Name: Wykrywanie octanu aldononitrylu, derywatyzowanej glukozaminy i kwasu muraminowego na podstawie GC do oznaczania pozostałości mikrobiologicznych w glebie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj metodę GC do analizy pochodnych aldononitrylu octanu glukozaminy i kwasu muraminowego w glebie. Protokół obejmuje trawienie kwasowe, izolację cukrów aminowych, derywatyzację oraz ekstrakcję ciecz-ciecz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana z grantów przyznanych przez DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER office of Science DE-FC02-07ER64494). Jesteśmy wdzięczni dr. Xudong Zhangowi oraz członkom jego grupy za pomocne dyskusje techniczne i nieocenione uwagi przy finalizacji protokołu.

1. Przygotowanie próbek i ekstrakcja kwasowa
<ol>
	<li>Liofilizować próbki gleby po pobraniu z terenu.</li>
	<li>Rozmieć i zhomogenizować próbki gleby za pomocą młyna kulowego, rozdrabniacza do gleby lub moździerza z tłuczkiem.</li>
	<li>Odważyć próbki gleby (zawierające &gt; 0,3 mg N) do kolby hydrolizy o pojemności 25 mL.</li>
	<li>Dodać 10 mL 6M HCl do każdej kolby hydrolizy, napełnić kolby gazem N2 i szczelnie zamknąć.</li>
	<li>Hydrolizować w temperaturze 105 °C w inkubatorze przez 8 godzin, korzystając z automatycznego przełącznika czasowego.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie próbek
<ol>
	<li>Wyjmij kolby z inkubatora i ostudź do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Do każdej kolby dodaj 100 μL wewnętrznego standardu myo-inozytolu (1 mg mL-1 w wodzie); wymieszaj poprzez delikatne potrząsanie.</li>
	<li>Przygotuj plastikowe lejki odprowadzające ciecz do kolb gruszkowatych o pojemności 200 mL ze szlifami ST/NS 24/40, ustawiając je na plastikowych podstawkach dla stabilności.</li>
	<li>Złóż filtry jakościowe Whatman #2 (średnica 11 cm) w ćwiartki i umieść w lejkach.</li>
	<li>Zamieszaj zawartość każdej kolby po hydrolizie i przelej zawiesinę do lejka w celu przefiltrowania (każdą kolbę można dodatkowo przepłukać ~3 mL wody).</li>
	<li>Wysusz filtrat za pomocą ewaporatora rotacyjnego w temperaturze ~45 °C pod próżnią.</li>
	<li>Resztki z każdej kolby gruszkowatej resuspenduj w 3~5 mL wody (w razie potrzeby użyj kąpieli ultradźwiękowej) i przelej do teflonowej probówki o pojemności 40 mL; przepłucz kolbę drugą porcją wody.</li>
	<li>Dostrój pH do wartości 6,6 - 6,8 za pomocą 1M roztworu KOH, aby wytrącić jony metali i inne cząsteczki organiczne.</li>
	<li>Usuń osad poprzez wirowanie przy 2000 rcf przez 10 minut.</li>
	<li>Przelej nadsącz do szklanej probówki o pojemności 40 mL, zakryj otwór probówki parafilmem, zamroź w temperaturze -20 °C, a następnie wykonaj otwory w parafilmie.</li>
	<li>Liofilizuj zamrożony nadsącz, aby usunąć cały płyn.</li>
	<li>Rozpuść pozostałość w 3 mL suchego metanolu, dokładnie mieszając w wstrząsaczu vortex (w razie potrzeby użyj kąpieli ultradźwiękowej); zakręć probówkę, a następnie wiruj przy 2000 rcf przez 10 minut, aby osadzić sole.</li>
	<li>Przenieś nadsącz do stożkowej probówki reakcyjnej o pojemności 3 mL; odparuj do suchości za pomocą urządzenia RapidVap w temperaturze 45 °C (lub, jeśli preferowane, pod łagodnym strumieniem suchego azotu).</li>
	<li>Do każdej probówki dodaj 100 μL standardu odzysku N-metyloglukaminy (1 mg mL-1 w wodzie) oraz 1 mL H2O, zakryj ujścia probówek parafilmem, zamroź w temperaturze -20 °C, wykonaj perforację w parafilmie, a następnie poddaj liofilizacji.</li>
	<li>Przygotuj standardy: dodaj 100 μL kwasu muraminowego (0,5 mg mL-1 w metanolu), 100 μL glukozaminy (1 mg mL-1 w wodzie), 100 μL myo-inozytolu (1 mg mL-1 w wodzie), 100 μL N-metyloglukaminy (1 mg mL-1 w wodzie) oraz 1 mL H2O, każdą probówkę zakryj parafilmem, zamroź w temperaturze -20 °C, wykonaj perforację w parafilmie, a następnie poddaj liofilizacji.</li>
</ol>
3. Derywatyzacja
<ol>
	<li>Przygotować odczynnik do derywatyzacji zawierający 32 mg mL-1 chlorowodorku hydroksyloaminy oraz 40 mg mL-1 4-dimetyloaminopirydyny w mieszaninie pirydyna-metanol (4:1 v/v).</li>
	<li>Do każdej z probówek reakcyjnych dodać 300 μL odczynnika do derywatyzacji, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać na wortexie.</li>
	<li>Probówki umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 75-80 °C na 35 minut (probówki muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec przedostawaniu się wody do wnętrza).</li>
	<li>Wyjąć probówki z łaźni wodnej i schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Do każdej z probówek reakcyjnych o pojemności 3 mL dodać 1 mL bezwodnika octowego, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać na wortexie, a następnie ponownie podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 75-80 °C przez 25 minut.</li>
	<li>Wyjąć probówki z łaźni wodnej i schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
4. Separacja i pomiar
<ol>
	<li>Do każdej probówki dodać 1,5 mL dichlorometanu, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać w wortexie.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 1 mL 1M HCl, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać w wortexie, a następnie pozostawić roztwory w spokoju do czasu rozdzielenia się dwóch faz; górną fazę (wodną) odessać i odrzucić, używając pipety o objętości 1000 μL.</li>
	<li>W ten sam sposób przeprowadzić ekstrakcję fazy organicznej 3 razy, lecz z użyciem 1 mL H2O (podczas ostatniego etapu przemywania należy zwrócić szczególną uwagę, aby usunąć całą górną fazę wodną).</li>
	<li>Odsuszyć końcowy roztwór za pomocą urządzenia RapidVap w temperaturze 45 °C (lub osuszyć azotem, jeśli jest to preferowane).</li>
	<li>Rozpuścić w 300 μL mieszaniny octanu etylu i heksanu (1:1 v/v), a następnie przenieść do bursztynowych probówek z nakrętką o pojemności 2 mL z wkładką do małych objętości i szczelnie zamknąć.</li>
	<li>W celu ilościowego oznaczenia przeprowadzić analizę metodą GC-FID, używając niepolarnej kapilarnej kolumny z topionego krzemienia: długość 30 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, grubość warstwy 0,25 μm; faza stacjonarna 5% fenylo-, 95% metylo-polysiloksan (DB-5 lub odpowiednik) z wodorem lub helem jako gazem nośnym, przy stałym przepływie 0,5 mL min-1. Chromatografia przebiega lepiej na wysokiej jakości fazach „inertywnych” i przy użyciu wodoru jako gazu nośnego, jednak wyniki są akceptowalne również dla powszechniejszych wariantów i przy użyciu helu. Parametry detektora wynoszą 300 °C; 400 mL min-1 powietrza oraz 30 mL min-1 dla gazów pomocniczych azotu i wodoru. Parametry wtrysku i temperatury pieca są następujące: wtrysk dzielony 1 μL (30:1) przy temperaturze wlotu GC 250 °C; początkowa temperatura pieca 120 °C; czas utrzymania 1 min.; wzrost temperatury pieca o 10 °C min-1 do 250 °C; czas utrzymania 2,5 min.; wzrost temperatury do 270 °C w tempie 20 °C min-1; czas utrzymania 2 min.; wzrost temperatury do 290 °C w tempie 20 °C min-1; czas utrzymania 5 min. Dostosować szybkość przepływu gazu nośnego tak, aby pochodne inozytolu, glukozaminy i kwasu muraminowego eluowały w 270 °C, a N-metyloglukamina eluowała w 270 °C.</li>
</ol>
5. Walidacja pochodnej
<ol>
	<li>Zastosuj miękką jonizację LC-ESI-TOF-MS w celu identyfikacji jonu cząsteczkowego i wyznaczenia masy cząsteczkowej pochodnej.</li>
	<li>W celu zwiększenia czułości wykorzystaj GC-EI-MS-SIM lub GC-EI-MSMS do badania wybranych jonów pochodnej.</li>
	<li>Do przygotowania pochodnych użyj wielu reagentów znakowanych izotopowo, a następnie wykorzystaj przesunięcie masy tych pochodnych znakowanych izotopowo w MS do analizy jonu cząsteczkowego i fragmentów jonowych.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Protokół metody składa się głównie z czterech etapów: trawienia kwasowego, oczyszczania próbki, derywatyzacji i oznaczenia metodą GC (Rysunek 1). Przykład analizy glukozaminy i kwasu muramowego z roztworów wzorcowych oraz z próbki gleby przedstawiono na Rysunku 2. Oprócz glukozaminy i kwasu muramowego za pomocą tej metody można jednocześnie oznaczyć mannozaminę i galaktozaminę (dwa izomery glukozaminy). Na podstawie czynników odpowiedzi standardów względem standardu wewnętrznego myo-inozytolu można wyznaczyć ilość tych biomarkerów w próbkach gleby. Standard odzysku został wykorzystany do jakościowego monitorowania procesu derywatyzacji. Schematy powstawania derywatów octowych aldonitryli glukozaminy i kwasu muramowego przedstawiono na Rysunku 3.
Proponowane struktury pochodnych określono za pomocą GC-EIMS-SIM w celu zwiększenia czułości lub LC-ESI-TOF-MS z miękką jonizacją8; proponowane struktury fragmentów jonowych powstałych podczas jonizacji elektronowej zbadano poprzez porównanie widm jonowych próbek przygotowanych z różnymi wbudowaniami izotopowymi11. Rysunek 4 przedstawia przesunięcie masy dominującego jonu m/z 187 acetylowanej pochodnej aldonitrylu glukozaminy w trzech scenariuszach, przygotowanych z nieznakowanymi odczynnikami, D-bezwodnikiem octowym oraz U-13C-glukozaminą. Po dalsze szczegółowe informacje i wyjaśnienia można odnieść się do naszych ostatnich publikacji8, 11. Strategia ta może służyć jako model do badania chemii pochodnych.
<img alt="Schemat pomiarowy, proces ekstrakcji; metoda GC, etapy pochodnowania i oczyszczania." src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat pomiarowy protokołu analizy glukozaminy i kwasu muramowego w próbkach gleby. Protokół składa się z 4 głównych etapów: trawienia kwasowego, oczyszczania, pochodnowania oraz oznaczenia metodą GC.
<img alt="Wykres chromatograficzny analizujący związki; standard w porównaniu z próbką gleby w celu obliczenia czynnika odpowiedzi." src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Chromatogramy GC-FID octanów aldononitryli inozytolu, glukozaminy, kwasu muraminowego, mannozaminy, galaktozaminy i metyloglukaminy dla standardów oraz gleby.
<img alt="Mechanizm reakcji chemicznej; wzory strukturalne; synteza organiczna; schemat wieloetapowej transformacji." src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schematy tworzenia acetylowanych pochodnych aldonitryli glukozaminy i kwasu muraminowego. Numer 1 oznacza reakcję nitrylową. Numer 2 oznacza acetylację.
<img alt="Widma spektrometrii mas; analiza fragmentów; schemat ze wzorami strukturalnymi i pikami molekularnymi." src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Widma mas pochodnej octowej aldononitrylu glukozaminy wraz z dominującymi strukturami jonów w trybie EI, przygotowanej przy użyciu (A) odczynników nieznakowanych, (B) anhydrydu D-octowego, (C) U-13C-glukozaminy. Gwiazdka oznacza atom ciężkiego izotopu lub grupę izotopową. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

<ol><li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+and+Fertility+of+Soils%22%5BJournal%5D)">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li>
<li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+studying+soil+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li>
<li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity%2C+biomass%2C+and+diversity+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Nutrition+and+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li>
<li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Science+Society+of+America+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li>
<li>Amelung, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmelung%2C+W+%22Assessment+Methods+for+Soil+Carbon%22">Assessment Methods for Soil Carbon</a>. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).</li>
<li>Guerrant, G. O., Moss, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile%2C+O-methyloxime%2C+alditol%2C+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li>
<li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid%2C+glucosamine%2C+mannosamine%2C+and+galactosamine+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li>
<li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li>
<li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GC%2FMS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li>
<li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li>
<li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li>
<li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona metoda oparta na GC do analizy glukozaminy i kwasu muraminowego zderywowanych do octanu aldonionitrylu stanowi stosunkowo szybki sposób ilościowego oznaczenia tych cukrów aminowych wyekstrahowanych z gleby. Pochodne te są stabilne chemicznie i mogą być oznaczane w ramach jednej analizy. Metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do próbek gleby i może zostać uproszczona w przypadku próbek pochodzących z macierzy nieglebowych.
Pompa próżniowa użyta w tej metodzie jest odporna na dział...

<table><tbody><tr><td>Kwas muraminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2503-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek D-(+)-glukozaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1514-100G</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004-500G</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A307003G025</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (bezwodny)</td><td>Acros Organics</td><td>AC326950010</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna</td><td>Acros Organics</td><td>AC148270050</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>VWR international</td><td>BJGC100-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek hydroksyloaminy</td><td>Fisher Scientific</td><td>H330-100</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>P368-500</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10-100</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan (chlorek metylenu)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-500</td><td></td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (6M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S456-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek hydroksyloaminy&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt;N</td><td>Icon services</td><td>IN5280</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;H (D&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros Organics</td><td>AC174670050</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza-U&lt;sup&gt;-13&lt;/sup&gt;C</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt;N </td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-713-1</td><td></td></tr><tr><td>Rapid-Vap</td><td>Labconco Corp.</td><td>790002</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>KNF Neuberger</td><td>D-79112</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hydrolizy</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 423A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofiolka do derywatyzacji</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-100E</td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>6890</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5972</td><td></td></tr><tr><td>LC-ESI-TOF-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>System HPLC serii Agilent 1200 połączony z Agilent LC/MSD-TOF</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie za pomocą gc pochodnych octowych aldonionitryli glukozaminy i kwasu muraminowego w celu oznaczenia pozostałości mikrobiologicznych w glebie

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Ilościowe podejścia do charakterystyki mikroorganizmów są kluczowe dla szerszego zrozumienia stanu i funkcji drobnoustrojów w ekosystemach. Obecne strategie analizy mikrobiologicznej obejmują zarówno tradycyjne laboratoryjne techniki zależne od hodowli, jak i metody oparte na bezpośredniej ekstrakcji i oznaczeniu określonych biomarkerów1, 2. Niewiele z różnorodnych gatunków drobnoustrojów zasiedlających glebę nadaje się do hodowli, w związku z czym metody zależne od hodowli wprowadzają istotne obciążenia systematyczne, co jest ograniczeniem nie występującym w analizie biomarkerów.
Glukozamina, mannozamina, galaktozamina i kwas muraminowy są powszechnie stosowane jako wskaźniki zarówno żywej, jak i martwej biomasy mikrobowej, z czego glukozamina (najbardziej obfita) oraz kwas muraminowy (obecny wyłącznie w komórkach bakteryjnych) stanowią najważniejsze składniki w systemach glebowych3, 4. Jednak brak wiedzy na temat przeprowadzania analiz ogranicza powszechne rozpowszechnienie tej metody w środowisku naukowym. spośród wszystkich istniejących metod analitycznych, pochodniowanie do octanów aldononitryli z następującą po nim analizą metodą GC okazało się korzystną opcją pod względem optymalnego zrównoważenia precyzji, czułości, prostoty, dobrego rozdziału chromatograficznego oraz stabilności podczas przechowywania próbek5.
W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół wiarygodnej i stosunkowo prostej analizy glukozaminy i kwasu muramowego z gleby po ich konwersji do octanów aldonitryli. Protokół składa się głównie z czterech etapów: trawienia kwasowego, oczyszczania próbek, derywatyzacji oraz oznaczania metodą GC. Procedura krok po kroku została zmodyfikowana na podstawie wcześniejszych publikacji6, 7. Ponadto przedstawiamy strategię strukturalnej walidacji jonu molekularnego pochodnej oraz jego fragmentów jonowych powstałych podczas jonizacji elektronowej. Zastosowaliśmy metody GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS oraz odczynniki znakowane izotopowo, aby określić masę cząsteczkową derywatyzowanej glukozaminy i kwasu muramowego w formie octanów aldonitryli; przesunięcia masy pochodnych znakowanych izotopowo w widmie jonowym wykorzystaliśmy do zbadania fragmentów jonowych każdej z pochodnych8. Oprócz wyjaśnienia teoretycznego, walidacja jonu molekularnego pochodnej i jego fragmentów jonowych będzie przydatna badaczom wykorzystującym δ13C lub fragmenty jonowe tych biomarkerów w badaniach biogeochemicznych9, 10.

Opisujemy protokół metody do analizy pochodnych octanu aldonitrylu glukozaminy i kwasu muraminowego ekstrahowanych z gleby za pomocą chromatografii gazowej (GC). W celu wyjaśnienia mechanizmu chemicznego przedstawiamy również strategię potwierdzenia struktury pochodnej oraz fragmentów jonowych powstających podczas jonizacji elektronowej.

Wykrywanie za pomocą GC pochodnych octowych aldonionitryli glukozaminy i kwasu muraminowego w celu oznaczenia pozostałości mikrobiologicznych w glebie

Metody ilościowe służące do charakteryzowania mikroorganizmów są kluczowe dla szerszego zrozumienia stanu i funkcji mikrobów w ekosystemach.

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie szczegółowego opisu analizy pochodnych octanu nitrylu Aldonu glukozaminy i kwasu mukonowego ekstrahowanych z gleb z wykorzystaniem techniki GC. Proces rozpoczyna się od trawienia kwasowego, które prowadzi do rozkładu polimerów organicznych i uwalniania glukozaminy oraz kwasu mukonowego. Następnie monomery aminocukrów są izolowane i oczyszczane z roztworu mieszaniny.Następnie przeprowadza się derywatyzację w celu przekształcenia tych aminocukrów w lotne octany nitryli aldonowych przeznaczone do analizy metodą chromatografii gazowej. Ostatnim etapem procedury jest ekstrakcja ciecz-ciecz oraz oznaczanie metodą GC. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące rozdzielenie linii bazowej octanów nitryli aldonowych aminocukrów elujących między standardami myo, acetolu i metyloglutaminy podczas analizy GC z detekcją za pomocą detektora jonizacji płomieniowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest optymalna równowaga między precyzją, czułością, prostotą, dobrą chromatyczną separacją graficzną a stabilnością podczas przechowywania próbek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu globalnego obiegu węgla, takie jak wkład mikroorganizmów SSE do pul stabilnego węgla glebowego. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd i informacje na temat akumulacji detrytusu mikrobiologicznego w glebach, może być ona również stosowana w innych macierzach, takich jak systemy oceaniczne, tkanki biologiczne, a nawet próbki pozaziemskie.Aby rozpocząć ten protokół, należy liofilizować próbki gleby po ich pobraniu w terenie, a następnie zmielić i uhomogenizować je za pomocą młyna kulowego do gleby lub moździerza z tłuczkiem. Odważone próbki zmielonej gleby należy umieścić w 25 mililitrowych kolbach do hydrolizy. Do każdej kolby należy dodać 10 mililitrów kwasu solnego o stężeniu six molar, a następnie wypełnić kolby azotem przed szczelnym zamknięciem.Hidrolizować w temperaturze 105 °C w inkubatorze przez osiem godzin. Korzystając z automatycznego przełącznika czasowego, wyjąć kolby z inkubatora i schłodzić do temperatury pokojowej.Do każdej kolby dodaj 100 µL wewnętrznego standardu myo-acetolu. Wymieszaj poprzez delikatne potrząsanie; przygotuj lejki plastikowe odprowadzające ciecz do kolb gruszkowych o pojemności 200 mL. Zastosuj szlifowane połączenia szklane o standardowej średnicy 24/40, ustawione na plastikowych uchwytach w celu zapewnienia stabilności.Złożyć okrągłe filtry jakościowe Whatman nr 2 na cztery części i umieścić je w lejkach. Zamieszać zawartość każdej kolby do hydrolizy i przelać zawiesinę do lejka. Aby odfiltrować każdą próbkę, odparować filtrat za pomocą ewaporatora rotacyjnego w temperaturze około 45 °C przy zastosowaniu próżni.Resztki wysuszone w każdej kolbie typu pear zawiesić w 3–5 ml wody i przelać do 40 ml teflonowej probówki. Każdą kolbę wypłukać drugą porcją wody. Doprowadzić pH próbek do poziomu 6,6–6,8, używając 1 M roztworu wodorotlenku potasu, aby wytrącić jony metali i inne cząsteczki organiczne. Następnie usunąć osady poprzez wirowanie z prędkością 2000 ×g przez 10 minut.Przelej supernatanty do szklanych probówek o pojemności 40 ml i zakryj otwory probówek parafilmem, a następnie zamroź supernatanty i wykonaj otwory w parafilmie. Liofilizuj zamrożone supernatanty, aby usunąć całą ciecz. Po wysuszeniu supernatantów rozpuść osad w trzech mililitrach bezwodnego metanolu.Po dokładnym wymieszaniu na wirówce vortex, szczelnie zakręć probówki, a następnie odwiruj z prędkością 2000 ×g przez 10 minut. Aby osadzić sole, przenieś nadsączniki do stożkowych fiolek reakcyjnych o pojemności 3 ml i odparuj do suchości za pomocą szybkiego ewaporatora w temperaturze 45 °C lub pod łagodnym strumieniem suchego azotu. Po odparowaniu do każdej fiolki dodaj 100 µL standardu odzysku i metyloglutaminy oraz 1 ml wody.Następnie zamroź próbki przed rozpoczęciem derywatyzacji. Przygotuj wzorce zgodnie z opisem w protokole pisemnym, a następnie liofilizuj zarówno próbki, jak i wzorzec. Przygotuj odczynnik do derywatyzacji zawierający 32 mg/ml chlorku hydroksyloaminy oraz 40 mg/ml.Cztery dimethyl amino purine w metanolu purynowym. Do każdej z reakcyjnych probówek dodać 300 µL odczynnika do derywatyzacji, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać na wortexie. Zamknięte probówki umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze od 75 do 80 °C na 35 minut.Wyjmij probówki z łaźni wodnej i ostudź do temperatury pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr bezwodnika octowego do każdej z trzech mililitrowych probówek reakcyjnych, szczelnie zamknij nakrętki i dokładnie wymieszaj za pomocą wortexa. Po czym przeprowadź drugą inkubację w łaźni wodnej w temperaturze od 75 do 80 °C przez 25 minut.Wyjmij probówki z łaźni wodnej i ostudź je do temperatury pokojowej. Aby rozpocząć separację i pomiar, dodaj 1,5 mililitra dichlorometanu do każdej probówki, a następnie wymieszaj w wortexie. Po dodaniu jednego mililitra jednego molarnego kwasu solnego do każdej probówki i dokładnym wymieszaniu w wortexie, pozostaw roztwory w spokoju do momentu rozdzielenia się dwóch faz.Odssać i odrzucić górną fazę wodną. W ten sam sposób, używając pipety 1000 µL, pobrać fazę organiczną trzykrotnie, przy czym w ostatnim etapie przemywania użyć 1 mL wody. Należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że cała górna faza wodna została usunięta.Wysuszyć końcowy roztwór za pomocą szybкого koncentratora próżniowego (VAP) w temperaturze 45 °C lub za pomocą strumienia azotu, rozpuścić każdą próbkę w 300 µL octanu etylu i heksanu, a następnie przenieść do 2 ml bursztynowych fiolek z nakrętką i wkładką do małych objętości i szczelnie zamknąć w celu ilościowego oznaczenia metodą chromatografii gazowej z detektorem jonizacji płomieniowej, wykorzystując niepolarną kolumnę kapilarną z topionego krzemianu, taką jak DB-5, zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym. Po standardowym przebiegu i analizie dostosować szybkość przepływu gazu nośnego tak, aby pochodne acetologlukozaminy i kwasu mukamowego eluowały w temperaturze 250 °C, a końcowa metyloglutamina eluowała w temperaturze 270 °C.Po uruchomieniu chromatografu gazowego przeprowadź wtrysk 1 µL w trybie split 30:1, przy temperaturze wlotu GC ustawionej na 250 °C, przy użyciu autosamplera. W ostatnim kroku tej procedury przeprowadź walidację pochodnej, korzystając z metod chromatograficznych i spektrometrycznych opisanych w protokole pisemnym. Tutaj przedstawiono przykłady analiz glukozaminy i kwasu mocznikowego z wzorców oraz z próbki gleby; oprócz glukozaminy i kwasu mukowego, za pomocą tej metody można jednocześnie oznaczyć dwa izomery glukozaminy – ozaminę i galaktozaminę, w oparciu o dokładną ilość zastosowanych wzorców oraz współczynniki odpowiedzi dla każdego z dwóch standardów wewnętrznych.Można określić ilość tych biomarkerów w próbkach gleby. Wzorzec odzysku został również wykorzystany do jakościowego monitorowania procesu derywatyzacji. Tutaj przedstawiono schematy powstawania octanu nitrylu aldonowego, pochodnej glukozaminy oraz kwasu mukonowego.Numer jeden oznacza reakcję nitrylową, a numer dwa acetylowanie. Proponowane struktury fragmentów jonowych powstałych w wyniku jonizacji elektronowej zbadano poprzez porównanie widm jonowych próbek przygotowanych z zastosowaniem różnych włączeń izotopowych. Tutaj przedstawiono przesunięcie masy dominującego jonu pochodnej acetanu nitrylu aldonu glukozaminy w różnych scenariuszach.W tym przykładzie preparat przygotowano z nieoznaczonych odczynników, a także z izotopowo znakowanego bezwodnika octowego oraz izotopowo znakowanej glukozaminy. Gwiazdka na strukturze chemicznej oznacza atom ciężkiego izotopu lub grupę izotopową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie rygorystycznie bezwodnych warunków podczas derywatyzacji.Zarówno rozpuszczalniki organiczne, jak i szkło laboratoryjne używane na tym etapie muszą być suche. Choć wielu dostawców oferuje rozpuszczalniki bezwodne, dostępne zasoby można osuszyć, przepuszczając je przez kolumny zawierające odczynniki suszące, takie jak siarczan magnezu. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas z rozdzielczością izotopową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące reakcji makrofauny, obrotu i akumulacji węgla lub azotu w glebach, poprzez rozróżnienie żywych i martwych organizmów makroskopowych po ich rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny makroekologii, biologii i chemii gleb do zbadania wkładu makroorganizmów w materię organiczną gleby oraz sekwestracji w naturalnych lub zarządzanych systemach lądowych.

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie pochodnych acetylowanilonitrylowych glukozaminy i kwasu muramowego opartych na GC w celu określenia pozostałości mikroorganizmów w glebie

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Test bioreporterowy całej komórki z Burkholderia sartisoli RP037-mChe został opracowany do wykrywania frakcji zanieczyszczenia organicznego (tj. fluoru) dostępnego do degradacji bakteryjnej po aktywnym transporcie przez grzybnię wypełniającą pory wypełnione powietrzem w systemie modelowym nienasyconym wodą.

Podejście bioreporterowe oparte na całej komórce do oceny transportu i biodostępności zanieczyszczeń organicznych w systemach nienasyconych wodą

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Ilustrujemy metody związane z badaniem przesiewowym i identyfikacją mikrobów wytwarzających biosurfaktanty. Przedstawiono również metody charakterystyki chromatograficznej i identyfikacji chemicznej biosurfaktantów, określające przemysłowe zastosowanie biosurfaktantu w zwiększaniu odzysku oleju resztkowego.

Zwiększony odzysk oleju dzięki połączeniu biosurfaktantów

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Obecny protokół opisuje ekstrakcję aminokwasów niebiałkowych z matryc biologicznych poprzez wytrącanie białek kwasu trichlorooctowego (TCA) i hydrolizę kwasową przed analizą za pomocą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas.

Ekstrakcja aminokwasów niebiałkowych z cyjanobakterii do analizy chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Tutaj opisana jest metoda chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas (HS-GC-MS/MS) odpowiednia do oznaczania trimetyloaminy (TMA) w lekach pochodzenia zwierzęcego. Protokół obejmuje wstępną obróbkę próbki, obróbkę w przestrzeni nad głową, warunki analizy, walidację metodologiczną oraz oznaczanie TMA w lekach pochodzenia zwierzęcego.

Ulepszona technika wykrywania trimetyloaminy w medycynie pochodzenia zwierzęcego za pomocą chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas w przestrzeni czołowej

Ten protokół przedstawia w pełni zautomatyzowany przepływ pracy do ekstrakcji geosminy i 2-metyloizoborneolu z wody i bogatych w lipidy tkanek ryb. Metoda pozwala na wczesne wykrycie tych cząsteczek, zanim osiągną one progi zapachowe. Przedstawiono reprezentatywne dane z otoczenia akwakultury.

Ekstrakcja i wykrywanie geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i rybach przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS

Protokół został opracowany do przygotowania oczyszczonych mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji białek mitochondrialnych do uwalniania N-glikanów oraz szybkiego wykrywania subkomórkowych, mitochondrialnych glikanów za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą w podczerwieni, jonizacji elektrorozpylanej w połączeniu z precyzyjnym analizatorem mas o wysokiej rozdzielczości.

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Poznaj metodę GC do analizy pochodnych aldononitrylu octanu glukozaminy i kwasu muraminowego w glebie. Protokół obejmuje trawienie kwasowe, izolację cukrów aminowych, derywatyzację oraz ekstrakcję ciecz-ciecz.

Wykrywanie octanu aldononitrylu, derywatyzowanej glukozaminy i kwasu muraminowego na podstawie GC do oznaczania pozostałości mikrobiologicznych w glebie (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie za pomocą GC pochodnych octowych aldonionitryli glukozaminy i kwasu muraminowego w celu oznaczenia pozostałości mikrobiologicznych w glebie

Przeglądaj więcej filmów