Name: Badania przesiewowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie nowej generacji: przydatne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność organelli roślinnych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowania nowej generacji. To podejście umożliwia precyzyjne mapowanie mutacji recesywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy wsparcie ze strony Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, Departamentu Energii USA (numer grantu DE-FG02- 91ER20021) oraz National Science Foundation (MCB 0948584) (F.B.). Dziękujemy pani Karen Bird za redakcję tekstu.

1. Obróbka EMS
Arabidopsis thaliana nasiona poddaje się mutagenezie z użyciem etanosulfonianu etylu (EMS) jako czynnika mutagennego3,4, który indukuje w genomie zamiany C na T, prowadząc do mutacji C/G na T/A5-7.
<ol>
	<li>Odważ 0,8 g nasion Arabidopsis (~40 000 nasion) zawierających fluorescencyjny marker organelli (konkretnie w niniejszym badaniu jako marker ER zastosowano ssGFPHDEL (sekwencja sygnałowa-GFP-tetrapeptyd HDEL)).</li>
	<li>Przenieś nasiona do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml, a następnie dodaj 25 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Dodaj 0,2% (v/v) metanosulfonianu etylu.</li>
	<li>Inkubuj przez 16 godzin na mieszalniku nutacyjnym przy niskich obrotach.</li>
	<li>Odsącz ciecz i wlej ją do kolby zawierającej 1,0 M NaOH w celu dezaktywacji EMS.</li>
	<li>Do probówki Falcon z nasionami dodaj 25 ml wody, zamknij i odwróć 5 razy, aby wypłukać nasiona; poczekaj, aż wszystkie nasiona opadną na dno, a następnie odsącz wodę i wlej ją do kolby z 1,0 M NaOH.</li>
	<li>Powtórz etap płukania do 10 razy.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś nasiona w minimalnej ilości wody.</li>
	<li>Przejdź do sterylizacji nasion, dodając 25 mL 10% wybielacza i energicznie wstrząsając przez 30 s. Pozostaw nasiona do opadnięcia na dno, a następnie zlej wybielacz i przepłucz 25 mL sterylnej wody. Zlej sterylną wodę i dodaj 25 mL 70% etanolu. Wstrząsaj probówkami przez 30 s. Pozostaw nasiona do opadnięcia na dno. Zlej etanol i przepłucz 25 mL sterylnej wody. Powtórz dwukrotnie płukanie sterylną wodą, a następnie wysyp nasiona na plastikową szalkę Petri zawierającą papier filtracyjny 3 MM i pozostaw do wyschnięcia pod dygestorium. Przechowuj w temperaturze 4 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Wysiej nasiona na podłoże ½ MS phytagel (połowa stężenia pożywki Murashige and Skoog) w szalce Petri o średnicy 150 mm (~250-300 nasion na szalkę).</li>
	<li>Hoduj nasiona M1 na szalce przez 2 tygodnie, a następnie przesadź do gleby.</li>
	<li>Zbierz nasiona M2 z poszczególnych roślin M1 w celu wygenerowania linii M2 (1000 niezależnych linii).</li>
</ol>
2. Przesiew konfokalny populacji M2 i M3
W tej sekcji opisujemy obserwację siewek za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego, zgodnie z wcześniejszym opisem8.
<ol>
	<li>Sześćdziesiąt nasion z każdej linii M2 hoduje się przez 7 do 10 dni na plastikowych szalkach Petri z pożywką ½ MS phytagel; na tej samej płytce hoduje się również 5 siewek niepoddanych działaniu EMS (kontrola).</li>
	<li>Od pięciu do dziesięciu liści zakotwiczych montuje się stroną abaksjalną do obiektywu (40X) na szkiełku przedmiotowym i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Każdy liść zakotwiczy obserwuje się w fluorescencji, od regionu kory do regionu środkowego, pod kątem jakichkolwiek zmian w subkomórkowej dystrybucji markera organelli.</li>
	<li>Rośliny pozytywne przesadza się do gleby, a ich nasiona zbiera i ponownie poddaje przesiewowi w celu potwierdzenia fenotypu mutantów w generacji M3.</li>
	<li>Usuwa się mutacje tła poprzez krzyżowanie wsteczne co najmniej trzy razy z genomem typu dzikiego, który może zawierać pożądany fluorescencyjny marker organelli.
	<ol>
		<li>Z rośliny matecznej, używając precyzyjnych nożyczek lub pęsety, usuwa się dojrzałe strąki oraz otwarte kwiaty.</li>
		<li>Z merystemu usuwa się zbyt małe pąki.</li>
		<li>Koniec pęsety wsuwa się między płatki a działki, aby otworzyć pąk kwiatowy i usunąć wszystkie pręciki.</li>
		<li>Za pomocą pęsety pobiera się otwarty, dojrzały kwiat z rośliny ojcowskiej i pociera się pręcikami o znamię rośliny poddanej emasculacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mapowanie
W tej sekcji opisano zasadniczy sposób mapowania mutacji recesywnej z wykorzystaniem zmodyfikowanego protokołu Borevitza9, który jest szybszy w porównaniu do tradycyjnych metod mapowania10,11. Podejście to wykorzystuje macierze oligonukleotydowe o wysokiej gęstości, które umożliwiają wykrycie licznych polimorfizmów pojedynczych cech (SFPs) w jednym badaniu12. Dzięki zastosowaniu macierzy Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip możliwe jest przeanalizowanie około 24 000 genów. Pulę osobników F2 wykazujących mutację porównuje się z pulą roślin F2 typu dzikiego, pobranych z tej samej populacji segregującej. Następnie mutacja zostanie zmapowana w regionie, w którym pula mutantów jest wzbogacona o allele genotypu mutanta, a w konsekwencji w tym samym regionie pula typu dzikiego okaże się wzbogacona o allele rodzica typu dzikiego13.
<ol>
	<li>DNA genomowy (3 μg) ekstrahuje się z homozygotycznej mutanty Columbia (M3) przy użyciu zestawu Qiagen DNeasy Plant Mini Kit, a następnie przekazuje do sekwencjonowania na Illumina Genome Analyzer II (GA II)14.</li>
	<li>Homozygotyczną mutantę Columbia (M3) krzyżuje się z Landsberg erecta w celu wygenerowania populacji mapującej.</li>
	<li>Mapowanie przeprowadza się na 70 do 100 osobnikach F2 wykazujących aberracyjny fenotyp oraz na takiej samej liczbie roślin F2 o fenotypie typu dzikiego.</li>
	<li>Z każdej rośliny pobiera się wycinek liścia (0,60 mm) za pomocą wycinaka do papieru. Wycinki należy pobierać z liści w tym samym wieku, aby zapewnić podobną ilość DNA. Próbki można przetwarzać w celu ekstrakcji genomowej oddzielnie lub w grupach. W tym drugim przypadku można zebrać od 5 do 10 próbek do jednej probówki Eppendorf, tak aby ostatecznie otrzymać mniej probówek, z których należy wyekstrahować DNA genomowy.</li>
	<li>Do ekstrakcji DNA genomowego stosuje się zestaw MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit (Epicentre). Ilość DNA genomowego uzyskanego z każdej próbki określa się za pomocą nanodropu.</li>
	<li>Następnie łączy się taką samą ilość DNA genomowego z każdej próbki, aż do uzyskania całkowitej ilości 300 ng (~30 μL) DNA roślinnego; dodaje się 60 μL roztworu random primers 2,5X [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-merkaptoetanol, 750 μg/ml oligodeoksynukleotydowych starterów losowych (random octamers)] (zestaw Bioprime) oraz 42 μL wody (objętość końcowa 132 μL).</li>
	<li>Denaturuje się DNA w temperaturze &gt;95 °C przez 5 do 10 min.</li>
	<li>Schładza się na lodzie.</li>
	<li>Do każdego zdenaturowanego DNA dodaje się 15 μL mieszaniny dNTPs 10X z Biotin dCTP [1 mM biotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP w 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (zestaw Bioprime) i uzupełnia 3 μL polimerazy Klenow (zestaw Bioprime).</li>
	<li>Inkubuje się przez noc w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Następnego dnia dodaje się 15 μL 3 M NaOAc i 400 μL zimnego 100% EtOH; miesza się.</li>
	<li>Inkubuje się w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, następnie wiruje przy 20 500x g przez 15 min, usuwa nadosad i przemywa 500 μL zimnym 75% EtOH.</li>
	<li>Wiruje przy 20 500x g przez 10 min.</li>
	<li>Osady DNA suszy się w temperaturze 37 °C przez 10 min i resuspendsuje w 100 μL wody.</li>
	<li>Używa się 5 μL do sprawdzenia wydajności i jakości na żelu (Rycina 2).</li>
	<li>95 μL reakcji znakowania dla typu dzikiego i mutanty przekazuje się do hybrydyzacji na matrycy genomowej GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array.</li>
	<li>Matryce są skanowane, a otrzymane pliki .CEL analizuje się przy użyciu oprogramowania R (<a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a>).</li>
	<li>Instaluje się oprogramowanie R, następnie otwiera program i wkleja następujący ciąg znaków: 
	source("<a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a>") 
	biocLite() 
	Następnie naciska się klawisz Enter – zainstaluje to standardowe pakiety Bioconductor (<a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a>).</li>
	<li>W nowym folderze na pulpicie pobiera się z następującej strony internetowej (<a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a>) pliki: 
	 readcel.R 
	 SFP.R 
	 Map.R 
	 ath1V5.RData 
	 ColLerCEL.zip 
	Plik ColLerCEL.zip należy rozpakować, a otrzymane pliki wkleić do nowego folderu.</li>
	<li>Dane otrzymane z eksperymentu GeneChip zmienia się na wildtype.CEL oraz mutant.CEL.</li>
	<li>Kopiuje się teraz dane GeneChip (wildtype.CEL i mutant.CEL) do folderu.</li>
	<li>Otwiera się program R: a) dla systemu Mac: klika się „Misc”, a następnie „Change working directory”; b) dla systemu PC: klika się „File”, a następnie „Change directory”.</li>
	<li>a) dla systemu Mac: wybiera się folder zawierający pliki. Klika się „Workspace”, „Load workspace file” i wybiera ath1V5.RData; b) dla systemu PC: wybiera się folder zawierający powyższe pliki, klika się „File”, następnie „Load workspace” i wybiera ath1V5.RData.</li>
	<li>Otwiera się plik readCEL.R w Notatniku i kopiuje cały tekst do programu R.</li>
	<li>Otwiera się plik SFP.R w Notatniku i kopiuje cały tekst do programu R.</li>
	<li>Otwiera się plik Map.R w Notatniku i kopiuje cały tekst do programu R.</li>
	<li>W oknie konsoli pojawi się następujący komunikat: 
	Chromosome x limits Mb y z 
	Search genes at TAIR paste in this link 
	3<a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z</a></li>
	<li>Kopiuje się i wkleja link do przeglądarki internetowej. Pojawi się okno z prośbą o otwarcie lub zapisanie pliku; należy wybrać zapisz. Wybiera się nazwę pliku i dodaje rozszerzenie „.xls”, a następnie klika Zapisz.</li>
	<li>Otwiera się plik „.xls”, w którym można znaleźć współrzędne dla mutanty (wynik przedstawiono graficznie na Rycini 3).</li>
	<li>W zmapowanym obszarze zmontowanych odczytów Illumina genomu mutanty identyfikuje się specyficzne przejścia EMS 4 wśród polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Fenotyp mutanty uzupełnia się poprzez transformację genami typu dzikiego przy użyciu standardowych procedur15.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia podejście wykorzystane do identyfikacji mutanta szlaku wydzielniczego za pomocą przesiewania mikroskopią konfokalną. Rysunek 2 przedstawia typowe przygotowanie znakowanego DNA genomowego do hybrydyzacji macierzowej. Na rysunku 3 zaprezentowano typowy wynik oczekiwany po analizie danych uzyskanych z macierzy genomowej GeneChip Arabidopsis ATH1.
<img alt="Proces mutagenezy Arabidopsis; traktowanie EMS, rośliny M1-M3; mikroskopia konfokalna; sekwencjonowanie genetyczne." src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Transgeniczne rośliny Arabidopsis wykazujące ekspresję ssGFPHDEL (marker ER) (1) były hodowane w celu uzyskania wystarczającej liczby nasion do traktowania EMS (2). Nasiona potraktowane EMS wysiano, aby wygenerować rośliny M1 (3). Każda roślina M1 reprezentuje inną linię, a nasiona zbierano oddzielnie z każdej z nich. Nasiona M2 wysiano na podłoże ½ MS (4), a następnie przesiewano pod kątem wad morfologii ER za pomocą mikroskopii konfokalnej (5). Podczas przesiewania zidentyfikowano rośliny zachowujące morfologię ER typu dzikiego (6) oraz rośliny wykazujące defektywne fenotypy ER (7). Rośliny te doprowadzono do pokolenia M3 w celu potwierdzenia fenotypu (8). DNA genomiczne z rośliny M3 wykorzystano do sekwencjonowania Solexa Illumina (a). Tę samą roślinę wykorzystano również do krzyżówek z Ler-wt w celu uzyskania populacji mapowania F2 (b).
<img alt="Wyniki elektroforezy żelu DNA, porównanie próbek typu dzikiego i mutantów, analiza białek." src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reakcje znakowania losowego Bioprime (5 μL z 100 μL) naniesiono na żel agarozowy 1%. Ścieżka a pochodzi z puli roślin F2 typu dzikiego, a ścieżka b z puli roślin F2 mutantów. (Marker to drabinka DNA 1 Kb-N3232, z NEB).
<img alt="Wykresy różnic częstości alleli w chromosomach 1-5; analiza zmienności genetycznej, forma wykresu." src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rycina przedstawia przykład mapowania mutacji Col-0 z wykorzystaniem hybrydyzacji macierzy genomowej GeneChip Arabidopsis ATH1. Mutacja w tym przykładzie znajduje się w chromosomie 1, ograniczona pionowymi liniami. Poziome linie reprezentują progi detekcji.

<ol><li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li>
<li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3%2C+a+non-essential+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li>
<li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li>
<li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li>
<li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li>
<li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li>
<li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Golgi+apparatus%3A+from+imaging+to+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li>
<li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li>
<li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li>
<li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li>
<li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li>
<li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).</li>
<li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy opisaliśmy metodę przesiewową opartą na mikroskopii konfokalnej w celu identyfikacji mutantów endomembranowych. Podejście to można łatwo rozszerzyć na inne organella komórkowe, dla których dostępne są specyficzne markery białkowe fluorescencyjne. Przesiew opiera się na identyfikacji mutantów wykazujących aberracyjny rozkład markera fluorescencyjnego, albo w organellum docelowym, albo w organellach, które nie powinny zawierać tego markera. Odpowiednio, mutanty te reprezentują populacje, w których zaburz...

<table><tbody><tr><td>Etylomethanosulfonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Baker</td><td>3722-05</td><td></td></tr><tr><td>podstawkowa pożywka Murashige i Skooga z witaminami Gamborga</td><td>Laboratoria fitotechnologiczne</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do zaawansowanego oczyszczania czystego DNA z liści roślin</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MPP92100</td><td></td></tr><tr><td>System znakowania DNA Bioprime</td><td>Invitrogen</td><td>18094-011</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macierz genomowa Arabidopsis ATH1 (gene chip)</td><td>Affymetrix</td><td>900385</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>probiówki Eppendorf 1,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny 90 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>n.d.</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło oscylacyjne (falowe)</td><td>Heidolph</td><td>n.d.</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>n.d.</td><td></td></tr></tbody></table>

przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Niniejszy protokół opisuje przesiewanie siewek Arabidopsis przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego oraz sposób mapowania mutacji recesywnych, które zmieniają subkomórkową dystrybucję specyficznego fluorescencyjnego markera z tagiem w szlaku wydzielniczym. Arabidopsis jest potężnym modelem biologicznym w badaniach genetycznych ze względu na rozmiar genomu, czas generacji oraz konserwację mechanizmów molekularnych pomiędzy królestwami. Genotypowanie macierzowe jako podejście do mapowania mutacji, stanowiące alternatywę dla tradycyjnej metody opartej na markerach molekularnych, jest korzystne, ponieważ jest stosunkowo szybsze i pozwala na mapowanie kilku mutantów w bardzo krótkim czasie. Metoda ta umożliwia identyfikację białek, które mogą wpływać na integralność dowolnego organellum w roślinach. W tym przypadku, jako przykład, proponujemy przesiew w celu zmapowania genów istotnych dla integralności retikulum endoplazmatycznego (ER). Nasze podejście można jednak łatwo rozszerzyć na inne organella komórek roślinnych (patrz np.1,2), co stanowi zatem istotny krok w stronę zrozumienia podstaw molekularnych sterujących innymi strukturami subkomórkowymi.

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Niniejszy protokół opisuje przesiewanie siewek Arabidopsis z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego oraz sposób mapowania mutacji recesywnych, które zmieniają...

Celem niniejszego eksperymentu jest identyfikacja genu lub genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych. Jest to realizowane poprzez wstępne dodanie metanosulfonianu etylu jako czynnika chemicznego w celu zmutagenizowania nasion Arabidopsis thaliana posiadających fluorescencyjny marker organelli. W drugim kroku nasiona z poszczególnych roślin pierwszej generacji zmutagowanej są zbierane w celu wyhodowania linii kolejnej generacji mutantów M2.Następnie nasiona mutagenu a Eliana obserwuje się przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania aberracyjnego fenotypu organalnego. Ostatnim krokiem jest wygenerowanie trzeciego pokolenia mutagentów i potwierdzenie obecności fenotypu mutantów. Ostatecznie mutację recesywną można zmapować przy użyciu narzędzi sekwencjonowania następnej generacji.Po zidentyfikowaniu lokalizacji zmutowanego genu, transformacja genem typu dzikiego powinna przywrócić prawidłowy fenotyp organelli. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące utrzymania integralności morfologicznej i funkcjonalnej organelli roślinnych. W przypadku metanów, traktowanie nasion atop sta sulfonianem indukuje zmiany w metylacji cytozyny w genomie, co prowadzi do konwersji guaniny w cytozynę.Wprowadzanie mutacji. Traktowanie EMS jest kluczowym krokiem w tym protokole, aby zapewnić optymalny stosunek mutacji u dwóch osobników M. W celu rozpoczęcia należy pozyskać nasiona Arabidopsis typu dzikiego ekotypu Columbia, które zostały wcześniej zmodyfikowane w celu wprowadzenia odpowiedniego fluorescencyjnego markera organelli.Przenieś 0,8 grama lub około 40 000 nasion do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Następnie dodaj 25 ml wody destylowanej oraz 0,2% etanosulfonianu etylu. Inkubuj mieszaninę przez 16 godzin w mieszalniku do mutagenezy przy niskich obrotach. Po inkubacji odessij ciecz i wlej ją do kolby zawierającej 1 M wodorotlenku sodu.Aby dezaktywować EMS, do probówki Falcon zawierającej nasiona należy dodać 25 mililitrów wody. Zamknąć probówkę i odwrócić ją pięciokrotnie, aby wypłukać nasiona. Po opadnięciu wszystkich nasion odessać wodę i przelać ją do kolby z jednym molarnym wodorotlenkiem sodu.Powtórz ten etap płukania do 10 razy. Po ostatnim płukaniu odcedź nasiona, pozostawiając minimalną ilość wody. Przystąp do sterylizacji nasion, dodając 25 milliliters 10%bleach i wstrząsając energicznie przez 30 sekund. Gdy nasiona opadną na dno, odlej bleach i wypłucz 25 milliliters sterylnej wody.Po usunięciu sterylnej wody należy dodać 25 mililitrów 70% etanolu. Wstrząsać probówkami przez 30 sekund i pozwolić nasionom opaść na dno. Odlać etanol i wypłukać nasiona 25 mililitrami sterylnej wody.Powtórz płukanie sterylną wodą dwukrotnie. Następnie wysyp nasiona na plastikową szalkę Petriego zawierającą papier filtracyjny o grubości trzech mm. Pozostaw nasiona do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza po inkubacji nasion przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsius.Umieść nasiona w szalce Petriego o średnicy 150 mm, w ilości około 250 do 300 nasion na szalkę, na połowie pożywki MS i scoog z dodatkiem fitogelu jako czynnika żelującego. Hoduj nasiona z generacji M1 na szalkach przez dwa tygodnie. Przesadź siewki do gleby i pozwól roślinom na dalszy wzrost.Po 30 do 45 dniach rośliny osiągną etap dojrzałości, w którym dojrzałe strąki będą wyraźnie widoczne. W tym momencie należy zebrać dwa nasiona M2 z poszczególnych roślin M1, aby wygenerować 1000 niezależnych linii M2. W celu obserwacji siewek pod mikroskopem konfokalnym lub fluorescencyjnym, należy hodować 60 nasion z każdej linii M2 przez siedem do 10 dni na plastikowych płytkach Petri w połówce.Na podłożu Moreish i scoog zawierającym fighter gel wyhoduj również pięć siewek kontrolnych niepoddanych działaniu EMS na tej samej płytce. Po wyrośnięciu siewek, zamocuj od pięciu do 10 cos lead-ins stroną ABAC seal w stronę obiektywu 40x na szkiełku przedmiotowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym; pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuj każdą oleinę od regionu korowego do przyśrodkowego pod kątem zmienionej rozmieszczenia subkomórkowego markera organelli. Po przesadzeniu roślin pozytywnych do gleby i wyhodowaniu siewek zgodnie z powyższym opisem, potwierdź występowanie fenotypu mutanta w pokoleniu M3.Usuń zanieczyszczające mutacje tła poprzez krzyżowanie zwrotne co najmniej trzy razy z genomem typu dzikiego zawierającym pożądany organellowy marker fluorescencyjny, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć mapowanie, użyj zestawu cogen DN Easy Z plant mini kit do wyekstrahowania około trzech mikrogramów DNA genomowego z M3, który reprezentuje homozygotyczny mutant DNA Columbia. Przekaż to DNA do sekwencjonowania w analizatorze genomu Illumina dwa 14.Kolejnym krokiem jest skrzyżowanie mutanta zago Colombia z Las Berger w celu uzyskania potomstwa F1 w wyniku samozapylenia, w którym może dojść do rekombinacji. Powstałe pokolenie F2 posłuży ostatecznie jako populacja mapująca zawierająca gen zainteresowania, który powoduje mutację. Poprzez porównanie genomowego DNA tej populacji z genomowym DNA roślin typu dzikiego, można zidentyfikować lokalizację mutacji w genomie.Po wyrośnięciu roślin z pokolenia F2, należy zebrać od 70 do 100 osobników F2 wykazujących fenotyp aberracyjny oraz taką samą liczbę roślin F2 o fenotypie typu dzikiego, pobierając z każdej rośliny krążek liścia za pomocą wycinaka do papieru. Krążki liści powinny być pobierane z liści w tym samym wieku. Aby zapewnić podobną ilość DNA, próbki można poddać ekstrakcji genomicznej pojedynczo lub w grupach.W tym przypadku możliwe jest zebranie od pięciu do 10 próbek do każdej probówki typu eend orph, aby zmniejszyć liczbę probówek, z których należy wyekstrahować DNA genomiczne. Do ekstrakcji DNA genomicznego należy użyć zestawu Master Pure Plant Leaf DNA Purification Kit. Ilość DNA genomicznego otrzymanego z każdej próbki można następnie oznaczyć za pomocą spektrofotometru NanoDrop.Następnie należy połączyć równą ilość DNA z każdej próbki, aż do uzyskania łącznie 300 nanogramów, zachowując rozdzielność próbek mutantów i typu dzikiego. Aby przygotować reakcję znakowania, należy najpierw dodać 60 mikrolitrów 2,5 x roztworu random primer i 42 mikrolitry wody. Po denaturacji DNA w temperaturze powyżej 95 stopni Celsjusza przez 5 do 10 minut, próbki należy schłodzić na lodzie, aby zdenaturować DNA. Należy dodać 15 mikrolitrów 10 X dNTPs.Wymieszać z biotynowanym DCTP i uzupełnić do objętości trzech mikrolitrów polimerazą Glen. Inkubować próbki przez noc w temperaturze 25 °C.Następnego dnia dodać 15 µL trzymolowego octanu sodu oraz 400 µL zimnego 100% etanolu. Próbki po zmieszaniu inkubować w temperaturze -80 °C przez jedną godzinę, a następnie odwirować przy 20 500 ×g przez 15 minut. Osad przemyć 500 µL zimnego, 75% etanolu, po czym przeprowadzić drugie wirowanie.Osusz granulki DNA w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Resuspenduj granulki w 100 µL wody i użyj 5 µL do sprawdzenia wydajności oraz jakości na żelu. Reakcje znakowania losowego (random labeling) naniesiono na żel agarozowy 1% z puli roślin F2 typu dzikiego oraz z puli roślin F2 mutantów.W ostatnim kroku nanieś 95 µL reakcji znakowania typu dzikiego i mutanta na macierz hybrydyzacyjną genomu arabidopsis ath dla chipów genowych. Po zeskanowaniu przez skaner, uzyskane pliki dot CL są analizowane przy użyciu naszego oprogramowania. Po zainstalowaniu oprogramowania otwórz program i wklej ciąg znaków bioconductor znajdujący się w pisemnej procedurze.Następnie naciśnij klawisz enter, co zainstaluje standardowe pakiety BIOCONDUCTOR ze strony internetowej dotyczącej mikromacierzy, genotypowania i mapowania. Pobierz i rozpakuj wymienione w tekście pliki do nowego folderu na pulpicie. Przechowuj dane uzyskane z eksperymentu z mikromacierzą dla typu dzikiego C, L oraz mutanta C. Teraz skopiuj dane z mikromacierzy dla typu dzikiego C i mutanta C do folderu.Następnie uruchom program R na komputerze PC. Kliknij „file”, a następnie wybierz „change directory”. Zaznacz folder zawierający pliki, kliknij „file load workspace”, a następnie wybierz „A one V five R data open read C do R”. Korzystając z Notatnika, skopiuj cały tekst do R. W przypadku komputera Mac kliknij „mis”, a następnie „change working directory”.Wybierz folder zawierający pliki. Kliknij workspace load workspace file i wybierz ATH one V five R data. W podobny sposób otwórz oba pliki SFP R oraz MAP R za pomocą edytora tekstu, a następnie skopiuj tekst do konsoli R.Pojawi się komunikat z prośbą o wyszukanie genów w bazie danych Arabidopsis Information Resource lub TAIR. Skopiuj i wklej link znajdujący się w tekście do przeglądarki internetowej. Wyświetli się okno z zapytaniem o otwarcie lub zapisanie pliku.Wybierz opcję zapisz. Nadaj nazwę plikowi i dodaj rozszerzenie. Wykonaj polecenie x ls.Następnie kliknij zapisz. Przedstawiono tutaj typowy oczekiwany wynik. Po analizie danych uzyskanych z matrycy genomowej Arabidopsis H1, rycina ta stanowi przykład mapowania mutacji Columbia zero z wykorzystaniem chipa genowego Arabidopsis oraz hybrydyzacji genomu H1, gdzie poziome linie reprezentują progi detekcji.Mutacja w tym przykładzie znajduje się na chromosomie pierwszym, ograniczonym pionowymi kreskami. Otwórz plik dot XLS, aby znaleźć współrzędną mutanta w obrębie zmapowanego obszaru. W zmontowanych odczytach Illumina genomu mutanta zidentyfikuj specyficzne przejścia EMS spośród polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.Po opanowaniu tej metody, opisane w niniejszym protokole podejście może zostać wykorzystane do mapowania genów w znacznie krótszym czasie w porównaniu z klasyczną metodą mapowania.

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescencyjna mikroskopia przesiewowa i sekwencjonowanie nowej generacji: Przydatne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Poznaj metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność organelli roślinnych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowania nowej generacji. To podejście umożliwia precyzyjne mapowanie mutacji recesywnych.

Badania przesiewowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie nowej generacji: przydatne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli (Wideo) | JoVE Journal

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Przeglądaj więcej filmów