Name: Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w iPSC przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP. Technika umożliwia identyfikację kolonii komórek macierzystych poprzez utratę fluorescencji GFP i ekspresję markerów pluripotencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez Yale School of Medicine oraz Child Health Research Award z Charles Hood Foundation.

1. Reprogramowanie za pomocą retrowirusa wykazującego ekspresję czynników reprogramujących
<ol>
 <li>Ludzkie fibroblasty hoduje się w pożywce do fibroblastów (10% FBS w DMEM z Pen/Strep).</li>
 <li>Na dzień przed infekcją wysiać 1x105 ludzkich fibroblastów do jednego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Odssać pożywkę, aby usunąć martwe komórki, i dodać 2 ml świeżej pożywki do fibroblastów. Dodać siarczan protaminy do końcowego stężenia 5 μg/ml.</li>
 <li>Ostrożnie dodać odpowiednią ilość każdego wirusa wykazującego ekspresję GFP, odpowiadającą wielokrotności infekcji (MOI) 55.</li>
 <li>Na dzień po infekcji usunąć nadsącz wirusowy, trzykrotnie przemyć 2 ml PBS, a następnie dodać 2 ml pożywki do fibroblastów.</li>
 <li>Trzy dni po infekcji sprawdzić fluorescencję GFP i uzupełnić dołek 2 ml pożywki do fibroblastów.</li>
 <li>Cztery dni po infekcji wysiać 1x104 /cm2 naświetlanych komórek zasilających z embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) w pożywce do fibroblastów na 10-cm szalkę Petriego powleczoną 0,1% żelatyną. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Pięć dni po infekcji odczepić zainfekowane ludzkie fibroblasty za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wirować przez 5 minut przy 200 g. Odssać pożywkę i resuspendować komórki w 10 ml pożywki do fibroblastów. Przenieść komórki na uprzednio powleczoną płytkę 10-cm.</li>
 <li>Po 24 godzinach wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli hESC (20% Knock-Out serum replacement, DMEM/F12, 0,1 ml nieistotnych aminokwasów, 4 ng/ml bFGF, Pen/Strep/Glutamate, beta-merkaptoetanol). Wymieniać pożywkę codziennie. Kolonie przypominające ESC zaczną pojawiać się między 20. a 27. dniem po infekcji.</li>
</ol>
2. Izolacja i ekspansja iPSC
<ol>
 <li>Pod mikroskopem fluorescencyjnym sprawdź brak fluorescencji GFP w kolonii wykazującej morfologię podobną do hESC.</li>
 <li>Za pomocą pipety 10 μl wybierz poszczególne kolonie iPSC i przenieś je do jednego dołka płytki 12-dołkowej powlekanej żelatyną i MEF, uzupełnionej o pożywkę dla hESC. Wymieniaj pożywkę codziennie.</li>
 <li>W celu pasażowania przemyj płytkę 1 ml DMEM/F12, następnie dodaj 0,5 ml kolagenazy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Przemyj komórki dwukrotnie za pomocą DMEM/F12.</li>
 <li>Dodaj 2 ml świeżej pożywki dla hESC. Używając cell liftera, rozbij kolonie na małe fragmenty i odklej pozostałe komórki od płytki.</li>
 <li>Przenieś resuspendowane fragmenty kolonii do jednego dołka płytki 6-dołkowej powlekanej żelatyną i MEF.</li>
</ol>
3. Analiza immunofluorescencyjna markerów pluripotencyjnych
<ol>
 <li>Komórki przemyć trzy razy PBS i utrwalić 4% paraformaldehydem przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Komórki delikatnie przemyć trzy razy PBS i poddać permeabilizacji 0,2% Tritonem X-100 w PBS przez 30 min.</li>
 <li>Zablokować niespecyficzne wiązanie, inkubując komórki w 3% BSA w PBS przez dwie godziny.</li>
 <li>Komórki inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Komórki przemyć trzy razy PBS i inkubować z odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
 <li>Komórki przemyć trzy razy PBS, dodając DAPI podczas ostatniego płukania, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
 <li>Barwienie wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
4. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym dla markerów pluripotencji
<ol>
 <li>Wyizolować całkowite RNA z ludzkich iPSC pochodzących z ludzkich fibroblastów, używając zestawu RNeasy firmy Qiagen.</li>
 <li>Zsyntetyzować pierwszą nić cDNA, wykorzystując odwrotną transkryptazę SuperScript II.</li>
 <li>Przeprowadzić qPCR w celu wykrycia genów pluripotencji, używając wcześniej opisanych starterów.6</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<ol>
 <li>Zmiany morfologiczne podczas przeprogramowania 
 Zainfekowaliśmy ludzkie fibroblasty BJ1 oraz Detroit 551 koktajlem retrowirusów niosących OCT4, SOX2, KLF4 i MYC, co pozwoliło nam wykryć zmiany morfologiczne podczas przeprogramowania (Rycina 1). Dwadzieścia jeden dni po infekcji zidentyfikowaliśmy małe kolonie iPSC po ich morfologii przypominającej hESC. Ponadto iPSC rozpoznano dzięki fluorescencji GFP. Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak ESC i iPSC, wykazują aktywność mechanizmów molekularnych tłumiących ekspresję genów prowirusowych7-9. Nasz unikalny wektor retrowirusowy wykazuje ekspresję GFP wraz z genami przeprogramowania za pomocą LTR retrowirusowego. W związku z tym komórki stale wykazujące fluorescencję GFP są uznawane za komórki wykazujące ekspresję transgenów bez wyciszenia genów prowirusowych. Prawidłowo przeprogramowane kolonie iPSC, które nabyły molekularną sieć pluripotencji, wykazują brak ekspresji GFP (Rycina 2)10. </li>
 <li>Charakterystyka pluripotencji ludzkich iPSC 
 Przeanalizowaliśmy kolonie pochodzące z fibroblastów Detroit-551 za pomocą immunohistochemii z przeciwciałami przeciwko Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 i NANOG (Tabela 2). Skutecznie przeprogramowane iPSC wykazują ekspresję wszystkich tych markerów (Rycina 3A). Przeanalizowaliśmy również ekspresję genów za pomocą ilościowej analizy RT-PCR. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja OCT4, SOX2, KLF4, MYC i NANOG była znacznie zwiększona w porównaniu z rodzicielskimi komórkami fibroblastów, lecz była porównywalna z ekspresją w ludzkich hESC H9 (Rycina 3B).</li>
</ol>
<img alt="Obrazy hodowli komórkowych w układzie mikroskopowym służące do identyfikacji etapów wzrostu i różnicowania komórek." src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zmiany morfologiczne fibroblastów ludzkich zainfekowanych retrowirusem. (A-D) Postępująca zmiana morfologiczna w koloniach fibroblastów Detroit-551 zainfekowanych czynnikami reprogramującymi. Dzień 5 (A), Dzień 10 (B), Dzień 14 (C), dzień 21 (D). Po 21 dniach komórki wykazują morfologię przypominającą hESC.
<img alt="Etapy różnicowania komórek w mikroskopii i obrazowaniu fluorescencyjnym; analiza w ustawieniu laboratoryjnym." src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywna ekspresja fluorescencyjna GFP w komórkach poddawanych reprogramowaniu. Fibroblasty BJ i Detroit 551 zainfekowano retrowirusem wykazującym cztery czynniki reprogramujące4 i inkubowano w medium hESC przez cztery tygodnie. Fibroblasty BJ (A, B) i Detroit 551 (C, D) wykazują podobną morfologię. Od 21. dnia zaczynają tworzyć się kolonie ujemne dla GFP, które reprezentują autentyczne iPSCs10. (E, F) przedstawiają przekształcone komórki Detroit 551, które nie przeszły prawidłowego reprogramowania. (A, C, E) kolonie w obrazie kontrastowym. (B, D) prawidłowo reprogramowane komórki wykazujące wyciszenie GFP. (F) silna ekspresja GFP w przekształconej kolonii.
<img alt="Wyniki barwienia immunofluorescencyjnego i wykres słupkowy ekspresji genów dla analizy markerów komórek macierzystych." src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Charakterystyka ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. (A) Kolonie ludzkich komórek 551-iPS-K1 wykazują ekspresję markerów typowych dla komórek pluripotencjalnych. Barwienie DAPI wskazuje całkowitą liczbę komórek w polu. (B) Ilościwa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) dla ekspresji OCT4, SOX2, KLF4, MYC w fibroblastach rodzicielskich, iPSC 551-iPS-K1 oraz ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) H9. Dane znormalizowano względem genu referencyjnego β-actin i przedstawiono w stosunku do poziomu ekspresji w fibroblastach rodzicielskich4.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
<li>Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych przeprogramowuje ludzkie fibroblasty do iPSCs. Podjęto wiele prób generowania ludzkich iPSCs z wykorzystaniem podejść nieintegrujących lub niegenetycznych w celu uzyskania klinicznie bezpiecznych iPSCs. Do tej pory metody te wykazują niezwykle niską wydajność i wymagają dalszej optymalizacji w celu poprawy powtarzalności11-14. Metody retrowirusowe lub lentiwirusowe są powszechnie stosowane do uzyskiwania i wykorzystywania iPSCs w ludzkich modelach chorób in vit...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy Knockout Serum Replacer</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol (14,3 M) lub MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. Pożywka hodowlana&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Żelatyna wieprzowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0.2%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>Komórki zasilające MEF</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna: mikroskop odwrócony z filtrem GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2. Odczynniki i sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ipsc) przy użyciu wektora retrowirusowego z gfp

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) są pluripotencjalne i stanowią nieocenione źródło komórkowe dla modelowania chorób in vitro oraz medycyny regeneracyjnej1. Wykazano wcześniej, że ludzkie komórki somatyczne mogą zostać przeprogramowane do stanu pluripotencjalności poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, Klf4 oraz Myc), stając się indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPSCs)2-4. Podobnie jak hESCs, ludzkie iPSCs są pluripotencjalne i stanowią potencjalne źródło komórek autologicznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów przy użyciu czterech czynników przeprogramowania sklonowanych do retrowirusowego szkieletu zawierającego GFP4. Stosując poniższy protokół, generujemy ludzkie iPSCs w ciągu 3-4 tygodni w warunkach hodowli ludzkich ESC. Kolonie ludzkich iPSCs ściśle przypominają hESCs pod względem morfologicznym i wykazują utratę fluorescencji GFP w wyniku wyciszenia transgenu retrowirusowego. Kolonie iPSC izolowane mechanicznie pod mikroskopem fluorescencyjnym zachowują się w sposób podobny do hESCs. W komórkach tych wykrywamy ekspresję wielu genów pluripotencjalności oraz markerów powierzchniowych.

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) są pluripotencjalne i stanowią nieocenione źródło komórkowe dla modelowania chorób in vitro oraz medycyny regeneracyjnej1. Wykazano, że...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie ludzkich komórek iPS poprzez retrosygnacyjną nadekspresję OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC z zastosowaniem systemu reporterowego GFP. Jest to osiągane poprzez uprzednie dodanie odpowiedniej ilości poszczególnych retrowirusów wykazujących ekspresję GFP. Następnie zainfekowane wirusem z ekspresją GFP komórki przenosi się na płytki powlekane 0,1% żelatyną z fibroblastami embrionalnymi myszy.Trzecim krokiem procedury jest wymiana medium na pożywkę do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Na koniec izoluje się kolonie iPS z wyciszonym GFP, które wykazują morfologię podobną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Ostatecznie wyniki wykazują ekspresję endogennych markerów pluripotencji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i R-T-Q-P-C-R.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie żywych komórek z zastosowaniem pluripotencjalnych markerów powierzchniowych i obserwacja zmian morfologicznych, jest pożądany iPad. Kolonie komórek można łatwo wyizolować, wykorzystując utratę ekspresji GFP jako marker komórek pluripotencjalnych w celu rozpoczęcia hodowli. Na jeden dzień przed infekcją wysiać ludzkie fibroblasty w medium do fibroblastów w ilości 1×10⁵ ludzkich fibroblastów do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Następnego dnia odessać medium, aby usunąć martwe komórki, i dodać 2 ml świeżego medium do fibroblastów z dodatkiem 5 µg/ml siarczanu protaminy.Następnie ostrożnie dodaj odpowiednią ilość każdego wirusa wykazującego ekspresję GFP, odpowiadającą wielokrotności zakażenia (MOI) równej pięciu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez noc, jeden dzień po zakażeniu. Usuń nadsącz wirusowy i przemyj trzy razy 2 mL PBS.Następnie, trzy dni po infekcji, należy dodać dwa mililitry pożywki dla fibroblastów. Sprawdzono fluorescencję GFP i uzupełniono studzienkę o dwa mililitry pożywki dla fibroblastów. Następnego dnia na 10-centymetrową szalkę Petriego pokrytą 0,1% żelatyny wysiano w pożywce dla fibroblastów 1 × 10⁴ na centymetr kwadratowy naświetlonych embrionalnych fibroblastów mysich lub komórek feeder MEF.Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia odkleić zakażone ludzkie fibroblasty, dodając 1 ml 0,05% trypsyny EDTA, i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37°C, a następnie wirować przez pięć minut przy 200 G. Resuspender komórki w 10 ml pożywki dla fibroblastów i wysiać je ponownie na podłoże uprzednio pokryte 0,1% żelatyną z mfs. Powtórzyć czynność po 24 godzinach.Wymień pożywkę na pożywkę hodowlaną HESC i wymieniaj ją codziennie. Kolonie przypominające ESC zaczną pojawiać się od 20 do 27 dni po infekcji; weryfikuj ich obecność pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sprawdź brak fluorescencji GFP w kolonii wykazującej morfologię podobną do HSC.Używając pipety 10 µL, pobierz poszczególne kolonie iPSC i przenieś je do pojedynczych dołków 12-dołkowej płytki powlekanej żelatyną i metoksylopectiną, uzupełnionej pożywką HESC. Wymieniaj pożywkę codziennie; pasażuj komórki, przemywając płytkę 1 mL pożywki DMM F 12.Następnie dodaj 0,5 ml kolagenazy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Przemyj komórki dwukrotnie za pomocą DM A MF 12. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki HESC.Następnie za pomocą scrapra (cell lifter) rozbić kolonie na małe fragmenty i odczepić pozostałe komórki od płytki. Przenieść resuspensowane fragmenty kolonii do jednego dołka sześciodołkowej płytki pokrytej żelatyną i MEF, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dwa dni.W celu sprawdzenia komórek metodą immunofluorescencji, należy przemyć je trzykrotnie PBS i utrwalić 4% paraldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki należy delikatnie przemyć trzykrotnie PBS i poddać permeabilizacji 0,2% Triton X 100 w PBS przez 30 minut.Zablokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując komórki w 3% BSA w PBS przez dwie godziny. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Potem przemyj komórki trzykrotnie PBS i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności.Przemyj komórki trzy razy buforem PBS, kończąc na ostatnim płukaniu. Dodaj dappy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wykonaj obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu przeprowadzenia ilościowej analizy w czasie rzeczywistym.Wyizoluj całkowite RNA z ludzkich IPC pochodzących z fibroblastów ludzkich za pomocą zestawu do izolacji RNA. Zsyntetyzuj pierwszą nici cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy.Następnie należy wykorzystać go jako matrycę do qPCR w celu wykrycia genów pluripotencji. Ludzkie fibroblasty BJ, które zostały zainfekowane koktajlem retrowirusów niosących OCT4, SOX2, KLF4 i MYC, wykazują przedstawione tutaj zmiany morfologiczne obserwowane podczas reprogramowania od piątego dnia. W dniach 10, 14 i 21 komórki zaczynają wykazywać morfologię przypominającą hESC, a po 21 dniach iPSC są rozpoznawane dzięki fluorescencji GFP.Pluripotentne komórki macierzyste, takie jak ESC i IPC, wykazują aktywność mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za represję ekspresji genów prowirusowych. Jednakże zastosowane w tym badaniu wektory retrowirusowe wykazują ekspresję GFP wraz z genami reprogramującymi pod kontrolą retrowirusowego LTR. Zatem komórki stale wykazujące ekspresję GFP są uznawane za komórki z ekspresją transgenów bez wyciszania genów prowirusowych; jak tutaj rzetelnie pokazano, reprogramowane kolonie iPSC, które nabyły molekularną sieć pluripotencji, wykazują brak ekspresji GFP.Rysunek ten przedstawia analizę immunohistochemiczną kolonii pochodzących z fibroblastów Detroit 5 51 z przeciwciałami przeciwko TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four, T four oraz nano, co potwierdza sukces procesu. Przeprogramowane iPSC wykazują ekspresję wszystkich tych markerów. Ponadto przeprowadzono ilościową analizę R-T-P-C-R w celu zbadania ekspresji genów, która wykazała, że poziomy T four, SOX two, KLF four M oraz nano były znacząco zwiększone w porównaniu z macierzystymi komórkami fibroblastów, ale porównywalne z poziomami w H nine HSCs.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić infekcję wirusem oraz jak zidentyfikować i wyizolować w pełni zaprogramowane lipidowo komórki IPA przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

reprogramming-human-somatic-cells-into-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeprogramowywanie ludzkich komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Poznaj metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w iPSC przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP. Technika umożliwia identyfikację kolonii komórek macierzystych poprzez utratę fluorescencji GFP i ekspresję markerów pluripotencji.

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP (Wideo) | JoVE Journal

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Przeglądaj więcej filmów