Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Ogólnym celem niniejszej procedury jest spójne i łatwe indukowanie EAE u dowolnej szczepu myszy, w tym u tych uznawanych za oporne na indukcję EAE. Osiąga się to poprzez uprzednie immunizowanie myszy dawców białkami swoistymi dla mieliny lub antygenami peptydowymi, zemulgowanymi w pełnym adjuwancie Freunda. Po 10 dniach izoluje się węzły chłonne od myszy dawców, a komórki węzłów chłonnych są restymulowane in vitro poprzez hodowlę z tym samym antygenem przez cztery do pięciu dni.

Następnie komórki są transferowane adoptywnie do naiwnych myszy biorców. U podatnych szczepów myszy EAE rozwinie się w ciągu od 8 do 14 dni, aby wywołać EAE u szczepu odpornego. 14 dni po transferze adoptywnym myszy biorcy zostały zimmunizowane antygenem w CFA.

Stosując tę metodę, można wywołać EAE u odpornych szczepów myszy. Główną zaletą protokołu transferu adaptacyjnego i wyzwania w indukcji EAE jest to, że pozwala on na niezawodne wywołanie choroby. Rzadko obserwuje się zachorowalność kliniczną niższą niż 100%.

Protokół indukowania choroby można dostosować do podatnych szczepów myszy, ale co ważniejsze, można go wykorzystać do wywołania EAE u wielu szczepów myszy, które wcześniej uznawano za oporne na tę chorobę. Prezentację procedur przeprowadzi nasz główny asystent badawczy, cha ching.

Zacznij od przygotowania roztworu MBP o stężeniu 2 mg/mL w PBS. Użyj strzykawki z matowym szkłem i złączem luer lock, aby pobrać 100 µL roztworu antygenu na każdą mysz przeznaczoną do immunizacji.

Za pomocą oddzielnej strzykawki pobierz równą objętość kompletnego adiuwantu Freuda H 37 ra. Następnie, używając trójdrożnego kurka, połącz obie strzykawki i przesuwaj tłoki tam i z powrotem, aby wymieszać antygen z adiuwantem do momentu powstania emulsji. Aby zweryfikować, czy proces przebiegł prawidłowo, przenieś roztwór do jednej ze strzykawek i odłącz pustą strzykawkę.

Lekko odciągnij tłok pustych strzykawek, a następnie wydmuchnij kroplę pozostałej mieszaniny do zlewki z czystą wodą w temperaturze pokojowej. Jeśli kropla się rozproszy, ponownie połącz strzykawki i kontynuuj mieszanie. Jeśli kropla pozostaje nienaruszona, co oznacza, że powstała emulsja, powtórz test w celu zebrania emulsji.

Do immunizacji. Połączyć plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml ze strzykawką szklaną, z której usunięto tłok. Ostrożnie przenieść roztwór do plastikowej strzykawki, napełniając ją po brzegi.

Następnie włóż plastikowy tłok i wypuść część emulsji, tak aby pozostało dokładnie 1,2 milliliters. W strzykawce nie powinno znajdować się żadnych pęcherzyków powietrza. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo.

Odłącz plastikową strzykawkę. Załóż igłę o rozmiarze 26 G i wypełnij przestrzeń martwą igły, przesuwając tłok do oznaczenia 1 ml. Mocno unieruchom mysz i odciągnij ogon, trzymając go między palcem serdecznym a małym, tak aby klatka piersiowa i brzuch były łatwo dostępne. Podskórnie.

Wstrzyknąć 50 µL emulsji w klatkę piersiową, tuż nad prawą pachą. Jeśli iniekcja zostanie wykonana prawidłowo, w miejscu wkłucia pojawi się niewielkie białe uwypuklenie. Powtórzyć procedurę nad lewą pachą, następnie puścić ogon i chwycić prawą tylną łapę, odsłaniając prawy bok myszy.

Wstrzyknij 50 µL roztworu tuż poniżej klatki piersiowej. Puść prawą tylną łapę. Obróć mysz w drugą stronę i powtórz iniekcję po lewej stronie.

Od siedmiu do 10 dni po immunizacji. Pobierz węzły chłonne od uśpionych zwierząt. Najpierw ułóż mysz na plecach z rozpostartymi kończynami i przymocuj je do deski sekcyjnej za pomocą szpilek.

Spryskaj mysz etanolem. Następnie, używając sterylnych narzędzi, wykonaj podłużne nacięcie skóry myszy od dolnej części brzucha aż do podbródka.

Wykonaj kolejne nacięcie od brzucha w dół jednej nogi, a następnie w dół drugiej nogi. Odwarstw skórę myszy i przypnij ją do deski sekcyjnej.

Należy również naciąć skórę wzdłuż czterech kończyn. Następnie odchylić i przymocować szpilkami górną część płatów skóry po obu stronach; węzły chłonne pachwinowe i pachowe, które zazwyczaj znajdują się blisko pachwin lub pach, powinny być widoczne jako niewielkie, nieprzezroczyste masy bezpośrednio pod skórą. Za pomocą dwóch pęset precyzyjnych delikatnie usunąć tkankę łączną znajdującą się nad pierwszym węzłem chłonnym.

Należy uważać, aby w trakcie tego procesu nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Po usunięciu tkanki łącznej należy umieścić jedną parę pęset pod węzłem chłonnym i odciągnąć go od ciała. Węzeł chłonny należy przenieść do 35 milimetrowej szalki Petriego zawierającej sterylny PBS, a pozostałe trzy węzły chłonne pobrać w ten sam sposób.

Po pobraniu wszystkich węzłów chłonnych, przenieś szalkę Petriego do komory z laminarnym przepływem powietrza. Używając tłoka sterylnej strzykawki, homogenizuj węzły chłonne w celu uwolnienia komórek, a następnie, aby usunąć zanieczyszczenia, przefiltruj zawiesinę przez nylonowe sito do probówki stożkowej.

Następnie uzupełnić objętość do 50 milliliters sterylnym PBS i wirować komórki przez 10 minutes. Po wirowaniu zawiesić komórki w małej objętości uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli komórkowej i policzyć żywe komórki. Dostosować stężenie do 4×10⁶ cells per milliliter.

Następnie wysiej komórki w ilości 2 ml na dołek w płytce 24-dołkowej. Do każdego dołka dodaj antygen MVP, aby uzyskać stężenie końcowe 100 µg/ml. Po dodaniu antygenu.

Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez pięć dni. Po ponownym stymulowaniu komórek zebrać je, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki z prędkością 1000 RPM przez 10 minut i resuspendować osad w niewielkiej objętości sterylnego PBS.

Następnie należy policzyć komórki i dostosować stężenie żywych komórek do poziomu 2,5 × 10⁸ komórek na ml za pomocą PBS. Pobrać komórki do strzykawki i założyć igłę o rozmiarze 26G w celu wykonania transferu adopcyjnego. Wstrzyknąć 0,2 ml komórek dożylnie do ogona każdej myszy, aby wywołać reakcję u myszy opornych dwa tygodnie po transferze adopcyjnym.

Wstrzyknąć zwierzętom 200 µg antygenu w objętości 200 µL emulsji w taki sam sposób, w jaki przeprowadzono immunizację myszy dawców. Od siedmiu do 10 dni po wyzwaniu rozwinie się choroba porażenna, której postęp można monitorować. Choroba rozpoczyna się od osłabienia ogona.

Stopień zaawansowania choroby ocenia się w następujący sposób: stopień pierwszy, gdy ogon jest wiotki; stopień drugi, jeśli u myszy rozwinie się niedowład jednej kończyny tylnej; stopień trzeci, jeśli obie kończyny tylne są sparaliżowane; stopień czwarty przypisuje się w przypadku paraliżu obu kończyn przednich.

Stopień piąty oznacza większą liczbę myszy. Stopień szósty oznacza śmierć myszy. Jak pokazano tutaj, od siedmiu do 14 dni po wywołaniu choroby u myszy rozwinie się monofazowa choroba porażenna, którą można ocenić zgodnie z klasycznymi kryteriami EAE.

Mimo że myszy mogą wyzdrowieć, nie nastąpi u nich spontaniczny nawrót choroby. Indukcja choroby wymaga stymulacji swoistym antygenem. Wyzwanie samym CFA lub nieistotnym antygenem nie prowadzi do wywołania choroby.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat metody transferu adoptywnego i wyzwania w celu indukowania EAE. Poprzez połączenie transferu adoptywnego komórek węzłów chłonnych specyficznych dla antygenu z wzmacniającym wyzwaniem antygenowym, można łatwo indukować EAE u dowolnej linii myszy. Metoda ta pozwala nam przełamać mechanizmy oporności właściwe dla niektórych linii myszy, a tym samym umożliwia badanie oporności na chorobę. Również.

Technikę tę można z łatwością dostosować do badania dowolnego procesu chorobowego o podłożu autoimmunologicznym.