Uproszczona technika wycięcia rogówki in situ oraz ewakuacji tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej

W dzisiejszym materiale demonstrujemy uproszczoną technikę pobierania rogówki oraz tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej pochodzącej od dawców pośmiertnych. Opisana metoda pozwoli na pozyskanie wysokiej jakości tkanek do celów transplantacyjnych, chirurgicznych oraz badawczych, bez uszkadzania pozostałych struktur gałki ocznej. Dzięki 18-letniemu doświadczeniu i przeprowadzaniu licznych przeszczepów rogówki każdego roku, utrzymujemy wysoki standard naszej pracy, opracowując nowe techniki i codziennie doskonaląc nasze umiejętności.

Aby to osiągnąć, najpierw przeprowadzamy ekscyzję rogówki, a następnie ewizcerację siatkówki. Rogówka jest tkanką beznaczyniową, która umożliwia przechodzenie światła na siatkówkę i z tego względu powinna zawsze zachowywać wysoki stopień przezroczystości. Rogówka składa się z pięciu warstw: nabłonka, błony Bowmana, rąbka (stromy), błony Descemeta oraz endotelium.

W przypadku uszkodzenia rogówki można ją zastąpić przy pomocy odpowiedniej rogówki donora. Choroidea jest błoną pośrednią między twardówką a siatkówką, ograniczoną od wewnątrz błoną Brucha, i odpowiada za przepływ krwi w oku. Prawidłowa ewakuacja choroidei jest tak samo istotna, jak usunięcie siatkówki.

Siatkówka pomaga w odbieraniu światła z rogówki i soczewki i przekształca je w energię chemiczną, która ostatecznie jest przesyłana do mózgu. Ze względu na to, że nerw wzrokowy jest przezroczysty i delikatny, należy go systematycznie usuwać, aby uzyskać tkankę dobrej jakości. Włącz dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

Oczyść komorę z laminarnym przepływem powietrza przy użyciu 70% alkoholu izopropylowego. Załóż odzież ochronną, taką jak czepka chirurgiczna, jałowe rękawiczki i osłony ramion. Stosując technikę aseptyczną, przygotuj pole sterylne, umieszczając na nim sterylną tacę oraz uprzednio wysterylizowaną tace z narzędziami.

Aseptycznie otwórz opakowanie z jałowymi instrumentami i przełóż je na pole jałowe, unikając jakiegokolwiek zanieczyszczenia. Rozmieść wszystkie jałowe materiały i instrumenty na polu jałowym, a słoiki z gałkami ocznymi ustaw tak, aby znajdowały się przy krawędzi pola jałowego. Dla ułatwienia pracy oznacz butelki z wcześniej przygotowanym medium do przechowywania, roztworem jodku poliolu, siarczanem sodu oraz jałowym roztworem buforu fosforanowo-solnego.

Po wyjęciu z jałowej pożywki należy pozwolić tkankom ocznym i roztworom osiągnąć temperaturę pokojową, ponieważ są one przechowywane w lodówkach w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Należy unikać wielokrotnych cykli ogrzewania i chłodzenia. Używając sterylnej pęsety, należy usunąć gazy i gąbki z naczynia z okiem.

Umieść gałkę oczną na pokrywce i zdejmij dodatkowe opatrunki. Ostrożnie podnieś gałkę oczną wraz z nerwem wzrokowym i zanurz ją w sterylnym IPVP. Dekontaminuj gałki oczne w sterylnym IPVP przez dwie minuty.

Przenieś gałkę oczną do sterylnego siarczanu sodu na jedną minutę. Przenieś gałki oczne do sterylnego roztworu buforu fosforanowego dla linii komórkowych i pozostaw do czasu rozpoczęcia procedury. Pracując pod laminarnym nawiewem powietrza, umyj i wyjmij gałkę oczną z PBS, a następnie umieść ją w polu sterylnym.

Owiń gałkę oczną sterylną gazą, pozostawiając niezakryte rogówkę oraz około pięciu milimetrów twardówki wokół rogówki; gałkę oczną można po prostu trzymać w dłoni. Zachowując odpowiedni nacisk, za pomocą sterylnych nożyczek usuń wszelkie pozostałości spojówki, uważając, aby nie uszkodzić rogówki.

Używając jednorazowego ostrza skalpela, wykonaj nacięcie twardówki w odległości od trzech do czterech milimetrów od regionu limbusa. Następnie rozszerz nacięcie o 360 stopni, unikając perforacji leżącej poniżej tkanki naczyniówki oraz deformacji naturalnej krzywizny rogówki. Wykonaj cztery duże nacięcia, pozostawiając cztery małe przerwy, aby zapobiec wypłynięciu ciała szklistego.

Wszystkie cztery nacięcia są wykonane, zapewniając brak usunięcia jakichkolwiek innych tkanek. Obecność małych blaszek twardówki może utrudniać cięcie, dlatego należy upewnić się, że wycięcie twardówki zostało zakończone za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych. Operację tę należy przeprowadzić bez uszkodzenia naczyniówki, siatkówki i ciała szklistego.

Sprawdź nacięcie, aby upewnić się, że jest ono kompletne. Jeśli nacięcie zostało wykonane prawidłowo, brzeg rogówkowo-twardówkowy przylega do ciała rzęskowego tylko w punkcie odpowiadającym rogówce; odłóż gałkę oczną w pobliże centrum sterylnego podłoża. Zakończ usuwanie rogówki, używając sterylnej pęsety.

Unieruchom brzeg twardówki i wytnij fragment rogówki wraz z brzegiem twardówki, oddzielając go od gałki ocznej. Delikatnie oddziel wszelkie pozostałe tkanki przyległe od wyciętego fragmentu rogówki i twardówki. Nigdy nie ciągnij za brzeg rogówkowo-twardówkowy w sposób, który mógłby spowodować naprężenie poprzeczne rogówki, ani nie pozwól, aby opadł on z powrotem na komorę przednią.

Gęstość komórek śródbłonia rogówki sprawdza się przy użyciu roztworu hipotonicznego, a śmiertelność komórek za pomocą barwienia trypanowym błękitem przez około jedną minutę. Barwnik trypanowy usuwa się sterylną gazą drucianą, a następnie rogówkę płucze w sterylnym PBS. Następnie przenosi się ją na sterylną płytkę Petriego wypełnioną roztworem sacharozy.

Roztwór ten pomaga w stworzeniu środowiska hipotonicznego oraz ułatwia wizualną identyfikację komórek. Następnie komórki są zliczane pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 100x i mierzone jako liczba komórek na milimetr kwadratowy. Zazwyczaj ocenia się gęstość komórkową oraz cechy morfologiczne, takie jak granice międzykomórkowe, polimorfizm, degenerację, dystrofię oraz śmiertelność komórek.

Grubość rogówki jest również istotnym parametrem w procesie transplantacji, obok dobrego stopnia przejrzystości wyciętej rogówki. Sterylny zacisk do rogówki (CLO) służy do unieruchomienia rogówki na brzegu twardówki; należy zagiąć zacisk CLO, aby zapewnić otwarcie otworu wystarczające do zablokowania brzegu twardówki, a następnie przenieść brzeg twardówki rogówki za pomocą zacisku do wcześniej przygotowanego medium do przechowywania rogówek, przygotowanego w temperaturze pokojowej. Rogówka powinna być następnie przechowywana w temperaturze 31 stopni SIU podczas czterotygodniowej konserwacji.

Nośnik do przechowywania poddawany jest kilku testom mikrobiologicznym przy użyciu instrumentu B 9 2 4 0. Ponieważ podczas przechowywania rogówka ulega pogrubieniu powyżej jej zwykłego rozmiaru wymaganego do transplantacji, banki tkanek oka stosują środki przeciwobrzękowe w celu zmniejszenia grubości. W celu przywrócenia rogówce normalnego rozmiaru oraz do medium transportowego stosuje się 6% Dextron T 500.

Oczyść sterylne instrumenty za pomocą środka do usuwania RNA, aby stworzyć środowisko wolne od RN przed wycięciem siatkówki. Przygotuj pole sterylne i upewnij się, że gałka oczna jest nienaruszona, a usunięte zostały jedynie rogówka i brzeg twardówki. Jeśli ciało witrakowate wycieka, usunięcie tkanki siatkówkowej staje się utrudnione.

Jeśli dawca ma mniej niż 65 lat, twardówka jest przechowywana w 70% alkoholu do celów chirurgicznych po wykonaniu badań serologicznych. W takich przypadkach nie wycina się twardówki, a jedynie usuwa ciało szkliste, przechowując całą twardówkę do wycięcia siatkówki. Należy rozpocząć od wykonania niewielkiego nacięcia w pobliżu strony rogówkowej twardówki, przemieszczając się w stronę nerwu wzrokowego przy użyciu sterylnej pęsety i nożyczek.

Przytrzymaj fragment twardówki za pomocą sterylnej pęsety i tnij nożyczkami prosto w kierunku nerwu wzrokowego, kawałek po kawałku, unikając uszkodzenia ciała szklistego. Czopy naczyniówkowe należy oddzielić od twardówki, ponieważ są one ze sobą złączone. Wytnij całą twardówkę, aby odsłonić tkankę naczyniówki.

Po całkowitym nacięciu twardówki, oddziel twardówkę od pozostałych tkanek, przecinając ją w pobliżu nerwu wzrokowego; widoczna stanie się teraz cała warstwa naczyniówki pokrywająca ciało szkliste. Napełnij te sterylne probówki wolne od RNaz 2 ml buforu RL, używając dwóch sterylnych pęset. Delikatnie usuń warstwę naczyniówki, chwytając nerw wzrokowy jedną pęsetą i usuwając naczyniówkę drugą.

częściowo oddziel naczyniówkę i przetnij ją, aby ułatwić usunięcie. Warstwę naczyniówki można wyciąć nożyczkami, unikając uszkodzenia siatkówki. Wyciętą warstwę naczyniówki umieść w roztworze RNA later i przechowuj w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.

Usuń całą dodatkową naczyniówkę, aby odsłonić tkankę siatkówki. Po usunięciu całej warstwy naczyniówki widoczna będzie przezroczysta warstwa siatkówki. Wyraźnie widać, że warstwa naczyniówki posiada wewnętrzną błonę Brucha, którą również można by usunąć, jednak jej zidentyfikowanie gołym okiem jest trudne.

Podobnie, użyj dwóch pęset, aby usunąć warstwę siatkówki. Łatwo jest wyizolować dużą ilość siatkówki, jeśli wycinek zostanie wykonany w pobliżu nerwu wzrokowego. Wszystkie warstwy oka są teraz widoczne.

Umieść wyciętą siatkówkę w roztworze RNA later i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Oczyść obszar roboczy, używając 70% alkoholu izopropylowego. Komórki śródbłonka barwione trypanowym błękitnie można obserwować przy powiększeniu 100x za pomocą mikroskopu odwróconego.

Odpowiednią rogówkę, zawierającą więcej niż 200 komórek na milimetr kwadratowy, zazwyczaj przechowuje się do dalszego wykorzystania. Klasyfikacja jakości od przeciętnej do doskonałej ułatwia prowadzenie badań porównawczych. Zazwyczaj, gdy rogówka jest gotowa do przeszczepienia, odnotowuje się jej grubość oraz przezroczystość, a następnie odpowiednią rogówkę wykorzystuje się do keratoplastyki penetrującej, podczas której przeszczepiana jest cała rogówka.

Śmiertelność komórek sprawdza się poprzez obserwację zabarwionych na niebiesko komórek i ocenia jako procent komórek martwych. Całkowita śmiertelność komórek przekraczająca 2% jest uznawana za nieakceptowalną podczas przechowywania. Jeśli gęstość komórek jest niższa niż 2200 komórek na milimetr kwadratowy lub występują uszkodzenia wynikające ze śmiertelności, rogówka może zostać wykorzystana do przedniej keratoplastyki lamelarnej.

Jeśli przednia część rogówki jest uszkodzona, a gęstość komórek endotelialnych rogówki jest dobra, rogówka może zostać wykorzystana do tylnej keratoplastyki lamellarnej. Grubość rogówki zazwyczaj zwiększa się podczas hodowli organu. Medium transportowe pomaga w odzyskaniu jej normalnego kształtu i struktury.

Ponadto hodowla organowa wspomaga reepitelializację rogówki, a dzięki długiemu okresowi przechowywania ułatwia właściwy dobór dawcy. Badania mikrobiologiczne i serologiczne. Pozwala to na zapewnienie wystarczającego czasu na zorganizowanie operacji oraz umożliwia sprawdzenie gęstości i morfologii komórek śródbłonka, gdy nie jest to możliwe ze względu na zbyt długi czas po śmierci.

Zatem, przy zastosowaniu opisanego postępowania, rogówki można wyciąć bez uszkodzenia innych tkanek. Jeśli rogówka nie nadaje się do transplantacji, może ona zostać wykorzystana do celów badawczych w celu opracowania nowych pożywek i warunków przechowywania do badania chorób powierzchni oka, izolacji komórek macierzystych bliwa oraz badania wpływu leków na rogówkę. W przypadku siatkówki możemy uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek RNA tkanek sąsiednich i zachować integralność RNA, co ma fundamentalne znaczenie.

Tkanki te, niezbędne do celów badawczych, mają na celu charakterystykę transkryptomu tkanek oka, izolację komórek macierzystych na potrzeby projektów medycyny regeneracyjnej oraz ocenę różnic histologicznych między tkankami pochodzącymi od osobników zdrowych i chorych. Po usunięciu tkanki siatkówki może ona zostać wykorzystana w różnych celach, w związku z czym kolejne kroki i warunki stosowane do konserwacji mogą się odpowiednio różnić. Na przykład tkankę siatkówki można umieścić w probówkach zawierających odczynniki stabilizujące RNA, takie jak r nator lub bufor thisis do ekstrakcji RNA lub DNA, bądź w dysplasezie lub trypsynie do izolacji komórek.

Utrwalanie roztworami przed zatopieniem tkanek w parafinie lub OCT do badań immunohistochemicznych. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w badaniach.