millipore, Mediolan, Włochy) przy użyciu pompy próżniowej. Medium przechowywać w butelkach w temperaturze pokojowej (RT).</td></tr></tbody></table>

uproszczona technika wycięcia rogówki in situ oraz ewakuacji tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Enukleacja to proces pobierania gałki ocznej od dawcy pośmiertnego przy zachowaniu nienaruszonej struktury gałki. Wycięcie (ekszycja) odnosi się do pobierania tkanek oka, zwłaszcza rogówki, poprzez odcięcie jej od gałki ocznej. Ewisceracja to proces usuwania narządów wewnętrznych, w tym przypadku określonych jako siatkówka. Gałka oczna składa się z rogówki, twardówki, ciała szklistego, soczewki, tęczówki, siatkówki, naczyniówki, mięśni itd. (Ryc. 1 w Suplemencie). W przypadku uszkodzenia rogówki u pacjenta, konieczne jest jej usunięcie i przeszczepienie zdrowej tkanki za pomocą operacji keratoplastyki. Zaburzenia genetyczne lub defekty funkcji siatkówki mogą upośledzać wzrok. Ludzkie gałki oczne mogą być wykorzystywane w różnych procedurach chirurgicznych, takich jak bankowanie tkanek oka, przeszczepy ludzkiej rogówki lub twardówki oraz badania nad tkankami ocznymi. Jednakże dostępnych jest niewiele informacji na temat wycinania ludzkiej rogówki i siatkówki, prawdopodobnie ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. Większość badań opisujących podobne procedury jest przeprowadzana na modelach zwierzęcych. Naukowcy polegają na dostępności prawidłowo wypreparowanych i dobrze zakonserwowanych tkanek ocznych, aby poszerzyć wiedzę na temat rozwoju, homeostazy i funkcji ludzkiego oka. Ponieważ otrzymujemy dużą liczbę gałek ocznych, z których około 40% (Tabela 1) jest wykorzystywanych do celów badawczych, jesteśmy w stanie przeprowadzać ogromną liczbę eksperymentów na tych tkankach, regularnie opracowując techniki ich wycinania i konserwacji.
Rogówka jest tkanką beznaczyniową, która umożliwia przechodzenie światła na siatkówkę, a w tym celu powinna zawsze zachowywać wysoki stopień przezroczystości. W obrębie rogówki obszar limbusa, będący rezerwuarem komórek macierzystych, wspomaga rekonstrukcję komórek nabłonkowych oraz ogranicza przerastanie spojówki, utrzymując przezroczystość i klarowność rogówki. Rozmiar i grubość rogówki są kluczowe dla wyraźnego widzenia, ponieważ zmiany w którymkolwiek z tych parametrów mogą prowadzić do rozproszonego, nieostrego obrazu. Rogówka składa się z 5 warstw: a) nabłonka, b) błony Bowmana, c) zmętnienia (stromy), d) błony Descemeta oraz e) śródbłonka. Wszystkie warstwy muszą funkcjonować prawidłowo, aby zapewnić wyraźne widzenie4,5,6. Brzydawka jest błoną pośrednią między twardówką a siatkówką, ograniczoną od wewnątrz błoną Brucha, i odpowiada za przepływ krwi w oku. Brzydawka pomaga również regulować temperaturę i dostarcza składników odżywczych do zewnętrznych warstw siatkówki5,6. Siatkówka jest warstwą tkanki nerwowej, która pokrywa tył gałki ocznej (Ryc. 1 w materiale uzupełniającym) i składa się z dwóch części: części fotoreceptywnej i części niereceptywnej. Siatkówka pomaga w odbieraniu światła przechodzącego przez rogówkę i soczewkę, a następnie przekształca je w energię chemiczną, która ostatecznie jest przesyłana do mózgu za pomocą nerwu wzrokowego5,6.
Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie protokołu sekcji tkanek rogówki i siatkówki z ludzkich gałek ocznych. Uniknięcie kontaminacji krzyżowej z sąsiednimi tkankami oraz zachowanie integralności RNA ma fundamentalne znaczenie, ponieważ tkanki te są niezbędne do celów badawczych nakierowanych na (i) charakterystykę transkryptomu tkanek oka, (ii) izolację komórek macierzystych do projektów z zakresu medycyny regeneracyjnej oraz (iii) ocenę różnic histologicznych między tkankami od osób zdrowych i chorych. W niniejszej pracy opisujemy technikę, której obecnie używamy do usuwania rogówki, naczyniówki i tkanek siatkówki z gałki ocznej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół sekcji ludzkiej gałki ocznej oraz wycięcia tkanek rogówki i siatkówki. Towarzyszący film pomoże badaczom opanować odpowiednią technikę pozyskiwania cennych tkanek ludzkich, które są trudne do regularnego zdobycia.

W pracy opisano uproszczoną technikę wycinania rogówki oraz ewizceracji tkanek siatkówki z gałki ocznej ludzkich dawców pośmiertnych. Opisana tutaj technika pozwala na pobranie wysokiej jakości tkanek do celów transplantacyjnych, chirurgicznych lub badawczych bez uszkadzania pozostałych struktur gałki ocznej.

Uproszczona technika wycięcia rogówki in situ oraz ewakuacji tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej

Enukleacja to proces pobierania gałki ocznej od dawcy pośmiertnego w taki sposób, aby pozostała część gałki pozostała nienaruszona. Wycięcie odnosi się do...

W dzisiejszym materiale demonstrujemy uproszczoną technikę pobierania rogówki oraz tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej pochodzącej od dawców pośmiertnych. Opisana metoda pozwoli na pozyskanie wysokiej jakości tkanek do celów transplantacyjnych, chirurgicznych oraz badawczych, bez uszkadzania pozostałych struktur gałki ocznej. Dzięki 18-letniemu doświadczeniu i przeprowadzaniu licznych przeszczepów rogówki każdego roku, utrzymujemy wysoki standard naszej pracy, opracowując nowe techniki i codziennie doskonaląc nasze umiejętności.Aby to osiągnąć, najpierw przeprowadzamy ekscyzję rogówki, a następnie ewizcerację siatkówki. Rogówka jest tkanką beznaczyniową, która umożliwia przechodzenie światła na siatkówkę i z tego względu powinna zawsze zachowywać wysoki stopień przezroczystości. Rogówka składa się z pięciu warstw: nabłonka, błony Bowmana, rąbka (stromy), błony Descemeta oraz endotelium.W przypadku uszkodzenia rogówki można ją zastąpić przy pomocy odpowiedniej rogówki donora. Choroidea jest błoną pośrednią między twardówką a siatkówką, ograniczoną od wewnątrz błoną Brucha, i odpowiada za przepływ krwi w oku. Prawidłowa ewakuacja choroidei jest tak samo istotna, jak usunięcie s

a-simplified-technique-for-situ-excision-cornea-evisceration-retinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Uproszczona technika in situ wycinania rogówki i wydalenia tkanki siatkówki z ludzkiej gałki ocznej

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Ten film demonstruje metodę wywoływania zapalenia powierzchni oka i dysfunkcji gruczołów Meiboma w modelu mysim. Stymulacja układu odpornościowego myszy za pomocą immunogenu, a następnie ponowna stymulacja tym samym immunogenem sprzyja zapaleniu powierzchni oka, które powoduje zatkanie wydzielania gruczołów Meiboma przez aggNET wytwarzane przez neutrofile i prowadzi do zespołu suchego oka.

Metoda wywoływania stanu zapalnego powierzchni oka w modelu mysim

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Celem tego protokołu jest pokazanie skutecznej techniki izolowania całego, nienaruszonego rdzenia i kory ciała szklistego z pośmiertnych wyłuszczonych oczu świń.

Sekcja całego ciała szklistego do analizy witreodynamicznej

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Naucz się uproszczonej techniki wycinania rogówki i patroszenia siatkówki z ludzkiego gałki ocznej. Metoda zachowuje jakość tkanek do transplantacji i badań, minimalizując uszkodzenia struktur okularnych.

Uproszczona technika wycięcia rogówki in situ oraz ewakuacji tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej

Przeglądaj więcej filmów