Przygotowanie plastrów przystrzałkowych do badania grzbietowo-brzusznej organizacji przyśrodkowej kory śródwęchowej gryzoni

Opisujemy procedury przygotowania i zapisu elektrofizjologicznego z wycinków mózgu, które utrzymują grzbietowo-brzuszną oś przyśrodkowej kory śródwęchowej (MEC). Ponieważ neuronalne kodowanie lokalizacji przebiega zgodnie z organizacją grzbietowo-brzuszną w obrębie MEC, procedury te ułatwiają badanie mechanizmów komórkowych ważnych dla nawigacji i pamięci.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie topograficznej organizacji właściwości synaptycznych i integracyjnych neuronów w przyśrodkowej korze prawej strony. Osiąga się to poprzez przygotowanie wycinków przyśrodkowej kory wewnętrznej RH zorientowanych w grzbietowej płaszczyźnie brzusznej. W drugim kroku wykonuje się nagrania z zaciskiem łatkowym mento neuronów kory RH w celu zbadania ich właściwości synaptycznych i integracyjnych.

Następnie określa się lokalizację zarejestrowanego neuronu w celu oceny grzbietowo-brzusznej organizacji mierzonych właściwości elektrofizjologicznych. Uzyskuje się wyniki, które pokazują topograficzną organizację wewnętrznych właściwości komórek gwiaździstych w warstwie drugiej na podstawie pomiarów ich rezystancji wejściowej, stałej czasowej błony i progu potencjału czynnościowego, Procedurę zademonstruje Hugh Pastel, doktorant z mojego laboratorium. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak poziomo zorientowane wycinki mózgu, jest to, że można dokładnie zarejestrować położenie zarejestrowanego neuronu wzdłuż grzbietowej osi brzusznej kory wewnętrznej.

Aby rozpocząć tę procedurę, usuń mózg z myszy i natychmiast umieść go w cięciu na zimno. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z bąbelkami karbogenu. Po trzech minutach ostrożnie wyjmij mózg z nacięcia A CSF za pomocą szpatułki.

Delikatnie umieść go w pozycji pionowej na bibule filtracyjnej, która została zwilżona cięciem A CSF. Następnie użyj brzytwy lub skalpela, aby usunąć jak najwięcej móżdżku bez wpływu na przyśrodkową korę jelitową, która znajduje się na końcu rdzenia mózgu. Usuń rostralną część mózgu, przecinając ją w płaszczyźnie koronalnej.

Następna półka sec, mózg w pionowej płaszczyźnie linii środkowej. Następnie wróć półkule do pęcherzyka, przecinając płyn mózgowo-rdzeniowy na półtorej minuty przed zamontowaniem. Upewnij się, że krawędź tnąca ostrza vibrato jest ustawiona pod kątem 20 stopni od poziomu Na powierzchni montażowej wykonaj płytki pasek super kleju równolegle do ostrza vibrato, w przybliżeniu o szerokości półkuli i wystarczająco długi, aby pomieścić dwie półkule od końca do końca.

Następnie przenieś każdą półkulę z cięcia płynu mózgowo-rdzeniowego na powierzchnię montażową, ustawiając półkulę tak, aby jej środkowa powierzchnia spoczywała na szpatułce, a jej grzbietowy zasięg był skierowany w stronę wibrującego ostrza tonującego. Delikatnie wsuń półkulę na pasek super kleju i upewnij się, że środkowa powierzchnia każdej półkuli jest równoległa do podstawy vibrato. Następnie natychmiast zanurz półkule w cięciu na zimno.

Płyn CSF. Utrzymuj temperaturę i nasycenie samochodu przez cały proces krojenia. Za pomocą vibram usuń korę z obu półkul w płaszczyźnie strzałkowej, aż najbardziej boczna część przyśrodkowej kory jelitowej w każdej półkuli zostanie zidentyfikowana co najmniej 600 mikrometrów od powierzchni bocznej.

Boczny zasięg przyśrodkowej kory jelitowej identyfikuje się na podstawie braku grubego białego pasma wokół brzusznej krzywizny rdzenia hipokampa. Niewypukły kształt jego granicy rostralnej i kątowy narożnik rdzenia grzbietowego wycinają 400 mikronów odcinków parastrzałkowych z obu półkul, aż do osiągnięcia przyśrodkowego zasięgu przyśrodkowej kory jelitowej. Po każdym krojeniu należy natychmiast umieścić plastry w nasyconym karbogenem wzorcu A CSF utrzymywanym w łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza i inkubować je przez około 15 minut.

Po 15 minutach wyjmij uchwyt na plastry z łaźni wodnej i kontynuuj bulgotanie z karbogenem w temperaturze pokojowej przez co najmniej 45 minut. Przenieś plasterek do komory nagrywającej, która jest stale bąbelkowana wzorcem nasyconym karbogenem A-C-S-F-A 35 stopni Celsjusza. Następnie zidentyfikuj przybliżony obszar zapisu w przyśrodkowej korze wejściowej RH.

Następnie przełącz się na obiektyw o dużym powiększeniu. Zidentyfikuj żywe komórki w tym regionie. W tym momencie można przeprowadzić eksperymenty z wykorzystaniem konwencjonalnego zacisku krosowego całej komórki do rejestrowania potencjału błonowego lub prądu błonowego ze zidentyfikowanych neuronów.

Tożsamość neuronu można zweryfikować na podstawie właściwości elektrofizjologicznych zarejestrowanego neuronu oraz poprzez włączenie znaczników fluorescencyjnych do roztworu wewnątrzkomórkowego. Po eksperymencie mającym na celu określenie położenia zarejestrowanego neuronu wzdłuż grzbietowej osi brzusznej, przełącz się na obiektyw o małym powiększeniu. Zaznacz interesujące Cię miejsce, dołączając elektrodę rejestrującą do obrazu lub zmniejszając przysłonę irysową w polu.

Aby pozostawić jasny okrąg wokół miejsca zainteresowania na zduplikowanym obrazie, obszaru kory przyśrodkowej i prawej strony oraz otaczających obszarów wycinka, aby wskazać miejsce nagrania na obrazie, duplikat można następnie nałożyć na początkowy obraz miejsca nagrania i jego otoczenia. Do pokrycia obszaru od brzusznego miejsca zapisu do grzbietowej granicy przyśrodkowej kory wewnętrznej mogą być wymagane maksymalnie trzy oddzielne obrazy w małym powiększeniu. Obrazy te można następnie zszyć ze sobą za pomocą oprogramowania do obróbki obrazów.

Grzbietowa granica przyśrodkowej kory jelitowej stanowi wygodny punkt orientacyjny do pomiaru grzbietowej pozycji brzusznej, ale brzuszna granica przyśrodkowej kory jelitowej nie jest tak dobrze zdefiniowana. Tu. Sekcje przystrzałkowe DIC i NIAL pokazują odpowiednio okrągły hipokamp i brak występu okołoorbicznego w pierwszej warstwie bocznej kory jelitowej. Są to obrazy typowych wycinków, które zawierają przyśrodkową korę dojelitową.

Obszar paras jest wyraźnie widoczny przez plamy pociskowe. Na odpowiednich obrazach grzbietowa granica przyśrodkowej kory dojelitowej wskazywana czarną strzałką jest brzuszna w stosunku do grupy komórek okołoorowych, które wystają daleko do warstwy pierwszej, jak wskazano czerwoną strzałką. Oto przykład złożonego obrazu wycinka strzałkowego w czterokrotnym powiększeniu.

Pozycje komórki grzbietowej i komórki brzusznej są oznaczone odpowiednio niebieskimi i zielonymi kółkami. strzałka oznacza szacowaną granicę grzbietową przyśrodkowej kory wewnętrznej i jest przedłużona do głębokich warstw przez białą przerywaną linię. Ciągła biała linia jest przewodnikiem pokazującym ścieżkę konturu, wzdłuż której pokazany jest tutaj pikselowy pomiar odległości od grzbietowej granicy przyśrodkowej kory wewnętrznej do brzusznie zlokalizowanych nagrań komórek z zaznaczonych komórek grzbietowych i brzusznych gwiaździstych.

Nagrania te pomagają ustalić tożsamość komórek i zilustrować, w jaki sposób właściwości elektryczne przyśrodkowej kory mózgowej. Warstwa dwie komórki gwiaździste różnią się w miejscu grzbietowym i brzusznym Podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas przygotowywania plastrów, ponieważ wysokiej jakości plastry są niezbędne do produktywnych zapisów elektrofizjologicznych.