Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydolnościowe dla Drosophila melanogaster

Celem następnego eksperymentu jest poddanie Dsof oraz Melanogaster treningowi w ramach nowatorskiego programu ćwiczeń wytrzymałościowych oraz ocena efektów tego treningu. Zostaje to osiągnięte poprzez zastosowanie zautomatyzowanego urządzenia, które wielokrotnie podnosi i opuszcza kilka fiolek z muchami, aktywując w ten sposób ich instynktowną reakcję wspinania się, co zapewnia muchom sesję treningową. Muchy są trenowane codziennie według harmonogramu stopniowego zwiększania intensywności, od dwóch do trzech godzin, w trwającym trzy tygodnie okresie treningowym.

Następnie muchy poddawane są różnym testom behawioralnym w celu pomiaru efektów ćwiczeń. Wyniki pokazują, że muchy ćwiczące wspinają się szybciej, co zmierzono za pomocą testu szybko wywołanej ujemnej geotaksji lub testu pierścieniowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trening wytrzymałościowy u innych zwierząt, jest szeroki zestaw dostępnych narzędzi do manipulacji genetycznych u drosophila.

W badaniach nad ćwiczeniami wytrzymałościowymi pomysł na tę metodę pojawił się podczas przeprowadzania licznych testów negatywnej geotaksji. Zastanawialiśmy się, jak długo muchy są w stanie wspinać się i czy w ten sposób możemy poddać je treningowi wytrzymałościowemu. Wieża mocy (power tower) jest zbudowana na prostokątnym kawałku sklejki, który jest przymocowany zaciskami do stołu.

Prędkość obrotowa wynosi 4,5 obrotów na minutę. Silnik przekładniowy spoczywa na kilku deskach i jest podłączony do regulatora prędkości, bezpiecznika oraz wyłącznika zasilania. W skrzynce przyłączeniowej wentylator o średnicy trzech cali, umieszczony w metalowej rurze, jest skierowany na silnik w celu jego chłodzenia.

Do silnika podłączone jest obrotowe ramię z rolką. Podczas pracy silnika i ramienia, obracają się one, naciskając na jeden koniec zgiętego pręta przymocowanego do sklejki. Po drugiej stronie pręta, za pomocą zawiasu drzwiowego, przymocowane jest koło, które może toczyć się po platformie.

Urządzenie porusza się w górę i w dół podczas obrotów silnika, którego moc jest dostosowana tak, aby pełen okres obrotu trwał 15 sekund. Na platformie za pomocą gumek mocowane są stojaki z fiolkami z muszkami, a fiolki umieszczone w tych stojakach są zabezpieczone siatką, która również jest przymocowana do platformy. Dzięki gumkom platforma może przesuwać się w górę i w dół wzdłuż standardowych prowadnic szufladowych, a poduszka ze styropianu amortyzuje wstrząsy podczas opadania. Wieża zasilająca (power tower) jest obsługiwana w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, aby odpowiadała ona warunkom hodowli zwierząt.

Do przeprowadzenia eksperymentu związanego z wysiłkiem fizycznym wymagane jest minimum 240 samców much w tym samym wieku, aby umożliwić podłużne monitorowanie wytrzymałości oraz zdolności wspinania się (ujemna geooks). Muszki należy utrzymywać w populacjach po 20 osobników na fiolkę. Podziel fiolki na dwie równoliczne grupy, z których jedna będzie poddana wysiłkowi; fiolki z tej grupy należy zamknąć korkami z flugów, natomiast grupę kontrolną należy zamknąć korkami gąbkowymi.

Do unieruchomienia wykorzystuje się gąbkę, ponieważ jej dopasowany rozmiar umożliwia łatwe umieszczenie jej przy dnie fiolki. Miększy materiał gąbki ogranicza również urazy powodowane przez twardsze zatyczki. Fiolki z pożywką należy wymieniać co drugi dzień przed przeprowadzeniem testów.

Podczas treningu muchy pozostają w fiolkach z pożywką, ponieważ w przypadku użycia pustych fiolek znacznie więcej osobników ulega obrażeniom związanym z treningiem. Podczas umieszczania fiolek z muchami kontrolnymi na wieży zasilającej, należy docisnąć gąbkowe korki do poziomu około trzech milimetrów nad powierzchnią pożywki, ograniczając w ten sposób ruchy much.

Ruch w celu uzyskania spójnych wyników. Testuj obie grupy much przez pięć kolejnych dni w tygodniu, stosując harmonogram stopniowy, który zwiększa czas trwania sesji z dwóch do trzech godzin dziennie w okresie trzech tygodni. Oczywiście można zastosować dowolny inny schemat.

Niezbędna jest spójność w traktowaniu osobników, porze dnia oraz metodach analizy w ciągu trzytygodniowego okresu. Staranne planowanie i praktyka w wykonywaniu procedur zmniejszają ryzyko wystąpienia błędów związanych ze zmęczeniem. Analizy mogą być prowadzone podłużnie na muchach przed, po lub w trakcie reżimu treningowego.

Może być ona również wykorzystana do oceny bezpieczniejszej odpowiedzi na zmienną środowiskową. Test zmęczeniowy należy przeprowadzić w dniu, w którym nie odbywa się trening. Na początku dnia obie grupy much należy umieścić w wieży mocy (power tower).

Uruchom aparat i obserwuj każdą fiolkę co 10 minut. Jeśli w czterech kolejnych pomiarach w fiolce pięć lub mniej much wspinie się na wysokość powyżej dwóch cali, grupę tę uznaje się za zmęczoną. Usuń zmęczone muchy z wieży zasilającej, gdy ta nadal pracuje, i odnotuj czas ich usunięcia.

Obserwuj wszystkie fiolki przez maksymalnie 10 godzin i zestaw wyniki. Jeden test do oznaczania ilościowego. Efekty treningu są mierzone poprzez codzienny pomiar prędkości biegu, który można przeprowadzać w trakcie całego programu treningowego oraz po jego zakończeniu.

Aby zmierzyć długoterminowy efekt treningu. W celu rozpoczęcia testu prędkości wspinaczki lub testu pierścienia, należy najpierw przenieść muchy do nowych pustych fiolek i umieścić rząd sześciu fiolek w statywie. Do przymocowania fiolek do statywu używa się zwiniętych kawałków taśmy.

Następnie ustaw statyw przed źródłem światła, takim jak kaseta do zdjęć rentgenowskich, która zapewni równomierne oświetlenie probówek. Teraz ustaw aparat do sfotografowania statywu w taki sposób, aby pozycja każdej muchy w każdej probówce była widoczna. Następnie stuknij w sześć probówek, aby wszystkie muchy opadły na ich dno, i wykonaj zdjęcie w określonym czasie.

Dwie sekundy po tym, jak wszystkie muchy zostaną ogłuszone. Jeśli używana jest lampa błyskowa aparatu, należy jej używać konsekwentnie. Powtórz ten proces cztery razy dla każdego zestawu fiolek przed przejściem do wieży zasilającej.

Aby przeanalizować dane, należy indywidualnie ocenić każde zdjęcie za pomocą oprogramowania w celu wyznaczenia górnej i dolnej granicy fiolki. Następnie należy zmierzyć wysokość wspinaczki dla każdej muchy. Następnie skopiuj wartości wysokości wspinaczki do programu Excel.

Każdej muszce w każdej fiolce przypisuje się ocenę od zera do czterech, odpowiadającą wysokości kwadrantu. Wspinaczka do najwyższego kwadrantu otrzymuje ocenę cztery, a całkowity brak wspinaczki – zero. Dla każdej fiolki należy obliczyć ocenę dla każdej z 20 muszek, a następnie wyznaczyć średnią ocenę dla danej kohorty.

Wartość tę nazywa się indeksem wspinania. Do analizy danych wykorzystuje się średnią z czterech indeksów wspinania każdej kohorty wyznaczonych w danym dniu. W przypadku braku oprogramowania do przetwarzania obrazów, na pustych fiolkach można narysować linie kwadrantów, a następnie ręcznie przypisywać muchom wartości kwadrantów, podczas gdy muchy typu odpowiedziały na protokół wytrzymałościowy zmniejszonym związanym z wiekiem spadkiem zdolności wspinania.

Stan ten utrzymywał się po zakończeniu treningu, co odzwierciedlały podłużne testy obręczy (ring assays) przeprowadzone w ciągu pięciu tygodni życia. Zatem indukowanie wysiłku za pomocą programu power tower może służyć jako bodziec behawioralny, a zdolność czynników genetycznych lub środowiskowych do modulowania tego efektu może zostać oceniona. I odwrotnie, power tower może być również wykorzystywany jako miernik efektu (output).

Na przykład, gdy badano czas do wystąpienia zmęczenia u much z różną zawartością sacharozy w diecie, zwiększona zawartość sacharozy korelowała ze zwiększoną wydolnością organizmu. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie kohorty much są w tym samym wieku, a metody są stosowane konsekwentnie przez cały czas trwania eksperymentu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak trenować i oceniać wytrzymałość much o dowolnym genotypie.