Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Celem niniejszego eksperymentu jest identyfikacja genu lub genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych. Jest to realizowane poprzez wstępne dodanie metanosulfonianu etylu jako czynnika chemicznego w celu zmutagenizowania nasion Arabidopsis thaliana posiadających fluorescencyjny marker organelli. W drugim kroku nasiona z poszczególnych roślin pierwszej generacji zmutagowanej są zbierane w celu wyhodowania linii kolejnej generacji mutantów M2.

Następnie nasiona mutagenu a Eliana obserwuje się przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania aberracyjnego fenotypu organalnego. Ostatnim krokiem jest wygenerowanie trzeciego pokolenia mutagentów i potwierdzenie obecności fenotypu mutantów. Ostatecznie mutację recesywną można zmapować przy użyciu narzędzi sekwencjonowania następnej generacji.

Po zidentyfikowaniu lokalizacji zmutowanego genu, transformacja genem typu dzikiego powinna przywrócić prawidłowy fenotyp organelli. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące utrzymania integralności morfologicznej i funkcjonalnej organelli roślinnych. W przypadku metanów, traktowanie nasion atop sta sulfonianem indukuje zmiany w metylacji cytozyny w genomie, co prowadzi do konwersji guaniny w cytozynę.

Wprowadzanie mutacji. Traktowanie EMS jest kluczowym krokiem w tym protokole, aby zapewnić optymalny stosunek mutacji u dwóch osobników M. W celu rozpoczęcia należy pozyskać nasiona Arabidopsis typu dzikiego ekotypu Columbia, które zostały wcześniej zmodyfikowane w celu wprowadzenia odpowiedniego fluorescencyjnego markera organelli.

Przenieś 0,8 grama lub około 40 000 nasion do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Następnie dodaj 25 ml wody destylowanej oraz 0,2% etanosulfonianu etylu. Inkubuj mieszaninę przez 16 godzin w mieszalniku do mutagenezy przy niskich obrotach. Po inkubacji odessij ciecz i wlej ją do kolby zawierającej 1 M wodorotlenku sodu.

Aby dezaktywować EMS, do probówki Falcon zawierającej nasiona należy dodać 25 mililitrów wody. Zamknąć probówkę i odwrócić ją pięciokrotnie, aby wypłukać nasiona. Po opadnięciu wszystkich nasion odessać wodę i przelać ją do kolby z jednym molarnym wodorotlenkiem sodu.

Powtórz ten etap płukania do 10 razy. Po ostatnim płukaniu odcedź nasiona, pozostawiając minimalną ilość wody. Przystąp do sterylizacji nasion, dodając 25 milliliters 10%bleach i wstrząsając energicznie przez 30 sekund. Gdy nasiona opadną na dno, odlej bleach i wypłucz 25 milliliters sterylnej wody.

Po usunięciu sterylnej wody należy dodać 25 mililitrów 70% etanolu. Wstrząsać probówkami przez 30 sekund i pozwolić nasionom opaść na dno. Odlać etanol i wypłukać nasiona 25 mililitrami sterylnej wody.

Powtórz płukanie sterylną wodą dwukrotnie. Następnie wysyp nasiona na plastikową szalkę Petriego zawierającą papier filtracyjny o grubości trzech mm. Pozostaw nasiona do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza po inkubacji nasion przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsius.

Umieść nasiona w szalce Petriego o średnicy 150 mm, w ilości około 250 do 300 nasion na szalkę, na połowie pożywki MS i scoog z dodatkiem fitogelu jako czynnika żelującego. Hoduj nasiona z generacji M1 na szalkach przez dwa tygodnie. Przesadź siewki do gleby i pozwól roślinom na dalszy wzrost.

Po 30 do 45 dniach rośliny osiągną etap dojrzałości, w którym dojrzałe strąki będą wyraźnie widoczne. W tym momencie należy zebrać dwa nasiona M2 z poszczególnych roślin M1, aby wygenerować 1000 niezależnych linii M2. W celu obserwacji siewek pod mikroskopem konfokalnym lub fluorescencyjnym, należy hodować 60 nasion z każdej linii M2 przez siedem do 10 dni na plastikowych płytkach Petri w połówce.

Na podłożu Moreish i scoog zawierającym fighter gel wyhoduj również pięć siewek kontrolnych niepoddanych działaniu EMS na tej samej płytce. Po wyrośnięciu siewek, zamocuj od pięciu do 10 cos lead-ins stroną ABAC seal w stronę obiektywu 40x na szkiełku przedmiotowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym; pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuj każdą oleinę od regionu korowego do przyśrodkowego pod kątem zmienionej rozmieszczenia subkomórkowego markera organelli. Po przesadzeniu roślin pozytywnych do gleby i wyhodowaniu siewek zgodnie z powyższym opisem, potwierdź występowanie fenotypu mutanta w pokoleniu M3.

Usuń zanieczyszczające mutacje tła poprzez krzyżowanie zwrotne co najmniej trzy razy z genomem typu dzikiego zawierającym pożądany organellowy marker fluorescencyjny, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć mapowanie, użyj zestawu cogen DN Easy Z plant mini kit do wyekstrahowania około trzech mikrogramów DNA genomowego z M3, który reprezentuje homozygotyczny mutant DNA Columbia. Przekaż to DNA do sekwencjonowania w analizatorze genomu Illumina dwa 14.

Kolejnym krokiem jest skrzyżowanie mutanta zago Colombia z Las Berger w celu uzyskania potomstwa F1 w wyniku samozapylenia, w którym może dojść do rekombinacji. Powstałe pokolenie F2 posłuży ostatecznie jako populacja mapująca zawierająca gen zainteresowania, który powoduje mutację. Poprzez porównanie genomowego DNA tej populacji z genomowym DNA roślin typu dzikiego, można zidentyfikować lokalizację mutacji w genomie.

Po wyrośnięciu roślin z pokolenia F2, należy zebrać od 70 do 100 osobników F2 wykazujących fenotyp aberracyjny oraz taką samą liczbę roślin F2 o fenotypie typu dzikiego, pobierając z każdej rośliny krążek liścia za pomocą wycinaka do papieru. Krążki liści powinny być pobierane z liści w tym samym wieku. Aby zapewnić podobną ilość DNA, próbki można poddać ekstrakcji genomicznej pojedynczo lub w grupach.

W tym przypadku możliwe jest zebranie od pięciu do 10 próbek do każdej probówki typu eend orph, aby zmniejszyć liczbę probówek, z których należy wyekstrahować DNA genomiczne. Do ekstrakcji DNA genomicznego należy użyć zestawu Master Pure Plant Leaf DNA Purification Kit. Ilość DNA genomicznego otrzymanego z każdej próbki można następnie oznaczyć za pomocą spektrofotometru NanoDrop.

Następnie należy połączyć równą ilość DNA z każdej próbki, aż do uzyskania łącznie 300 nanogramów, zachowując rozdzielność próbek mutantów i typu dzikiego. Aby przygotować reakcję znakowania, należy najpierw dodać 60 mikrolitrów 2,5 x roztworu random primer i 42 mikrolitry wody. Po denaturacji DNA w temperaturze powyżej 95 stopni Celsjusza przez 5 do 10 minut, próbki należy schłodzić na lodzie, aby zdenaturować DNA. Należy dodać 15 mikrolitrów 10 X dNTPs.

Wymieszać z biotynowanym DCTP i uzupełnić do objętości trzech mikrolitrów polimerazą Glen. Inkubować próbki przez noc w temperaturze 25 °C.

Następnego dnia dodać 15 µL trzymolowego octanu sodu oraz 400 µL zimnego 100% etanolu. Próbki po zmieszaniu inkubować w temperaturze -80 °C przez jedną godzinę, a następnie odwirować przy 20 500 ×g przez 15 minut. Osad przemyć 500 µL zimnego, 75% etanolu, po czym przeprowadzić drugie wirowanie.

Osusz granulki DNA w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Resuspenduj granulki w 100 µL wody i użyj 5 µL do sprawdzenia wydajności oraz jakości na żelu. Reakcje znakowania losowego (random labeling) naniesiono na żel agarozowy 1% z puli roślin F2 typu dzikiego oraz z puli roślin F2 mutantów.

W ostatnim kroku nanieś 95 µL reakcji znakowania typu dzikiego i mutanta na macierz hybrydyzacyjną genomu arabidopsis ath dla chipów genowych. Po zeskanowaniu przez skaner, uzyskane pliki dot CL są analizowane przy użyciu naszego oprogramowania. Po zainstalowaniu oprogramowania otwórz program i wklej ciąg znaków bioconductor znajdujący się w pisemnej procedurze.

Następnie naciśnij klawisz enter, co zainstaluje standardowe pakiety BIOCONDUCTOR ze strony internetowej dotyczącej mikromacierzy, genotypowania i mapowania. Pobierz i rozpakuj wymienione w tekście pliki do nowego folderu na pulpicie. Przechowuj dane uzyskane z eksperymentu z mikromacierzą dla typu dzikiego C, L oraz mutanta C. Teraz skopiuj dane z mikromacierzy dla typu dzikiego C i mutanta C do folderu.

Następnie uruchom program R na komputerze PC. Kliknij „file”, a następnie wybierz „change directory”. Zaznacz folder zawierający pliki, kliknij „file load workspace”, a następnie wybierz „A one V five R data open read C do R”. Korzystając z Notatnika, skopiuj cały tekst do R. W przypadku komputera Mac kliknij „mis”, a następnie „change working directory”.

Wybierz folder zawierający pliki. Kliknij workspace load workspace file i wybierz ATH one V five R data. W podobny sposób otwórz oba pliki SFP R oraz MAP R za pomocą edytora tekstu, a następnie skopiuj tekst do konsoli R.

Pojawi się komunikat z prośbą o wyszukanie genów w bazie danych Arabidopsis Information Resource lub TAIR. Skopiuj i wklej link znajdujący się w tekście do przeglądarki internetowej. Wyświetli się okno z zapytaniem o otwarcie lub zapisanie pliku.

Wybierz opcję zapisz. Nadaj nazwę plikowi i dodaj rozszerzenie. Wykonaj polecenie x ls.

Następnie kliknij zapisz. Przedstawiono tutaj typowy oczekiwany wynik. Po analizie danych uzyskanych z matrycy genomowej Arabidopsis H1, rycina ta stanowi przykład mapowania mutacji Columbia zero z wykorzystaniem chipa genowego Arabidopsis oraz hybrydyzacji genomu H1, gdzie poziome linie reprezentują progi detekcji.

Mutacja w tym przykładzie znajduje się na chromosomie pierwszym, ograniczonym pionowymi kreskami. Otwórz plik dot XLS, aby znaleźć współrzędną mutanta w obrębie zmapowanego obszaru. W zmontowanych odczytach Illumina genomu mutanta zidentyfikuj specyficzne przejścia EMS spośród polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.

Po opanowaniu tej metody, opisane w niniejszym protokole podejście może zostać wykorzystane do mapowania genów w znacznie krótszym czasie w porównaniu z klasyczną metodą mapowania.