Wzrost biofilmów Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis tworzy odporne na leki biofilmy, gdy są hodowane w określonych warunkach. W tym miejscu opisano metody hodowli biofilmów M. tuberculosis i określenia częstości występowania osób utrzymujących się w tolerancji na leki. Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metody hodowli biofilmów gruźlicy na granicy faz pożywki powietrznej oraz określenie częstości występowania w biofilmach basi tolerujących leki. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie odpowiednich pożywek i inokulumów. Drugim krokiem jest wyhodowanie biofilmów gruźlicy na 12 płytkach świata.

Następnie dodaje się testowy antybiotyk w pożądanym stężeniu i częstotliwości utrzymujących się na leki. W gruźlicy M można określić biofilmy. Ostatecznie technika ta może zostać wykorzystana do zrozumienia podstaw rozwoju biofilmu i rozszyfrowania mechanizmów tolerancji leków w gruźlicy M, Główną zaletą hodowli in vitro biofilmu gruźlicy mikrom w pożywkach wolnych od detergentów jest to, że spontaniczny wzrost wielokomórkowej architektury kompleksu linii basowej ujawnia unikalne właściwości organizmu niespotykane w kulturze platońskiej.

Należą do nich przyczepienie powierzchniowe, interakcje międzykomórkowe, synteza macierzy akcesorowej i adaptacja fizjologiczna w heterogenicznym mikrośrodowisku tej struktury. Co ważne, informacje te będą bardzo istotne w zrozumieniu podstaw gruźlicy M, trwałości w pewnych wyspecjalizowanych niszach, takich jak jamy, gdzie w strukturach wielokomórkowych prawdopodobnie wystąpi bujny wzrost basi w środowisku dodatkowym. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku krótszej terapii gruźlicy, ponieważ identyfikacja i ukierunkowanie czynników związanych z biofilmami może zmniejszyć częstość występowania subpopulacji tolerujących leki w biofilmach.

W tym protokole do hodowli gruźlicy M stosuje się standardową kompozycję pożywek soans. Jednak przy hodowli biofilmów innych gatunków prątków należy użyć odpowiednich specjalistycznych pożywek, przygotować pierwotne inokulum gruźlicy M. W 125-mililitrowych plastikowych butelkach zawierających 15 mililitrów płynnego podłoża.

Między 80 wzrostem. Kultury w standardowych warunkach, aż ich OD 600 wyniesie od 0,7 do 1,0, co zajmuje około tygodnia Przy tej gęstości kultura może być używana bezpośrednio jako inokulum w rozcieńczeniu od jednego do 100. Z przygotowanym inokulum dodać 600 mikrolitrów do 60 mililitrów pożywki z sawtonów.

Po delikatnym wymieszaniu inokulum z pożywką, dozować 4,5 mililitra mieszaniny do każdej studzienki 12. Dobrze talerz, przykryj talerz i owiń go kilka razy paramem. Następnie inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu tygodniach niezakłóconego wzrostu przystąp do testów na obecność substancji trwałych tolerujących lek. Po pięciu tygodniach dojrzewania objętość pożywki zmniejszy się do około trzech mililitrów na studzienkę w czterech dołkach. Wstrzyknij interesujący Cię antybiotyk tuż pod biofilmem na pożywce.

Cztery inne studzienki należy wstrzyknąć samym rozpuszczalnikiem, a ostatnie cztery studzienki należy pozostawić w spokoju. Zapewnia to siłę statystyczną, a odpowiednie kontrole delikatnie pęcznieją płytkę, tak aby antybiotyk został dokładnie rozprowadzony w pożywce. Teraz przykryj talerz.

Umieść świeże warstwy paraform wokół płytki i inkubuj płytkę przez okres od jednego do siedmiu dni, zgodnie z eksperymentem. Pod koniec inkubacji dodaj do każdej z nich po 80 sztuk. Dobrze spęcznij delikatnie całą płytkę, aby równomiernie rozprowadzić detergent.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach za pomocą pipety wymieszaj zawartość każdej studzienki, aż będzie jednolita. Następnie przenieś kulturę do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Odwiruj stożkową rurkę i zreusuj. Zawiesić granulat w pięciu mililitrach świeżego buforu do mycia, odwirować i wznowić. Zawieś komórki w buforze płuczącym jeszcze trzy razy.

Następnie przechowuj komórki w buforze do płukania przez noc na bujaku w chłodnym pomieszczeniu. Chociaż niska temperatura została pierwotnie opracowana dla magmy EMS, aby zminimalizować jej wzrost podczas dyspersji i stosowania również w przypadku gruźlicy M. Wolno rosnące gatunki można najprawdopodobniej kołysać w temperaturze pokojowej bez żadnego wpływu na wyniki.

Kołysanie w temperaturze pokojowej może być konieczne w przypadku pracy w trzech obiektach BSL Następnego dnia przygotuj strzykawkę do homogenizacji i przeniesienia. Do każdej zawiesiny należy dopasować końcówkę mikropipety do sterylnej strzykawki. Przytnij szeroki koniec końcówki na wymiar, podłącz go do strzykawki i owiń połączenie folią para.

Przełóż schłodzoną zawiesinę komórek przez strzykawkę z końcówką i umieść zawartość w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Powtórz ten krok pięć do sześciu razy, ciągle wymieniając rurkę, aż zawieszenie będzie wyglądało na bardzo jednorodne. Teraz przygotować seryjne rozcieńczenia każdej zawiesiny i umieścić każde rozcieńczenie na płytce agarowej.

Po inkubacji płytek przez trzy tygodnie należy określić częstość występowania osób utrzymujących się w populacji biofilmu, porównując liczbę kolonii płytek na płytkach podawanych antybiotykom i płytkach kontrolnych. Po wyhodowaniu w butelce. W pierwszym tygodniu u podstawy butelki wyrosła gruźlica M.

Pod koniec drugiego tygodnia zaobserwowano niejednolity wzrost bakterii na granicy faz mediów powietrznych, który stał się jeszcze bardziej widoczny pod koniec trzeciego tygodnia. Zaobserwowano również przyczepianie się bakterii do ścianki pojemnika, a wzrost kultury następował przede wszystkim na granicy faz mediów powietrznych. Ciecz pod powierzchnią była przezroczysta.

Pod koniec piątego tygodnia struktura była w pełni dojrzała. W formacie 12-dołkowym po pięciu tygodniach inkubacji zaobserwowano solidny biofilm na granicy faz pożywki powietrznej w każdym dołku na płytkach, które nie były całkowicie owinięte. Zaobserwowano zróżnicowany wzrost biofilmu, a także znaczne parowanie pożywki.

Rozwój bakterii na tych płytkach został zahamowany. Liczba żywotnych pałeczek w biofilmach była dość powtarzalna i zróżnicowana w zależności od różnych antybiotyków. Na przykład w przypadku ryfampicyny, antybiotyku Bacter cydal, po gwałtownym spadku żywotności w ciągu pierwszych trzech do czterech dni nastąpiła trwała faza, w której niewielki odsetek populacji pozostaje całkowicie oporny na antybiotyki, niezależnie od stężenia antybiotyku lub czasu ekspozycji.

Ta sama procedura może być stosowana w badaniach przesiewowych mutantów w celu identyfikacji genów, które są zaangażowane w przyłączanie się Mycobacterium tuberculosis do wzrostu powierzchni biofilmu bakterii na granicy faz i dojrzewania Pecos. Nie zapominaj, że praca z gruźlicą M może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.