Name: Proste urządzenia mikroprzepływowe do obrazowania in vivo C. elegans, Drosophila i Danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj proste urządzenia mikroprzepływowe do obrazowania in vivo C. elegans, Drosophila i Danio rerio bez znieczulenia. Membrana PDMS umożliwia immobilizację organizmów do obserwacji procesów biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Krishanu Rayowi za szczepy Drosophila, Tarjani Agarwal za opiekę nad klatką z Drosophila, Peterowi Juo za nuIs25 oraz CGC za szczepy C. elegans. SPK przygotował jsIs609 w laboratorium Michaela Noneta. Dziękujemy Arpanowi Agnihotri (BITS Pilani) za pomoc w obrazowaniu time-lapse transportu mitochondriów u zwierząt jsIs609 w urządzeniach mikrofluidycznych. Jesteśmy wdzięczni dr Vatsali Thirumalai i Surya Prakashowi za dostarczenie embrionów zebrafish. Dziękujemy dr Krishnie oraz CIFF w NCBS za możliwość korzystania z konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym, wspieranego przez Department of Science and Technology- Centre for Nanotechnology (nr SR/55/NM-36-2005). Dziękujemy również Kaustubhowi Rau, V. Venkatramanowi i Chetanie Sachidanand za dyskusje. Praca ta była finansowana ze stypendium podoktorskiego DBT (S.M.), programu fast-track DST (S.M.) oraz grantu DBT dla (S.P.K.). S.A. otrzymał wsparcie z grantów DST i CSIR przyznanych dla SPK.

1. Wytwarzanie matrycy SU8
<ol>
 <li>Zaprojektuj struktury mikrofluidyczne w oprogramowaniu Clewin i wydrukuj je za pomocą plotera laserowego o rozdzielczości 65 024 DPI i minimalnym rozmiarze elementu 8 μm na folii do obwodów drukowanych. </li>
 <li>Oczyść płytki krzemowe o wymiarach 2 cm x 2 cm z natywną warstwą tlenku w 20% KOH przez 1 min, a następnie wypłucz w wodzie dejonizowanej; przygotuj jedną płytkę dla warstwy przepływowej i jedną dla odpowiadającej jej warstwy kontrolnej. </li>
 <li>Osusz elementy strumieniem azotu, a następnie odwodnij na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C przez 4 h. Pozostaw elementy do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.</li>
 <li>Umieszczaj elementy krzemowe pojedynczo na uchwycie wirówki i włącz próżnię. Pokryj powierzchnie krzemu ~20 μl heksametylodysilazanu (HMDS) i nanieś powłokę za pomocą wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 5 s, a następnie przy 3 000 rpm przez 30 s.</li>
 <li>Pokryj całkowicie płytki krzemowe ~1,5 ml SU8-2025 (<a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</a>) i nanieś powłokę za pomocą wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 5 s, a następnie przy 2 000 rpm przez 30 s. Taki protokół wirowania pozwala uzyskać grubość fotorezistu ~40 μm, co jest odpowiednie dla warstw kontrolnych i przepływowych dla wczesnych stadiów larwalnych C. elegans.</li>
 <li>Nanieś ~1,5 ml SU8-2050 za pomocą wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 5 s, a następnie przy 2 000 rpm przez 30 s, aby uzyskać grubość fotorezistu ~80 μm, odpowiednią do wytworzenia warstwy przepływowej dla późnych stadiów larwalnych C. elegans, podstawowej warstwy przepływowej dla larw Drosophila/zebrafish oraz ich odpowiednich warstw kontrolnych.</li>
 <li>Umieść elementy krzemowe na płycie grzejnej warstwą SU8 skierowaną do góry. Przeprowadź wstępne wypalanie (soft bake) pokrytych elementów krzemowych w temperaturze 65 °C przez 1 min, a następnie w 95 °C przez 10 min. Pozostaw elementy do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku. </li>
 <li>Umieść wstępnie wypalone elementy krzemowe na stole naświetlania powierzchnią pokrytą SU8-2025 skierowaną do góry w stronę lampy UV. Użyj maski fotograficznej z projektem I (L1, Ryc. 1B) oraz projektem II (L2, Ryc. 1B) odpowiednio dla wzoru warstwy przepływowej i kontrolnej dla wczesnych stadiów larwalnych C. elegans. Umieść maskę fotograficzną na warstwie SU8 i upewnij się, że maska ściśle przylega do powłoki. Otwórz migawkę lampy UV i naświetlaj wstępnie wypalone płytki SU8 lampą UV o mocy 200 W przez maskę fotograficzną przez 15 s.</li>
 <li>Użyj maski fotograficznej z projektem I (L1, Ryc. 1B) oraz projektem II (L2, Ryc. 1B) na elementach pokrytych SU8-2050 (przygotowanych w kroku 1.6), aby wytworzyć warstwę przepływową i kontrolną dla późnych stadiów larwalnych C. elegans. Użyj maski fotograficznej z projektem I (L1, Ryc. 1C) oraz projektem II (L2, Ryc. 1C) odpowiednio dla podstawowej warstwy przepływowej i warstwy kontrolnej dla larw Drosophila/zebrafish na płytkach pokrytych SU8-2050 (przygotowanych w kroku 1.6). Naświetl powierzchnie SU8 przez maskę fotograficzną lampą UV o mocy 200 W przez 15 s.</li>
 <li>Umieść naświetlone elementy krzemowe na płycie grzejnej warstwą powłoki skierowaną do góry. Przeprowadź wypalanie końcowe (post bake) płytek w temperaturze 65 °C przez 1 min, a następnie w 95 °C przez 10 min. Pozostaw elementy do ostygnięcia przed przejściem do następnego kroku. </li>
 <li>Wywołaj elementy, używając roztworu wywoływacza SU8 przez 20 min. Wypłucz elementy w alkoholu izopropylowym (IPA) i osusz strumieniem azotu.</li>
 <li>Umieść elementy krzemowe w desykatore z wzorem SU8 skierowanym do góry. Powlekaj elementy oparami 50 μl trichloroo(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu w desykatorze przez 2 h.</li>
</ol>
Środki ostrożności: Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z odczynnikami chemicznymi w trakcie traktowania KOH, nakładania i wywoływania fotorezystu. Powlekanie oparami silanu powinno być przeprowadzane wewnątrz eksykatora w wentylowanym pomieszczeniu. Należy chronić rezyst SU8 przed nadmierną ekspozycją na światło. Przy korzystaniu ze źródła światła UV należy stosować okulary ochronne.
2. Wykonanie formy z PDMS
<ol>
 <li>Przygotuj PDMS w stosunku 10:1, łącząc 50 g bazy Sylgard 184 z 5 g czynnika sieciującego w plastikowym kubku. Mieszaj zawartość ręcznie przez ok. 3 min. Odgazuj mieszaninę w deskryptorze, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza powstałe podczas mieszania.</li>
 <li>Wlej ostrożnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, warstwę mieszaniny PDMS o grubości 5 mm na wafle krzemowe z wzorem SU8 projektu II (warstwa kontrolna). W przypadku powstania pęcherzyków podczas wlewania, odgazuj PDMS na wzorze SU8 w niskiej próżni, aby usunąć wszystkie pęcherzyki.</li>
 <li>Umieść wafle krzemowe z wzorem SU8-2025 projektu I (warstwa przepływowa) na uchwycie wirówki i włącz próżnię, aby je ustabilizować. Przykryj wafle ok. 1 ml mieszaniny PDMS i pokryj je za pomocą wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 5 s, a następnie przy 1 500 rpm przez 30 s.</li>
 <li>Nanieś ok. 1 ml mieszaniny PDMS na wafle krzemowe z wzorem SU8-2050 o grubości 80 μm projektu I (L1, Rycina 1B), przeznaczone dla warstwy przepływowej dla późnych stadiów larwalnych C. elegans, używając wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 5 s, a następnie przy 1 000 rpm przez 30 s. Nanieś grubą warstwę mieszaniny PDMS na elementy krzemowe z wzorem SU8-2050 warstwy przepływowej projektu I (L1, Rycina 1C) dla larw Drosophila/zebrafish, używając wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 35 s.</li>
 <li>Wypal w piecu z konwekcyjnym obiegiem gorącego powietrza w temperaturze 50 °C przez 6 h pokryte PDMS elementy krzemowe projektu I oraz wafle z odpowiadającym im projektem II dla warstwy kontrolnej zawierającej PDMS dla C. elegans i/lub larw Drosophila/zebrafish.</li>
 <li>Wytnij element PDMS z podłoża krzemowego zawierającego wzór SU8 II dla C. elegans i/lub larw Drosophila/zebrafish, używając ostrego ostrza. Wywierć mały otwór o średnicy ok. 1 mm nad zbiornikiem łączącym główną pułapkę w formie PDMS za pomocą dziurkacza Harrisa.</li>
 <li>Umieść wydziurawiony blok PDMS (zawierający formę o grubości 40 μm dla warstwy kontrolnej L2) na plastikowej tacy, stroną formowaną warstwy kontrolnej do góry. Umieść pokryty PDMS wafel krzemowy zawierający projekt SU8 o grubości 40 μm projektu I na tej samej tacy, stroną pokrytą PDMS do góry. Wsuń tacę do komory urządzenia do plazmowania i włącz próżnię na 2 min. Następnie włącz zasilanie plazmy i obniż ciśnienie w komorze, aż nabierze ona jasno-różowego koloru. Poddaj obie powierzchnie działaniu plazmy powietrznej o mocy 18 W w niskiej próżni przez 2 min.</li>
 <li>Umieść wydziurawiony blok PDMS usunięty z matrycy SU8 o grubości 80 μm zawierającej wzór II dla późnych stadiów larwalnych C. elegans lub larw Drosophila/zebrafish na plastikowej tacy, stroną formowaną warstwy kontrolnej do góry. Umieść jednocześnie na tej samej tacy odpowiadającą wypaloną warstwę PDMS naniesioną metodą spin-coatingu na wafel krzemowy zawierający projekt o grubości 80 μm projektu I dla późniejszych stadiów C. elegans lub larw Drosophila/zebrafish, stroną płaską pokrytą PDMS do góry. Zastosuj ten sam protokół opisany powyżej, aby poddać je działaniu plazmy powietrznej.</li>
 <li>Złącz dwie powierzchnie potraktowane plazmą dla C. elegans i/lub larw Drosophila/zebrafish, wywierając lekki nacisk, i wypal w piecu z konwekcyjnym obiegiem gorącego powietrza w temperaturze 50 °C przez 2 h.</li>
 <li>Wytnij złączone urządzenia z podłoża krzemowego z projektem SU8 projektu I dla C. elegans i/lub larw Drosophila/zebrafish. Wywierć otwory dostępowe w zbiornikach wlotowym i wylotowym kanału przepływowego.</li>
 <li>Umieść złączoną formę PDMS dla C. elegans na plastikowej tacy, stroną formowaną projektu warstwy przepływowej do góry. Wyczyść szklaną laseczkę przykrywkową (22 X 22 mm, grubość nr 1) i umieść ją na tej samej plastikowej tacy. Wsuń tacę zawierającą formę PDMS i szklaną laseczkę do komory plazmy. Poddaj dolną powierzchnię PDMS urządzenia oraz szklaną laseczkę działaniu plazmy powietrznej o mocy 18 W przy niskim ciśnieniu przez 2 min. Złącz dwie powierzchnie potraktowane plazmą, wywierając lekki nacisk, i wypal w piecu z konwekcyjnym obiegiem gorącego powietrza w temperaturze 50 °C przez 2 h.</li>
 <li>Przechowuj urządzenie w czystym środowisku do przyszłego użycia.</li>
</ol>
3. Dodatkowe kroki dla urządzenia do Drosophila/zebry
<ol>
 <li>Naraź czystą szklaną powierzchnię o wymiarach 2 cm X 2 cm na 50 μl par trichlorosilanu (1H,1H,2H,2H-perfluorooctylu) w eksykanie przez 2 hr.</li>
 <li>Nanieś metodą wirowania ~1 ml mieszaniny PDMS w stosunku 10:1 przygotowanej w kroku 2.1 na sylanizowaną powierzchnię szkła, używając wirówki SPIN150 przy 500 rpm przez 35 sec. Wypal podłoża szklane pokryte PDMS w piecu z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 50 °C przez 6 hr, powierzchnią pokrytą skierowaną do góry. Pozostaw warstwę PDMS do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.</li>
 <li>Wykrawaj w pokrytej warstwie otwór za pomocą specjalnie wykonanego, ostrego metalowego wycinaka w środku PDMS, aby utworzyć warstwę dystansową z PDMS. Kształt metalowego wycinaka jest zaprojektowany analogicznie do projektu przepływu dla Drosophila/danio pręgowanego (L1, Ryc. 1C).</li>
 <li>Naraź warstwę dystansową z PDMS oraz blok z pojedynczym wiązaniem (warstwę przepływową i warstwę kontrolną, wykonane w kroku 2.9 dla larw Drosophila/danio pręgowanego) na plazmę powietrzną o mocy 18 Watt przy użyciu oczyszczacza plazmowego w niskiej próżni. Złącz dwie powierzchnie traktowane plazmą i wypal je w piecu z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 50 °C przez 2 hr.</li>
 <li>Odetnij złączone urządzenie od szkła, wykonaj otwory dostępowe w zbiornikach wlotowym i wylotowym, a następnie przyłącz je do szklanego szkiełka podstawowego (22 X 22 mm, grubość nr 1) przy użyciu oczyszczacza plazmowego, jak opisano w kroku 2.11. W ten sposób powstanie urządzenie do unieruchamiania larw Drosophila pierwszego stadium z wysokością kanału ~500 μm. W przypadku larw danio pręgowanego powtórz proces wytwarzania warstwy dystansowej z PDMS z dodatkowym krokiem łączenia. Podwójna warstwa PDMS-S zapewnia wysokość kanału 900 μm dla 30 hfp larw danio pręgowanego.</li>
</ol>
Środki ostrożności: Należy unikać zanieczyszczeń pyłem podczas wytwarzania urządzeń. Dwie powierzchnie oczyszczone plazmą muszą być całkowicie wolne od pyłu, aby zapewnić prawidłowe wiązanie. W sytuacjach, gdy nie ma dostępu do specjalistycznego pomieszczenia czystego, urządzenia należy przechowywać w eksykatorze, aby zminimalizować gromadzenie się cząsteczek pyłu w urządzeniach.
4. Wykorzystanie membrany PDMS
<ol>
 <li>Podłącz jeden koniec rurki micro-flex (średnica wewnętrzna ~1,6 mm, średnica zewnętrzna ~4,8 mm) do regulatora zasilania sprężonym azotem, a drugi koniec do zbiornika głównej pułapki za pomocą igły o rozmiarze 18 G (średnica zewnętrzna ~1,25 mm) przyklejonej do rurki. Trzydrożny kurek zamontowany w połowie połączenia rurki umożliwia przyłożenie lub zwolnienie nacisku na membranę.</li>
 <li>Wypełnij rurkę podłączoną do urządzenia PDMS słupkiem wody destylowanej o długości 10 cm przed podłączeniem jej do zbiornika głównej pułapki w urządzeniu dla C. elegans i/lub larw Drosophila/rybek danio.</li>
 <li>Ustaw zawór zasilania azotem na wartość 14 psi i monitoruj przy niskim powiększeniu mikroskopu odwróconego ugięcie membrany głównej pułapki w stronę kanału przepływowego. Długość słupka wody w rurce micro-flex ulega skróceniu za każdym razem, gdy trzydrożny kurek jest otwarty. Krawędzie ugiętej membrany są widoczne w świetle przechodzącym (Rysunek 1I i 1J). Ugięcie membrany powoduje przemieszczenie cząstek kurzu/pęcherzyków powietrza pod membraną PDMS i wypchnięcie ich do granic kanału.</li>
 <li>Odczekaj, aż czoło cieczy całkowicie wypełni mikrokanał, nie pozostawiając uwięzionego powietrza.</li>
 <li>Zwolnij ciśnienie za pomocą trzydrożnego kurka, aby membrana powróciła do pozycji spoczynkowej.</li>
</ol>
5. Wprowadzanie larw C. elegans, Drosophila i danio pręgowanego do urządzenia oraz ich unieruchomienie pod elastyczną membraną PDMS
<ol>
 <li>Wypełnij kanał przepływowy buforem M9 [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 L, sterylizować w autoklawie] dla C. elegans 18 lub 1X PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, H2O do 1 L, sterylizować w autoklawie] dla larw Drosophila/zebrafish 19 przez 10 min przed eksperymentem.</li>
 <li>Zlokalizuj pojedynczego osobnika C. elegans o wymaganym stadium na płytce NGM 18 (lub larwy Drosophila pierwszego stadium z agarowej płytki z jajami lub ręcznie dechorionowane larwy zebrafish 30 hpf w medium płynnym 20) za pomocą stereomikroskopu o niskim powiększeniu. Pobierz pojedynczego osobnika, używając małej objętości roztworu buforowego w mikrokońcówce. W przypadku większych larw Drosophila lub zebrafish w buforze użyj mikrokońcówki z odciętym końcem.</li>
 <li>Wprowadź pojedynczy organizm przez wlot kanału przepływowego. Dostosuj ciśnienie pipetowania, aby umieścić osobnika pod główną pułapką.</li>
 <li>Powoli zwiększaj ciśnienie membrany PDMS, aby dosunąć zwierzę do krawędzi kanału i unieruchomić je pod ciśnieniem 14 psi dla C. elegans, 7 psi dla Drosophila i 3 psi dla larw zebrafish.</li>
 <li>Ustaw unieruchomionego osobnika w centrum pola widzenia mikroskopu. Użyj mikroskopu odwróconego z odpowiednimi ustawieniami dla obrazowania w jasnym polu o wysokiej rozdzielczości lub obrazowania fluorescencyjnego. Wykonaj pojedyncze zdjęcia fluorescencyjne lub serię czasową (time-lapse) z predefined frame rate.</li>
 <li>Zwolnij ciśnienie w pułapce i monitoruj lokomocję zwierzęcia przez 5-10 min przy niskim powiększeniu.</li>
 <li>Wypłucz zwierzę i wprowadź nowego osobnika, aby powtórzyć powyższe kroki.</li>
 <li>Wypłucz wszystkie zwierzęta z rezerwuaru odpadów, używając wody destylowanej podawanej strzykawką. Osusz kanał, przepychając powietrze za pomocą strzykawki w celu ponownego użycia w przyszłości.</li>
</ol>
Środki ostrożności: Zwierzęta wymagające wyższego ciśnienia pipetowania w celu przemieszczenia się wewnątrz głównego kanału wykazują tendencję do słabej lokomocji/zdrowia po uwolnieniu z pułapki i powinny być pomijane podczas obrazowania. Należy oczyścić kanał przepływowy z wszelkich śladów buforu, aby zapobiec zatykaniu kanału przez kryształy. W przypadku użycia oleju do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, należy oczyścić szklane szkiełko zakrywe, aby utrzymać korzystny stosunek sygnału do szumu w kolejnych eksperymentach.

<ol><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).</li>
<li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li>
<li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization%2C+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab Chip. 8, 653-656 (2008).</li>
<li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9, 151-157 (2009).</li>
<li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li>
<li>Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+currents+regulate+sensitivity+and+dynamic+range+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons.</a> Neuron. 20, 763-772 (1998).</li>
<li>Snow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95, 905-928 (1980).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).</li>
<li>Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+and+behavioral+effects+of+carbon+dioxide+on+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A.+Mol.+Integr.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. The zebrafish book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+C.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).</li>
<li>Fatouros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tau+aggregation+in+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li>
<li>Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+axonal+kinesin-3+motor+for+fast+anterograde+vesicle+transport+that+facilitates+retrograde+transport+of+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).</li>
<li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).</li>
<li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li>
<li>Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+development+in+the+zebrafish.+I.+Myocardial+fate+map+and+heart+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation.</a> Development. 119, 31-40 (1993).</li>
<li>Hall, D. H., Hedgecock, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li>
<li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104%2FKIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200(2010).</li>
<li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li>
<li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A.+Mol.+Integr.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Urządzenia mikrofluidyczne z PDMS są optycznie przezroczyste, co pozwala na ich wykorzystanie do obrazowania in vivo w wysokiej rozdzielczości dowolnego przezroczystego lub półprzezroczystego organizmu modelowego. Nasz projekt nadaje się do czasoprzestrzennego obrazowania zdarzeń komórkowych i podkomórkowych w wysokim powiększeniu u nienaruszonych żywych zwierząt. Mikrotworzywo z wykorzystaniem technik miękkiej litografii umożliwia łatwą manipulację wymiarami urządzenia dla różnych rozmiarów organizmów modelowyc...

<table><tbody><tr><td>Wafle krzemowe</td><td>University wafer</td><td>150 mm (100) Mech Grade SSP Si</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Clewin</td><td>Oprogramowanie WieWeb</td><td>Wersja 2.90</td><td></td></tr><tr><td>Ploter laserowy</td><td>Fine Line Imaging</td><td>65 024 DPI</td><td></td></tr><tr><td>HMDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>Microchem</td><td>SU8-2025, SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>Wywoływacz</td><td>Microchem</td><td>SU8 Developer</td><td></td></tr><tr><td>Silan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>Oriel</td><td>66943</td><td>Lampa rtęciowa Oriel 200W</td></tr><tr><td>Piec z nadmuchy powietrzem</td><td>Ultra Instruments</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>Ustawiony na 50 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>IKA Laboratory Equipment</td><td>3810000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ika.com&quot; target=&quot;_blank">http://www.ika.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oczyszczacz plazmowy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (spinner)</td><td>Semiconductor Production Systems</td><td>SPIN150-NPP</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.SPS-Europe.com&quot; target=&quot;_blank">www.SPS-Europe.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Gold Seal</td><td>22 X 22 mm, grubość nr 1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center (CGC)</td><td>&lt;em&gt;e1265, ayIs4&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington</td><td>P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Danio pręgowany</td><td>Indyjski typ dziki</td><td>Typ dziki</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tygon</td><td>Sigma</td><td>Z279803</td><td></td></tr><tr><td>Mikroiła</td><td>Sigma</td><td>Z118044</td><td>Pocięta na odcinki o długości 1 cm</td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny</td><td>Sigma</td><td>S7521</td><td></td></tr><tr><td>Wykrawacz Harrisa</td><td>Sigma</td><td>Z708631</td><td></td></tr><tr><td>Sprężony azot</td><td>Lokalny dostawca gazów</td><td></td><td>Użyć regulatora do kontroli ciśnienia</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Andor Olympus</td><td>Konfokalny mikroskop z dyskiem wirującym Yokogawa</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rsbweb.nih.gov/ij&quot; target=&quot;_blank">www.rsbweb.nih.gov/ij&lt;/a&gt;</td><td>Program do przetwarzania obrazów oparty na języku Java</td></tr></tbody></table>

proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo obrazowanie c. elegans, muszka owocówka oraz danio pręgowany

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Mikrofabrykowane urządzenia fluidyczne zapewniają dostępny mikrośrodowisko do badań in vivo na małych organizmach. Proste procesy fabrykacji urządzeń mikrofluidycznych są dostępne dzięki technikom soft litografii 1-3. Urządzenia mikrofluidyczne były wykorzystywane do obrazowania subkomórkowego 4,5, laserowej mikrochirurgii in vivo 2,6 oraz obrazowania komórkowego 4,7. Obrazowanie in vivo wymaga unieruchomienia organizmów. Osiągano to za pomocą ssania 5,8, kanałów zwężających się 6,7,9, odkształcalnych membran 2-4,10, ssania z dodatkowym chłodzeniem 5, gazów anestetycznych 11, żeli wrażliwych na temperaturę 12, kleju cyjanoakrylowego 13 oraz środków anestetycznych, takich jak lewamisol 14,15. Powszechnie stosowane środki anestetyczne wpływają na przekaźnictwo synaptyczne 16,17 i wiadomo, że mają szkodliwy wpływ na subkomórkowy transport neuronalny 4. W niniejszym badaniu prezentujemy urządzenie oparte na membranie z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), które pozwala na unieruchomienie bez użycia środków anestetycznych nienaruszonych genetycznych organizmów modelowych, takich jak Caenorhabditis elegans (C. elegans), larwy Drosophila oraz larwy danio pręgowanego. Organizmy modelowe te nadają się do badań in vivo w urządzeniach mikrofluidycznych ze względu na ich niewielkie średnice oraz optycznie przezroczyste lub półprzezroczyste ciała. Średnice ciała wynoszą od ~10 μm do ~800 μm dla wczesnych stadiów larwalnych C. elegans oraz larw danio pręgowanego i wymagają urządzeń mikrofluidycznych o różnych rozmiarach w celu osiągnięcia pełnego unieruchomienia dla obrazowania time-lapse o wysokiej rozdzielczości. Organizmy te są unieruchamiane za pomocą ciśnienia przyłożonego przez sprężony azot przez kolumnę cieczy i obrazowane przy użyciu mikroskopu odwróconego. Zwierzęta uwolnione z pułapki powracają do normalnej lokomocji w ciągu 10 min.
Prezentujemy cztery zastosowania obrazowania poklatkowego u C. elegans, mianowicie: obrazowanie transportu mitochondriów w neuronach, transportu pęcherzyków presynaptycznych u mutanta z defektem transportu, transportu receptorów glutaminianu oraz podziału komórek neuroblastów Q. Dane uzyskane z takich filmów wykazują, że immobilizacja mikrofluidyczna jest użyteczną i dokładną metodą pozyskiwania danych in vivo dotyczących zdarzeń komórkowych i subkomórkowych w porównaniu do zwierząt poddanych anestezji (Rycina 1J i 3C-F 4).
Wymiary urządzenia zostały zmienione, aby umożliwić obrazowanie typu time-lapse różnych stadiów rozwoju C. elegans, larw Drosophila pierwszego stopnia oraz larw zebrafish. Transport pęcherzyków znakowanych synaptotagminą z GFP (syt.eGFP) w neuronach sensorycznych wykazuje ukierunkowany ruch markerów pęcherzyków synaptycznych ekspresowanych w cholinergicznych neuronach sensorycznych w nienaruszonych larwach Drosophila pierwszego stopnia. Podobne urządzenie zostało wykorzystane do przeprowadzenia obrazowania time-lapse pracy serca w larwach zebrafish około 30 h po zapłodnieniu (hpf). Dane te pokazują, że opracowane przez nas proste urządzenia mogą być zastosowane w różnych systemach modelowych do badania wielu zjawisk biologii komórki i rozwoju in vivo.

Urządzenie do unieruchamiania stanowi dwuwarstwowy blok PDMS, wykonany poprzez połączenie dwóch warstw: warstwy przepływowej (warstwa 1) i warstwy sterującej (warstwa 2), jak pokazano na Rysunku 1. Główna pułapka jest połączona z butlą z azotem poprzez regulator i trójdrożny kurek odcinający, aby przyłożyć niezbędne ciśnienie (3-14 psi) na membranę za pomocą kolumny cieczy (Rysunek 1A). Odgięta membrana unieruchamia C. elegans, Drosophila lub larwy ryb zebrafish w kanal...

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych zebranych z różnych systemów modelowych.

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Mikrofabrykowane urządzenia fluidyczne zapewniają dostępny mikrośrodowisko do badań in vivo na małych organizmach. Proste procesy fabrykacji są ...

Cześć, nazywam się Shamal i jestem pracownikiem postdoc w zespole TUR Kika w Narodowym Centrum Nauk Biologicznych w Indiach. W tym filmie pokażę Państwu, jak wykonać bio-mikrourządzenie przy użyciu technik soft lithography w warunkach standardowego laboratorium. Urządzenia te zostaną wykorzystane do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości w genetycznych organizmach modelowych.Niniejszy protokół pozwoli badaczom na wykonanie tego obrazowania poklatkowego u nienaruszonych organizmów bez zastosowania środków znieczulających. Przejdźmy zatem do realizacji. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez znieczulenia genetycznych organizmów modelowych, takich jak *C. elegans*, nienaruszone *D. melanogaster* oraz larwy danio pręgowanego.W niniejszym badaniu prezentujemy urządzenie do przejrzystej immobilizacji oparte na membranie, wykonane przy użyciu miękkiego formowania PDMS. Aby unieruchomić pojedynczy organizm, lokalizujemy poszczególne zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym, pobieramy je za pomocą małej kropli roztworu buforowego przy użyciu mikropipety, wprowadzamy zwierzę do kanału przepływowego i immobilizujemy je pod membraną PTMS. Proces ten odbywa się przy użyciu przyłącza sprężonego azotem poprzez trójdrożny zawór kulowy.Zaprojektuj struktury mikroprzepływowe przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Oczyść podłoża krzemowe o wymiarach 2 cm na 2 cm w 20% KH przez jedną minutę i wypłucz wodą destylowaną. Wysusz elementy strumieniem azotu i odwodnij w temperaturze 122 °C przez cztery godziny.Nanosi się Spinco hexa metal na fragmenty krzemu, wirując z prędkością 500 RPM przez pięć sekund i 3000 RPM przez 30 sekund. Nanosi się Spinco SU 8 2 0 2 5 na wafla krzemowe, wirując z prędkością 500 RPM przez pięć sekund i 2000 RPM przez 30 sekund. Powlekłe fragmenty krzemu poddaje się wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) w temperaturze 65 °C przez jedną minutę oraz w temperaturze 95 °C przez 10 minut.Naświetl wypieczone wafle powlekone SU-8 lampą UV o mocy 200 W przez fotomaskę dla projektu jeden i projektu dwa, odpowiednio dla warstwy przepływowej i warstwy kontrolnej. Poddaj wafle wygrzewaniu po naświetlaniu (post-bake) w temperaturze 65 °C przez 1 minutę oraz w 95 °C przez 10 minut. Wywołaj próbki, używając roztworu wywoływacza SUA przez 20 minut.Koduj fragmenty w oparach trichloroperfluorocykloheksanu w eksykatorze przez dwie godziny. Wymieszaj bazę poly dyl xox oraz utwardzacz w stosunku wagowym 10:1. Odgazuj mieszaninę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza powstałe podczas mieszania.Wlej mieszaninę PDMS o grubości pięciu milimetrów na płytki krzemowe z wzorem SC. Rób to delikatnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Rozprowadź cienką i jednorodną warstwę PDMS na płytkach krzemowych z projektem dla warstwy przepływu, stosując wirowanie przy 500 RPM przez pięć sekund, a następnie przy 1500 RPM przez 30 sekund.Wypiekać oba elementy projektu jednego oraz projektu dwa zawierające PDMS w temperaturze 50 °C przez sześć godzin. Wyciąć element PDMS z podłoża krzemowego, używając ostrza zawierającego wzorzec SCH dwa. Wywiercić mały otwór na górze zbiornika łączącego główną pułapkę w formie z PDMS.Używając igły o największej średnicy wkłucia lub igły G18, poddaj dolną powierzchnię warstwy sterującej oraz górną powierzchnię warstwy przepływu działaniu plazmy powietrznej o mocy 18 W przez dwie minuty. Połącz obie powierzchnie poddane działaniu plazmy, przykładając delikatny nacisk, a następnie wypalaj w temperaturze 50 °C przez dwie godziny.Wytnij powiązane urządzenia z podłoża krzemowego za pomocą projektu SUH nr 1 i wykonaj otwory dostępowe w zbiornikach wlotowym i wylotowym kanału przepływowego. Odsłoń dolną powierzchnię PD urządzenia i czystą szklaną pokrywę. Poddaj działaniu plazmy powietrznej o napięciu 18 V przez dwie minuty.Przyciśnij delikatnie dwie powierzchnie potraktowane plazmą i wypalaj w temperaturze 50 °C przez dwie godziny. Przechowuj urządzenie w czystym środowisku do przyszłego użycia. Po wykonaniu urządzeń pokażę Państwu, jak wykorzystać membranę PDMS do unieruchomienia C. elegans w urządzeniu. Podłącz jeden koniec rurki Microflex do regulatora ciśnienia gazu azotowego, a drugi koniec do głównego zbiornika pułapki za pomocą igły o rozmiarze 18 G.Trójdrożny kurek odcinający umieszczony w połowie połączenia rurek umożliwia przyłożenie lub zwolnienie ciśnienia na membranie. Wypełnij rurkę i połączenie z urządzeniem PDMS 10 centymetrową kolumną wody destylowanej przed podłączeniem jej do zbiornika głównej pułapki. Otwórz zawór dopływu azotu, aby uzyskać ciśnienie PSI i monitoruj pod niskim powiększeniem mikroskopu odwróconego ugięcie membrany głównej pułapki w kierunku kanału przepływowego.Następnie zwolnić trójdrożny kurek i ustawić membranę w pozycji spoczynkowej. Wypełniać kanał przepływowy buforem przez 10 minut. Przed rozpoczęciem eksperymentu zlokalizować pojedynczą osobę gatunku sea elegance, korzystając z mikroskopu stereoskopowego przy niskim powiększeniu.Pobierz pojedyncze zwierzę wraz z niewielką objętością roztworu buforowego do mikrokońcówki. Wprowadź pojedynczy osobnik przez wlot kanału przepływowego. Dostosuj ciśnienie pipetowania, aby umieścić zwierzę pod główną pułapką.Powoli zwiększaj ciśnienie membrany PDMS, aby przycisnąć zwierzę do krawędzi kanału i unieruchomić je pod ciśnieniem od 7 do 14 PSI. Użyj mikroskopu odwróconego z ustawieniami odpowiednimi dla wysokiej rozdzielczości obrazowania w świetle przechodzącym lub fluorescencyjnym. Wykonaj pojedyncze obrazy fluorescencyjne lub serię obrazów w określonych odstępach czasu przy zdefiniowanej częstotliwości klatek na sekundę.Zwolnić ciśnienie pułapki i monitorować zachowanie lokomotoryczne zwierzęcia. Przez pięć minut, przy niskim powiększeniu, wypłukać zwierzę i wprowadzić nowy osobnik. Aby powtórzyć kroki DevOp, użyć odciętej końcówki mikropipety, aby pobrać pojedynczą larvę oph i wprowadzić ją do większego urządzenia mikroferrycznego.Wprowadź pojedynczą larwę przez wlot kanału przepływowego. Powoli zwiększaj ciśnienie membrany PDMS i unieruchom ją, stosując ciśnienie ESI na poziomie siedmiu. Użyj mikroskopu odwróconego do obrazowania fluorescencyjnego przy niskim powiększeniu, a następnie wykonaj sekwencję obrazów fluorescencyjnych (time-lapse) w celu obrazowania transportu.Zwolnij ciśnienie pułapki i monitoruj aktywność ruchową larwy przy małym powiększeniu. Wykorzystaj tę samą zasadę działania urządzenia w celu unieruchomienia i wykonania obrazowania poklatkowego 30-godzinnych embrionów ryb zebrowych po zapłodnieniu. Val heart.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo być w stanie wykonać podobne mikrourządzenia we własnym laboratorium i z sukcesem wykorzystać je do immobilizacji organizmów w celu przeprowadzenia wysokorozdzielczych, niezwykłych eksperymentów. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w badaniach.

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Proste urządzenia mikrofluidyczne do obrazowania in vivo C. elegans, Drosophila i rybek zebra

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Innowacyjna metoda wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych wykorzystujących laminowanie politereftalanu etylenu (PET) znacznie zmniejsza koszty i złożoność chwytania i obrazowania wielu żywych zarodków danio pręgowanego.

Tanie projekty mikrofluidyki laminacji politereftalanu etylenu do multipleksowanego obrazowania danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj proste urządzenia mikroprzepływowe do obrazowania in vivo C. elegans, Drosophila i Danio rerio bez znieczulenia. Membrana PDMS umożliwia immobilizację organizmów do obserwacji procesów biologicznych.

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Przeglądaj więcej filmów