Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich komórek IPS poprzez nadekspresję OCT 4 za pośrednictwem retrowirusa, SOX 2K, LF 4 i M za pomocą systemu reporterowego GFP. Osiąga się to poprzez dodanie najpierw odpowiedniej ilości indywidualnego GFP wykazującego ekspresję retrowirusa. Następnie komórki zakażone wirusem wykazującym ekspresję GFP są przenoszone na 0,1% płytki pokryte żelatyną z mysimi fibroblastami zarodkowymi.

Trzecim etapem procedury jest zastąpienie pożywki pożywką do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Na koniec wyizolowano kolonie IPS wyciszone przez GFP, które wykazują podobną morfologię do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Ostatecznie wyniki wskazują na ekspresję endogennych markerów pluripotencjalnych poprzez barwienie immunofluorescencyjne i R-T-Q-P-C-R.

Główną zaletą tej techniki dotychczasowej metody, jaką jest barwienie stylu życia za pomocą pluripotencjalnego markera powierzchniowego i obserwacja zmiany morfologicznej, jest pożądany iPad. Kolonie komórkowe można łatwo wyizolować przy użyciu utraty ekspresji GFP jako markera dla komórek pluripotencjalnych Aby rozpocząć hodowlę. Ludzkie fibroblasty w pożywce fibroblastów na dzień przed infekcją płytka jeden razy 10 do piątej Ludzkie fibroblasty do jednej studzienki z sześciodołkową płytką następnego dnia odessać pożywkę w celu usunięcia martwych komórek i dodać dwa mililitry świeżej pożywki fibroblastowej z pięcioma mikrogramami na mililitr siarczanu protaminy.

Następnie ostrożnie dodać odpowiednią ilość każdego wirusa wykazującego ekspresję GFP, co odpowiada liczbie pięciu infekcji. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc dzień po zakażeniu. Usunąć wirusowy supernatant przemyć trzykrotnie dwoma mililitrami PBS.

Następnie dodaj dwa mililitry pożywki fibroblastowej trzy dni po zakażeniu. Sprawdź fluorescencję GFP i uzupełnij studzienkę dwoma mililitrami. Pożywka z fibroblastami następnego dnia umieszcza się na płytce jeden razy od 10 do czwartej na centymetr kwadratowy napromieniowanej myszy, fibroblastów embrionalnych lub komórek żywiących metamfetaminę w pożywce fibroblastów na 10-centymetrową szalkę Petriego pokrytą 0,1% żelatyną.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odłącz zakażone ludzkie fibroblasty za pomocą jednego mililitra 0,05% tripsyny EDTA przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wiruj przez pięć minut w temperaturze 200 G. Ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach pożywki fibroblastowej i odtwórz komórki na wstępnie pokrytej 0,1% żelatynie z mfs. 24 godziny później.

Zastąp pożywkę pożywką hodowlaną HESC i zmieniaj pożywkę codziennie. Kolonie podobne do ESC zaczną pojawiać się od 20 do 27 dni po zakażeniu po pojawieniu się kolonii podobnych do ESC pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sprawdź, czy nie ma fluorescencji GFP w kolonii, która wykazuje podobną morfologię do HSC.

Za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Wybierz pojedyncze kolonie IPSC i umieść je w jednym dołku na 12-dołkowej płytce pokrytej żelatyną i metamfetaminą, uzupełnionej pożywką HESC. Zmienić podłoże dziennego pasażu komórek, myjąc płytkę jednym mililitrem DMM F 12.

Następnie dodaj 0,5 mililitra kolagenazy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj komórki dwukrotnie za pomocą DM A MF 12. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki HESC.

Następnie użyj podnośnika komórkowego, aby rozbić kolonie na małe kawałki i oderwać pozostałe komórki od płytki. Przenieś zawieszone kawałki kolonii do jednego dołka z żelatyną i MEF pokrytym sześcioma. Dobrze płytkować i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Aby sprawdzić komórki za pomocą immunofluorescencji. Umyj je trzykrotnie PBS i utrwal 4% paraldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie umyj komórki trzykrotnie PBS i przemuj je 0,2% tritton X 100 w PBS przez 30 minut.

Zablokuj niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację komórek z 3% BSA w PBS przez dwie godziny. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj komórki trzykrotnie PBS i inkubuj je z przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Umyj komórki trzykrotnie PBS podczas ostatniego prania. Dodaj dappy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Obrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu uzyskania ilościowego czasu rzeczywistego.

PCR izoluje całkowite RNA z ludzkich IPC pochodzących z ludzkich fibroblastów. Korzystanie z zestawu do izolacji RNA. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy.

Następnie użyj go jako matrycy dla QPCR do wykrywania genów pluripotencji. Ludzkie fibroblasty, BJ jeden, który został zakażony koktajlem retrowirusów przenoszących OCT cztery, SOX dwa, KLF cztery i Mick pokazane tutaj, to zmiany morfologiczne obserwowane podczas przeprogramowania od piątego dnia. Dzisiejsze 10, 14 i 21 komórki zaczynają wykazywać morfologię podobną do HESC po 21 dniach, a IPC są rozpoznawane przez fluorescencję GFP.

Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak ESC i IPC, wyrażają molekularną maszynerię do tłumienia ekspresji genów prowirusowych. Jednak zastosowane tutaj wektory retrowirusowe wyrażają GFP wraz z przeprogramowaniem genów przez retrowirusowy LTR. Tak więc uważa się, że komórki wykazujące ciągłą ekspresję GFP wyrażają transgeny bez wyciszania genów prowirusowych, jak widać tutaj wiernie, przeprogramowane kolonie IPSC, które nabywają sieć molekularną pluripotencji, wykazują brak ekspresji GFP.

Ten rysunek przedstawia analizę immunohistochemiczną kolonii pochodzących z Detroit 5 51 fibroblastów z przeciwciałami przeciwko TRA 180 1, TRA jeden 60 SSEA cztery T cztery i nano, jak można zobaczyć z powodzeniem. Przeprogramowane IPC wyrażają wszystkie te markery. Ponadto przeprowadzono ilościowe R-T-P-C-R w celu analizy ekspresji genów i ujawniły, że T 4 SOX dwa, KLF cztery M i nano były znacznie zwiększone w porównaniu z macierzystymi komórkami fibroblastów, ale współmierne do komórek H 9 HSC.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainfekować wirusa, zidentyfikować i podnieść w pełni zaprogramowane wargi komórki IPA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.