Pomiar aktywności czynnika V w osoczu ludzkim za pomocą testu krzepnięcia mikropłytek

Ogólnym celem poniższej procedury było opracowanie testu mikropłytki, który mierzy aktywność białka krzepnięcia czynnika V podczas tworzenia skrzepu fibryny w ludzkim osoczu. W odpowiedzi na uraz aktywowany jest proces krzepnięcia krwi, który powoduje szereg reakcji konwersji Xymogenu do proteazy, które ostatecznie prowadzą do wytworzenia enzymu krzepnięcia trombiny, trombiny klekuje rozpuszczalny fibrynogen do monomerów fibryny, które następnie łączą się, tworząc nierozpuszczalny skrzep fibryny. Zwykle krew pozostaje jako swobodnie płynąca ciecz w stanie zdrowym lub nieuszkodzonym, a ilość powstałej fibryny jest równa ilości fibryny zdegradowanej lub rozbitej.

Jednak w niektórych sytuacjach chorobowych zbyt duża ilość krzepnięcia prowadzi do chorób serca i udaru mózgu, podczas gdy zbyt mała ilość krzepnięcia prowadzi do tendencji do krwawień, które często obserwuje się w hemofiliach. Czynnik V jest białkiem w osoczu, które w swojej aktywowanej postaci czynnika piątego A jest krytycznym akceleratorem wytwarzania trombiny podczas tworzenia skrzepów fibryny jako część kompleksu enzymatycznego protrombiny, protrombina składa się z czterech składników: czynnika 10 A, czynnika proteazy pięciu A, lipidu kofaktora, powierzchni i wapnia. Czynnik meliny piąty A zwiększa sprawność katalityczną lub kcat czynnika 10 A w kierunku jego substratu protrombiny około 3000 razy, zwiększając w ten sposób znacznie wytwarzanie trombiny i tworzenie skrzepów fibryny.

Platforma mikropłytkowa jest preferowana do pomiaru zdarzeń katalizowanych enzymami ze względu na wygodę, koszt czasu, małe objętości próbek, ciągłe monitorowanie i wysoką przepustowość. Zdarzenie tworzenia się skrzepu fibryny można monitorować za pomocą czytnika mikropłytek, mierząc wzrost absorbancji światła osocza w miarę zmiany z przezroczystego żółtego wyglądu bez skrzepu fibryny i minimalnej absorbancji światła do nieprzezroczystego, mętnego wyglądu ze skrzepem fibryny i maksymalną absorbancją światła. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczne testy z rurką przechylną lub testy z automatycznymi analizatorami, jest to, że metoda jest szybka, niedroga, ma małe wymagania dotyczące objętości próbki i ma wysoką przepustowość.

Test mierzy aktywność nieumyślnie aktywowanego i aktywowanego trombiną czynnika piątego w celu uzyskania pełnej ilościowej oceny jego całkowitej aktywności funkcjonalnej. Technikę tę zademonstruje Derek Tilley, mistrz w laboratorium. W celu zmierzenia aktywności czynnika piątego w próbce osocza, konieczne jest skonstruowanie jednoetapowej aktywności czynnika piątego, standardowych krzywych czasu tworzenia się skrzepów fibryny w panelu A oraz początkowej szybkości tworzenia się skrzepów fibryny w panelu B przy użyciu normalnego osocza ludzkiego lub NHP jako wzorca, który z definicji zawiera jedną jednostkę czynnika pięć Aktywność na ML rozmrażanie osocza z niedoborem czynnika piątego, normalne osocze ludzkie i próbka osocza nieznane i tromboplastyna w temperaturze 37 stopni przez 10 minut.

Delikatnie wymieszać transfer plazmy i plastyki skrzeplowej z niedoborem czynnika piątego do oddzielnych plastikowych tacek do mycia i inkubować na lodzie. Przechowuj normalne ludzkie osocze i próbkę osocza bez nieznanego osocza na lodzie po delikatnym wymieszaniu. Przechowywać chlorek wapnia 25 milimolów w wodzie destylowanej na oddzielnej tacy myjącej w temperaturze pokojowej dla czynnika pięć jeden Standardowe krzywe aktywności etapu.

Przygotować 200 mikrolitrów każdego z dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń normalnego ludzkiego osocza od 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 i 512 razy w HBS pH 7,4 za pomocą 1,5 ml mikroprobówek wirówek, dobrze zawirować i inkubować na lodzie. W przypadku nieznanej próbki osocza należy przygotować po 200 mikrolitrów po 40 razy rozcieńczenia normalnego osocza ludzkiego i nieznanego osocza próbki w HBS pH 7,4 przy użyciu 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych. Umieść pięć pasków mikrostudzienki w uchwycie szablonu czytnika mikropłytek.

Włącz czytnik mikropłytek i uzyskaj dostęp do oprogramowania aplikacyjnego Softmax Pro za pomocą pipety wielokanałowej. Wykonaj jednoczesne dodawanie 50 mikrolitrów osocza z niedoborem czynnika piątego do wszystkich dołków mikropłytki próbki za pomocą jednej pipety, dodaj 50 mikrolitrów przygotowanych 10 seryjnych rozcieńczeń normalnego osocza ludzkiego i 40-krotne rozcieńczenia normalnego osocza ludzkiego i próbki osocza nieznanego, aby oddzielić dołki MICROPLATE za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 50 mikrolitrów plastyki skrzeplinowej do wszystkich dołków na próbki. Inkubować w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez jedną minutę z wytrząsaniem przez 15 do 25 sekund jednominutowej inkubacji.

Za pomocą komputera połączonego z czytnikiem MICROPLATE uzyskaj dostęp do oprogramowania aplikacyjnego Softmax Pro Microplate. Ustaw czytnik mikropłytek na długość fali absorbancji na 405 nanometrów, tryb na temperaturę kinetyczną na 25 stopni Celsjusza i zaprogramuj czytnik mikropłytek tak, aby trząsł się przez pierwsze pięć sekund po dodaniu chlorku wapnia i mierzył absorbancję przy 405 nanometrach co pięć sekund przez sześć minut. Następnie pięciosekundowy odstęp między wytrząsaniem nie jest wliczany do obliczonych czasów krzepnięcia przy użyciu dwóch pipet wielokanałowych jednocześnie dodających 50 mikrolitrów chlorku wapnia do dwóch pasków mikropłytki z próbkami.

Odczekaj 15 sekund i natychmiast naciśnij ikonę start w Softmax Pro na komputerze, aby rozpocząć test. Dla każdej analizowanej próbki osocza określa się czas tworzenia się skrzepu i definiuje go jako czas w sekundach do osiągnięcia połowy maksymalnego wzrostu chłonności. Początkowa szybkość tworzenia się skrzepów jest definiowana jako szybkość wzrostu chłonności w ciągu pierwszych pięciu punktów czasowych liniowej części wzrostu chłonności w czasie.

Stopień tworzenia się skrzepów definiuje się jako różnicę między maksymalną i minimalną chłonnością osiągniętą podczas tworzenia się skrzepów na końcu cyklu. Użyj profili CHŁONNOŚĆ w funkcji czasu w Softmax Pro, aby określić czas, początkową szybkość i zakres tworzenia się skrzepów dla seryjnego rozcieńczania normalnego ludzkiego osocza. Aby skonstruować jednoetapowe krzywe wzorcowe aktywności czynnika V, należy użyć czasów krzepnięcia dla 40-krotnie rozcieńczonych normalnych niewiadomych dotyczących ludzkiego osocza i próbki osocza, aby interpolować aktywność czynnika piątego w jednostkach na promil z jednoetapowej krzywej standardowej aktywności czynnika piątego.

Reprezentuje to jednoetapową aktywność czynnika pięć lub bez celowej aktywacji przez trombinę. Jest to reprezentatywny przykład tworzenia się skrzepów fibryny w teście czynnika piątego w czasie generowanym przez czytnik mikropłytek. Profil przedstawia tworzenie skrzepów fibryny przy użyciu 32-krotnie rozcieńczonego normalnego osocza ludzkiego w jednej mikropłytce.

Otóż oś pionowa oznacza zmianę chłonności na 405 nanometrach, która nastąpiła w wyniku tworzenia się skrzepów fibryny. Czas tworzenia się skrzepu obliczono jako punkt środkowy krzywej chłonności w funkcji czasu, wynoszący 36,4 sekundy. Początkowe tempo tworzenia skrzepów obliczono na 611,88 milijednostek na minutę.

Zasięg powstawania chmur obliczono na 0,35 jednostki. Test czynnika piątego dokładnie mierzy początkową szybkość w czasie i zakres powstawania chmur. Inspekcja studni po zakończeniu testu potwierdziła, że doszło do tworzenia się skrzepów.

Wszystkie reakcje osiągnęły w przybliżeniu ten sam stopień tworzenia się chmur z ogólną zmianą absorbancji przy 405 nanometrach wynoszącą od 0,35 do 0,45 jednostki między początkową absorbancją przed a maksymalną absorbancją po plastyce skrzepliny i chlorku wapnia. Do tego dochodzą reprezentatywne przykłady jednoetapowej aktywności czynnika piątego, standardowej krzywej czasu krzepnięcia w sekundach w porównaniu z aktywnością czynnika piątego w jednostkach na promil oraz początkowej szybkości tworzenia pazurów w milijednostkach na minutę w porównaniu z czynnikiem piątym. Aktywność w jednostkach na promil dla normalnego osocza ludzkiego pokazano odpowiednio w panelu A i panelu B.

Ponieważ czynnik piąty jest zwykle aktywowany przez trombinę. Aktywny czynnik kofaktora piąty A drugi test po dodaniu i inkubacji z trombiną ma kluczowe znaczenie dla dokładnego pomiaru dwuetapowej aktywności czynnika pięć próbki osocza z celową aktywacją przez dodanie trombiny dla dwuetapowego testu czynnika pięć. Przygotować od 200 do 300 mikrolitrów oczyszczonej trombiny o jej końcowym stężeniu stu nanomolowców w HBS pH 7,4 i inkubować na lodzie, rozcieńczyć 120 mikrolitrów powyżej normalnego ludzkiego osocza i próbki osocza od 40 do 100 razy ze 170 mikrolitrami HBS pH 7,4 zawierającego 2,8 milimola.

Chlorek wapnia. Dodać 10 mikrolitrów trombiny, aby uzyskać końcowe stężenie 10 nanomolowe Do każdej próbki. Wir. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni Przez jedną minutę rozcieńczyć normalne ludzkie osocze i pobrać próbkę osocza do 500 razy, dodając 400 mikrolitrów HBS pH 7,4.

Określ czas krzepnięcia dla normalnego osocza ludzkiego w każdym z nieznanych testów osocza próbki na podstawie profili absorbancji w funkcji czasu w soft max Pro. Biorąc pod uwagę 500-krotne rozcieńczenie, użyj czasu krzepnięcia dla każdej próbki, aby obliczyć dwuetapową aktywność czynnika pięć z jednostopniowej standardowej krzywej czasu krzepnięcia w funkcji aktywności czynnika pięć. Reprezentuje to dwuetapową aktywność czynnika pięć lub taką, która jest celowo aktywowana przez trombinę.

Całkowita aktywność czynnika piątego może być następnie obliczona jako działanie dwuetapowe czynnika pięć pomniejszone o działanie czynnika piątego jednoetapowego. Standardowa krzywa logarytmicznego czasu krzepnięcia w funkcji aktywności logarytmu piątego została wykorzystana do pomiaru aktywności czynnika piątego w normalnym osoczu ludzkim i osoczu od dziewięciu pacjentów z rozsianym wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym lub DIC, wszystkich dziewięciu pacjentów z DIC. Wykazywał jednoetapową aktywność czynnika piątego i początkowe tempo tworzenia się skrzepów, które zmniejszyły się średnio o 54 i 18%Czynnik piąty, dwuetapowy i całkowita aktywność były zmniejszone u pacjentów z DIC średnio o 44 i 42% w porównaniu z normalnym ludzkim osoczem.

Czynnik piąty i pacjenci z DIC spowodowali wydłużenie czasu i zmniejszenie szybkości tworzenia się skrzepów włókien. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak wdrożyć tę metodę w swoim laboratorium. Metodę tę można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dowolnego czynnika krzepnięcia w osoczu, dzięki czemu nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań badawczych i klinicznych.

Ostatecznie informacje o czynniku V będą miały pozytywny wpływ na środowisko opieki zdrowotnej poprzez wcześniejszą diagnostykę i leczenie zaburzeń zakrzepowych lub krzepnięcia, takich jak DIC.