Name: Monitorowanie redukcyjnych i oksydacyjnych półreakcji monooksygenazy zależnej od flawiny za pomocą spektrofotometrii z zatrzymanym przepływem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj spektrofotometrię z zatrzymanym przepływem do badania półreakcji redukcyjnych i oksydacyjnych monooksygenazy SidA z Aspergillus fumigatus. Ta metoda umożliwia pomiar stałych szybkości powstawania przejściowych produktów pośrednich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania wspierane przez grant NSF MCB-1021384.

1. Przygotowanie buforu beztlenowego
<ol>
 <li>Przygotować 1 L 100 mM buforu fosforanowego potasu o pH 7,5. Wlać 250 mL buforu do kolby Büchnera o pojemności 500 mL z magnesem do mieszania.</li>
 <li>Zamknąć kolbę korkiem gumowym i ustawić na mieszadle magnetycznym. Podłączyć krótką rurkę kolby do linii Schlenka.</li>
 <li>Odgazować bufor pod próżnią przez 5 godzin w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. W tym czasie przeprowadzić 5 kolejnych cykli odgazowania próżniowego i przepłukiwania argonem w odstępach godzinnych.</li>
 <li>Przepłukać kolbę argonem przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić kolbę w komorze glove box.</li>
 <li>Pozostawić otwartą kolbę w komorze glove box przez noc przy intensywnym mieszaniu.</li>
</ol>
2. Usuwanie tlenu z układu stopped-flow
<ol>
 <li>Przygotować 1 L 0,1 M octanu sodu o pH 5,0. Wlać 125 mL tego buforu do kolby Büchnera o pojemności 250 mL i wykonać kroki 1.2-1.4.</li>
 <li>Odważyć 5 mg oksydazy glukozowej z Aspergillus niger (181300 U/g) do probówki Eppendorfa 1,5 mL oraz 0,9 g glukozy do stożkowej probówki Falcon 50 mL. Umieścić oba pojemniki w komorze rękawicowej.</li>
 <li>Rozpuścić oksydazę glukozową i glukozę w 50 mL anaerobowego 0,1 M octanu sodu o pH 5,0 (stężenia końcowe odpowiednio 18,13 U/mL i 100 mM). Napełnić strzykawki zbiornikowe tym roztworem (Rycina 1).</li>
 <li>Upewnić się, że zawory napędowe znajdują się w pozycji „load” (ładowanie) i napełnić strzykawki napędowe (Rycina 1). Przekręcić zawór F do pozycji „drive” (napęd). Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przetłoczyć bufor ze strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Powtórzyć ten krok łącznie dziesięć razy. Wykonać tę samą procedurę z pozostałymi trzema strzykawkami napędowymi. Odczekać jedną godzinę.</li>
 <li>Wymienić roztwór w strzykawkach zbiornikowych na ten sam bufor zawierający oksydazę glukozową i glukozę. Powtórzyć krok 2.4.</li>
 <li>Powtórzyć krok 2.5 i pozostawić roztwór w układzie przepływowym na noc.</li>
 <li>Po inkubacji nocnej powtórzyć krok 2.5.</li>
</ol>
3. Przygotowanie buforu nasyconego tlenem
<ol>
 <li>Przygotować 100 mM bufor fosforan potasu (pH 7.5) i przelać 50 mL do fiolki o pojemności 50 mL z mieszadłem magnetycznym. Zamknąć fiolkę korkiem Wheaton i aluminiową plombą Wheaton.</li>
 <li>Umieścić fiolkę w lodzie. Zanurzyć w roztworze długą igłę podłączoną do zbiornika z 100% tlenem. Wprowadzić przez korek fiolki drugą, krótką igłę, pełniącą funkcję odpowietrznika.</li>
 <li>Napowietrzać roztwór 100% tlenem przez 1 godzinę przy jednoczesnym mieszaniu.</li>
 <li>Najpierw wyjąć z fiolki krótką igłę, a po 10 sekundach wyjąć długą igłę. Umieścić zamkniętą fiolkę w komorze rękawicowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu NADPH
<ol>
 <li>Odważ 1 mg NADPH do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 mL i umieść ją w komorze rękawicowej.</li>
 <li>Rozpuść NADPH w 300 μL anaerobowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM i pH 7,5. Pobierz 30 μL tego roztworu z komory rękawicowej, aby określić stężenie NADPH za pomocą spektrofotometru (ε340 nm= 6,270 M-1cm-1).</li>
</ol>
5. Usuwanie tlenu z roztworu enzymu
<ol>
 <li>Pobrać 400 μL roztworu enzymu z zamrażarki i rozmrozić w komorze rękawicowej. Roztwór enzymu (360 μM) został wcześniej przygotowany w 100 mM buforze fosforanowym potasu (pH 7.5) zawierającym 100 mM NaCl i zamrożony w ciekłym azocie.</li>
 <li>Przenieść roztwór enzymu do fiolki o pojemności 25 mL z mieszadełkiem magnetycznym, zamknąć fiolkę korkiem Wheaton i aluminiową plombą Wheaton, a następnie wyjąć z komory rękawicowej.</li>
 <li>Umieścić fiolkę w lodzie i podłączyć do linii Schlenka, wprowadzając igłę przez korek fiolki.</li>
 <li>Odgazować roztwór enzymu, wykonując 5 kolejnych cykli odgazowywania próżniowego i przepłukiwania argonem co 20 minut przez 1 godzinę.</li>
 <li>Przepłukać fiolkę argonem przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić fiolkę w lodzie wewnątrz komory rękawicowej.</li>
</ol>
6. Redukcyjna półreakcja: Monitorowanie redukcji flawiny
<ol>
 <li>Przygotować aparat stopped-flow oraz oprogramowanie sterujące Pro-Data do trybu pojedynczego mieszania zgodnie z protokołem producenta.</li>
 <li>Włączyć cyrkulacyjną kąpiel wodną (15 °C). Usunąć tlen z wody poprzez przepuszczanie azotu przez 20 minut. Zapobiega to zanieczyszczeniu tlenem układu przepływowego.</li>
 <li>Utrzymać temperaturę strzykawek napędowych i komory obserwacyjnej na poziomie 15 °C, podłączając obudowę kąpieli wodnej urządzenia stopped-flow do łaźni cyrkulacyjnej.</li>
 <li>W oknie Control Panel oprogramowania sterującego Pro-Data wybrać wyzwalacz Photodiode Array, External (aby aktywować działanie stopped-flow) oraz skalę logarytmiczną.</li>
 <li>Uruchomić oprogramowanie Pro-Data viewer i określić katalog, w którym przechowywane będą pliki z danymi.</li>
 <li>Zastąpić roztwór w strzykawkach rezerwuarowych C i F beztlenowym 100 mM buforem fosforanowym potasu (pH 7.5). Przekręcić zawory C i F do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor z obu strzykawek napędowych przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiednie tłoki napędowe łącznie pięć razy (przed każdym ruchem tłoka kliknąć Empty).</li>
 <li>Aby upewnić się, że oksydaza glukozowa została całkowicie usunięta z układu przepływowego, wykonać krok 6.6 łącznie cztery razy.</li>
 <li>Kliknąć Baseline w oprogramowaniu sterującym Pro-Data.</li>
 <li>Zmieszać 100 μL roztworu enzymu z zapasu z 1100 μL beztlenowego 100 mM buforu fosforanowego potasu (stężenie końcowe po zmieszaniu w układzie stopped-flow wyniesie 15 μM).</li>
 <li>Zastąpić roztwór w strzykawce rezerwuarowej F roztworem enzymu. Przekręcić zawór F do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Wykonać tę czynność łącznie trzy razy. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustawić czas akwizycji na 60 s.</li>
 <li>Upewnić się, że obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek. Przekręcić oba zawory do pozycji „drive” i kliknąć Acquire w oprogramowaniu sterującym Pro-Data, aby wykonać napęd. Powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać dane w trzech powtórzeniach. Pozwala to na uzyskanie widm utlenionej formy enzymu.</li>
 <li>Wykorzystując wartość A452 nm uzyskaną z pomiarów, wyznaczyć stężenie enzymu przed mieszaniem (ε452 nm= 13,700 M-1cm-1) i przygotować 4 mL roztworu NADPH o stężeniu 1,5-krotnie wyższym.</li>
 <li>Zastąpić roztwór w strzykawce rezerwuarowej C roztworem NADPH oraz opróżnić i napełnić strzykawkę stopową trzy razy, zgodnie z opisem w punkcie 6.10.</li>
 <li>Powtórzyć krok 6.11. Pozwala to na uzyskanie widm podczas redukcji enzymu.</li>
</ol>
7. Utleniająca półreakcja: monitorowanie utleniania flawiny
<ol>
 <li>Przygotować aparat do pomiarów stop-flow oraz oprogramowanie sterujące Pro-Data do pracy w trybie podwójnego mieszania zgodnie z protokołem producenta.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 6.2-6.5.</li>
 <li>Wymienić roztwór w czterech strzykawkach zbiorczych na beztlenowy 100 mM bufor fosforanowy potasu (pH 7.5). Przekręcić zawór F do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor ze strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Wykonać ten krok łącznie pięć razy dla każdej strzykawki napędowej.</li>
 <li>Wykonać krok 7.3 łącznie cztery razy, aby całkowicie usunąć zawartość z układu przepływowego.</li>
 <li>Kliknąć Baseline w oprogramowaniu sterującym Pro-Data.</li>
 <li>Zmieszać 200 μL roztworu enzymu z zapasu z 1000 μL beztlenowego 100 mM buforu fosforanowego potasu (stężenie końcowe po zmieszaniu w stop-flow wynoszące 15 μM).</li>
 <li>Wymienić roztwór w strzykawce zbiorczej A na roztwór enzymu. Przekręcić zawór A do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej A przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Wykonać ten krok łącznie trzy razy. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustawić czas opóźnienia (delay time) na 0.5 s i czas akwizycji (acquisition time) na 60 s.</li>
 <li>Upewnić się, że wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych. Przekręcić wszystkie zawory do pozycji „drive” i kliknąć Acquire w oprogramowaniu sterującym Pro-Data, aby wykonać pomiar. Powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać dane w trzech powtórzeniach. Pozwala to na uzyskanie widm utlenionej formy enzymu.</li>
 <li>Wymienić roztwór w strzykawce zbiorczej B na roztwór NADPH o stężeniu 1,5 raza większym niż roztwór enzymu w strzykawce A. Przekręcić zawór B do pozycji „drive”, a następnie trzy razy opróżnić i napełnić strzykawkę stopową, jak opisano w punkcie 7.7.</li>
 <li>Wymienić roztwór w strzykawce zbiorczej C na bufor natleniony. Przekręcić zawór C do pozycji „drive”, a następnie trzy razy opróżnić i napełnić strzykawkę stopową, jak opisano w punkcie 7.7. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustawić czas opóźnienia i czas akwizycji odpowiednio na 15 i 900 s.</li>
 <li>Powtórzyć krok 7.8. Pozwala to na uzyskanie widm podczas reoksydacji całkowicie zredukowanego enzymu.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
 <li>Uruchom oprogramowanie Pro-Data converter. Kliknij ikonę Options i wybierz Save in ProDataCSV.</li>
 <li>Otwórz katalog, w którym zapisano pliki danych. Przeciągnij pliki do okna konwertera APL Pro-Data. Dane zostaną automatycznie zapisane w formacie CSV w tym samym katalogu.</li>
 <li>Otwórz pliki w formacie CSV za pomocą programu Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Znormalizuj linię bazową zapisów stopped-flow poprzez odjęcie odpowiadającej im absorbancji przy 700 nm.</li>
 <li>Przeanalizuj skorygowane zapisy za pomocą programu KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA), dopasowując wykres absorbancji w odpowiadającym maksimum w funkcji czasu do odpowiedniej funkcji wykładniczej. Jak pokazano na Ryc. 2B, absorbancję przy 452 nm przedstawiono w funkcji czasu, aby określić szybkość redukcji flawiny po zmieszaniu enzymu i NADPH w urządzeniu stopped-flow. W tym przypadku najlepsze dopasowanie danych uzyskano przy użyciu równania dwuwykładniczego, a dla pierwszej i drugiej fazy redukcji obliczono szybkości wynoszące odpowiednio 0.65 i 0.23 s-1. Aby określić szybkość powstawania produktu pośredniego C4a-hydroperoksyflawiny oraz reoksydację po reakcji zredukowanego enzymu z tlenem, przeanalizowano zapisy stopped-flow odpowiednio przy 380 i 452 nm (Ryc. 3B). Przy użyciu równania jednowykładniczego obliczono szybkości wynoszące odpowiednio 1.4 i 0.006 s-1 dla pierwszego i drugiego etapu utleniającej półreakcji.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Wyniki eksperymentów opisanych w poprzednich sekcjach pokazują, w jaki sposób można monitorować reakcję połowiczną redukcji Af SidA poprzez pomiar zmian absorbancji przy 452 nm, które odpowiadają zmianom stanu redoks flawiny. Szybkość tego etapu można określić poprzez dopasowanie danych do odpowiedniego równania (Rycina 2; krok 8.4). Uzyskana szybkość redukcji (0,65 s-1) jest zbliżona do wartości kcat obliczonej w eksperymentach w stanie stacjonarnym2, co sugeruje, że redukcja jest etapem limitującym szybkość reakcji. Wykorzystując tryb podwójnego mieszania w technice stopped-flow, można określić szybkość utleniania oraz produkty pośrednie w tej reakcji połowicznej (Rycina 3; krok 8.4). W reakcji katalizowanej przez Af SidA wyraźnie wykryto C4a-hydroperoksyflawinę (λmax wynoszące 380 nm), a także obliczono szybkość jej powstawania i rozkładu. Niska uzyskana szybkość reoksydacji (0,006 s-1) wskazuje, że C4a-hydroperoksyflawina jest bardzo stabilna w obecności ornityny.
<img alt="Kataliza enzymatyczna przedstawiająca reakcje połowiczne redukcyjne i utleniające, schemat struktury chemicznej." src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Schemat 1"> 
Schemat 1. Mechanizm Af SidA. Przedstawiono pierścień izoallozaksyny kofaktora FAD. Utleniona flawina (A) wiąże NADPH (B) i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę oraz NADP+ (C). Po reakcji z tlenem cząsteczkowym i związaniu ornityny powstaje C4a-hydroperoksyflawina (D). Jest to gatunek hydroksylujący. Po hydroksylacji ornityny hydroksyflawina (E) musi ulec odwodnieniu, aby utworzyć utleniony enzym. NADP+ pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim uwalnianym produktem (F).
<img alt="Układ spektroskopowy ze stacją roboczą PC do pomiaru absorpcji przejściowej; schemat i etykiety sprzętu." src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Instrument do pomiarów stopped-flow. A) Zdjęcie komponentów spektrofotometru stopped-flow Applied Photophysics SX20. B) Zdjęcie jednostki do obsługi próbek. C) Schemat obwodu przepływowego w trybie podwójnego mieszania.
<img alt="Widma absorbancji i dane kinetyczne; analiza absorpcji przejściowej; pomiary fotoniczne." src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Beztlenowa redukcja SidA za pomocą NADPH w urządzeniu stopped-flow. A) Zmiany widmowe zarejestrowane po zmieszaniu równych objętości 30 μM SidA i 45 μM NADPH. Pierwsze widmo (utlenione SidA) oraz ostatnie widmo (całkowicie zredukowane SidA) zaznaczono odpowiednio kolorem niebieskim i czerwonym. B) Przebieg absorbancji przy 452 nm zarejestrowany w funkcji czasu.
<img alt="Wykres absorbancji w funkcji długości fali; spektroskopia UV-Vis; wskazuje na różne stężenia; piki spektralne." src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Utlenianie SidA w urządzeniu stopped-flow. A) Zmiany spektralne zarejestrowane po zmieszaniu równych objętości w pełni zredukowanego SidA oraz buforu natlenionego. Końcowe stężenia wynosiły 15 μM SidA, 22.5 μM NADPH oraz 0.95 mM tlenu. Widma zarejestrowane w czasie 0.034, 4.268 i 727.494 s odpowiadają odpowiednio w pełni zredukowanemu enzymowi, pośrednikowi w postaci C4a-hydroperoksyflawiny (λmax 380 nm) oraz utlenionemu enzymowi (λmax 450 nm). B) Przebieg absorbancji przy 382 i 452 nm zarejestrowany w funkcji czasu.

<ol><li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA%2C+encoding+L-ornithine+N5-oxygenase%2C+is+required+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li>
<li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li>
<li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+spectroscopic%2C+steady+state%2C+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore-associated+flavin+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li>
<li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFierke%2C+CA+%22Contemporary+enzyme+kinetics+and+mechanism%22">Contemporary enzyme kinetics and mechanism</a>. , Elsevier. USA. (2009).</li>
<li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li>
<li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavoprotein+monooxygenases%2C+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li>
<li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapman%2C+SK+%22Flavoprotein+Protocols%22">Flavoprotein Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, USA. (1999).</li>
<li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2%2C+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li>
<li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substituent+effects+on+the+reaction+of+%C3%8E%C2%B2-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li>
<li>Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28%CE%BC-1%2C2-Peroxo%29diiron%28III%2FIII%29+complex+as+a+precursor+to+the+diiron%28III%2FIV%29+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron-radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">(μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li>
<li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li>
<li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych informacji do ujawnienia.

Enzymy katalizujące reakcje redoks zazwyczaj zawierają kofaktory, takie jak hem i flawiny, które ulegają znacznym zmianom absorbancji w cyklu katalitycznym. Utleniona forma flawiny wykazuje maksima absorbancji przy ~ 360 i 450 nm, a jej redukcję zazwyczaj monitoruje się, śledząc spadek absorbancji przy 450 nm7. Co do zasady obecne są pewne przejściowe produkty pośrednie, jednak powstają i zanikają one zbyt szybko, aby można je było zmierzyć w zwykłych spektrofotometrach. Wykorzystując spektrofotometr stop-flow Applied Photophysics SX20 (lub podobne instrumenty), możliwe jest pomiar zmian absorbancji w skali milisekundowej (czas martwy, 2 ms). W niniejszej pracy zbadaliśmy reakcje połowiczne redukcyjne i oksydacyjne monooksygenazy zależnej od flawiny Af SidA, służącej jako model. Szybkość przeniesienia wodorku określono poprzez pomiar zmiany absorbancji przy 452 nm po zmieszaniu enzymu z NADPH w warunkach anaerobowych. Następnie, wykorzystując tryb podwójnego mieszania instrumentu stop-flow, enzym zareagował najpierw z NADPH aż do osiągnięcia pełnej redukcji, a następnie zredukowany kompleks enzym-NADP+ zmieszano z tlenem. Stosując tę procedurę, możliwe jest wykrycie przejściowych utlenionych produktów pośrednich flawiny oraz pomiar szybkości ich powstawania i zanikania. Identyfikacja tych produktów pośrednich dostarcza danych eksperymentalnych na temat natury gatunków reagujących w katalizie. W przypadku Af SidA jest to powstawanie C4a-hydroperoksyflawiny (zazwyczaj monitorowanej przy 370-380 nm), która jest gatunkiem hydroksylującym. Ponadto pomiar stałej szybkości każdego etapu pozwala uzyskać informacje o etapie limitującym szybkość reakcji i pomaga wyjaśnić kinetyczne i chemiczne mechanizmy działania enzymu. 
Ogólnie rzecz biorąc, podobne podejścia można zastosować do innych flawoenzymów lub białek, w których dochodzi do zmian absorbancji, takich jak białka zawierające hem, fosforan pyridoksalu lub żelazo niehemowe8-10. Ograniczeniem tej metody jest konieczność zastosowania dużych ilości oczyszczonego enzymu, co można jednak rozwiązać, wykorzystując system ekspresyjny o wysokiej wydajności. Optymalne stężenie białka do rejestracji widm ustala się tak, aby użyć ilości białka pozwalającej na zaobserwowanie wystarczająco silnego sygnału, ale nie tak dużej, aby nie marnować enzymu. Zazwyczaj najniższe stężenie enzymów zawierających flawinę stosowane w eksperymentach typu stopped-flow wynosi 6-10 μM (po zmieszaniu) i jest wyznaczane przy użyciu odpowiedniego molowego współczynnika ekstynkcji enzymu. W przypadku Af SidA procent enzymu z związanym FAD wynosi 50-65%2. Apo-białko jest w tych eksperymentach uważane za nieaktywne, ponieważ do katalizy niezbędny jest związany kofaktor FAD. Kolejnym możliwym ograniczeniem tej metody jest fakt, że procesy w enzymie zachodzące szybciej niż w ciągu 2 ms (czas martwy aparatury stopped-flow) nie zostaną zaobserwowane, jednak opisano strategie pozwalające na obniżenie szybkości reakcji w celu rozwiązania tego problemu. Przykładem takiego rozwiązania jest zastosowanie wysokiego stężenia NaCl w reakcji reduktazy ferredoksyny-NADP+11. Usuwanie tlenu z obwodu przepływowego urządzenia stopped-flow jest często trudnym etapem tego eksperymentu i wymaga szczególnej uwagi. Opisany tutaj system oksydaza glukozowa-glukoza jest z sukcesem stosowany w większości laboratoriów, ponieważ jest to metoda skuteczna i niedroga. Istnieją jednak pewne wady, do których należy produkcja H2O2, a w niektórych zastosowaniach należy rozważyć inne alternatywy, takie jak system dioksygenaza protokatechuanowa-protokatechuan12. Wykorzystanie beztlenowej komory rękawicowej (glove box) ułatwia zapewnienie warunków anaerobowych, ale nie jest ono niezbędne. Tlen musi zostać usunięty z obwodu przepływowego stopped-flow, ponieważ chcemy, aby enzym został zredukowany w obecności tlenu lub reagował z tlenem w określonych przez nas stężeniach. Mimo że urządzenie stopped-flow znajduje się w komorze rękawicowej, w obwodzie przepływowym może znajdować się tlen, jeśli w poprzednich eksperymentach stosowano bufory tlenowe. Oprócz pomiarów absorbancji, w spektrofotometrze stopped-flow Applied Photophysics SX20 z odpowiednimi akcesoriami można przeprowadzać analizy fluorescencyjne oraz dichroizmu kołowego.

<table><tbody><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Welch Allyn</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#252;kolby Ehrlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>70340-500</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-129</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S</td><td></td></tr><tr><td>Linie Schlenka</td><td>Kontes Corp</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Butla z argonem </td><td>Airgas</td><td>AR UPC300</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z azotem</td><td>Airgas</td><td>NI200</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z azotem, stopień ultrawysokiej czystości</td><td>Airgas</td><td>NI UHP200</td><td></td></tr><tr><td>Butla z tlenem</td><td>Airgas</td><td>OX 40</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z mieszanką 5% wodoru w azocie</td><td>Airgas</td><td>X02NI95B200H998</td><td></td></tr><tr><td>SX20 Spektrofotometr z przepływem zatrzymywanym</td><td>Zastosowana Fotofizyka</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Pudło rękawicowe</td><td>Coy Laboratories, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>probówki BD Falcon o pojemności 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowate BD Falcon 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrocentryfugi Eppendorf o pojemności 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>szklane fiolki o pojemności 50 i 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-402</td><td></td></tr><tr><td>Korki gumowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-447H</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki aluminiowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406-15</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu(I) jednoprzestrzenny</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC2714080025</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2889</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa z &lt;em&gt;A. niger&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141-250KU</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&amp;#946;&lt;/em&gt;-NADPH</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10116783</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek L(+)-ornityny</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10116783</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) to zawierająca FAD monooksygenaza, która katalizuje hydroksylację ornityny w biosyntezie sideroforów hydroksymatowych, niezbędnych dla wirulencji (np. ferrycyrocyny lub N',N",N'''-triacetylfuzaryniny C)1. Reakcję katalizowaną przez SidA można podzielić na półreakcje redukcyjną i oksydacyjną (Schemat 1). W półreakcji redukcyjnej utleniony FAD związany z Af SidA ulega redukcji przez NADPH2,3. W półreakcji oksydacyjnej zredukowany kofaktor reaguje z tlenem cząsteczkowym, tworząc produkt pośredni w postaci C4a-hydroperoksyflawiny, która przenosi atom tlenu na ornitynę. W niniejszej pracy opisujemy procedurę pomiaru szybkości reakcji oraz detekcji różnych form spektralnych SidA przy użyciu urządzenia typu stopped-flow zainstalowanego w beztlenowej komorze rękawicowej. W urządzeniu stopped-flow małe objętości substratów są szybko mieszane, a po zatrzymaniu przepływu przez strzykawkę stopową (Rysunek 1) rejestrowane są zmiany spektralne roztworu umieszczonego w komorze obserwacyjnej w funkcji czasu. W pierwszej części eksperymentu pokazujemy, jak można wykorzystać urządzenie stopped-flow w trybie pojedynczym, w którym bezpośrednio mierzy się beztlenową redukcję flawiny w Af SidA przez NADPH. Następnie stosujemy ustawienia podwójnego mieszania, w których Af SidA jest najpierw beztlenowo redukowany przez NADPH przez określony czas w pętli starzenia, a następnie reaguje z tlenem cząsteczkowym w komorze obserwacyjnej (Rysunek 1). Do przeprowadzenia tego eksperymentu niezbędne są beztlenowe bufory, ponieważ podczas monitorowania wyłącznie półreakcji redukcyjnej jakikolwiek tlen w roztworach zareagowałby z zredukowanym kofaktorem flawinowym, tworząc produkt pośredni C4a-hydroperoksyflawiny, który ostatecznie rozpadłby się z powrotem do utlenionej flawiny. Uniemożliwiłoby to dokładny pomiar szybkości redukcji ze względu na pełny obrót enzymatyczny. Podczas badania półreakcji oksydacyjnej enzym musi zostać zredukowany w obecności tlenu, aby zaobserwować wyłącznie etapy pomiędzy redukcją a utlenianiem. Jeden z buforów użytych w tym eksperymencie jest nasycony tlenem, co pozwala na badanie półreakcji oksydacyjnej przy wyższych stężeniach tlenu. Są to standardowe procedury stosowane podczas badania półreakcji redukcyjnych lub oksydacyjnych w monooksygenazach zawierających flawinę. Skala czasowa eksperymentów przedstanowych przeprowadzanych metodą stopped-flow wynosi od milisekund do sekund, co pozwala na wyznaczenie wewnętrznych stałych szybkości oraz detekcję i identyfikację produktów pośrednich w reakcji4. Opisane tutaj procedury można zastosować do innych monooksygenaz zależnych od flawiny.5,6

Opisujemy zastosowanie spektrometru z przepływem zatrzymanym (stopped-flow) do badania reakcji redukcyjnej i utleniającej sideroforu A Aspergillus fumigatus (SidA), który jest monooksygenazą zależną od flawiny. Następnie przedstawiamy widma odpowiadające produktom reakcji SidA i obliczamy stałe szybkości ich powstawania.

Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

Siderofora A (SidA) z Aspergillus fumigatus to zawierająca FAD monooksygenaza, która katalizuje hydroksylację ornityny w biosyntezie...

Niniejsza procedura wykorzystuje urządzenie do przepływu zatrzymanego (stopped flow) w celu wykrycia różnych form widmowych SID A oraz pomiaru szybkości reakcji. Reakcja katalizowana przez SID A może zostać podzielona na redukcyjną i oksydacyjną półreakcję FAD. Utleniona flawina wiąże N-A-D-P-H i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę oraz NADP; dodatkowo reakcja z tlenem cząsteczkowym i wiązanie ornityny prowadzą do powstania C four.Po hydroksylacji ornityny powstaje hydroksyflawina, która następnie ulega dehydratacji, tworząc utleniony enzym. NADP⁺ pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim uwalnianym substratem. Urządzenie do szybkich przepływów (stopped-flow) umożliwia szybkie mieszanie małych objętości reagentów oraz rejestrację pomiarów.Zmiany widmowe w czasie mierzone za pomocą spektrofotometru pozwalają na oznaczenie szybkości powstawania produktów i substratów w reakcji katalizowanej enzymatycznie, w szczególności w odniesieniu do przejściowych produktów pośrednich. Dwoje członków mojego laboratorium, Rita Robinson i Enviro Romero, zaprezentuje te eksperymenty, wykorzystując zestaw A z flawinową monooksygenazą jako układ modelowy. Wlej 250 ml buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM do kolby Buchnera o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne.Zamknąć kolbę korkiem gumowym, następnie umieścić ją na mieszalce magnetycznej i podłączyć krótkie ramie kolby do linii Schlenka. Odgazować bufor w próżni przez godzinę w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym mieszaniu, a następnie przepłukać argonem. Powtórzyć tę procedurę pięć razy.Na koniec przemyj kolbę argonem przez 10 sekund. Odłącz kolbę od manifoldu próżniowego i umieść ją wewnątrz komory rękawicowej. Kontynuuj energiczne mieszanie przy otwartej kolbie.Napełnić strzykawki zbiornicze roztworem oksydazy glukozowej o stężeniu 18,13 jednostek na mililitr oraz 100 milimolarnym roztworem glukozy. Następnie ustawić zawory napędowe w pozycji ładowania. Napełnić strzykawki napędowe.Następnie przekręć zawór F do pozycji napędowej. W oprogramowaniu do sterowania danymi pro kliknij opróżnij strzykawkę stopową, a następnie przesuń bufor ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Powtórz tę czynność dla pozostałych trzech strzykawek napędowych i pozostaw do równoważenia przez godzinę.Następnie ponownie napełnij strzykawki zbiornika i powtórz płukanie układu o zatrzymanym przepływie. Aby przygotować bufor nasycony tlenem, przedmuchuj roztwór 100%tlenem przez jedną godzinę przy jednoczesnym mieszaniu.Następnie wyjmij krótką igłę z fiolki i odczekaj 10 sekund. Następnie wyjmij długą igłę i umieść zamkniętą fiolkę w komorze rękawicowej. W przypadku roztworu N-A-D-P-H.Umieścić w komorze rękawicowej probówkę typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającą 1 mg NADPH. Rozpuścić w 300 µl anaerobowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM, pH 7,5.Odbierz 30 µL w celu oznaczenia stężenia N-A-D-P-H. Aby usunąć tlen z zapasu enzymu, przenieś roztwór do fiolki o pojemności 25 mL wyposażonej w mieszadło magnetyczne, korek z watą i aluminiową plombę. Umieść na lodzie.Podłącz do linii Schlenka, następnie odgazuj pod próżnią przez 20 minut, a następnie przepłucz argonem. Na koniec przepłucz fiolkę argonem przez 10 sekund i odłącz ją od manifoldu próżniowego. Umieść fiolkę w lodzie wewnątrz rękawicy (glove box).W oknie panelu sterowania oprogramowania Pro Data Control wybierz opcje: photo diode array, external trigger oraz logarithmic scale. Uruchom również oprogramowanie Pro Data Viewer i określ katalog do przechowywania plików danych.Następnie zastąp roztwór w strzykawkach zbiorniczych C i F beztlenowym 100 milimolarnym buforem fosforanowym potasu o pH 7,5. Przełącz zawory C i F w pozycję napędową. Kliknij opcję opróżniania strzykawki zatrzymującej w oprogramowaniu sterującym pro data.Następnie wypchnij bufor z obu strzykawek napędowych przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Powtórz płukanie za pomocą strzykawek rezerwuarowych C i F jeszcze trzy razy. Aby zapewnić całkowite usunięcie oksydazy glukozowej z obwodu przepływowego, kliknij baseline w oprogramowaniu pro data control.Zastąp roztwór w strzykawce zbiorniczej F roztworem enzymu. Przekręć zawór F do pozycji napędowej. W oprogramowaniu sterującym pro data kliknij opróżnij strzykawkę stopową.Wytłocz roztwór enzymu z strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Wróć do oprogramowania sterującego danymi pro i ustaw czas akwizycji na 60 sekund. Upewnij się, że obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych.Przekręć oba zawory do pozycji napędu i kliknij „acquire” w oprogramowaniu pro data control, aby rozpocząć pomiar. Uzyskaj dane widmowe utlenionej formy enzymu w trzech powtórzeniach, wykorzystując wartość A 4 52 nanometer otrzymaną z pomiarów. Wyznacz stężenie enzymu przed zmieszaniem i przygotuj cztery mililitry roztworu N-A-D-P-H.Napełnij strzykawkę rezerwuarową C roztworem N-A-D-P-H o stężeniu 1,5 raza większym, a następnie opróżnij i napełnij ponownie strzykawkę stopową trzy razy, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Następnie wykonaj pomiar widm podczas redukcji enzymu, przepłukując zawartość obwodu przepływowego beztlennym buforem fosforanowym z potasu o stężeniu 100 millimolar pH 7,5. Teraz kliknij „baseline” w oprogramowaniu pro data control.Następnie zmieszaj 200 µL roztworu zapasowego enzymu z 1000 µL beztlenowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM i pH 7,5. Zastąp roztwór w strzykawce zbiorczej A roztworem enzymu.Przełącz zawór A w pozycję napędu w oprogramowaniu sterującym pro data. Kliknij przycisk stop syringe empty. Przetłocz roztwór enzymu z tłoka napędowego A przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędu.Ustaw czas opóźnienia na 0,5 seconds oraz czas akwizycji na 60 seconds. Sprawdź, czy wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych. Następnie przełącz wszystkie zawory napędowe w pozycję napędową i kliknij acquire w oprogramowaniu pro data control.Należy uzyskać dane widmowe utlenionej formy enzymu w trzech powtórzeniach. Następnie roztwór w strzykawce rezerwuarowej B należy zastąpić roztworem N-A-D-P-H o stężeniu 1,5 raza wyższym niż stężenie enzymu w strzykawce A. Przekręć zawór B do pozycji napędu, a następnie trzy razy opróżnij i napełnij strzykawkę zatrzymującą, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami w oknie panelu sterowania.Ustaw czas opóźnienia na 0.5 seconds. W 20 seconds akwizycji wymień roztwór w strzykawce zbiorczej na bufor natleniony. Przełącz zawór C w pozycję napędową.Przepłucz trzy razy, korzystając z oprogramowania sterującego pro data. Ustaw czas opóźnienia na 15 sekund, a czas akwizycji na 900 sekund. Kontynuuj pozyskiwanie widm podczas reutleniania całkowicie zredukowanego enzymu w urządzeniu do przepływu zatrzymanego (stopped flow).Anaerobową redukcję SID A za pomocą N-A-D-P-H można monitorować, mierząc zmiany stanu redoks flawiny przy użyciu absorbancji przy 452 nm. Zmiany widmowe są rejestrowane w czasie, od utlenionego SID A do ostatniego widma w pełni zredukowanego SID A. Szybkość tego etapu enzymatycznego można określić, dopasowując dane do odpowiedniego równania. Szybkość utleniania oraz produkty pośrednie reakcji można również wyznaczyć, stosując tryb podwójnego mieszania w urządzeniu stopped flow w tej reakcji dla AF Sid A. Produkt pośredni C four A Hydroxi flavin jest wyraźnie wykrywalny z λmax wynoszącym 380 nm, natomiast utleniony enzym ma λmax wynoszący 450 nm.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu od czterech do sześciu godzin. Pamiętaj, aby zapewnić beztlenowość roztworom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak badać zarówno względną, jak i owrzodzeniową jonizację FLA w ramach niezależnych eksperymentów mono w dalszych etapach, takich jak szybka analiza chemiczna.Metoda Quentin może pomóc w wyjaśnieniu charakteru produktów pośrednich.

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Monitorowanie redukcyjnych i utleniających półreakcji flawinozależnej monooksygenazy przy użyciu spektrofotometrii przepływowej z zatrzymaniem przepływu

Źródło:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumenty OroborosTen film wyjaśnia, w jaki sposób strumień tlenu jest wykorzystywany do oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach ssaków. Demonstruje sekwencyjne zastosowanie digitoniny, substratów metabolicznych, ADP, rozprzęgacza i inhibitora w celu scharakteryzowania różnych stanów oddechowych. Uzyskany w ten sposób profil strumienia tlenu ujawnia funkcję mitochondriów i wydajność...

Pomiary strumienia tlenu w celu oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach

Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Tutaj prezentujemy protokół beztlenowego oczyszczania białek, koncentracji białka beztlenowego i późniejszej charakterystyki kinetycznej za pomocą systemu elektrod tlenowych. Metodę zilustrowano przy użyciu enzymu DesB, enzymu dioksygenazy, który jest bardziej stabilny i aktywny, gdy jest oczyszczany i przechowywany w środowisku beztlenowym.

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Tutaj prezentujemy protokół inaktywacji bakterii chorobotwórczych za pomocą reaktywnych form tlenu wytwarzanych podczas fotolizy mononukleotydu flawinowego (FMN) pod wpływem światła niebieskiego i fioletowego o niskiej intensywności. Wykazano, że fotoliza FMN jest prostą i bezpieczną metodą w procesach sanitarnych.

Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

To badanie wprowadza metodologię badania wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów za pomocą testów respirometrycznych i enzymatycznych. Bada modulację łańcucha transportu elektronów u różnych gatunków, dostarczając informacji na temat ukierunkowanego opracowywania biopestycydów przeciwko chorobom przenoszonym przez owady.

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Poznaj spektrofotometrię z zatrzymanym przepływem do badania półreakcji redukcyjnych i oksydacyjnych monooksygenazy SidA z Aspergillus fumigatus. Ta metoda umożliwia pomiar stałych szybkości powstawania przejściowych produktów pośrednich.

Monitorowanie redukcyjnych i oksydacyjnych półreakcji monooksygenazy zależnej od flawiny za pomocą spektrofotometrii z zatrzymanym przepływem (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

Przeglądaj więcej filmów