Wykrywanie za pomocą GC pochodnych octowych aldonionitryli glukozaminy i kwasu muraminowego w celu oznaczenia pozostałości mikrobiologicznych w glebie

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie szczegółowego opisu analizy pochodnych octanu nitrylu Aldonu glukozaminy i kwasu mukonowego ekstrahowanych z gleb z wykorzystaniem techniki GC. Proces rozpoczyna się od trawienia kwasowego, które prowadzi do rozkładu polimerów organicznych i uwalniania glukozaminy oraz kwasu mukonowego. Następnie monomery aminocukrów są izolowane i oczyszczane z roztworu mieszaniny.

Następnie przeprowadza się derywatyzację w celu przekształcenia tych aminocukrów w lotne octany nitryli aldonowych przeznaczone do analizy metodą chromatografii gazowej. Ostatnim etapem procedury jest ekstrakcja ciecz-ciecz oraz oznaczanie metodą GC. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące rozdzielenie linii bazowej octanów nitryli aldonowych aminocukrów elujących między standardami myo, acetolu i metyloglutaminy podczas analizy GC z detekcją za pomocą detektora jonizacji płomieniowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest optymalna równowaga między precyzją, czułością, prostotą, dobrą chromatyczną separacją graficzną a stabilnością podczas przechowywania próbek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu globalnego obiegu węgla, takie jak wkład mikroorganizmów SSE do pul stabilnego węgla glebowego. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd i informacje na temat akumulacji detrytusu mikrobiologicznego w glebach, może być ona również stosowana w innych macierzach, takich jak systemy oceaniczne, tkanki biologiczne, a nawet próbki pozaziemskie.

Aby rozpocząć ten protokół, należy liofilizować próbki gleby po ich pobraniu w terenie, a następnie zmielić i uhomogenizować je za pomocą młyna kulowego do gleby lub moździerza z tłuczkiem. Odważone próbki zmielonej gleby należy umieścić w 25 mililitrowych kolbach do hydrolizy. Do każdej kolby należy dodać 10 mililitrów kwasu solnego o stężeniu six molar, a następnie wypełnić kolby azotem przed szczelnym zamknięciem.

Hidrolizować w temperaturze 105 °C w inkubatorze przez osiem godzin. Korzystając z automatycznego przełącznika czasowego, wyjąć kolby z inkubatora i schłodzić do temperatury pokojowej.

Do każdej kolby dodaj 100 µL wewnętrznego standardu myo-acetolu. Wymieszaj poprzez delikatne potrząsanie; przygotuj lejki plastikowe odprowadzające ciecz do kolb gruszkowych o pojemności 200 mL. Zastosuj szlifowane połączenia szklane o standardowej średnicy 24/40, ustawione na plastikowych uchwytach w celu zapewnienia stabilności.

Złożyć okrągłe filtry jakościowe Whatman nr 2 na cztery części i umieścić je w lejkach. Zamieszać zawartość każdej kolby do hydrolizy i przelać zawiesinę do lejka. Aby odfiltrować każdą próbkę, odparować filtrat za pomocą ewaporatora rotacyjnego w temperaturze około 45 °C przy zastosowaniu próżni.

Resztki wysuszone w każdej kolbie typu pear zawiesić w 3–5 ml wody i przelać do 40 ml teflonowej probówki. Każdą kolbę wypłukać drugą porcją wody. Doprowadzić pH próbek do poziomu 6,6–6,8, używając 1 M roztworu wodorotlenku potasu, aby wytrącić jony metali i inne cząsteczki organiczne. Następnie usunąć osady poprzez wirowanie z prędkością 2000 ×g przez 10 minut.

Przelej supernatanty do szklanych probówek o pojemności 40 ml i zakryj otwory probówek parafilmem, a następnie zamroź supernatanty i wykonaj otwory w parafilmie. Liofilizuj zamrożone supernatanty, aby usunąć całą ciecz. Po wysuszeniu supernatantów rozpuść osad w trzech mililitrach bezwodnego metanolu.

Po dokładnym wymieszaniu na wirówce vortex, szczelnie zakręć probówki, a następnie odwiruj z prędkością 2000 ×g przez 10 minut. Aby osadzić sole, przenieś nadsączniki do stożkowych fiolek reakcyjnych o pojemności 3 ml i odparuj do suchości za pomocą szybkiego ewaporatora w temperaturze 45 °C lub pod łagodnym strumieniem suchego azotu. Po odparowaniu do każdej fiolki dodaj 100 µL standardu odzysku i metyloglutaminy oraz 1 ml wody.

Następnie zamroź próbki przed rozpoczęciem derywatyzacji. Przygotuj wzorce zgodnie z opisem w protokole pisemnym, a następnie liofilizuj zarówno próbki, jak i wzorzec. Przygotuj odczynnik do derywatyzacji zawierający 32 mg/ml chlorku hydroksyloaminy oraz 40 mg/ml.

Cztery dimethyl amino purine w metanolu purynowym. Do każdej z reakcyjnych probówek dodać 300 µL odczynnika do derywatyzacji, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać na wortexie. Zamknięte probówki umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze od 75 do 80 °C na 35 minut.

Wyjmij probówki z łaźni wodnej i ostudź do temperatury pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr bezwodnika octowego do każdej z trzech mililitrowych probówek reakcyjnych, szczelnie zamknij nakrętki i dokładnie wymieszaj za pomocą wortexa. Po czym przeprowadź drugą inkubację w łaźni wodnej w temperaturze od 75 do 80 °C przez 25 minut.

Wyjmij probówki z łaźni wodnej i ostudź je do temperatury pokojowej. Aby rozpocząć separację i pomiar, dodaj 1,5 mililitra dichlorometanu do każdej probówki, a następnie wymieszaj w wortexie. Po dodaniu jednego mililitra jednego molarnego kwasu solnego do każdej probówki i dokładnym wymieszaniu w wortexie, pozostaw roztwory w spokoju do momentu rozdzielenia się dwóch faz.

Odssać i odrzucić górną fazę wodną. W ten sam sposób, używając pipety 1000 µL, pobrać fazę organiczną trzykrotnie, przy czym w ostatnim etapie przemywania użyć 1 mL wody. Należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że cała górna faza wodna została usunięta.

Wysuszyć końcowy roztwór za pomocą szybкого koncentratora próżniowego (VAP) w temperaturze 45 °C lub za pomocą strumienia azotu, rozpuścić każdą próbkę w 300 µL octanu etylu i heksanu, a następnie przenieść do 2 ml bursztynowych fiolek z nakrętką i wkładką do małych objętości i szczelnie zamknąć w celu ilościowego oznaczenia metodą chromatografii gazowej z detektorem jonizacji płomieniowej, wykorzystując niepolarną kolumnę kapilarną z topionego krzemianu, taką jak DB-5, zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym. Po standardowym przebiegu i analizie dostosować szybkość przepływu gazu nośnego tak, aby pochodne acetologlukozaminy i kwasu mukamowego eluowały w temperaturze 250 °C, a końcowa metyloglutamina eluowała w temperaturze 270 °C.

Po uruchomieniu chromatografu gazowego przeprowadź wtrysk 1 µL w trybie split 30:1, przy temperaturze wlotu GC ustawionej na 250 °C, przy użyciu autosamplera. W ostatnim kroku tej procedury przeprowadź walidację pochodnej, korzystając z metod chromatograficznych i spektrometrycznych opisanych w protokole pisemnym. Tutaj przedstawiono przykłady analiz glukozaminy i kwasu mocznikowego z wzorców oraz z próbki gleby; oprócz glukozaminy i kwasu mukowego, za pomocą tej metody można jednocześnie oznaczyć dwa izomery glukozaminy – ozaminę i galaktozaminę, w oparciu o dokładną ilość zastosowanych wzorców oraz współczynniki odpowiedzi dla każdego z dwóch standardów wewnętrznych.

Można określić ilość tych biomarkerów w próbkach gleby. Wzorzec odzysku został również wykorzystany do jakościowego monitorowania procesu derywatyzacji. Tutaj przedstawiono schematy powstawania octanu nitrylu aldonowego, pochodnej glukozaminy oraz kwasu mukonowego.

Numer jeden oznacza reakcję nitrylową, a numer dwa acetylowanie. Proponowane struktury fragmentów jonowych powstałych w wyniku jonizacji elektronowej zbadano poprzez porównanie widm jonowych próbek przygotowanych z zastosowaniem różnych włączeń izotopowych. Tutaj przedstawiono przesunięcie masy dominującego jonu pochodnej acetanu nitrylu aldonu glukozaminy w różnych scenariuszach.

W tym przykładzie preparat przygotowano z nieoznaczonych odczynników, a także z izotopowo znakowanego bezwodnika octowego oraz izotopowo znakowanej glukozaminy. Gwiazdka na strukturze chemicznej oznacza atom ciężkiego izotopu lub grupę izotopową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie rygorystycznie bezwodnych warunków podczas derywatyzacji.

Zarówno rozpuszczalniki organiczne, jak i szkło laboratoryjne używane na tym etapie muszą być suche. Choć wielu dostawców oferuje rozpuszczalniki bezwodne, dostępne zasoby można osuszyć, przepuszczając je przez kolumny zawierające odczynniki suszące, takie jak siarczan magnezu. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas z rozdzielczością izotopową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące reakcji makrofauny, obrotu i akumulacji węgla lub azotu w glebach, poprzez rozróżnienie żywych i martwych organizmów makroskopowych po ich rozwoju.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny makroekologii, biologii i chemii gleb do zbadania wkładu makroorganizmów w materię organiczną gleby oraz sekwestracji w naturalnych lub zarządzanych systemach lądowych.