Badania przesiewowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie nowej generacji: przydatne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Celem tego eksperymentu jest identyfikacja genu lub genów odpowiedzialnych za morfologiczną i funkcjonalną integralność organelli roślinnych. Osiąga się to poprzez pierwsze dodanie sulfonianu metanu Ethel jako środka chemicznego do nasion atopii mutagenowej zawierających marker fluorescencyjny organelli. Drugim krokiem jest zebranie nasion z poszczególnych roślin pierwszego pokolenia mutagenów w celu wyhodowania linii kolejnego pokolenia mutantów M dwa.

Następnie mutagen a nasiona Eliana są obserwowane za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania nieprawidłowego fenotypu organów. Ostatnim krokiem jest wygenerowanie trzeciej generacji mutagenu i potwierdzenie obecności zmutowanego fenotypu. Ostatecznie mutację recesywną można zmapować za pomocą narzędzi sekwencjonowania nowej generacji.

Po zidentyfikowaniu lokalizacji zmutowanego genu, transformacja z genem typu dzikiego powinna przywrócić nieprawidłowy fenotyp narządów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące utrzymania integralności morfologicznej i funkcjonalnej organelli roślinnych. Metany Atilu, traktowanie sulfonianami nasion sta indukują zmiany czasu cytozyny w genomie, co skutkuje cytozyną gwan do czasu.

Dodawanie mutacji. Leczenie EMS jest kluczowym krokiem w tym protokole, aby zapewnić idealną mutację proporcji u dwóch osób M. Na początek należy uzyskać nasiona Arabidopsis typu dzikiego Columbia Ecotype, które zostały wcześniej zaprojektowane tak, aby zawierały odpowiedni marker fluorescencyjny organelli.

Przenieś 0,8 grama lub około 40 000 nasion do 50-mililitrowej tubki sokoła. Następnie dodaj 25 mililitrów wody destylowanej i 0,2% sulfonianu metanu Ethel. Po inkubacji inkubować mieszaninę przez 16 godzin na mieszalniku mutującym przy niskiej prędkości, po inkubacji odessać ciecz i wyrzucić ją do spalacza zawierającego jeden molowy wodorotlenek sodu.

Aby dezaktywować EMS, dodaj 25 mililitrów wody do probówki Falcon zawierającej nasiona. Zamknij rurkę i odwróć pięć razy, aby umyć nasiona. Gdy wszystkie nasiona opadną, odessać wodę i wylać do jednej molowej kolby wodorotlenku sodu.

Powtórz ten etap mycia do 10 razy po ostatnim praniu, Reese spędź nasiona w minimalnej ilości wody. Przystąp do sterylizacji nasion, dodając 25 mililitrów 10% wybielacza i energicznie wstrząsając przez 30 sekund. Gdy nasiona osiądą na dnie, odlej wybielacz i spłucz 25 mililitrami sterylnej wody.

Po usunięciu sterylnej wody dodaj 25 mililitrów 70% etanolu. Potrząsaj rurkami przez 30 sekund i pozwól nasionom osiąść na dnie. Odlej etanol i spłucz 25 mililitrami sterylnej wody.

Powtórz dwukrotnie mycie sterylną wodą. Następnie wysyp nasiona na plastikową szalkę Petriego zawierającą bibułę filtracyjną o średnicy trzech mm. Pozostaw nasiona do wyschnięcia pod maską po inkubacji nasion przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umieść nasiona na 150-milimetrowej szalce Petriego po około 250 do 300 nasionach na talerzu w połowie Magi i scoog pożywce zawierającej żel bojowy. Jako środek do galaretki hoduj nasiona z pokolenia M1 na talerzach przez dwa tygodnie. Przeszczep sadzonki do gleby i pozwól roślinom dalej rosnąć.

Po 30 do 45 dniach rośliny osiągną dojrzałą fazę, w której są dojrzałe, dzięki czemu wycieki będą wyraźnie widoczne. W tym momencie zbierz M dwa nasiona z poszczególnych roślin M1, aby wygenerować 1000 niezależnych M dwóch linii. Aby obserwować siewki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego, hoduj 60 nasion z każdej linii M two przez siedem do 10 dni na plastikowych szalkach Petriego na pół.

Moreish i scoog podłoże zawierające żel bojowy również uprawiają pięć sadzonek nietraktowanej kontroli EMS na tej samej płytce. Gdy sadzonki są już wyrośnięte, zamontuj od pięciu do 10 wkładów cos stroną uszczelniającą ABAC w kierunku 40-krotnej soczewki na szkiełku mikroskopowym i otoczone szkiełkiem nakrywkowym pod fluorescencją, obserwuj każdą oleinę od obszaru korowego do przyśrodkowego pod kątem zmienionej subkomórkowej dystrybucji markera organelli. Po przesadzeniu roślin z dodatnim wynikiem do gleby i wyhodowaniu sadzonek, jak właśnie opisano, potwierdź, że zmutowany fenotyp jest w pokoleniu M trzy.

Usunąć zanieczyszczające mutacje tła poprzez co najmniej trzykrotne krzyżowanie wsteczne z genomem typu dzikiego zawierającym pożądany narządowy marker fluorescencyjny, jak opisano w pisemnym protokole. Aby rozpocząć mapowanie, użyj mini zestawu do ekstrakcji mikrogramów DNA genomowego DN Easy Z, aby wyekstrahować około trzech mikrogramów genomowego DNA z M trzy, który reprezentuje homozygotyczne zmutowane DNA Columbia. Prześlij to DNA do analizatora genomu Illumina dwa sekwencjonowanie 14.

Następnym krokiem jest skrzyżowanie mutanta zago Colombia z Las Berger w celu uzyskania jednego potomstwa po samozapyleniu, w którym może wystąpić kombinacja. Pokolenie głuchych zębów będzie wynikiem i ostatecznie posłuży jako populacja mapująca zawierająca gen będący przedmiotem zainteresowania, który powoduje mutację. Porównując genomowe DNA tej populacji z genomowym DNA roślin typu studziennego, można zidentyfikować lokalizację mutacji w genomie.

Po wzroście dwóch roślin F, zbierz od 70 do 100 F, dwa osobniki wykazujące nieprawidłowy fenotyp i taką samą liczbę F dwóch roślin o fenotypie dzikim, zbierz krążek liściowy z każdej rośliny za pomocą całego stempla. Krążek liściowy należy zbierać z liści w tym samym wieku. Aby zapewnić podobne ilości DNA, próbki mogą być przetwarzane do ekstrakcji genomowej osobno lub w grupach.

W takim przypadku możliwe jest pobranie od pięciu do 10 próbek dla każdej probówki endomorfowej, dzięki czemu jest mniej probówek, z których trzeba wyekstrahować genomowe DNA. Użyj głównego zestawu do oczyszczania czystego DNA z liści roślin, aby wyekstrahować genomowe DNA. Genomowe DNA uzyskane z każdej próbki można następnie określić ilościowo za pomocą NanoDrop.

Następnie łącząc równą ilość DNA z każdej próbki do łącznej liczby 300 nanogramów, oddzielając próbki zmutowane i dzikie, aby najpierw przeprowadzić reakcję znakowania, dodaj 60 mikrolitrów 2,5 x losowy roztwór startera i 42 mikrolitry wody. Po denaturacji DNAA w temperaturze większej niż 95 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut, wezwij próbki na lód w celu denaturacji DNA. Dodaj 15 mikrolitrów 10 X DN tps.

Wymieszać z biotyną DCTP i uzupełnić trzema mikrolitrami. Polimeraza Glen. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnego dnia dodaj 15 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu i 400 mikrolitrów zimnego 100% etanolu. Inkubować zmieszane próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę po odwirowaniu w temperaturze 20 500 razy G przez 15 minut. Umyj granulat 500 mikrolitrami zimnego, 75% etanolu po drugim wirowaniu.

Suszyć granulki DNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach wody i użyć pięciu mikrolitrów, aby sprawdzić wydajność i jakość na żelu bio. Pierwsze losowe reakcje znakowania załadowano na 1% żel aros z puli dzikich roślin typu F dwóch i z puli zmutowanych roślin typu F.

W ostatnim kroku wyślij 95 mikrolitrów reakcji znakowania typu dzikiego i mutantów dla rzodkiewnika genowego i hybrydyzacji jednej macierzy genomu. Po zeskanowaniu gumki, uzyskane wynikowe pliki kropkowe CL są analizowane za pomocą naszego oprogramowania. Po zainstalowaniu naszego oprogramowania otwórz program i wklej ciąg bioconductor znaleziony w pisemnej procedurze.

Następnie naciśnij powrotu, który zainstaluje standardowe pakiety BIOCONDUCTOR ze strony internetowej tablicy, genotypowania i mapowania. Pobierz i rozpakuj pliki wymienione w tekście do nowego folderu na pulpicie. Pozostaw dane uzyskane z eksperymentu z chipem genetycznym do dzikiego typu C, L i mutanta C. Teraz skopiuj dane chipa genu dla dzikiego typu C i mutanta C do folderu.

Następnie otwórz R na komputerze. Kliknij pozycję plik, a następnie kliknij pozycję Zmień katalog. Wybierz folder zawierający pliki, kliknij obszar roboczy ładowania plików, a następnie wybierz dane A one V five R otwórz C do R za pomocą notatnika i skopiuj cały tekst do R dla komputera Mac, kliknij mis, a następnie kliknij zmień katalog roboczy.

Wybierz folder zawierający pliki. Kliknij obszar roboczy, załaduj plik obszaru roboczego i wybierz pozycję ATH jeden V pięć danych R. Podobnie otwórz zarówno SFP R, jak i MAP R za pomocą tekstu, edytuj i skopiuj tekst do R w oknie konsoli.

Pojawi się komunikat z prośbą o wyszukanie genów w zasobach informacyjnych Arabidopsis lub TAIR. Skopiuj i wklej link znajdujący się w tekście do przeglądarki internetowej. Pojawi się okno z prośbą o otwarcie lub zapisanie pliku.

Wybierz pozycję Zapisz. Wybierz nazwę pliku i dołącz rozszerzenie. Wykonaj x ls.

Następnie kliknij Zapisz. Pokazany tutaj jest typowy oczekiwany wynik. Po przeanalizowaniu danych uzyskanych z układu genomu jednego genomu rzodkiewnika pospolitego H z chipem genowym, rysunek ten stanowi przykład mapowania mutacji Columbia zero przy użyciu chipa genowego Arabidopsis, hybrydyzacji genomu H one, gdzie poziome paski reprezentują progi wykrywania.

Mutacja w tym przykładzie znajduje się na chromosomie pierwszym, ograniczonym pionowymi paskami. Otwórz plik kropka XLS, aby znaleźć współrzędne mutanta w zmapowanym obszarze. W zmontowanych odczytach zmutowanego genomu Illumina zidentyfikuj specyficzne przejścia EMS wśród polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.

Po opanowaniu podejścia opisującego ten protokół można użyć do mapowania genu w trzech krótkich ramach czasowych w porównaniu z klasyczną metodą mapowania.