Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

W niniejszej procedurze wykorzystano aparat do przepływu zatrzymanego (stopped flow), aby wykryć różne formy spektralne SID A i zmierzyć szybkości reakcji. Reakcja katalizowana przez SID A może zostać podzielona na redukcyjną i oksydacyjną półreakcję FAD. Utleniona flawina wiąże N-A-D-P-H i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę i NADP, natomiast reakcja tlenu cząsteczkowego i wiązanie ornityny prowadzą do powstania C cztery.

Hydroksyflawina powstaje po hydroksylacji ornityny, a następnie ulega dehydratacji, tworząc utleniony enzym. NA DP plus pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim uwalnianym substratem. Urządzenie do pomiarów metodą stopped-flow umożliwia szybkie mieszanie małych objętości reagentów oraz rejestrację wyników.

Zmiany spektralne w czasie mierzone za pomocą spektrofotometru pozwalają na oznaczenie szybkości powstawania i zanikania produktów reakcji katalizowanej enzymatycznie, w szczególności przejściowych produktów pośrednich. Dwie osoby z mojego laboratorium, Rita Robinson i Enviro Romero, zaprezentują te eksperymenty, wykorzystując zestaw A z flawinową monooksygenazą jako systemem modelowym. Wlej 250 ml 100 mM buforu fosforanowego potasu do kolby Buchnera o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne.

Zamknij kolbę korkiem gumowym, następnie ustaw ją na mieszadle magnetycznym i podłącz krótką rurkę kolby do linii próżniowej (sch flank line). Odgazuj bufor pod próżnią przez godzinę w temperaturze pokojowej przy mieszaniu, a następnie przepłucz argonem. Powtórz tę procedurę pięciokrotnie.

Na koniec przedmuchaj kolbę argonem przez 10 sekund. Odłącz kolbę od manifoldu próżniowego i umieść ją wewnątrz rukawicy (glove box). Kontynuuj energiczne mieszanie przy otwartej kolbie.

Napełnij strzykawki zbiornicze roztworami oksydazy glukozowej o stężeniu 18,13 jednostek na mililitr oraz glukozy o stężeniu 100 milimol na litr. Następnie ustaw zawory napędowe w pozycji ładowania. Napełnij strzykawki napędowe.

Następnie przekręć zawór F do pozycji napędowej (drive). Używając oprogramowania do sterowania danymi pro, kliknij „empty the stop syringe”, a następnie przetłocz bufor z tłoka napędowego F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Powtórz tę czynność dla pozostałych trzech tłoków napędowych; przeprowadź równoważenie przez godzinę.

Teraz należy ponownie napełnić strzykawki zbiorników i powtórzyć płukanie systemu z zatrzymanym przepływem. Aby przygotować bufor nasycony tlenem, należy napowietrzać roztwór 100% tlenem przez jedną godzinę przy jednoczesnym mieszaniu.

Następnie wyjmij krótką igłę z fiolki i odczekaj 10 sekund. Następnie wyjmij długą igłę i umieść zamkniętą fiolkę w komorze rękawicowej. W przypadku roztworu N-A-D-P-H.

Umieść w komorze rękawicowej probówkę typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającą 1 mg NADPH. Rozpuś substancję w 300 µl beztleniowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM, pH 7,5.

Odbierz 30 µL w celu oznaczenia stężenia NADPH. Aby usunąć tlen z zapasu enzymu, przenieś roztwór do fiolki o pojemności 25 mL wyposażonej w zakrętkę z mieszadłem magnetycznym, korek oraz alumową plombę. Umieść na lodzie.

Podłącz do linii Schlenka, następnie odgazuj za pomocą próżni przez 20 minut, a następnie przepłucz argonem. Na koniec przepłucz fiolkę argonem przez 10 sekund i odłącz ją od kolektora próżniowego. Umieść fiolkę w lodzie wewnątrz rękawicy.

W oknie panelu sterowania oprogramowania ProData wybierz opcje photo diode array, external trigger oraz logarithmic scale. Następnie uruchom oprogramowanie ProData Viewer i określ katalog do przechowywania plików z danymi.

Następnie zastąp roztwór w strzykawkach rezerwuarowych C i F beztlenowym 100 milimolarnym buforem fosforanowym potasu o pH 7,5. Przekręć zawory C i F do pozycji drive. W oprogramowaniu sterującym pro data kliknij opcję opróżniania strzykawki stopowej.

Następnie wypchnij bufor z obu strzykawki napędowej przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Powtórz płukanie za pomocą strzykawek z rezerwuarem C i F jeszcze trzy razy. Aby zapewnić całkowite usunięcie oksydazy glukozowej z układu przepływowego, kliknij przycisk baseline w oprogramowaniu sterującym pro data.

Zastąp roztwór w strzykawce zbiorczej F roztworem enzymu. Przekręć zawór F do pozycji napędzania. W oprogramowaniu sterującym pro data kliknij opróżnij strzykawkę stopową.

Wytłocz roztwór enzymu z strzykawki napędowej F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Wróć do oprogramowania sterującego danymi pro, aby ustawić czas akwizycji na 60 sekund. Upewnij się, że obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami i że tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych.

Przekręć oba zawory do pozycji drive i kliknij acquire w oprogramowaniu pro data control, aby przeprowadzić pomiar. Pozyskaj dane widmowe utlenionej formy enzymu w trzech powtórzeniach, wykorzystując wartość A 4 52 nanometer uzyskaną z pomiarów. Wyznacz stężenie enzymu przed zmieszaniem i przygotuj cztery mililitry roztworu N-A-D-P-H.

Napełnij strzykawkę zbiornika C roztworem N-A-D-P-H o stężeniu 1,5 raza większym, a następnie opróżnij i ponownie napełnij strzykawkę zatrzymującą trzy razy, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zarejestruj widma podczas redukcji enzymu, wypłukując zawartość układu przepływowego beztlennym 100 millimolarnym buforem fosforanowym potasu o pH 7,5. Teraz kliknij przycisk baseline w oprogramowaniu sterującym pro data.

Następnie zmieszaj 200 µL roztworu zapasowego enzymu z 1000 µL anaerobowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM i pH 7,5. Zastąp roztwór w strzykawce rezerwuarowej A roztworem enzymu.

Przełącz zawór A w pozycję napędową w oprogramowaniu sterującym pro data. Kliknij przycisk stop syringe empty. Wypchnij roztwór enzymu z strzykawki napędowej A przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy.

Ustaw czas opóźnienia na 0,5 seconds oraz czas akwizycji na 60 seconds. Sprawdź, czy wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek. Następnie przełącz wszystkie zawory napędowe w pozycję drive i kliknij acquire w oprogramowaniu pro data control.

Należy zebrać dane spektralne utlenionej formy enzymu w trzech powtórzeniach. Następnie roztwór w strzykawce zbiorczej B należy zastąpić roztworem N-A-D-P-H o stężeniu 1,5 raza większym niż stężenie enzymu w strzykawce A. Zawór B należy ustawić w pozycji napędowej, a następnie trzy razy opróżnić i napełnić strzykawkę zatrzymującą, zgodnie z wcześniejszą instrukcją w oknie panelu sterowania.

Ustaw czas opóźnienia na 0,5 seconds. Przy akwizycji w 20 seconds zastąp roztwór w strzykawce zbiorczej buforem natlenionym. Przekręć zawór C do pozycji napędowej.

Przepłucz układ trzy razy w oprogramowaniu sterującym pro data. Ustaw czas opóźnienia na 15 sekund oraz czas akwizycji na 900 sekund. Kontynuuj pomiar widm podczas reoksydacji całkowicie zredukowanego enzymu w urządzeniu stopped-flow.

Anaerobową redukcję SID A za pomocą N-A-D-P-H można monitorować, mierząc zmiany stanu redoks flawiny przy użyciu absorbancji przy 452 nm. Zmiany widmowe są rejestrowane w czasie – od utlenionego SID A do ostatniego widma w pełni zredukowanego SID A. Szybkość tego etapu enzymatycznego można wyznaczyć poprzez dopasowanie danych do odpowiedniego równania. Szybkość utleniania oraz produkty pośrednie reakcji można również wyznaczyć, wykorzystując tryb podwójnego mieszania w urządzeniu stopped-flow w tej reakcji przez AF Sid A. Pośrednik C four A Hydroxi flavin jest wyraźnie wykrywalny przy lambda max wynoszącym 380 nm, natomiast utleniony enzym posiada lambda max wynoszące 450 nm.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu od czterech do sześciu godzin. Należy pamiętać o zapewnieniu beztlenowych warunków dla roztworów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak badać zarówno względną, jak i owrzodziejącą jonizację FLA niezależnego mono w dalszych eksperymentach, takich jak szybka analiza chemiczna.

Metoda Quentina może pomóc w wyjaśnieniu natury produktów pośrednich.