Name: Wzrost biofilmów Mycobacterium tuberculosis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę hodowli biofilmów Mycobacterium tuberculosis na granicy powietrze-pożywka i oceny częstości opornych form przetrwalnikowych. Technika ta pozwala badać mechanizmy tolerancji na leki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została zrealizowana przy wsparciu finansowym National Institute of Health oraz American Lung Association.

1. Hodowla biofilmu M. tuberculosis w butelce 250 mL z zakrętką
<ol>
 <li>Przygotowanie pożywki: Rozpuścić 0,5g KH2PO4, 0,5g MgSO4, 4g L-asparaginy, 2g kwasu cytrynowego, 0,05g cytrynianu amonu żelaza (III) oraz 60mL glicerolu w 900mL wody. Dostosować pH do wartości 7,0 za pomocą NaOH. Przeprowadzić autoklawowanie, schłodzić, a bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu dodać sterylny ZnSO4 do stężenia końcowego 0,1% w/v. Ponieważ mc27000 jest aukstrofem pantotenianowym, szczep ten wymaga również dodatku kwasu pantotenowego w stężeniu końcowym 10μg/mL.</li>
</ol>
Uwaga: Jest to standardowy skład pożywki Sautona stosowanej dla M. tuberculosis. Jeśli jednak jest to wymagane, do innych gatunków prątków można zastosować inne specjalistyczne pożywki.
<ol start="2">
 <li>Przygotowanie inokulum: Hodować M. tuberculosis w podłożu 7H9OADC z dodatkiem 0,05% Tween-80 przez tydzień, aż do uzyskania OD600 na poziomie 0,7–1,0. Kulturę można bezpośrednio wykorzystać jako inokulum w rozcieńczeniu 1:100.</li>
 <li>Odmierzyć 25 mL pożywki Sautona do 250 mL polistyrenowej butelki z zakrętką (Corning). Dodać 250 μl inokulum do pożywki, szczelnie zakręcić butelkę i umieścić ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C na 3 tygodnie, nietruchając. Butelkę należy obserwować codziennie, aby upewnić się, że nie doszło do kontaminacji.</li>
 <li>Pod koniec trzeciego tygodnia poluzować zakrętkę butelki, aby umożliwić dalszy wzrost M. tuberculosis na granicy faz. Jeśli zakrętka nie zostanie poluzowana na tym etapie, niewystarczająca koncentracja tlenu w naczyniu zahamuje dalszy wzrost bakterii.</li>
</ol>

2. Wzrost biofilmu M. tuberculosis w płytkach 12-dołkowych
<ol>
 <li>Przygotować pożywkę oraz inokulum mc27000 zgodnie z opisem w sekcjach A1 i A2.</li>
 <li>Wymieszać 60mL pożywki z 600μl inokulum. Rozdzielić po 4,5mL mieszaniny do każdego dołka płytki. Przykryć płytkę pokrywką. Owinąć płytkę kilkukrotnie parafilmem. Inkubować płytkę bez zakłócania w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C przez 5 tygodni.</li>
</ol>
3. Określanie częstości występowania lekoopornych komórek persystujących w biofilmach M. tuberculosis
<ol>
 <li>Hodować biofilmy M. tuberculosis w formacie 12-dołkowym zgodnie z opisem w sekcji B. Cały proces potrwa około 5 tygodni.</li>
 <li>Po dojrzeniu biofilmów (po 5 tygodniach inkubacji) wstrzyknąć wybrany antybiotyk w pożądanym stężeniu do medium pod biofilmami, używając mikrokońcówki do pipety.</li>
</ol>
Uwaga: Objętość pożywki pod błonami biofilmu zmniejsza się do około 3,0 mL. W związku z tym badacze powinni odpowiednio obliczyć ilość leku.
<ol start="3">
 <li>Delikatnie zakręć płytką, aby antybiotyk został dokładnie rozproszony w podłożu. W celu uzyskania statystycznie istotnych wyników, wstrzyknij antybiotyk do czterech dołków. Równolegle wstrzyknij taką samą objętość rozpuszczalnika, w którym rozpuszczono antybiotyk, do kolejnych czterech dołków, a ostatnie cztery dołki na płytce pozostaw nietknięte. Przykryj płytkę pokrywką i owiń brzegi płytki nowymi warstwami parafilmu. Umieść ją z powrotem w inkubatorze na pożądany czas.</li>
 <li>Po zakończeniu inkubacji otwórz płytkę i dodaj Tween-80 do stężenia końcowego 0,1% (objętościowo) w każdym z dołków. Delikatnie zakręć całą płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie detergentu. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wymieszaj zawartość każdego dołka pipetą kilka razy, aby całą zawartość można było równomiernie przenieść do 15mL probówki stożkowej.</li>
 <li>Odwiruj zawartość probówki przy 4000rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Resuspenduj osad w 5mL świeżego buforu do mycia (PBS z 10% glicerolem i 0,05% Tween-80). Powtórz proces mycia trzy razy. Resuspenduj osad w 5mL buforu do mycia. Przechowuj na rockerze przez noc w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
Uwaga: Chociaż niska temperatura została pierwotnie opracowana dla M. smegmatis (aby zminimalizować jego wzrost podczas dyspersji) i stosowana również dla M. tuberculosis, gatunki wolnorosnące można najprawdopodobniej inkubować w wytrząsarkach w temperaturze pokojowej bez wpływu na wynik. Wytrząsanie w temperaturze pokojowej może być konieczne w przypadku pracy w laboratorium poziomu BSL-3.
<ol start="6">
 <li>Przygotować sterylną strzykawkę z założoną mikrokońcówką (2-200μl), odcinając jej szeroki koniec do odpowiedniego rozmiaru, mocując ją do strzykawki i owijając parafilmem. Przenieść całą zawartość probówki za pomocą strzykawki z końcówką i zebrać do nowej probówki 15mL. Powtórzyć ten krok 5-6 razy, aż do uzyskania dość jednorodnej zawiesiny.</li>
 <li>Przygotować rozcieńczenia seryjne zawiesiny i wysiać je na płytki 7H11OADC, aby określić liczbę żywych kolonii w każdej próbce. Inkubować płytki przez trzy tygodnie w inkubatorze w temperaturze 37°C. Określić częstotliwość występowania persisterów w populacji biofilmu, obliczając stosunek liczby kolonii uzyskanych na płytkach traktowanych antybiotykiem do liczby kolonii na płytkach traktowanych rozpuszczalnikiem.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
W przypadku hodowli w butelce, wzrost M. tuberculosis można zaobserwować na dnie naczynia pod koniec pierwszego tygodnia. Pod koniec drugiego tygodnia widoczny jest punktowy wzrost bakterii na granicy fazy powietrze-medium, choć wzrost na tej granicy jest stale widoczny pod koniec trzeciego tygodnia (Rys. 1A). W tym czasie obserwuje się również przywieranie bakterii do ścianki pojemnika. Od tego momentu wzrost kultury odbywa się przede wszystkim na granicy fazy powietrze-medium. Ciecz pod powierzchnią wzrostu pozostaje klarowna. Zazwyczaj struktura ta dojrzewa pod koniec piątego tygodnia (Rys. 1B). Jeśli inkubacja zostanie przedłużona, struktury zaczną opadać na dno pojemnika. Co interesujące, szczelne zakręcenie korka do końca trzeciego tygodnia jest istotnym etapem procesu i z nieznanych przyczyn butelka z niedokręconym korkiem znacznie opóźnia inicjację wzrostu na granicy faz 9.
W formacie 12-dołkowym, pod koniec pięciu tygodni, w każdym z dołków widoczny jest trwały biofilm na granicy fazy powietrze-pożywka (Rys. 2A). Jeśli płytki nie zostaną całkowicie owinięte, obserwuje się zróżnicowany wzrost biofilmu. W najgorszym przypadku znaczne odparowanie pożywki może zahamować wzrost bakterii (Rys. 2B). Zatem owinięcie płytki jest niezbędne zarówno w celu zapobieżenia odparowaniu, jak i zapewnienia środowiska sprzyjającego tworzeniu się biofilmu (patrz poprzedni akapit).
Liczba żywotnych prątków w biofilmach wyznaczona tą techniką jest dość powtarzalna. Odpowiedź biofilmów M. tuberculosis różni się w zależności od rodzaju antybiotyków. W przypadku antybiotyku bakteriobójczego, takiego jak ryfampicyna, utrata żywotności wykazuje trend dwufazowy 9. Następuje szybki spadek żywotności w ciągu pierwszych trzech do czterech dni, po którym następuje faza persistencji, w której niewielki odsetek populacji pozostaje całkowicie oporny na antybiotyki, niezależnie od stężenia leku lub czasu ekspozycji. Rycina 3 przedstawia liczbę żywotnych prątków w dojrzałych biofilmach po 7-dniowej ekspozycji na 50μg/mL (50 razy więcej niż MIC) ryfampicyny.
<img alt="Proces krystalizacji w zlewce, pokazujący tworzenie się kryształów w roztworze w warunkach laboratoryjnych." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1A."> 
Rysunek 1A. Wczesne pojawienie się prątków M. tuberculosis na granicy fazy powietrze-podłoże bakterii po 3 tygodniach inkubacji.
<img alt="Wytrącanie chemiczne w zlewce; pojemnik 250mL, proces sedymentacji, wynik eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1B."> 
Rysunek 1B. Dojrzałe biofilmy M. tuberculosis na granicy fazy powietrze-pożywka po pięciu tygodniach inkubacji.
<img alt="Wzrost drobnoustrojów na płytce 12-dołkowej; eksperyment służący do obserwacji i analizy hodowli komórkowych." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2A."> 
Rycina 2A. 5-tygodniowe biofilmy M. tuberculosis hodowane w formacie 12-dołkowym.
<img alt="Mikrobiologia, płytka 12-dołkowa, układ do hodowli komórkowej, eksperyment laboratoryjny, analiza wzrostu." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2B."> 
Rysunek 2B. Nieudana próba hodowli biofilmu M. tuberculosis w płytce 12-dołkowej bez zastosowania parafilmu.
<img alt="Wykres żywotności, % żywotności w funkcji czasu po ekspozycji na Rif; wyniki eksperymentu dotyczącego odpowiedzi mikrobiologicznej." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. Reprezentatywny wykres przedstawiający częstość występowania tolerancyjnych na leki form przetrwalnikowych (persisters) w biofilmach M. tuberculosis hodowanych w formacie 12-dołkowym i eksponowanych na 50μg/mL ryfampicyny przez siedem dni.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Henke, J. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+social+engagements%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial social engagements.</a> Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).</li>
<li>Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all+and+all+for+one%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One for all and all for one.</a> Science. 280, 226-227 (1998).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Ojha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL1%3A+a+dedicated+chaperone+involved+in+mycolic+acid+biosynthesis+during+biofilm+formation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria.</a> Cell. 123, 861-873 (2005).</li>
<li>Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).</li>
<li>Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+tuberculosis+incidence+and+their+determinants+in+134+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries.</a> Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).</li>
<li>Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+and+sterilizing+activities+of+antituberculosis+drugs+during+the+first+14+days%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).</li>
<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Gruźlica (TB), wywołana zakażeniem Mycobacterium tuberculosis, pozostaje poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego na świecie. Szacuje się, że niemal jedna trzecia populacji świata jest bezobjawowo zakażona tym patogenem; co roku w klinikach pojawia się około 9 milionów nowych przypadków z objawami aktywnej gruźlicy, a około 1,7 miliona osób umiera z powodu tej infekcji 11. Ogromne obciążenie wynikające z tej choroby jest spowodowane przede wszystkim brakiem szczepionki oraz niezwykle skomplikowaną...

<table><tbody><tr><td>Inkubator</td><td>VWR international</td><td>Model # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe butelki hodowlane</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 mL</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka (rocker)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka chromatograficzna</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (jednopodstawkowy)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian amonu(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>kwas D-pantotenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Difco Middlebrook 7H9</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Middlebrook OADC</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>butelka do przechowywania 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>płytki 12-dołkowe</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>ryfampicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet 1-200&amp;mu;L</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówki 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco Mycobacteria 7H11</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dwupodstawkowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

wzrost biofilmu mycobacterium tuberculosis

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, czynnik etiologiczny gruźlicy u ludzi, posiada niezwykłą zdolność przetrwania w warunkach stresu środowiskowego, w tym w obecności antybiotyków. Chociaż odporność M. tuberculosis na stres jest prawdopodobnie jednym z czynników przyczyniających się do konieczności stosowania 6-miesięcznej chemioterapii gruźlicy 1, molekularne mechanizmy leżące u podstaw tego charakterystycznego fenotypu patogenu pozostają niejasne. Wiele gatunków mikroorganizmów wyewoluowało tak, aby przetrwać w stresujących środowiskach poprzez samoorganizację w wysoko uporządkowane, przytwierdzone do powierzchni i otoczone macierzą struktury nazywane biofilmem 2-4. Wzrost w formie społeczności wydaje się być preferowaną strategią przetrwania mikroorganizmów, co jest osiągane dzięki komponentom genetycznym regulującym przytwierdzanie do powierzchni, komunikację międzykomórkową oraz syntezę zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) 5,6. Tolerancja na stres środowiskowy jest prawdopodobnie ułatwiona przez EPS, a być może także przez adaptację fizjologiczną poszczególnych prątków do heterogenicznych mikrośrodowisk w obrębie złożonej architektury biofilmu 7.
W serii niedawnych prac wykazaliśmy, że M. tuberculosis oraz Mycobacterium smegmatis wykazują silną tendencję do wzrostu w zorganizowanych strukturach wielokomórkowych, zwanych biofilmem, które mogą tolerować stężenia ponad 50-krotnie wyższe od minimalnych stężeń hamujących dla leków przeciwprątkowych izoniazydy i rifampicyny 8-10. Co ciekawe, M. tuberculosis wymaga jednak specyficznych warunków do tworzenia dojrzałych biofilmów, w szczególności stosunku przestrzeni nad cieczą do pożywki wynoszącego 9:1, a także ograniczonej wymiany powietrza z atmosferą 9. Potrzeba wyspecjalizowanych warunków środowiskowych może być powiązana z faktem, że M. tuberculosis jest obligatoryjnym patogenem człowieka i w związku z tym przystosował się do środowiska tkankowego. W niniejszej publikacji prezentujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis w butelkach oraz w formacie płytki 12-dołkowej, co jest wygodne zarówno w badaniach bakteriologicznych, jak i genetycznych. Opisaliśmy protokół dla osłabionego szczepu M. tuberculosis, mc27000, z delecją w dwóch loci, panCD i RD1, które są krytyczne dla wzrostu patogenu in vivo 9. Szczep ten może być bezpiecznie stosowany w warunkach BSL-2 w celu zrozumienia podstawowej biologii patogenu gruźlicy, co pozwala uniknąć konieczności korzystania z kosztownych zapleczy BSL-3. Metoda ta może zostać rozszerzona, poprzez odpowiednią modyfikację pożywek, na hodowlę biofilmów innych hodowlanych gatunków prątków.
Ogólnie rzecz biorąc, jednolity protokół hodowli biofilmu prątków pomoże badaczom zainteresowanym analizą podstawowych cech odporności prątków. Ponadto przejrzysta i zwięzła metoda hodowli biofilmu prątków pomoże również badaczom klinicznym i farmaceutycznym w testowaniu skuteczności potencjalnych leków.

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

*Mycobacterium tuberculosis*, czynnik etiologiczny gruźlicy u ludzi, wykazuje nadzwyczajną zdolność do przetrwania w warunkach stresu środowiskowego, w tym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metody hodowli biofilmów M. tuberculosis na granicy fazy powietrze-medium oraz określenie częstotliwości występowania lekoopornych komórek w biofilmach. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie odpowiednich mediów i inokulum, a następnie wyhodowanie biofilmów M. tuberculosis na płytkach 12-dołkowych.Następnie dodaje się testowany antybiotyk w pożądanym stężeniu, aby określić częstotliwość występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). W przypadku M tuberculosis można oznaczyć biofilmy. Ostatecznie technika ta może zostać wykorzystana do pomocy w zrozumieniu podstaw rozwoju biofilmu oraz do odszyfrowania mechanizmów tolerancji na leki u M tuberculosis. Główną zaletą hodowli biofilmu M tuberculosis in vitro w mediach wolnych od detergentów jest to, że spontaniczny wzrost podstawowej, złożonej architektury wielokomórkowej ujawnia unikalne właściwości organizmu, których nie obserwuje się w hodowli planktonicznej.Obejmują one przyleganie do powierzchni, oddziaływania międzykomórkowe, syntezę macierzy pomocniczej oraz adaptację fizjologiczną w heterogennym mikrośrodowisku tej struktury. Co istotne, informacje te będą niezwykle istotne dla zrozumienia podstaw persistencji M tuberculosis w określonych wyspecjalizowanych niszach, takich jak jamy, w których w strukturach wielokomórkowych prawdopodobnie dochodzi do gwałtownego wzrostu bakterii w środowisku pomocniczym. Implikacje tej techniki rozciągają się na skrócenie terapii gruźlicy, ponieważ identyfikacja i celowanie w czynniki związane z biofilmami mogłoby zmniejszyć częstotliwość występowania lekoopornych subpopulacji w biofilmach.W niniejszym protokole do hodowli M tuberculosis zastosowano standardowy skład pożywek Soans. Jednakże podczas hodowli biofilmów innych gatunków prątków należy użyć odpowiednich dla nich specjalistycznych pożywek. Przygotuj pierwotne inokulum M tuberculosis w plastikowych butelkach o pojemności 125 mililitrów zawierających 15 mililitrów pożywki płynnej.Przez 80 wzrost. Hodowle w standardowych warunkach, aż ich OD 600 osiągnie wartość od 0,7 do 1,0, co zajmuje około tygodnia. Przy takiej gęstości hodowlę można wykorzystać bezpośrednio jako inokulum w rozcieńczeniu 1:100. Po przygotowaniu inokulum, dodaj 600 µL do 60 mL pożywki Sawtons.Po delikatnym wymieszaniu inokulum z pożywką, należy odlać 4,5 milliliters mieszaniny do każdego dołka płytki 12-dołkowej, przykryć płytkę i owinąć ją kilkukrotnie folią Parafilm. Następnie płytkę inkubuje się w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C.Po pięciu tygodniach niezakłóconego wzrostu należy przystąpić do testowania lekopornych komórek przetrwalnikowych (persisters). Po pięciu tygodniach dojrzewania objętość medium w czterech dołkach zmniejszy się do około trzech mililitrów na dołek. Wprowadź badany antybiotyk bezpośrednio pod biofilm w medium.Do czterech kolejnych dołków należy wstrzyknąć sam rozpuszczalnik, a ostatnie cztery dołki pozostawić bez żadnych dodatków. Zapewnia to istotność statystyczną oraz odpowiednie kontrole. Delikatnie zakołysać płytką, aby antybiotyk całkowicie rozprzestrzenił się w podłożu. Następnie przykryć płytkę.Nałóż świeże warstwy parafiny wokół płytki i inkubuj ją od jednego do siedmiu dni, zależnie od przebiegu eksperymentu. Po zakończeniu inkubacji dodaj tween 80 do każdego dołka. Delikatnie potrząśnij całą płytką, aby równomiernie rozprowadzić detergent.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po upływie 15 minut wymieszaj zawartość każdej studzienki za pomocą pipety do uzyskania jednorodności. Następnie przenieś kulturę do 15 mililitrowej probówki stożkowej.Odwiruj probówkę stożkową, a następnie resuspenduj osad. Zawieś osad w pięciu mililitrach świeżego buforu do przemywania, odwiruj i resuspenduj. Powtórz zawieszenie komórek w buforze do przemywania jeszcze trzy razy.Następnie komórki należy inkubować w buforze do płukania przez noc na wytrząsarce w chłodni. Choć niską temperaturę opracowano pierwotnie dla EMS magmatic, aby zminimalizować jego wzrost podczas dyspersji, metodę tę stosuje się również dla M tuberculosis. Gatunki wolno rosnące można prawdopodobnie inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej bez wpływu na wyniki.Jeśli praca odbywa się w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL 3, konieczne może być wytrząsanie w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przygotować strzykawkę do homogenizacji i przeniesienia materiału. Dla każdej zawiesiny dopasować końcówkę mikropipety do sterylnej strzykawki. Odciąć szeroki koniec końcówki do odpowiedniego rozmiaru, połączyć ją ze strzykawką i zabezpieczyć połączenie parafilmem.Przenieś schłodzoną zawiesinę komórkową za pomocą strzykawki z dopasowaną końcówką i umieść zawartość w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Powtórz ten krok od pięciu do sześciu razy, każdorazowo wymieniając probówkę, aż zawiesina stanie się bardzo jednorodna. Następnie przygotuj rozcieńczenia seryjne każdej zawiesiny i wysej każde rozcieńczenie na płytce z agarem.Po trzech tygodniach inkubacji płytek należy określić częstość występowania persisterów w populacji biofilmu, porównując liczbę kolonii na płytkach traktowanych antybiotykiem oraz na płytkach kontrolnych. W przypadku hodowli w butelce, w ciągu pierwszego tygodnia M tuberculosis rósł przy dnie butelki.Pod koniec drugiej tygodnia zaobserwowano wyspowy wzrost bakterii na granicy fazy powietrze-pożywka, który stał się jeszcze bardziej widoczny pod koniec trzeciego tygodnia. Odnotowano również przywieranie bakterii do ścianek naczynia, a wzrost kultury następował głównie na granicy fazy powietrze-pożywka. Ciecz pod powierzchnią wzrostu była klarowna.Pod koniec piątego tygodnia struktura w pełni dojrzała. W formacie 12 dołków, po pięciu tygodniach inkubacji, w każdym dołku na płytkach, które nie były całkowicie owinięte, zaobserwowano silny biofilm na granicy fazy powietrze-pożywka. Odnotowano zróżnicowany wzrost biofilmu, a także znaczne odparowanie pożywki.Wzrost bakterii na tych płytkach został zahamowany. Liczba żywotnych pałeczek w biofilmach była dość powtarzalna i różniła się w zależności od zastosowanych antybiotyków. Na przykład w przypadku rifampicyny, antybiotyku bakteriobójczego, gwałtowny spadek żywotności w ciągu pierwszych trzech do czterech dni nastąpił po fazie trwałości, w której niewielki odsetek populacji pozostał całkowicie oporny na antybiotyki, niezależnie od stężenia leku lub czasu ekspozycji.Tę samą procedurę można wykorzystać w przesiewaniu mutantów w celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przywieranie mycobacterium tuberculosis do powierzchni biofilmu, wzrost bakterii na granicy faz oraz dojrzewanie biofilmu. Należy pamiętać, że praca z M tuberculosis może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie warunków izolacyjnych poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3.

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wzrost Mycobacterium tuberculosis Biofilmów

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Ten protokół opisuje solidną metodę tworzenia biofilmu błonki. Metoda jest skalowalna do różnych objętości hodowli, co pozwala na łatwe zastosowanie do różnych celów eksperymentalnych. Konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę potencjału biofilmotwórczego kilku gatunków prątków.

Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Poznaj metodę hodowli biofilmów Mycobacterium tuberculosis na granicy powietrze-pożywka i oceny częstości opornych form przetrwalnikowych. Technika ta pozwala badać mechanizmy tolerancji na leki.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Przeglądaj więcej filmów