Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki
April 19th, 2012
Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki i późniejszej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek ujawnia stopień heterogeniczności komórkowej obecnej w tkance i odkrywa nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pojedynczych komórek do analizy transkryptomu opartej na mikromacierzy. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie siatkówki z otaczającej tkanki, a następnie dysocjację jej na pojedyncze komórki. Drugim krokiem jest pobranie pojedynczych komórek i umieszczenie ich w probówkach PCR zawierających bufor do lizy.
Następnie komórki są poddawane lizie, a CDNA jest amplifikowane za pomocą odwrotnej transkrypcji, po której następuje reakcja łańcuchowa polimerazy. Ostatecznie hybrydyzacja pojedynczej komórki CD NA na mikromacierzy A iMatrix służy do ujawnienia mRNA ulegających ekspresji w pojedynczej komórce. Główną zaletą profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach w porównaniu z wykorzystaniem metod obejmujących całe tkanki jest to, że izolacja pojedynczej komórki pozwala uzyskać dostęp do bardzo małych populacji komórek, które składałyby się na całą tkankę.
Komórki te mogą być dowolne, od różnych typów neuronów po małe populacje komórek macierzystych. To, co technika pojedynczej komórki pozwala nam zrobić dla tych komórek, to zidentyfikować oba typy komórek, specyficzne markery dla tych małych populacji komórek, oraz zidentyfikować sieci genów, które ulegają ekspresji w tych niezwykle rzadkich podzbiorach komórek. Dodatkowo, technika profilowania pojedynczych komórek pozwala nam zidentyfikować sieci genów, które ulegają przejściowej ekspresji podczas bardzo dynamicznych przemian rozwojowych w bardzo małych podzbiorach komórek.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki rozwojowej, takie jak to, kiedy komórki progenitorowe zaczynają wyrażać sieci genów związane z różnicowaniem i jak te komórki progenitorowe różnią się od siebie. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie komórkowe chorób neurodegeneracyjnych, takich jak jaskra, ponieważ poprzez wyjaśnienie kluczowych sieci w rozwoju poszczególnych komórek jesteśmy o krok bliżej do możliwości wygenerowania tych komórek do wykorzystania w komórkowej terapii zastępczej. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia siatkówki myszy w naczyniu wypełnionym PBS.
Następnie usuń ciało szkliste i soczewkę. Następnie usuń cały nabłonek barwnikowy siatkówki. Inkubuj siatkówkę w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie delikatnie postukaj w rurkę, aby usunąć wszelkie osiadłe komórki. Następnie delikatnie rozdrobnić go trzykrotnie, od 10 do 20 razy za pomocą pipetera P 1000. Jeśli utrzymują się duże grudki tkanki, inkubuj ją przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i ponownie wstaw do lodówki 10 do 20 razy.
Następnie dodaj pięć mikrolitrów DNA, jeden po 10 jednostek na mikrolitr do siatkówki i inkubuj ją przez pięć minut. W próbce w temperaturze pokojowej ponownie delikatnie natrzyj pipeter P 1000, a następnie ponownie 10 do 20 razy. Wirować z prędkością 3000 obr./min przez trzy minuty.
Następnie usuń supernatant i pozostaw na dnie od 100 do 200 mikrolitrów płynu. Postukaj w rurkę, aby usunąć granulkę. Następnie dodaj jeden mililitr HBSS i ponownie zawieś granulkę z delikatnym tacją.
Wirować z prędkością 3000 obr./min przez trzy minuty. Po zakończeniu ostrożnie usuń supernatant. Następnie zregeneruj, zawieś go w 450 mikrolitrach PBS zawierających 0,1% BSA w następnym kroku, przygotuj dwie sześciocentymetrowe naczynia zawierające pięć mililitrów PBS uzupełnionych 0,1% BSA.
Na następnej płytce zdysocjowane komórki na jednym naczyniu. Pozwól komórkom osiąść przez co najmniej pięć minut. Następnie umieść naczynie z dysocjowanymi komórkami pod odwróconym mikroskopem.
Użyj pipety z cienką końcówką z rurką aspiratora, aby pobrać pojedynczą komórkę. Następnie umieść mikropipetę blisko komórki, a z łatwością wejdzie do mikropipety poprzez działanie kapilarne. Następnie wyrzuć komórkę na drugą szalkę i upewnij się, że tylko jedna komórka została pobrana w celu profilowania ekspresji genów.
Odbywa się to poprzez usunięcie obcych komórek lub przeniesienie interesującej komórki w inne miejsce za pomocą nowej mikropipety. Gdy pojedyncza komórka jest całkowicie odizolowana od sąsiednich komórek, użyj nowej mikropipety, aby zassać komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Następnie wyrzuć go bezpośrednio do 0,2 mililitra probówki PCR zawierającej 4,5 mikrolitra buforu do lizy komórek.
Krótko odwirować próbkę w mikrowirówce, aby zanurzyć komórkę w buforze do lizy. Zrób to, obracając się po co piątej komórce, a następnie ponownie na końcu zbierania. Pamiętaj, aby trzymać probówkę na lodzie przez cały czas izolacji pojedynczej komórki i zebrać pojedyncze komórki w ciągu dwóch godzin po dysocjacji, aby uzyskać optymalne wyniki w tej procedurze, krótko odkręć próbkę w mikrowirówce, aby upewnić się, że pojedyncza komórka jest zanurzona w buforze do lizy komórek.
Aby przyspieszyć lizę komórek, inkubuj próbkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 90 sekund w termocyklerze. Następnie natychmiast umieść probówkę z powrotem na lodzie na dwie minuty. Aby wykonać odwrotną transkrypcję, dodaj 0,33 mikrolitra.
Indeks górny trzeci przy 200 jednostkach na mikrolitr, inhibitor 0,05 mikrolitra przy 40 jednostkach na mikrolitr i 0,07 mikrolitra. T cztery białko genu 32 do probówki. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 50 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza w termocyklerze po 50 minutach, dezaktywować enzym w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez kolejne 15 minut.
Kiedy to zrobisz, umieść rurkę z powrotem na lodzie. Aby usunąć wolny starter, dodaj 0,1 mikrolitra, 10 x bufor egzonukleazy, 0,8 mikrolitra, D, H2O i 0,1 mikrolitra. Egzonukleaza, jedna w ilości 20 jednostek na mikrolitr do probówki inkubowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w termocyklerze.
Po 30 minutach dezaktywuj enzym, inkubując mieszaninę reakcyjną w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 25 minut. Na koniec umieść probówkę z powrotem na lodzie. Następnie dodać sześć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej ogonów do próbki.
Inkubuj go w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodać 10 mikrolitrów próbki ogoniastej do mieszaniny reakcyjnej PCR. Wykonaj syntezę drugiej nici i amplifikację PCR, aby oznaczyć CDNA.
Aby uzyskać solidną hybrydyzację na mikromacierzach iMatrix, najpierw należy rozdrobnić CD NA, dodając od 10 do 20 mikrolitrów jednokomórkowego CD NA do ośmiu mikrolitrów, jeden x jeden dla wszystkich. Następnie dodaj jeden mikrolitr tego rozcieńczonego DNA do roztworu reakcyjnego o objętości 80 mikrolitrów. Następnie dodaj do niego 20 mikrolitrów, pięć XTDT, 2,5 mikrolitra biotyny oraz sześć D-D-A-T-P i jeden mikrolitr rozcieńczonego TDT.
Następnie dodaj do niego 20 mikrolitrów, pięć XTDT, 2,5 mikrolitra, biotynę oraz sześć D-D-A-T-P i jeden mikrolitr TDT. Inkubować mieszaninę przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie pięć minut w 65 stopniach Celsjusza.
Następnie przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast zhybrydyzuj do mikromacierzy iMatrix. Oto reprezentatywny przykład rozmazów CD NA dla pojedynczych komórek i linii PCR SPECYFICZNYCH DLA GENU: A-F-G-N-H zawierają silne rozmazy CD NA, podczas gdy linie B, C, D i E są znacznie mniej solidne. CDNA wyizolowano z fluorescencyjnych komórek zwojowych siatkówki, a następnie przetestowano przy użyciu starterów PCR specyficznych dla markerów komórek zwojowych siatkówki, BRN three B i PAC six, genu PCR specyficznego dla markera fotoreceptora.
CRX wykorzystano do określenia poziomu zanieczyszczenia w pojedynczej komórce. CDNA i podzbiory komórek zwojowych siatkówki zidentyfikowano poprzez badania przesiewowe na obecność genu tachy kinin one. Wyniki mikromacierzy dla wybranych genów ulegających ekspresji w 22 odrębnych pojedynczych komórkach są przedstawione w formacie mapy cieplnej.
Intensywność sygnałów z mikromacierzy została przeskalowana tak, aby odpowiadała intensywności koloru czerwonego, podczas gdy oznacza brak sygnału na mikromacierzy. Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak QPCR, aby potwierdzić wzorzec ekspresji genów widoczny w mikropromieniach. Wyniki hybrydyzacji C mogą być również wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji komórek, które wyrażają określone geny.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć całkiem niezłe pojęcie o tym, jak dysocjować siatkówki, izolować pojedyncze komórki i generować CDNA z tych pojedynczych komórek. Do hybrydyzacji na mikromacierzy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek siatkówki i wzmacniania ich cDNA do analizy transkryptomowej. Technika ta pozwala badaczom na zbadanie heterogeniczności komórkowej i identyfikację genów markerowych dla rzadkich populacji komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Genetyka
Tło
- Transkryptyka pojedynczych komórek dostarcza informacji o różnorodności komórkowej.
- Zrozumienie ekspresji genów w pojedynczych komórkach jest kluczowe dla genetyki rozwojowej.
- Ta metoda może ujawnić przemijające sieci genów podczas rozwoju.
- Ma zastosowanie w terapiach komórkowych w chorobach neurodegeneracyjnych.
Cel badania
- Izolować pojedyncze komórki siatkówki dla szczegółowego profilowania ekspresji genów.
- Identyfikować specyficzne markery dla małych populacji komórek.
- Wyjaśniać sieci genów zaangażowane w różnicowanie komórek.
Zastosowane metody
- Sekcja siatkówki i dysocjacja na pojedyncze komórki.
- Lizys komórek i amplifikacji cDNA za pomocą odwrotnej transkrypcji i PCR.
- Hybridyzacja na mikrosieciach do analizy ekspresji mRNA.
- Izolowanie pojedynczych komórek za pomocą pipety z ostrym końcem.
Główne wyniki
- Udane izolowane pojedynczych komórek siatkówki do analizy transkryptomowej.
- Identyfikacja profili ekspresji genów w rzadkich populacjach komórek.
- Wgląd w przemiany rozwojowe w określonych typach komórek.
- Potencjalne zastosowania w rozumieniu chorób neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Metoda zwiększa zrozumienie heterogeniczności komórkowej.
- Dostarcza ram dla badań nad ekspresją genów w małych populacjach komórek.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do postępów terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of retinal neurons enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and identify rare cell populations critical for CNS target validation. This approach enhances predictive confidence in early discovery by revealing gene networks and markers that are masked in bulk tissue analyses. The method supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying developmental transitions and cell fate determinants relevant to neurodegenerative disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables identification of cell-type specific markers in rare neuronal subsets for functional target validation.
- Reveals gene expression programs active during transient developmental transitions, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates molecular classification of neuronal cell types, improving predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell gene expression profiles for downstream assay development and screening workflows.
- Supports assay reproducibility by enabling quantitative measurement of mRNA expression in individual cells.
- Allows for the detection of contamination and specificity through gene-specific PCR validation of isolated cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by elucidating gene networks implicated in neurodegenerative disease models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by mapping developmental gene expression trajectories.
- Supports identification of candidate genes for cellular therapy development in CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell profiling method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging hypothesis-driven target validation with translational biomarker identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving heterogeneity and clarifying gene networks in rare cell types.
- Screening: Delivers quantitative, cell-specific gene expression data for assay standardization and reproducibility.
- Analytics: Provides microarray and PCR-based readouts to compare gene expression across individual cells and conditions.
- Translational Research: Enables mapping of developmental gene expression relevant to disease modeling and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for profiling diverse tissues and cell types across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and transcriptomic analysis for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying cell fate determinants and gene networks in rare populations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and candidate genes for neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell isolation, microarray analysis, and quantitative PCR.
- Demands access to specialized instrumentation for cell handling and transcriptomic profiling.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Protocol is adaptable to various tissues but may require optimization for different cell types or developmental stages.
- Potential limitations include technical variability in cell capture and amplification efficiency.
