Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Cześć, nazywam się Shamal i jestem pracownikiem postdoc w zespole TUR Kika w Narodowym Centrum Nauk Biologicznych w Indiach. W tym filmie pokażę Państwu, jak wykonać bio-mikrourządzenie przy użyciu technik soft lithography w warunkach standardowego laboratorium. Urządzenia te zostaną wykorzystane do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości w genetycznych organizmach modelowych.

Niniejszy protokół pozwoli badaczom na wykonanie tego obrazowania poklatkowego u nienaruszonych organizmów bez zastosowania środków znieczulających. Przejdźmy zatem do realizacji. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez znieczulenia genetycznych organizmów modelowych, takich jak *C. elegans*, nienaruszone *D. melanogaster* oraz larwy danio pręgowanego.

W niniejszym badaniu prezentujemy urządzenie do przejrzystej immobilizacji oparte na membranie, wykonane przy użyciu miękkiego formowania PDMS. Aby unieruchomić pojedynczy organizm, lokalizujemy poszczególne zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym, pobieramy je za pomocą małej kropli roztworu buforowego przy użyciu mikropipety, wprowadzamy zwierzę do kanału przepływowego i immobilizujemy je pod membraną PTMS. Proces ten odbywa się przy użyciu przyłącza sprężonego azotem poprzez trójdrożny zawór kulowy.

Zaprojektuj struktury mikroprzepływowe przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Oczyść podłoża krzemowe o wymiarach 2 cm na 2 cm w 20% KH przez jedną minutę i wypłucz wodą destylowaną. Wysusz elementy strumieniem azotu i odwodnij w temperaturze 122 °C przez cztery godziny.

Nanosi się Spinco hexa metal na fragmenty krzemu, wirując z prędkością 500 RPM przez pięć sekund i 3000 RPM przez 30 sekund. Nanosi się Spinco SU 8 2 0 2 5 na wafla krzemowe, wirując z prędkością 500 RPM przez pięć sekund i 2000 RPM przez 30 sekund. Powlekłe fragmenty krzemu poddaje się wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) w temperaturze 65 °C przez jedną minutę oraz w temperaturze 95 °C przez 10 minut.

Naświetl wypieczone wafle powlekone SU-8 lampą UV o mocy 200 W przez fotomaskę dla projektu jeden i projektu dwa, odpowiednio dla warstwy przepływowej i warstwy kontrolnej. Poddaj wafle wygrzewaniu po naświetlaniu (post-bake) w temperaturze 65 °C przez 1 minutę oraz w 95 °C przez 10 minut. Wywołaj próbki, używając roztworu wywoływacza SUA przez 20 minut.

Koduj fragmenty w oparach trichloroperfluorocykloheksanu w eksykatorze przez dwie godziny. Wymieszaj bazę poly dyl xox oraz utwardzacz w stosunku wagowym 10:1. Odgazuj mieszaninę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza powstałe podczas mieszania.

Wlej mieszaninę PDMS o grubości pięciu milimetrów na płytki krzemowe z wzorem SC. Rób to delikatnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Rozprowadź cienką i jednorodną warstwę PDMS na płytkach krzemowych z projektem dla warstwy przepływu, stosując wirowanie przy 500 RPM przez pięć sekund, a następnie przy 1500 RPM przez 30 sekund.

Wypiekać oba elementy projektu jednego oraz projektu dwa zawierające PDMS w temperaturze 50 °C przez sześć godzin. Wyciąć element PDMS z podłoża krzemowego, używając ostrza zawierającego wzorzec SCH dwa. Wywiercić mały otwór na górze zbiornika łączącego główną pułapkę w formie z PDMS.

Używając igły o największej średnicy wkłucia lub igły G18, poddaj dolną powierzchnię warstwy sterującej oraz górną powierzchnię warstwy przepływu działaniu plazmy powietrznej o mocy 18 W przez dwie minuty. Połącz obie powierzchnie poddane działaniu plazmy, przykładając delikatny nacisk, a następnie wypalaj w temperaturze 50 °C przez dwie godziny.

Wytnij powiązane urządzenia z podłoża krzemowego za pomocą projektu SUH nr 1 i wykonaj otwory dostępowe w zbiornikach wlotowym i wylotowym kanału przepływowego. Odsłoń dolną powierzchnię PD urządzenia i czystą szklaną pokrywę. Poddaj działaniu plazmy powietrznej o napięciu 18 V przez dwie minuty.

Przyciśnij delikatnie dwie powierzchnie potraktowane plazmą i wypalaj w temperaturze 50 °C przez dwie godziny. Przechowuj urządzenie w czystym środowisku do przyszłego użycia. Po wykonaniu urządzeń pokażę Państwu, jak wykorzystać membranę PDMS do unieruchomienia C. elegans w urządzeniu. Podłącz jeden koniec rurki Microflex do regulatora ciśnienia gazu azotowego, a drugi koniec do głównego zbiornika pułapki za pomocą igły o rozmiarze 18 G.

Trójdrożny kurek odcinający umieszczony w połowie połączenia rurek umożliwia przyłożenie lub zwolnienie ciśnienia na membranie. Wypełnij rurkę i połączenie z urządzeniem PDMS 10 centymetrową kolumną wody destylowanej przed podłączeniem jej do zbiornika głównej pułapki. Otwórz zawór dopływu azotu, aby uzyskać ciśnienie PSI i monitoruj pod niskim powiększeniem mikroskopu odwróconego ugięcie membrany głównej pułapki w kierunku kanału przepływowego.

Następnie zwolnić trójdrożny kurek i ustawić membranę w pozycji spoczynkowej. Wypełniać kanał przepływowy buforem przez 10 minut. Przed rozpoczęciem eksperymentu zlokalizować pojedynczą osobę gatunku sea elegance, korzystając z mikroskopu stereoskopowego przy niskim powiększeniu.

Pobierz pojedyncze zwierzę wraz z niewielką objętością roztworu buforowego do mikrokońcówki. Wprowadź pojedynczy osobnik przez wlot kanału przepływowego. Dostosuj ciśnienie pipetowania, aby umieścić zwierzę pod główną pułapką.

Powoli zwiększaj ciśnienie membrany PDMS, aby przycisnąć zwierzę do krawędzi kanału i unieruchomić je pod ciśnieniem od 7 do 14 PSI. Użyj mikroskopu odwróconego z ustawieniami odpowiednimi dla wysokiej rozdzielczości obrazowania w świetle przechodzącym lub fluorescencyjnym. Wykonaj pojedyncze obrazy fluorescencyjne lub serię obrazów w określonych odstępach czasu przy zdefiniowanej częstotliwości klatek na sekundę.

Zwolnić ciśnienie pułapki i monitorować zachowanie lokomotoryczne zwierzęcia. Przez pięć minut, przy niskim powiększeniu, wypłukać zwierzę i wprowadzić nowy osobnik. Aby powtórzyć kroki DevOp, użyć odciętej końcówki mikropipety, aby pobrać pojedynczą larvę oph i wprowadzić ją do większego urządzenia mikroferrycznego.

Wprowadź pojedynczą larwę przez wlot kanału przepływowego. Powoli zwiększaj ciśnienie membrany PDMS i unieruchom ją, stosując ciśnienie ESI na poziomie siedmiu. Użyj mikroskopu odwróconego do obrazowania fluorescencyjnego przy niskim powiększeniu, a następnie wykonaj sekwencję obrazów fluorescencyjnych (time-lapse) w celu obrazowania transportu.

Zwolnij ciśnienie pułapki i monitoruj aktywność ruchową larwy przy małym powiększeniu. Wykorzystaj tę samą zasadę działania urządzenia w celu unieruchomienia i wykonania obrazowania poklatkowego 30-godzinnych embrionów ryb zebrowych po zapłodnieniu. Val heart.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo być w stanie wykonać podobne mikrourządzenia we własnym laboratorium i z sukcesem wykorzystać je do immobilizacji organizmów w celu przeprowadzenia wysokorozdzielczych, niezwykłych eksperymentów. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w badaniach.