Name: Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki i amplifikacji cDNA do analizy transkryptomicznej. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej oraz identyfikację markerów genowych rzadkich populacji komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Schemat blokowy przedstawiający protokół znajduje się na Rysunku 1. Numery katalogowe konkretnych odczynników użytych w tym protokole podano w Tabeli 1. Przeprowadzić dysekcję siatkówki w kąpieli z PBS. Podczas dysekcji zaleca się usunięcie ciała szklistego i soczewki, ponieważ ich obecność może utrudniać dysocjację. Usunięcie całego nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) nie zawsze jest krytycznie ważne i w niektórych przypadkach może być niemożliwe do całkowitego wykonania. Jednak w przypadku eksperymentów z profilowaniem pojedynczych komórek fotoreceptorów należy usunąć RPE. Niezastosowanie tego kroku może prowadzić do zanieczyszczenia profili komórek pręcikowych genami ekspresowanymi w RPE, co prawdopodobnie wynika z połączeń między fotoreceptorami a RPE. 
	W celu przeprowadzenia dysocjacji, całe siatkówki dorosłych myszy inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 10 min w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 20 μl aktywowanej papainy, 20 μl 25 mM cysteiny w 5 mM EDTA oraz 360 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego o 10 mM HEPES. Na wszystkich etapach protokołu należy stosować końcówki do pipet z filtrem, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenia. Stężenie papainy oraz czas inkubacji będą się różnić w zależności od wieku i rodzaju tkanki. Na przykład, aby zdysocjować rozwijające się siatkówki izolowane w 0. dniu po urodzeniu (P0), należy inkubować siatkówkę w 10 μl aktywowanej papainy, 10 μl 25 mM cysteiny w 5 mM EDTA oraz 380 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego o 10 mM HEPES przez 10 min w temperaturze 37 °C. Siatkówki różnych gatunków wymagają również nieco innych warunków. Siatkówki kurczaka są cieńsze niż siatkówki myszy na większości etapów rozwoju. Do ich dysocjacji wystarczy zastosowanie 10 μl aktywowanej papainy, 10 μl 25 mM cysteiny w 5 mM EDTA oraz 380 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego o 10 mM HEPES przez 5 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie ostukać probówkę, aby oderwać osiadłe komórki, a następnie delikatnie triturować 10-20 razy za pomocą pipety p1000. Jeśli nadal obecne są duże skupiska tkanki, inkubować przez dodatkowe 10 min w temperaturze 37 °C, a następnie ponownie triturować 10-20 razy.</li>
	<li>Dodać 5 μl DNazy I (10 U/μl) i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Delikatnie triturować za pomocą pipety p1000. Dokładna liczba powtórzeń musi zostać określona empirycznie, lecz zazwyczaj mieści się w przedziale 10-20.</li>
	<li>Wirować w wirówce naknadkowej przy 3000 rpm przez 3 min. Usunąć nadpłyn, pozostawiając 100-200 μl cieczy na dnie, i ostukać probówkę, aby rozbić osad. Dodać 1 ml HBSS i resuspenderć osad poprzez delikatną triturację. Ostukanie probówki jest tutaj kluczowe, ponieważ samo resuspenderowanie osadu może spowodować lizę wielu komórek siatkówki, co jest szczególnie istotne w przypadku siatkówek dorosłych myszy.</li>
	<li>Wirować przy 3000 rpm przez 3 min. Ostrożnie usunąć nadpłyn i resuspenderć w 450 μl PBS zawierającego 0,1% BSA. Ważne jest usunięcie jak największej ilości nadpłynu, aby zminimalizować obecność mRNA z lizowanych komórek oraz wszelkich produktów dysocjacji, które mogłyby hamować przyszłe reakcje.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Przygotować dwie płytki 6 cm zawierające 5 ml PBS z dodatkiem 0,1% BSA. Wysiać zdysocjowane komórki na jedną płytkę i pozostawić je do osiadania przez co najmniej 5 min. Stosowana gęstość komórek w dużym stopniu zależy od charakteru pojedynczych komórek poddawanych profilowaniu. Na przykład w przypadku bardzo rzadkich komórek znakowanych markerem fluorescencyjnym, takim jak GFP, całe zdysocjowane siatkówki wysiewa się na jedną płytkę 6 cm. W przypadku komórek występujących częściej, początkowo wysiewa się ich mniej, aby ułatwić pobranie jednej (lub bardzo blisko jednej) komórki za pomocą pierwszej mikropipety.</li>
	<li>Umieścić płytkę ze zdysocjowanymi komórkami na mikroskopie odwróconym. Stosujemy model IMT-2 firmy Olympus. Używając mikropipet zaciągniętych do cienkiej końcówki (średnica wewnętrzna 0,5 mm, średnica zewnętrzna 1,04 mm) (Rysunek 2) oraz rurki aspiracyjnej, pobrać pojedynczą komórkę. Komórki łatwo wnikają do mikropipety, gdy zostanie ona umieszczona blisko nich na płytce. Kluczowe jest, aby rurka aspiracyjna nie była ani za długa, ani za krótka w stosunku do odległości od stolika mikroskopu odwróconego (stosowane przez nas rurki aspiracyjne do tego mikroskopu mają długość 38,1 cm). Jeśli rurka jest zbyt długa, komórki mogą nie być wydajnie usuwane z mikropipety do probówki zbiorczej. Głównym powodem stosowania starszego modelu mikroskopu odwróconego IMT-2 jest fakt, że wykazuje on idealną odległość do stolika dla naszych rurek zestawu aspiracyjnego. Po wniknięciu do mikropipety, komórka (lub komórki) jest wydalana na drugą płytkę (płytkę płuczącą), aby upewnić się, że do profilowania ekspresji genów pobrano dokładnie jedną komórkę. Na drugiej płytce często konieczne jest usunięcie nadmiarowych komórek nową mikropipetą lub przeniesienie interesującej nas komórki w inne miejsce, aby mieć pewność, że do mikropipety dostanie się tylko jedna komórka.</li>
	<li>Gdy pojedyncza komórka zostanie całkowicie odizolowana od komórek sąsiednich, użyć nowej mikropipety, aby zaspirować interesującą komórkę zgodnie z opisem w sekcji 2.2, a następnie wydalić ją bezpośrednio do probówki PCR 0,2 ml zawierającej 4,5 μl buforu do lizy komórek. Komórkę wydala się na ściankę probówki, uważając, aby nie odłamać końcówki mikropipety do wnętrza probówki. Próbki można krótko wirować w mikrocentry fudze naketowej, aby zanurzyć komórkę w buforze do lizy. Wirowanie to wykonuje się zazwyczaj po każdej piątej komórce, a następnie ponownie na koniec pobierania. Probówki zawierające pojedyncze komórki w buforze do lizy powinny być przechowywane w lodzie przez cały czas trwania izolacji pojedynczych komórek. Dla uzyskania optymalnych wyników pojedyncze komórki zbiera się w ciągu dwóch godzin po dysocjacji. Po upływie tego czasu najlepiej przejść do etapu odwrotnej transkrypcji, ponieważ zaobserwowano, że dodatkowy czas zwiększa ryzyko degradacji RNA.</li>
</ol>
3. Odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Krótko odwiruj próbki w miniwirówce laboratoryjnej, aby upewnić się, że wszystkie pojedyncze komórki są zanurzone w buforze do lizy komórek. Aby wspomóc lizę komórek, inkubuj próbkę w termocyklerze w temperaturze 70 °C przez 90 sec. Natychmiast przenieś probówki z powrotem na lód.</li>
	<li>Pozostaw probówki na lodzie przez 2 min. Podczas dodawania wszystkich odczynników używaj końcówek do pipet z filtrem, aby zapobiec kontaminacji. Aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, dodaj 0,33 μl Superscript III (200 U/μl), 0,05 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) oraz 0,07 μl białka T4 gene 32. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez 50 min w temperaturze 50 °C w termocyklerze. Inaktywuj enzym w temperaturze 70 °C przez 15 min, a następnie przenieś na lód.</li>
	<li>Aby usunąć wolne primery, dodaj 0,1 μl Exonuclease Buffer (10X), 0,8 μl dH20 (stopnia czystości do biologii molekularnej) oraz 0,1 μl Exonuclease I (20 U/μl). Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 min w termocyklerze. Inaktywuj enzym, inkubując reakcję w temperaturze 80 °C przez 25 min, a następnie przenosząc probówki na lód.</li>
</ol>
4. Tailing i PCR pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Dodaj 6 μl mieszaniny do reakcji ogonowania i inkubuj próbkę w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 20 min, 70 °C przez 10 min, a następnie przechowuj w 4 °C</li>
	<li>Dodaj 10 μl ogonowanej próbki do mieszaniny reakcyjnej PCR i przeprowadź syntezę drugiej nici oraz amplifikację PCR zgodnie z następującymi warunkami:
	<ol>
		<li>95 °C przez 2 min</li>
		<li>37 °C przez 5 min</li>
		<li>72 °C przez 16 min</li>
		<li>93 °C przez 40 sec</li>
		<li>67 °C przez 1 min</li>
		<li>72 °C przez 6 min, dodając 6 sec na cykl</li>
		<li>Powtórz kroki od 4 do 6 przez 34 cykle</li>
		<li>72 °C przez 10 min</li>
		<li>Przechowywanie w 4 °C</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. znakowanie dla chipów Affymetrix
<ol>
	<li>Oznakuj 10-20 μg cDNA (stężenie namnożonego cDNA pochodzącego z pojedynczej komórki wynosi zazwyczaj ~1 μg/μl), aby uzyskać silną hybrydyzację na mikromacierzach Affymetrix. W pierwszej kolejności przeprowadź fragmentację cDNA, dodając 10-20 μl cDNA z pojedynczej komórki do 8 μl buforu 1X One-Phor-All oraz 1 μl rozcieńczonej (1:10 w buforze 1X One-Phor-All) DNaseI w reakcji o objętości 80 μl. Inkubuj w termocyklerze przez 13 min w temperaturze 37 °C. Inaktywuj DNase I przez 15 min w 100 °C, a następnie umieść na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 20 μl buforu 5X TdT, 2,5 μl Biotin N6-ddATP (Enzo Biosciences) oraz 1 μl TdT (rozcieńczonego 1:8 w buforze TdT).</li>
	<li>Inkubuj przez 90 min w 37 °C, a następnie przez 5 min w 65 °C. Przechowuj w -20 °C lub niezwłocznie przeprowadź hybrydyzację z mikromacierzą Affymetrix. Hybrydyzację wykonuje się zgodnie ze standardowymi protokołami Affymetrix.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Aby ocenić jakość cDNA, 10 μl próbki cDNA naniesiono na 1% żel agarozowy. Jakość cDNA ocenia się głównie na podstawie zakresu wielkości (500-2000 bp) oraz intensywności smużki cDNA (Rysunek 1 oraz Rysunek 3a). Na żelu przedstawionym na Rysunku 1, co druga ścieżka pokazuje smużkę cDNA z komórek siatkówki izolowanych w dniu E16.5. Ścieżki pomiędzy nimi pokazują smużki powstałe w sytuacji, gdy do igły i do probówki PCR zaciągnięto jedynie medium. Ścieżki te nigdy nie są całkowicie pozbawione słabej smużki, jednak nie wykazują żadnych wyników po zastosowaniu genospecyficznych starterów PCR do amplifikacji genów. Ponadto intensywność smużki cDNA może się nieco różnić (porównać Rysunek 1 i Rysunek 3a). Na Rysunku 3a ścieżki a, f, g i h zawierają wyraźne smużki cDNA, podczas gdy ścieżki b, c, d i e są znacznie mniej wyraźne.
PCR specyficzny dla genu jest wykorzystywany jako wtórna metoda oceny jakości cDNA z pojedynczej komórki. cDNA przedstawione na Rysunku 3 wyizolowano z fluorescencyjnych komórek zwojowych siatkówki i przetestowano za pomocą starterów PCR dla markerów komórek zwojowych siatkówki Brn3b i Pax6. W tym badaniu 1 μl cDNA poddano 30 cyklom PCR. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym byłby preferowaną metodą, jednak może być on zbyt kosztowny i nie jest niezbędny do samej oceny jakości cDNA. Wszystkie 8 badanych pojedynczych komórek dało wynik dodatni dla Brn3b, a 6 z 8 dla Pax6 (Rysunek 3b). Nawet smugi cDNA o mniejszej intensywności wytworzyły prążki dla Brn3b i Pax6. Pomimo tych wyników PCR, z naszego doświadczenia wynika, że smugi cDNA, takie jak te w ścieżkach b, c, d i e, nie dają wyraźnych hybrydyzacji na macierzach Affymetrix i są zazwyczaj unikane. PCR specyficzny dla genu markera fotoreceptorów Crx został wykorzystany do określenia poziomu zanieczyszczeń w cDNA z pojedynczych komórek (Rysunek 3b). Wybrano marker fotoreceptorów, ponieważ komórki te stanowią większość siatkówki (~70%) i w związku z tym każda liza komórek, która wystąpiła, najprawdopodobniej dotyczyłaby fotoreceptorów pręcikowych. Nawet po 30 cyklach PCR w tych preparatach cDNA obecna była tylko niewielka ilość Crx. Wreszcie, ten screening oparty na PCR może być użyty do wstępnego określenia, z jakich podgrup danego typu komórek pochodziło cDNA, przed poddaniem ich pełnemu profilowaniu za pomocą mikromacierzy. Może to pomóc w ustaleniu priorytetów dla profilowanych komórek, ponieważ jest to najdroższy etap całego procesu. Na przykład zidentyfikowaliśmy podgrupy komórek zwojowych siatkówki, przesiewowo badając obecność genu Tachykinin1 (Rysunek 3b).
Na podstawie niewielkiego przesiewu metodą PCR wybrano konkretne pojedyncze komórki, a ich cDNAs zhybrydyzowano z macierzą Affymetrix. Dane z macierzy zostały porównane, a wzorce zidentyfikowane przy użyciu standardowych algorytmów klastrowania. W celu graficznego przedstawienia danych wygenerowano mapy ciepła (heatmaps), takie jak na Rysunku 4. W odniesieniu do danych z profilowania pojedynczych komórek na Rysunku 4 można wyciągnąć dwa główne wnioski. Po pierwsze, geny wykazujące ekspresję w konkretnych typach komórek występują niemal wyłącznie w tych typach po przeprowadzeniu protokołu dla pojedynczych komórek. W większości przypadków, gdy geny markerowe jednego typu komórek są znajdowane również w drugim typie — na przykład w obserwacji, że komórki bipolarne wykazują niższą ekspresję niektórych genów „pręcików” — ekspresja w drugim typie komórek jest łatwo potwierdzana za pomocą hybrydyzacji in situ lub barwienia przeciwciałami. Po drugie, w bardziej zróżnicowanych profilach komórek amacrynowych i zwojowych natychmiast widoczna jest heterogeniczność ekspresji genów. Pou4f1 jest wykazany jedynie w około 1/4 rozwijających się komórek zwojowych, natomiast Nr4a2 i Scube2 są dwoma przykładami genów o heterogenicznej ekspresji w różnych komórkach amacrynowych. W rzeczywistości geny przedstawione na mapie ciepła stanowią jedynie niewielką próbkę, ponieważ zidentyfikowano i potwierdzono kilkaset genów jako markery rozwijających się komórek zwojowych lub markery różnych populacji komórek amacrynowych2,4.
<img alt="Izolacja pojedynczych komórek z wyizolowanej siatkówki poprzez trawienie papainą, schemat z wynikami kontroli jakości." src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat metody profilowania pojedynczych komórek. Po pierwsze, siatkówki są izolowane i dysocjowane do pojedynczych komórek z użyciem papainy. Po drugie, pojedyncze komórki są pobierane za pomocą wyciągniętej szklanej igły i przenoszone do probówek PCR. Komórki są lizaowane, a cDNA amplifikowane poprzez odwrotną transkrypcję, a następnie reakcję PCR. Jakość otrzymanego cDNA jest oceniana na żelu agarozowym, takim jak ten przedstawiony na zdjęciu. Po drabinie DNA w pierwszej ścieżce, kolejne ścieżki pokazują rozmycia (smears) cDNA z pojedynczych komórek (oznaczone czerwonymi nawiasami), naprzemiennie z produktami amplifikacji z kontroli podłoża. Rozmycia o takiej jakości (czerwone nawiasy) są hybrydyzowane z mikromacierzy Affymetrix.
<img alt="Cewnik moczowy z igłą; zestaw sprzętu medycznego do drenażu moczu." src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zdjęcia igieł i zestawu rurki aspiracyjnej. Pojedyncze komórki są izolowane z wykorzystaniem działania kapilarnego wyciągniętej szklanej mikropipety (średnica wewnętrzna 0,5 mm, średnica zewnętrzna 1,04 mm) i przenoszone poprzez nadciśnienie powstające podczas wydmuchiwania powietrza do aspiratora. Ważne jest, aby rurka aspiracyjna była jednocześnie wystarczająco długa, by umożliwić łatwą manipulację, i wystarczająco krótka, by niezawodnie uwalniać pojedyncze komórki. Na obrazie B przedstawiono widok powiększony rurki kapilarnej wprowadzonej do igły.
<img alt="Wyniki elektroforezy PCR; prążki DNA, kontrola negatywna, ekspresja genów (Brn3b, Crx, Pax6, Tach)." src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny przykład rozmazań cDNA z pojedynczych komórek oraz specyficznych dla genów reakcji PCR. W celu oceny jakości cDNA z pojedynczych komórek po amplifikacji, 10 μl każdej próbki z pojedynczej komórki naniesiono na 1% żel agarozowy wraz z kontrolą negatywną (A). Pomiędzy 500-2000 bp powinna pojawić się rozmazana smuga. Dodatkowe przesiewowe badanie PCR w kierunku specyficznych genów może pomóc w identyfikacji/potwierdzeniu typu wyizolowanej komórki oraz stopnia zanieczyszczenia próbki (B). Aby potwierdzić tożsamość tych komórek, przetestowano startery specyficzne dla markerów komórek zwojowych siatkówki Brn3b oraz Pax6 (wiersze 1 i 2). W celu oceny poziomu zanieczyszczenia preparatu fotoreceptorami zastosowano startery specyficzne dla markera fotoreceptorów Crx (wiersz 3). Podgrupy komórek zwojowych można również zidentyfikować poprzez przesiewowe badanie markerów takich jak Tachykinin1 (wiersz 4).
<img alt="Mapa ciepła ekspresji genów w komórkach siatkówki; schemat aktywności genów w komórkach pręcikowych, bipolarnych, zwojowych i amakrynowych." src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Ekspresja genów markerowych w pojedynczych komórkach. Wyniki mikroarray dla wybranych genów wykazujących ekspresję w 22 odrębnych pojedynczych komórkach przedstawiono w formie mapy ciepła. Intensywność sygnałów z mikroarray została przeskalowana tak, aby odpowiadała intensywności koloru czerwonego. Kolor czarny oznacza brak sygnału w mikroarray. Przedstawione prekursory komórek zwojowych siatkówki (RGC) zostały wyizolowane z tkanek zarodkowych, natomiast pozostałe komórki wyizolowano z siatkówek osobników dorosłych.

<ol><li>Tietjen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+analysis+of+neuronal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.</a> Neuron. 38, 161-175 (2003).</li>
<li>Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+of+developing+retinal+ganglion+and+amacrine+cells+revealed+through+single+cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li>
<li>Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+preferentially+in+the+developing+peripheral+margin+of+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup.</a> Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).</li>
<li>Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+diversification+of+retinal+amacrine+interneurons+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li>
<li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li>
<li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159(2006).</li>
<li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).</li>
<li>Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+retinal+progenitor+cells+display+extensive+heterogeneity+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e1588(2008).</li>
<li>Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+problem+of+neuronal+cell+types%3A+a+physiological+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach.</a> Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).</li>
<li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity%3A+too+many+cell+types+for+comfort%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity: too many cell types for comfort.</a> Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).</li>
<li>Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+determination+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell fate determination in the vertebrate retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).</li>
<li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+markers+of+bipolar+cells+in+the+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina.</a> J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).</li>
<li>Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+noise+controls+lineage+choice+in+mammalian+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells.</a> Nature. 453, 544-547 (2008).</li>
<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+the+myth+of+the+average+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and the myth of the average cell.</a> Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confronting+complexity%3A+strategies+for+understanding+the+microcircuitry+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+mouse+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of mouse retinal development.</a> PLoS Biol. 2, e247(2004).</li>
<li>Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+gene+expression+program+of+mammalian+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).</li>
<li>Chowers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+preferentially+expressed+in+the+retina+using+a+custom+human+retina+cDNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).</li>
<li>Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-hit+model+of+cell+death+in+inherited+neuronal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations.</a> Nature. 406, 195-199 (2000).</li>
<li>McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+normally+incompatible+developmental+pathways+in+retinoblastoma+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis.</a> Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus%3A+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li>
<li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li>
<li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18(2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Coraz więcej badań wykazuje znaczną zmienność międzykomórkową w populacjach, które uważano za bardziej jednorodne pod względem ekspresji genów6,8. Przynajmniej w jednym przypadku wykazano, że ten „szum” ekspresji genów pełni istotną funkcję biologiczną13. Różnice w ekspresji genów między poszczególnymi komórkami są maskowane podczas stosowania tradycyjnych metod analizy całych tkanek. Eksperymenty te generują profil ekspresji „przeciętnej” komórki, która może nie być reprezentatywna14. Pr...

profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Wysoce wyspecjalizowane, lecz niezwykle nieliczne populacje komórek odgrywają istotne role w wielu tkankach. Identyfikacja markerów specyficznych dla danego typu komórek oraz programów ekspresji genów dla ekstremalnie rzadkich podzbiorów komórek stanowiła wyzwanie przy zastosowaniu standardowych metod analizy całych tkanek. Profilowanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach umożliwia bezprecedensowy dostęp do typów komórek stanowiących jedynie niewielki procent całkowitej masy tkanki1-7. Ponadto technika ta może być wykorzystywana do badania programów ekspresji genów, które są przejściowo wyrażane w niewielkiej liczbie komórek podczas dynamicznych przejść rozwojowych8.
Kwestia różnorodności komórkowej pojawia się wielokrotnie w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), gdzie połączenia neuronalne mogą zachodzić pomiędzy bardzo zróżnicowanymi komórkami9. Dokładna liczba odrębnych typów komórek nie jest precyzyjnie znana, lecz szacuje się, że w samej korze może istnieć nawet 1000 różnych typów10. Funkcje złożonych obwodów neuronalnych mogą zależeć od niektórych rzadkich typów neuronów oraz ekspresjonowanych przez nie genów. Dzięki identyfikacji nowych markerów i wsparciu w molekularnej klasyfikacji różnych neuronów, podejście jednokomórkowe jest szczególnie użyteczne w analizie typów komórek w układzie nerwowym. Może ono również pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów rozwoju neuronalnego poprzez identyfikację genów o różnym poziomie ekspresji oraz szlaków genowych podczas wczesnych etapów rozwoju progenitorów neuronalnych.
Siatkówka kręgowców, jako prosta i łatwo dostępna tkanka o znacznej różnorodności neuronalnej, stanowi doskonały system modelowy do badania procesów rozwoju komórkowego, różnicowania neuronalnego oraz dywersyfikacji neuronów. Jednakże, podobnie jak w innych częściach OUN, ta różnorodność komórkowa może stanowić problem przy określaniu ścieżek genetycznych, które prowadzą progenitory siatkówki do przyjęcia konkretnego losu komórkowego, szczególnie biorąc pod uwagę, że fotoreceptory pręcikowe stanowią większość całkowitej populacji komórek siatkówki11. Przedstawiamy tutaj metodę identyfikacji transkryptów ekspresjonowanych w pojedynczych komórkach siatkówki (Rycina 1). Technika profilowania pojedynczych komórek pozwala na ocenę stopnia heterogeniczności występującej w różnych populacjach komórkowych siatkówki2,4,5,12. Ponadto metoda ta ujawniła szereg nowych genów kandydackich, które mogą odgrywać rolę w procesach decydowania o losie komórek zachodzących w podgrupach komórek progenitorowych siatkówki8. Po wprowadzeniu kilku prostych modyfikacji w protokole, technika ta może być wykorzystana dla wielu różnych tkanek i typów komórek.

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Wysoce wyspecjalizowane, lecz niezwykle nieliczne populacje komórek odgrywają istotne role w wielu tkankach. Identyfikacja markerów specyficznych dla danego typu komórek i ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pojedynczych komórek do analizy transkryptomu w oparciu o mikromacierze. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie siatkówki z otaczających ją tkanek, a następnie rozbicie jej na pojedyncze komórki. Drugim krokiem jest zebranie pojedynczych komórek i umieszczenie ich w probówkach do PCR zawierających bufor lizujący.Następnie komórki poddaje się lizie, a cDNA jest amplyfikowane za pomocą odwrotnej transkrypcji, po której następuje reakcja łańcuchowa polimerazy. Ostatecznie wykorzystuje się hybrydyzację cDNA z pojedynczej komórki na mikromacierzy A iMatrix w celu wykrycia mRNA ekspresowanego w pojedynczej komórce. Główną zaletą profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach w porównaniu do podejść opartych na całej tkance jest fakt, że izolacja pojedynczych komórek umożliwia dostęp do bardzo małych populacji komórek, które stanowią część całej tkanki.Komórki te mogą być czymkolwiek – od różnych typów neuronów po niewielkie populacje komórek macierzystych. Technika pojedynczych komórek pozwala nam w odniesieniu do tych komórek zidentyfikować zarówno typy komórek, specyficzne markery dla tych małych populacji, jak i sieci genów eksp

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Poznaj metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki i amplifikacji cDNA do analizy transkryptomicznej. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej oraz identyfikację markerów genowych rzadkich populacji komórek nerwowych.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Przeglądaj więcej filmów