Name: Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydajności dla Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj protokół treningu wytrzymałościowego dla Drosophila melanogaster z wykorzystaniem zautomatyzowanego urządzenia. Naucz się oceniać wpływ ćwiczeń na zdolność wspinaczkową much.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NHLBI przyznanego RW.

1. Konfiguracja i obsługa Power Tower
<ol>
 <li>Wieża zasilająca (Power Tower) jest umieszczona na prostokątnym kawałku sklejki przymocowanym zaciskami do stołu. Silnik przekładniowy o prędkości 4,5 rpm firmy Grainger opiera się na czterech deskach o wymiarach 2"x6" i jednej płycie ze sklejki o grubości ¾ cala. Silnik, regulator prędkości AC/DC, bezpiecznik oraz przełącznik włącz/wyłącz są połączone przewodami w puszce przyłączeniowej.</li>
 <li>W celu chłodzenia silnika w pionowym kawałku sklejki o grubości ½ cala wycięto otwór o średnicy 3 cali. Po jednej stronie do sklejki przymocowano wentylator o średnicy 3 cali, a po drugiej metalowy cylinder o średnicy 3 cali.</li>
 <li>Do silnika podłączono wykonane na zamówienie ramię obrotowe z zamontowanym na końcu rolkiem. Silnik wraz z przymocowanym ramieniem obracają się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, naciskając jedną stronę zgiętej profilowej rury kwadratowej o przekroju ¾ cala, która jest przymocowana do sklejki za pomocą zawiasu drzwiowego. Do górnej części profilu rury, poniżej platformy, przymocowano kółko, aby umożliwić jego toczenie się po platformie znajdującej się bezpośrednio nad nim.</li>
 <li>Ramię naciska na jeden koniec profilu rury i unosi koniec przeciwległy, podnosząc dwupoziomową platformę (Rycina 1D). Gdy rolka na ramieniu mija profil rury, ramię może powrócić do pozycji wyjściowej, co powoduje opadnięcie platformy (Rycina 1F).</li>
 <li>Platformy składają się z regałów umieszczonych na sklejce i zabezpieczonych linkami bungee zahaczonymi o śruby z oczkiem. Platformy przesuwają się w górę i w dół wzdłuż prowadnic szufladowych przymocowanych do sklejki za pomocą wsporników.</li>
 <li>Fiolki umieszcza się w regałach i zabezpiecza kwadratową siatką przymocowaną linkami bungee.</li>
 <li>Pod platformą umieszczono poduszkę ze styropianu, aby amortyzować wstrząs podczas opadania.</li>
 <li>Moc silnika jest dostosowana w taki sposób, aby pełny okres obrotu trwał 15 sekund.</li>
</ol>
2. Protokół ćwiczeń
<ol>
 <li>Muchy są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%, przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Zarówno trening wysiłkowy, jak i ocena wydolności fizycznej są przeprowadzane w pomieszczeniu z temperaturą kontrolowaną na poziomie 25 °C.</li>
 <li>Muchy są zbierane i dobierane pod względem wieku z dokładnością do 1-2 dni. Do podłużnego monitorowania wytrzymałości oraz zdolności do negatywnej geotaksji (wspinania się) – dwóch wskaźników fizjologicznych odzwierciedlających efekty treningu – wymagane jest minimum 240 much. Monitorowanie podłużne pozwala wyizolować indukowane zmiany w stosunku do wartości początkowych dla każdej kohorty, eliminując zakłócenia wynikające z różnic między kohortami. Muchy do dodatkowych eksperymentów należy zbierać w zależności od potrzeb.</li>
 <li>Po zebraniu muchy są dzielone na 120 osobników doświadczalnych, które zostaną poddane reżimowi treningowemu, oraz 120 osobników kontrolnych, które nie będą ćwiczyć. Muchy są przechowywane w fiolkach po 20 osobników każda. Fiolki z muchami doświadczalnymi są zatykane twardymi korkami z octanu celulozy (Flugs), a fiolki z muchami kontrolnymi (nietrenowanymi) są zatykane miękkimi gąbkowymi zatyczkami, które można docisnąć, aby unieruchomić muchy podczas przebywania na urządzeniu Power Tower. Gąbka jest stosowana do unieruchomienia, ponieważ jej elastyczny rozmiar umożliwia łatwe umieszczenie jej blisko dna fiolki. Miększy materiał gąbkowy ogranicza również urazy powodowane przez twardsze korki Flugs.</li>
 <li>Muchy na urządzeniu Power Tower są przechowywane i trenowane w fiolkach zawierających 5 mL pożywki, co zapewnia im miękkie lądowanie w porównaniu do much trenowanych w pustych fiolkach. Pożywka składa się zazwyczaj z 10% sacharozy, 10% drożdży i 2% agaru w wodzie, choć nie zaobserwowano, aby muchy często żerowały w trakcie sesji treningowej. W przypadku użycia pustych fiolek podczas treningu, odsetek much ulegających urazom gwałtownie wzrasta.</li>
 <li>Urządzenie Power Tower jest obsługiwane w pomieszczeniu z temperaturą kontrolowaną i utrzymywaną na poziomie 25 °C. Muchy doświadczalne są umieszczane na Power Tower i zmuszane do wspinania się. Muchy kontrolne są również umieszczane na Power Tower, ale gąbkowa zatyczka jest dociskana do fiolki na wysokość około 3 mm nad muchami w celu ograniczenia ich ruchu. Grupa ta służy jako kontrola dla wszelkich efektów wynikających z przebywania na urządzeniu Power Tower, które nie są związane z wysiłkiem fizycznym. Choć muchy te wciąż mają pewną przestrzeń do manewrowania, wielokrotnie obserwowano, że w tych warunkach poruszają się one bardzo mało i nie wykazują fizjologicznej odpowiedzi na wysiłek. Wskazane może być również włączenie dodatkowej grupy kontrolnej, która w ogóle nie jest umieszczana na urządzeniu Power Tower.</li>
 <li>Muchy ćwiczą przez pięć kolejnych dni w każdym tygodniu, zgodnie z harmonogramem stopniowego zwiększania obciążenia (Rysunek 2). W pierwszym tygodniu muchy ćwiczą przez 2 godziny na sesję, w drugim tygodniu przez 2,5 godziny na sesję, a w trzecim tygodniu przez 3 godziny na sesję. Chociaż testowano inne reżimy, protokół ten daje spójne wyniki dla różnych genotypów i w zróżnicowanych warunkach. Protokół ten może być jednak modyfikowany na wiele sposobów, aby dostosować go do konkretnego eksperymentu.</li>
</ol>
3. Ćwiczenia fizyczne i zmęczenie lokomotoryczne
<ol>
 <li>Czas do wystąpienia zmęczenia podczas wysiłku wytrzymałościowego jest użytecznym wskaźnikiem fizjologicznym służącym do potwierdzenia i/lub ilościowego określenia wydolności wysiłkowej danej kohorty. Testy zmęczeniowe mogą być prowadzone w sposób podłużny w kohortach, które zostaną wykorzystane w eksperymentach treningowych. Analizy mogą być przeprowadzane przed rozpoczęciem treningu, po zakończeniu protokołu treningowego lub w obu tych terminach. Jeśli istnieje potrzeba monitorowania postępów w trakcie treningu, można dodać inne punkty czasowe pośrednie. Test zmęczeniowy może być również wykorzystany do pomiaru wytrzymałości wysiłkowej w odpowiedzi na inne interwencje niż protokół treningowy, np. zmianę diety (Rysunek 3B).</li>
 <li>Testy zmęczeniowe należy przeprowadzać w dniu, w którym nie odbywa się trening. Zarówno muchy eksperymentalne, jak i kontrolne, umieszcza się w fiolkach po 20 osobników w urządzeniu Power Tower i zmusza do wspinaczki aż do momentu zmęczenia. Zmęczenie definiuje się jako brak reakcji w postaci wspinania się na bodziec ujemnej geotaksji. Zachowanie zmęczeniowe jest oceniane poprzez obserwację wizualną.</li>
 <li>Fiolkę z muchami uznaje się za „zmęczoną”, gdy 5 lub mniej much jest w stanie wspiąć się wyżej niż 2 cale podczas czterech kolejnych opadnięć. Zmęczone fiolki są usuwane z urządzenia Power Tower podczas jego pracy, a czas usunięcia zostaje odnotowany. Czasy usunięcia można przedstawić w formie histogramu zagnieżdżonego lub wykresu „czasu do wystąpienia zmęczenia” (time-to-failure). Przykład danych przedstawionych na wykresie „czasu do wystąpienia zmęczenia” pokazano na Rysunku 3B.</li>
 <li>Fiolki są monitorowane w odstępach 10-minutowych przez maksymalnie 10 godzin (Rysunek 3B).</li>
</ol>
4. Ćwiczenia fizyczne, wiek a sprawność lokomotoryczna
<ol>
 <li>Ponieważ niniejszy protokół treningowy opiera się na indukowanym zachowaniu biegowym, głównym testem służącym do ilościowego określenia efektów treningu jest podłużny pomiar zmiany średniej prędkości biegu w trakcie treningu. W trakcie treningu kohorty po 120 much (grupa ćwicząca i niećwicząca) są codziennie badane pod kątem reakcji na bodziec negatywnej geotaksji. Do pomiaru zdolności wspinaczkowych much stosuje się technikę RING opisaną przez Gargano i wsp. (2005) 12. W skrócie technika ta mierzy średnią wysokość wspinaczki przebytej przez muchy w fiolce w określonym czasie po indukcji negatywnej geotaksji. Wysokość wspinaczki w określonym czasie jest równoważna prędkości wspinania się. Pomiary wykonuje się przed umieszczeniem much na urządzeniu do codziennego treningu, aby uniknąć komplikacji wynikających ze zmęczenia po dziennym biegu.</li>
 <li>W naszym standardowym protokole muchy ćwiczą łącznie przez trzy tygodnie, a zdolność wspinania się jest badana przez łącznie pięć tygodni: trzy tygodnie podczas treningu wysiłkowego i dwa tygodnie po zakończeniu ćwiczeń (Rysunek 2). Pozwala to eksperymentatorowi określić, czy efekty ćwiczeń w zakresie mobilności utrzymują się po zakończeniu programu.</li>
 <li>Do analizy zdolności wspinaczkowych wykorzystuje się cztery zdjęcia dziennych wyników RING każdej kohorty. Na każdym zdjęciu znajduje się sześć fiolek. Po indukcji negatywnej geotaksji, przy użyciu kamery z timerem, wykonuje się zdjęcie po określonej liczbie sekund. Zazwyczaj stosujemy dwie sekundy, choć czas ten można zmieniać w zależności od warunków eksperymentalnych. Dla każdego zdjęcia każda fiolka jest dzielona na cztery kwadranty o równej wysokości, a oprogramowanie do przetwarzania obrazu służy do przypisania każdej musze punktacji na podstawie kwadrantu, do którego dotarła w wyznaczonym czasie. Muchy, które wspinają się do najwyższego kwadrantu, otrzymują 4 punkty, muchy w kolejnym najwyższym kwadrancie otrzymują 3, muchy w drugim najwyższym kwadrancie otrzymują 2, a muchy w najniższym kwadrancie otrzymują 1. Muchom, które w ogóle nie wspinają się z dna, przypisuje się 0 punktów.</li>
 <li>Dla każdej fiolki na danym zdjęciu generowany jest „indeks wspinaczkowy” poprzez wyciągnięcie średniej z punktacji wszystkich much w tej fiolce. Następnie indeksy każdej fiolki z czterech zdjęć są uśredniane, aby uzyskać ostateczny indeks wspinaczkowy na dany dzień.</li>
 <li>Wszystkie eksperymenty z negatywną geotaksją są prowadzone podłużnie. Wyniki są normalizowane do początkowej punktacji „przed ćwiczeniami”, aby zredukować wpływ zmienności kohort w zdolności wspinania się i podkreślić względną zmianę podłużną zdolności wspinaczkowych kohorty w wyniku treningu wysiłkowego. Punktacja początkowa jest określana jako średnia z indeksów wspinaczkowych z pierwszych trzech dni i przyjmuje wartość 1. Kolejne próby są następnie wyrażane jako procent indeksu początkowego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Muchy typu dzikiego reagują na protokół wytrzymałościowy zmniejszeniem związanego z wiekiem spadku zdolności wspinania się, który utrzymuje się po zakończeniu treningu, co odzwierciedlają podłużne testy RING przeprowadzone w ciągu pięciu tygodni życia (Rycina 3A). To opóźnione obniżenie poziomu negatywnej geotaksji jest standardową odpowiedzią fenotypową, która może służyć jako kontrola pozytywna w celu upewnienia się, że odpowiedź na wysiłek u typu dzikiego przebiega prawidłowo. Zbiór danych ten przedstawiono jako przykład tego, w jaki sposób indukcja wysiłku za pomocą programu Power Tower może być wykorzystana jako bodziec behawioralny. Następnie można ocenić zdolność różnych czynników genetycznych lub środowiskowych do modulowania tego efektu.
Z drugiej strony, Power Tower może być również wykorzystywany jako parametr wyjściowy w różnych schematach eksperymentalnych. Na przykład można zmieniać genotyp, dietę lub inne warunki. Następnie, za pomocą Power Tower można przetestować wpływ tych zmiennych na fizjologię wysiłku. Poniżej przedstawiamy przykład takiego podejścia. Gdy w testach czasu do wyczerpania badano muchy o różnej zawartości sacharozy w diecie, zwiększona zawartość sacharozy korelowała ze zwiększoną wydolnością organizmu (Rycina 3B).
<img alt="Układ eksperymentu równowagi statycznej; aparat do pomiaru momentu obrotowego; sześć konfiguracji; badanie z zakresu fizyki mechanicznej." src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zasada działania Power Tower. (A-C) Zmotoryzowane zagięte ramię z przymocowanym rolkiem obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do momentu zetknięcia się z zagiętą kwadratową rurką. (D,E) Ramię naciska w dół na zagiętą kwadratową rurkę, co powoduje uniesienie platformy z fiolkami zawierającymi muszki. (F) Gdy ramię mija rurkę, platforma opada z powrotem, zmuszając muszki do powrotu na dno fiolki.
<img alt="Schemat eksperymentu na muchach; wpływ ćwiczeń na zmęczenie; harmonogram zabiegów i analiz." src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Sugerowany protokół ćwiczeń. Muchy poddane protokołowi treningowemu ćwiczą przez pięć dni w tygodniu w ramach trzytygodniowego programu stopniowanego, w którym czas trwania ćwiczeń zwiększa się co tydzień o 30 minut, zaczynając od początkowych 2 godzin. Standardowe analizy obejmują testy zmęczenia przed i po programie ćwiczeń oraz testy RING od 1. do 5. tygodnia. Wszystkie analizy są wykonywane w dubletach na równej liczbie much niećwiczących jako kontroli negatywnej. W zależności od decyzji badacza można przeprowadzić inne testy fizjologiczne lub biochemiczne.
<img alt="Wykres wpływu ćwiczeń; indeks wspinania w funkcji dnia, procent niepowodzeń w funkcji czasu; wykres analizy danych." src="/files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ćwiczenia wytrzymałościowe zmieniają wiele aspektów mobilności. (A) Testy RING przeprowadzone podłużnie w różnych grupach wiekowych w jednej parze kohort samców Y1W67C23. Codziennie mierzono średnią prędkość wspinania się u jednakowych pod względem wieku, genetycznie identycznych much ćwiczących oraz niećwiczących grup kontrolnych. Wyniki wyrażono w formie indeksu wspinania, który znormalizowano do średniej wysokości wspinania z pierwszych trzech dni pomiarów. Muchy trenowane wykazały mniejszy związany z wiekiem spadek zdolności do negatywnej geotaksji w porównaniu z jednakowymi pod względem wieku niećwiczącymi rodzeństwem w różnych grupach wiekowych (ANOVA 2-droginowa, p &lt; 0.005). (B) Testy zmęczeniowe przeprowadzone przez 8 godzin na jednakowych pod względem wieku samic Canton S wykazują istotny wpływ zawartości sacharozy w diecie na czas do wystąpienia zmęczenia (test Log-rank, p &lt; 0.0001). Przed eksperymentem muchy karmiono dietą drożdże/sacharoza/agar z 10% stężeniem drożdży (masa/objętość) i zmiennym procentem sacharozy w diecie. Dla każdej diety przetestowano pięć fiolek zawierających po 20 much. Wykres przedstawia liczbę fiolek, w których w danym punkcie czasowym wciąż biegło pięć lub więcej much. Wyniki te można traktować statystycznie i graficznie jako krzywą przeżycia (lub czas do wystąpienia awarii), gdzie „awarię” fiolki definiuje się jako punkt w czasie, w którym mniej niż pięć much nadal reaguje na bodziec negatywnej geotaksji. Należy zauważyć, że możliwe jest zastosowanie wielu innych projektów badań i metod statystycznych, a sposób przetwarzania i pomiaru danych powinien być dostosowany do indywidualnych celów.

<ol><li>Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Prevalence+of+Diabetes%3A+Estimates+for+the+year+2000+and+projections+for+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the year 2000 and projections for 2030.</a> Diabetes Care. 25, 1047-1053 (2004).</li>
<li>Flegal, K. M., Carroll, M. D., Ogden, L. C., Johnson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Trends+in+Obesity+Among+US+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Trends in Obesity Among US Adults.</a> JAMA. 288, 1723-1727 (1999).</li>
<li>Hubert, H. B., Feinleib, M., McNamar, P. M., Castelli, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+an+Independent+Risk+Factor+for+Cardiovascular+Disease%3A+A+26-year+Follow-up+of+Participants+in+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Obesity as an Independent Risk Factor for Cardiovascular Disease: A 26-year Follow-up of Participants in the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 67, 698-977 (1983).</li>
<li>Ross, R., Dagnone, D., Jones, P. J. H., Smith, H., Paddags, A., Hudson, R., Janssen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+obesity+and+related+comorbid+conditions+after+diet-induced+weight+loss+or+exercise-induced+weight+loss+in+med+%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9C+A+randomized%2C+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in obesity and related comorbid conditions after diet-induced weight loss or exercise-induced weight loss in med â€“ A randomized, controlled trial.</a> Annals of Internal Medicine. 133, 92-103 (2000).</li>
<li>Goodyea, L. J., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+Glucose+Transport%2C+and+Insulin+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise Glucose Transport, and Insulin Sensitivity.</a> Annual Review of Medicine. 49, 235-261 (1998).</li>
<li>Linke, A., Adams, V., Schulze, P. D., Erbs, S., Gielen, S., Fiehn, E., Mobius-Winkler, S., Schubert, A., Schuler, G., Hambrecht, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+Effects+of+Exercise+Training+in+Patients+With+Chronic+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Antioxidative Effects of Exercise Training in Patients With Chronic Heart Failure.</a> Circulation. 111, 1763-1763 (2005).</li>
<li>Kemi, O. J., Ellingsen, O., Smith, G. L., Wisloff, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+changes+in+calcium+handling+in+left+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced changes in calcium handling in left ventricular cardiomyocytes.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 356-368 (2008).</li>
<li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+muscle+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man%3A+alterations+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships between muscle mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 80, 22-27 (1999).</li>
<li>Wu, Z., Puigserver, P., Andersson, U., Zhang, C., Adelmant, G., Mootha, V., Troy, A., Cinti, S., Lowell, B., Scarpulla, R. C., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+Controlling+Mitochondrial+Biogenesis+and+Respiration+through+the+Thermogenic+Coactivator+PGC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms Controlling Mitochondrial Biogenesis and Respiration through the Thermogenic Coactivator PGC-1.</a> Cell. 98, 115-124 (1999).</li>
<li>Goto, M., Terada, S., Kato, M., Katoh, M., Yokozeki, T., Tabata, I., Shimokawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+Cloning+and+mRNA+Analysis+of+PGC-1+in+Epirtrochlearis+Muscle+in+Swimming-Exercised+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">cDNA Cloning and mRNA Analysis of PGC-1 in Epirtrochlearis Muscle in Swimming-Exercised Rats.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , 274-350 (2000).</li>
<li>Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-Training+in+Young+Drosophila+melanogaster+Reduces+Age-Related+Decline+in+Mobility+and+Cardiac+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance.</a> PLoS ONE. 4, e5886-e5886 (2009).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ogólny protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu okazał się skuteczny w dokumentowaniu efektów fizjologicznych po treningu. Niemniej jednak, kilka etapów tego protokołu można modyfikować, aby dostosować je do konkretnych potrzeb eksperymentalnych. Na przykład, długość treningu oraz liczba sesji mogą zostać zmienione w celu zwiększenia lub zmniejszenia stopnia trudności programu, zależnie od potrzeb. Wysokość pojemnika, w którym mierzy się zdolność do negatywnej geotaksji, może zostać zmieniona, aby zwiększyć dostępny obszar do dokumentowania poprawy. Możliwe jest również zastosowanie różnych metod automatyzacji ilościowego pomiaru prędkości wspinania. W zasadzie każdy program komputerowy zdolny do odróżnienia muchy od tła może zostać wykorzystany w celu przyspieszenia procesu gromadzenia danych.
Niektóre aspekty protokołu należy jednak modyfikować z dużą ostrożnością. Na przykład wstępne eksperymenty silnie wskazują, że przynajmniej jeden dzień odpoczynku w tygodniu sprzyja większej poprawie niż nieustanny codzienny trening. Ponadto wiadomo, że rytmy okołodobowe i temperatura wpływają na aktywność zwierząt zimnokrwistych. Godzina treningu może być różna, ale powinna być zawsze stała w ramach porównywanych grup, aby uniknąć możliwości wystąpienia zakłócających efektów rytmów okołodobowych. Kontrola temperatury jest również niezbędna, dlatego zalecamy wydzielenie osobnego pomieszczenia o stałej temperaturze do przechowywania sprzętu treningowego. Na koniec, samce i samice muszą być hodowane i mierzone osobno, aby uniknąć potencjalnego wpływu różnic w płodności oraz wydolności fizycznej zależnej od płci.
Potencjalne zastosowania tej metodologii ogranicza jedynie wyobraźnia badacza. W ramach wstępnych prac wykorzystaliśmy tę metodologię w trzech szerokich zastosowaniach:
<ol>
	<li>Pomiar wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na różne aspekty biologii typu dzikiego w różnym wieku.</li>
 <li>Pomiar wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na specyficzne fenotypy mutantów.</li>
 <li>Przesiewowe poszukiwanie czynników genetycznych niezbędnych do uzyskania korzyści płynących z ćwiczeń.</li>
</ol>
Każde z tych zastosowań obejmuje szeroki wachlarz konkretnych możliwości. Na podstawie naszych wstępnych doświadczeń fenotypy mutantów wykazują tendencję do zmienności w zależności od poziomu aktywności fizycznej w takim samym stopniu, w jakim zależą one od diety. Wykorzystanie modeli bezkręgowców do lepszego zrozumienia związku między dietą, ćwiczeniami a fizjologią starzenia się jest prawdopodobnie najważniejszym ogólnym zastosowaniem niniejszego protokołu.

<table><tbody><tr><td>Silnik z przekładnią Dayton</td><td>Grainger</td><td>1LRA6A</td><td></td></tr><tr><td>Puszka elektryczna Raco</td><td>Grainger</td><td>5A052</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa Raco</td><td>Grainger</td><td>5A053</td><td></td></tr><tr><td>Bezpiecznik Cooper Bussmann</td><td>Grainger</td><td>6F043</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt bezpiecznika Cooper Bussmann</td><td>Grainger</td><td>1DD33</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik Carling Technologies</td><td>Grainger</td><td>2X464</td><td></td></tr><tr><td>Regulator prędkości AC/DC Dayton</td><td>Grainger</td><td>4X796</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczki do wąskich probówek plastikowych</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydolnościowe dla drosophila melanogaster

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

Jednym z najpilniejszych problemów, z jakimi mierzą się współcześni badacze medyczni, jest gwałtowny wzrost poziomu otyłości, a w konsekwencji wzrost liczby powiązanych z nią zaburzeń, takich jak cukrzyca i choroby układu sercowo-naczyniowego 1-3. Ważnym obszarem badań nad tymi powiązanymi problemami zdrowotnymi jest rola ćwiczeń wytrzymałościowych jako korzystnej interwencji.
Trening fizyczny jest niedrogą, nieinwazyjną interwencją przynoszącą szereg korzystnych rezultatów, w tym redukcję nadmiaru tkanki tłuszczowej 4, zwiększenie wrażliwości mięśni szkieletowych na insulinę 5, nasilenie reakcji przeciwzapalnych i przeciwutleniających 6 oraz poprawę zdolności skurczowych kardiomiocytów 7. Wiadomo, że ćwiczenia o niskiej intensywności zwiększają aktywność i biogenezę mitochondriów u ludzi 8 oraz myszy, przy czym istotnym pośrednikiem jest koaktywator transkrypcyjny PGC1-α 9,10. 
Pomimo znaczenia aktywności fizycznej jako narzędzia do walki z wieloma istotnymi chorobami związanymi z wiekiem, rozległe podłużne badania genetyczne były utrudnione przez brak protokołu treningu wytrzymałościowego dla krótkożyjących gatunków modelowych. Różnorodność narzędzi genetycznych dostępnych dla Drosophila, w połączeniu z krótką długością życia i niskimi kosztami utrzymania, czyni tę muszkę atrakcyjnym modelem do dalszego badania tych mechanizmów genetycznych. Mając to na uwadze, opracowaliśmy nowatorski aparat, znany jako Power Tower, do wielkoskalowego treningu fizycznego u Drosophila melanogaster 11. Power Tower wykorzystuje instynktowną u muszek ujemną geotaksję do wielokrotnego indukowania szybkiego wspinania się. Za każdym razem, gdy maszyna podnosi, a następnie opuszcza platformę z muszkami, indukuje się ich wspinanie. Muszki reagują tak długo, jak maszyna jest w działaniu lub dopóki nie staną się zbyt zmęczone, by odpowiadać. Dzięki temu badacz może wykorzystać to urządzenie do jednoczesnego treningu dużych grup muszek w tym samym wieku i identycznych pod względem genetycznym. Dodatkowo opisujemy powiązane testy przydatne do monitorowania postępów podłużnych kohort muszek podczas treningu.

Opisujemy pierwszy protokół treningu wytrzymałościowego dla ważnego gatunku modelowego genetycznie, Drosophila melanogaster, oraz przedstawiamy kilka testów pozwalających monitorować poprawę mobilności po treningu.

Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydolnościowe dla Drosophila melanogaster

Jednym z najpilniejszych problemów, przed którymi stają współcześni badacze medycyny, jest gwałtowny wzrost poziomu otyłości, z wynikającym z tego wzrostem liczby schorzeń z nią powiązanych...

Celem następnego eksperymentu jest poddanie Dsof oraz Melanogaster treningowi w ramach nowatorskiego programu ćwiczeń wytrzymałościowych oraz ocena efektów tego treningu. Zostaje to osiągnięte poprzez zastosowanie zautomatyzowanego urządzenia, które wielokrotnie podnosi i opuszcza kilka fiolek z muchami, aktywując w ten sposób ich instynktowną reakcję wspinania się, co zapewnia muchom sesję treningową. Muchy są trenowane codziennie według harmonogramu stopniowego zwiększania intensywności, od dwóch do trzech godzin, w trwającym trzy tygodnie okresie treningowym.Następnie muchy poddawane są różnym testom behawioralnym w celu pomiaru efektów ćwiczeń. Wyniki pokazują, że muchy ćwiczące wspinają się szybciej, co zmierzono za pomocą testu szybko wywołanej ujemnej geotaksji lub testu pierścieniowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trening wytrzymałościowy u innych zwierząt, jest szeroki zestaw dostępnych narzędzi do manipulacji genetycznych u drosophila.W badaniach nad ćwiczeniami wytrzymałościowymi pomysł na tę metodę pojawił się podczas przeprowadzania licznych testów negatywnej geotaksji. Zastanawialiśmy się, jak długo muchy są w stanie wspinać się i czy w ten sposób możemy poddać je treningowi wytrzymałościowemu. Wieża mocy (power tower) jest zbudowana na prostokątnym kawałku sklejki, który jest przymocowany zaciskami do stołu.Prędkość obrotowa wynosi 4,5 obrotów na minutę. Silnik przekładniowy spoczywa na kilku deskach i jest podłączony do regulatora prędkości, bezpiecznika oraz wyłącznika zasilania. W skrzynce przyłączeniowej wentylator o średnicy trzech cali, umieszczony w metalowej rurze, jest skierowany na silnik w celu jego chłodzenia.Do silnika podłączone jest obrotowe ramię z rolką. Podczas pracy silnika i ramienia, obracają się one, naciskając na jeden koniec zgiętego pręta przymocowanego do sklejki. Po drugiej stronie pręta, za pomocą zawiasu drzwiowego, przymocowane jest koło, które może toczyć się po platformie.Urządzenie porusza się w górę i w dół podczas obrotów silnika, którego moc jest dostosowana tak, aby pełen okres obrotu trwał 15 sekund. Na platformie za pomocą gumek mocowane są stojaki z fiolkami z muszkami, a fiolki umieszczone w tych stojakach są zabezpieczone siatką, która również jest przymocowana do platformy. Dzięki gumkom platforma może przesuwać się w górę i w dół wzdłuż standardowych prowadnic szufladowych, a poduszka ze styropianu amortyzuje wstrząsy podczas opadania. Wieża zasilająca (power tower) jest obsługiwana w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, aby odpowiadała ona warunkom hodowli zwierząt.Do przeprowadzenia eksperymentu związanego z wysiłkiem fizycznym wymagane jest minimum 240 samców much w tym samym wieku, aby umożliwić podłużne monitorowanie wytrzymałości oraz zdolności wspinania się (ujemna geooks). Muszki należy utrzymywać w populacjach po 20 osobników na fiolkę. Podziel fiolki na dwie równoliczne grupy, z których jedna będzie poddana wysiłkowi; fiolki z tej grupy należy zamknąć korkami z flugów, natomiast grupę kontrolną należy zamknąć korkami gąbkowymi.Do unieruchomienia wykorzystuje się gąbkę, ponieważ jej dopasowany rozmiar umożliwia łatwe umieszczenie jej przy dnie fiolki. Miększy materiał gąbki ogranicza również urazy powodowane przez twardsze zatyczki. Fiolki z pożywką należy wymieniać co drugi dzień przed przeprowadzeniem testów.Podczas treningu muchy pozostają w fiolkach z pożywką, ponieważ w przypadku użycia pustych fiolek znacznie więcej osobników ulega obrażeniom związanym z treningiem. Podczas umieszczania fiolek z muchami kontrolnymi na wieży zasilającej, należy docisnąć gąbkowe korki do poziomu około trzech milimetrów nad powierzchnią pożywki, ograniczając w ten sposób ruchy much.Ruch w celu uzyskania spójnych wyników. Testuj obie grupy much przez pięć kolejnych dni w tygodniu, stosując harmonogram stopniowy, który zwiększa czas trwania sesji z dwóch do trzech godzin dziennie w okresie trzech tygodni. Oczywiście można zastosować dowolny inny schemat.Niezbędna jest spójność w traktowaniu osobników, porze dnia oraz metodach analizy w ciągu trzytygodniowego okresu. Staranne planowanie i praktyka w wykonywaniu procedur zmniejszają ryzyko wystąpienia błędów związanych ze zmęczeniem. Analizy mogą być prowadzone podłużnie na muchach przed, po lub w trakcie reżimu treningowego.Może być ona również wykorzystana do oceny bezpieczniejszej odpowiedzi na zmienną środowiskową. Test zmęczeniowy należy przeprowadzić w dniu, w którym nie odbywa się trening. Na początku dnia obie grupy much należy umieścić w wieży mocy (power tower).Uruchom aparat i obserwuj każdą fiolkę co 10 minut. Jeśli w czterech kolejnych pomiarach w fiolce pięć lub mniej much wspinie się na wysokość powyżej dwóch cali, grupę tę uznaje się za zmęczoną. Usuń zmęczone muchy z wieży zasilającej, gdy ta nadal pracuje, i odnotuj czas ich usunięcia.Obserwuj wszystkie fiolki przez maksymalnie 10 godzin i zestaw wyniki. Jeden test do oznaczania ilościowego. Efekty treningu są mierzone poprzez codzienny pomiar prędkości biegu, który można przeprowadzać w trakcie całego programu treningowego oraz po jego zakończeniu.Aby zmierzyć długoterminowy efekt treningu. W celu rozpoczęcia testu prędkości wspinaczki lub testu pierścienia, należy najpierw przenieść muchy do nowych pustych fiolek i umieścić rząd sześciu fiolek w statywie. Do przymocowania fiolek do statywu używa się zwiniętych kawałków taśmy.Następnie ustaw statyw przed źródłem światła, takim jak kaseta do zdjęć rentgenowskich, która zapewni równomierne oświetlenie probówek. Teraz ustaw aparat do sfotografowania statywu w taki sposób, aby pozycja każdej muchy w każdej probówce była widoczna. Następnie stuknij w sześć probówek, aby wszystkie muchy opadły na ich dno, i wykonaj zdjęcie w określonym czasie.Dwie sekundy po tym, jak wszystkie muchy zostaną ogłuszone. Jeśli używana jest lampa błyskowa aparatu, należy jej używać konsekwentnie. Powtórz ten proces cztery razy dla każdego zestawu fiolek przed przejściem do wieży zasilającej.Aby przeanalizować dane, należy indywidualnie ocenić każde zdjęcie za pomocą oprogramowania w celu wyznaczenia górnej i dolnej granicy fiolki. Następnie należy zmierzyć wysokość wspinaczki dla każdej muchy. Następnie skopiuj wartości wysokości wspinaczki do programu Excel.Każdej muszce w każdej fiolce przypisuje się ocenę od zera do czterech, odpowiadającą wysokości kwadrantu. Wspinaczka do najwyższego kwadrantu otrzymuje ocenę cztery, a całkowity brak wspinaczki – zero. Dla każdej fiolki należy obliczyć ocenę dla każdej z 20 muszek, a następnie wyznaczyć średnią ocenę dla danej kohorty.Wartość tę nazywa się indeksem wspinania. Do analizy danych wykorzystuje się średnią z czterech indeksów wspinania każdej kohorty wyznaczonych w danym dniu. W przypadku braku oprogramowania do przetwarzania obrazów, na pustych fiolkach można narysować linie kwadrantów, a następnie ręcznie przypisywać muchom wartości kwadrantów, podczas gdy muchy typu odpowiedziały na protokół wytrzymałościowy zmniejszonym związanym z wiekiem spadkiem zdolności wspinania.Stan ten utrzymywał się po zakończeniu treningu, co odzwierciedlały podłużne testy obręczy (ring assays) przeprowadzone w ciągu pięciu tygodni życia. Zatem indukowanie wysiłku za pomocą programu power tower może służyć jako bodziec behawioralny, a zdolność czynników genetycznych lub środowiskowych do modulowania tego efektu może zostać oceniona. I odwrotnie, power tower może być również wykorzystywany jako miernik efektu (output).Na przykład, gdy badano czas do wystąpienia zmęczenia u much z różną zawartością sacharozy w diecie, zwiększona zawartość sacharozy korelowała ze zwiększoną wydolnością organizmu. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie kohorty much są w tym samym wieku, a metody są stosowane konsekwentnie przez cały czas trwania eksperymentu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak trenować i oceniać wytrzymałość much o dowolnym genotypie.

endurance-training-protocol-longitudinal-performance-assays-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół szkolenia wytrzymałościowego i testy długotrwałej wydajności dla Drosophila melanogaster

Badanie złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila melanogaster zależy od możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzić ten proces przy użyciu wysokorozdzielczego systemu śledzenia.

Wysokorozdzielcze śledzenie wideo lokomocji u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Naukowcy używają protokołu długości życia Drosophila do mierzenia, jak różne warunki eksperymentalne wpływają na długowieczność muszek i generowania krzywych przeżycia w tym procesie, aby określić ilościowo wyniki eksperymentu. Protokół próbki obejmuje test stosowany do badania wpływu narażenia na długowieczność substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub EDC, takich jak 17-α-etynyloestradiol (EE2).

Protokół długości życia dla Drosophila melanogaster: generowanie krzywych przeżycia w celu identyfikacji różnic w długości życia much

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania długości ścieżki żerowania Drosophila melanogaster. Omawiamy przygotowanie i postępowanie ze zwierzętami doświadczalnymi, sposób wykonywania testu i analizy danych.

Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster

System Oceny Ilościowej Ćwiczeń Rotacyjnych (REQS) może indukować ćwiczenia u Drosophila melanogaster poprzez rotację, jednocześnie mierząc ilość aktywności wykonywanej przez zwierzęta. W tym miejscu przedstawiamy protokół punkt po punkcie, w którym szczegółowo opisano, w jaki sposób mierzyć poziom aktywności zwierząt doświadczających zabiegów ćwiczeń rotacyjnych za pomocą REQS.

Pomiar poziomu wysiłku fizycznego u Drosophila melanogaster za pomocą Rotacyjnego Systemu Kwantyfikacji Wysiłkowej (REQS)

TreadWheel wykorzystuje ruch obrotowy, aby delikatnie wywołać ćwiczenia u dorosłych Drosophila melanogaster, wykorzystując wrodzoną, negatywną geotaksję much. Pozwala na analizę interakcji między ćwiczeniami a czynnikami, takimi jak genotyp, płeć i dieta, oraz ich wpływu na testy fizjologiczne i molekularne w celu oceny zdrowia metabolicznego.

TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest zapewnienie ćwiczeń lotniczych muszce owocowej Drosophila. Reprezentatywne wyniki pokazują, że trening lotniczy skutkuje zwiększoną pojemnością tlenową i odpornością na dietę wysokotłuszczową.

FLEX: Protokół szkolenia z ćwiczeń lotniczych dla muszki owocowej Drosophila

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Poznaj protokół treningu wytrzymałościowego dla Drosophila melanogaster z wykorzystaniem zautomatyzowanego urządzenia. Naucz się oceniać wpływ ćwiczeń na zdolność wspinaczkową much.

Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydolnościowe dla Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów