Monitorowanie redukcyjnych i oksydacyjnych półreakcji monooksygenazy zależnej od flawiny za pomocą spektrofotometrii z zatrzymanym przepływem

W tej procedurze wykorzystuje się przyrząd do zatrzymanego przepływu do wykrywania różnych form widmowych SID A i pomiaru szybkości. Reakcję katalizowaną przez SID A można podzielić na redukcyjne i utleniające półreakcje FAD. Utleniona flawina wiąże się z N-A-D-P-H i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę i NADP oraz reakcję tlenu cząsteczkowego i wiązanie ornityny prowadzi do powstania C czterech.

Hydroksyflawina po hydroksylacji ornityny, hydroksyflawina odwadnia się, tworząc utleniony enzym. NA DP plus pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim substratem, który jest uwalniany. Przyrząd do pomiaru zatrzymanego przepływu ułatwia szybkie mieszanie małych objętości reagentów i płyt.

Zmiany spektralne w czasie Spektrofotometr strat materiału pozwala zmierzyć szybkość powstawania i reakcji katalizowanej enzymem, w szczególności przejściowych produktów pośrednich. Dwie osoby z mojego laboratorium, Rita Robinson i Enviro Romero, zademonstrują te eksperymenty przy użyciu zestawu A w monooksygenazie smakowej jako systemu modelowego. Wlać 250 mililitrów 100-milimolowego buforu fosforanu potasu do 500-mililitrowej kolby Buchnera zawierającej mieszadło.

Uszczelnić kolbę gumowym korkiem, następnie umieścić ją na płytce mieszającej i połączyć krótką rurkę kolby z linią boczną. Odgazować bufor w próżni przez godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem, a następnie przepłukać argonnem. Powtórz pięć razy.

Na koniec przepłukać kolbę preparatem Argonne przez 10 sekund. Odłączyć kolbę od kolektora próżniowego i umieścić ją w schowku na rękawiczki. Kontynuować energiczne mieszanie przy otwartej kolbie.

Napełnij strzykawki zbiornika 18,13 jednostki na mililitr oksydazy glukozowej i 100 milimolowych roztworów glukozy. Teraz ustaw zawory napędowe w pozycji obciążenia. Napełnić strzykawki napędowe.

Następnie przekręć zawór F do pozycji jazdy. Korzystając z oprogramowania do kontroli danych pro, kliknij przycisk opróżnij strzykawkę zatrzymującą, a następnie przepchnij bufor ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiednią pamięć RAM. Kontynuować z pozostałymi trzema strzykawkami napędowymi, równoważyć przez godzinę.

Teraz napełnij strzykawki zbiornika i powtórz płukanie systemu zatrzymanego przepływu. Do przygotowania buforu nasyconego tlenem. Bąbelkować roztwór 100% tlenem przez godzinę z mieszaniem.

Następnie wyjąć krótką igłę z fiolki i odczekać 10 sekund. Przystąpić do wyjmowania długiej igły i umieścić zamykającą fiolkę w schowku na rękawiczki. Do rozwiązania N-A-D-P-H.

Umieść 1,5-mililitrową probówkę einor zawierającą jeden miligram N-A-D-P-H w schowku na rękawiczki. Rozpuścić w 300 mikrolitrach beztlenowego, 100-milimolowego buforu fosforanu potasu. Odczyn pH 7,5.

Usuń 30 mikrolitrów, aby określić stężenie N-A-D-P-H. Teraz, aby usunąć tlen z zapasu enzymu, przenieś roztwór do 25-mililitrowej fiolki zawierającej nakrętkę z mieszadłem z pszenicą i korkiem oraz aluminiową uszczelką. Ułóż na lodzie.

Podłączyć do przewodu schlink, a następnie odgazowywać za pomocą próżni przez 20 minut, a następnie przepłukać argonnem. Na koniec przepłukać fiolkę lekiem Argonne przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić fiolkę na lodzie w schowku na rękawiczki.

W oknie panelu sterowania oprogramowania do kontroli danych pro. Wybierz układ fotodiod, zewnętrzny wyzwalacz i skalę logarytmiczną. Uruchom także oprogramowanie do przeglądania danych pro i zdefiniuj katalog do przechowywania plików danych.

Teraz zastąp roztwór w strzykawkach zbiornika C i F beztlenowym 100-milimolowym buforem fosforanu potasu o pH 7,5. Przekręć zawory C i F do pozycji jazdy. Kliknij przycisk opróżnij strzykawkę zatrzymującą w oprogramowaniu do kontroli danych pro.

Następnie przepchnąć bufor z obu strzykawek napędowych przez obwód przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu. Powtórzyć płukanie strzykawkami C i F jeszcze trzy razy. Aby zapewnić całkowite usunięcie oksydazy glukozowej z obwodu przepływu, przejdź do kliknięcia linii bazowej w oprogramowaniu do kontroli danych pro.

Zastąp roztwór strzykawki F roztworem enzymu. Przekręć zawór F do pozycji jazdy. Kliknij przycisk opróżnij strzykawkę zatrzymującą w oprogramowaniu do kontroli danych pro.

Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu. Wróć do oprogramowania do kontroli danych pro, aby ustawić czas akwizycji na 60 sekund. Sprawdzić, czy obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiadającymi im roztworami i czy siłowniki napędowe stykają się ze strzykawką napędową. Tłoki.

Przekręć oba zawory do pozycji napędu i kliknij przycisk "acquire" w oprogramowaniu pro data control, aby uruchomić napęd. Uzyskać dane spektralne utlenionej formy enzymu w trzech egzemplarzach, wykorzystując wartość A 4,52 nanometra uzyskaną z napędów. Określić stężenie enzymu przed zmieszaniem i przygotować cztery mililitry roztworu N-A-D-P-H.

1,5-krotnie bardziej skoncentrowaną strzykawkę do napełniania zbiornika C roztworem N-A-D-P-H, a następnie opróżnić i ponownie napełnić strzykawkę zatrzymującą trzy razy, jak pokazano wcześniej. Teraz uzyskaj widma podczas redukcji zawartości enzymu wypłukiwanego z obwodu przepływu za pomocą beztlenowego 100-milimolowego buforu fosforanu potasu o pH 7,5. Teraz kliknij linię bazową w oprogramowaniu do kontroli danych pro.

Następnie wymieszać 200 mikrolitrów roztworu podstawowego enzymu z 1000 mikrolitrami beztlenowego, 100-milimolowego buforu fosforanu potasu. pH 7,5. Zastąp roztwór strzykawki zbiornikowej A roztworem enzymu.

Przekręć zawór A do pozycji napędu w oprogramowaniu pro data control. Kliknij pustą strzykawkę zatrzymującą. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej A przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu.

Ustaw czas opóźnienia na 0,5 sekundy, a czas akwizycji na 60 sekund. Sprawdzić, czy wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiadającymi im roztworami, a siłowniki napędowe stykają się z tłokami strzykawki napędowej. Następnie przekręć wszystkie zawory napędowe do pozycji napędu i kliknij na acquire w oprogramowaniu pro data control.

Uzyskać dane spektralne utlenionej formy enzymu w trzech egzemplarzach. Następnie zastąpić roztwór strzykawki B roztworem N-A-D-P-H. 1,5 raza bardziej skoncentrowany niż roztwór enzymu w strzykawce A. Przekręć zawór B do pozycji napędu, a następnie opróżnij i ponownie napełnij strzykawkę zatrzymującą trzy razy, jak pokazano wcześniej w oknie panelu sterowania.

Ustaw czas opóźnienia na 0,5 sekundy. Akwizycja po 20 sekundach, zastąp roztwór morza strzykawki zbiornika natlenionym buforem. Przekręć zawór C do pozycji jazdy.

Spłucz trzy razy w oprogramowaniu do kontroli danych pro. Ustaw czas opóźnienia na 15 sekund i czas akwizycji na 900 sekund. Kontynuuj pozyskiwanie widm podczas ponownego utleniania w pełni zredukowanego enzymu w przyrządzie o zatrzymanym przepływie.

Beztlenową redukcję SID A za pomocą N-A-D-P-H można monitorować, mierząc zmiany stanu redoks flawiny za pomocą absorbentu o stężeniu 452. Zmiany spektralne są rejestrowane w czasie od utlenionego SID A do ostatniego widma całkowicie zredukowanego SID A. Szybkość tego etapu enzymatycznego można określić, dopasowując dane do odpowiedniego równania. Szybkość utleniania i produkty pośrednie reakcji można również określić za pomocą trybu podwójnego mieszania zatrzymanego przepływu w tej reakcji przez AF Sid A. Półprodukt C cztery A Hydroxi flawiny jest wyraźnie wykrywany z maksimum lambda wynoszącym trzy 80 nanometrów, a utleniony enzym ma maksimum lambda 450 nanometrów.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Pamiętaj, aby upewnić się, że roztwory są beztlenowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać zarówno względny, jak i wrzodziejący jon niezależnego mono FLA w dalszym eksperymencie, takim jak szybka substancja chemiczna.

Quentin może pomóc wyjaśnić smutną naturę produktów pośrednich.