Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pojedynczych komórek do analizy transkryptomu w oparciu o mikromacierze. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie siatkówki z otaczających ją tkanek, a następnie rozbicie jej na pojedyncze komórki. Drugim krokiem jest zebranie pojedynczych komórek i umieszczenie ich w probówkach do PCR zawierających bufor lizujący.

Następnie komórki poddaje się lizie, a cDNA jest amplyfikowane za pomocą odwrotnej transkrypcji, po której następuje reakcja łańcuchowa polimerazy. Ostatecznie wykorzystuje się hybrydyzację cDNA z pojedynczej komórki na mikromacierzy A iMatrix w celu wykrycia mRNA ekspresowanego w pojedynczej komórce. Główną zaletą profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach w porównaniu do podejść opartych na całej tkance jest fakt, że izolacja pojedynczych komórek umożliwia dostęp do bardzo małych populacji komórek, które stanowią część całej tkanki.

Komórki te mogą być czymkolwiek – od różnych typów neuronów po niewielkie populacje komórek macierzystych. Technika pojedynczych komórek pozwala nam w odniesieniu do tych komórek zidentyfikować zarówno typy komórek, specyficzne markery dla tych małych populacji, jak i sieci genów ekspresjonowanych w tych niezwykle rzadkich podzbiorach komórek. Dodatkowo technika profilowania pojedynczych komórek umożliwia nam identyfikację sieci genów, które są przejściowo ekspresjonowane podczas bardzo dynamicznych przejść rozwojowych w bardzo małych podzbiorach komórek.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki rozwoju, takie jak moment, w którym komórki progenitorowe zaczynają ekspresować sieci genowe związane z różnicowaniem oraz sposób, w jaki komórki te różnią się od siebie. Zastosowania tej techniki obejmują terapie komórkowe chorób neurodegeneracyjnych, takich jak jaskra, ponieważ dzięki wyjaśnieniu kluczowych sieci w rozwoju poszczególnych komórek jesteśmy o krok bliżej możliwości generowania tych komórek do wykorzystania w terapii zastępczej. Rozpocznij procedurę, umieszczając siatkówkę myszy w naczyniu wypełnionym PBS.

Następnie usuń ciało szkliste oraz soczewkę. Potem usuń cały nabłonek pigmentowy siatkówki. Inkubuj siatkówkę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w temperaturze 37 °C przez 10 minut.

Następnie delikatnie ostukaj probówkę, aby rozbić osad komórek. Potem ostrożnie pipetuj zawartość od 10 do 20 razy za pomocą pipety P 1000. Jeśli nadal obecne są duże grudki tkanki, inkubuj je przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C i ponownie pipetuj od 10 do 20 razy.

Następnie do probówki dodaj 5 µL DNA w stężeniu 10 j./µL i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie delikatnie wymieszaj zawartość pipetą P 1000, pipetując 10–20 razy. Odwiruj w wirówce z prędkością 3000 RPM przez 3 minuty.

Następnie usunąć supernatant, pozostawiając na dnie od 100 do 200 µL płynu. Opukać probówkę, aby oderwać osad. Następnie dodać 1 mL HBSS i resuspender osad poprzez delikatne mieszanie.

Wiruj próbkę przy 3000 RPM przez trzy minuty. Po zakończeniu procesu ostrożnie usuń supernatant. Następnie resuspenduj osad w 450 µL PBS zawierającego 0,1% BSA; w kolejnym kroku przygotuj dwie sześciocentymetrowe płytki zawierające 5 mL PBS uzupełnionego o 0,1% BSA.

Następnie wysiej zdysocjowane komórki na jedną szalkę. Pozostaw komórki do osadzenia się na co najmniej pięć minut. Po tym czasie umieść szalkę ze zdysocjowanymi komórkami pod mikroskopem odwróconym.

Użyć pipety z cienką końcówką z rurką aspiracyjną, aby pobrać pojedynczą komórkę. Następnie umieścić mikro pipetę blisko komórki, dzięki czemu zostanie ona wciągnięta do mikro pipety wskutek działania kapilarnego. Następnie wydmuchnąć komórkę na drugą szalkę i upewnić się, że do profilowania ekspresji genów pobrano tylko jedną komórkę.

Przeprowadza się to poprzez usunięcie zbędnych komórek lub przeniesienie interesującej nas komórki w inne miejsce za pomocą nowej mikropipety. Gdy pojedyncza komórka zostanie całkowicie odizolowana od komórek sąsiednich, należy użyć nowej mikropipety, aby ją odessać. Następnie należy ją wprowadzić bezpośrednio do 0,2 ml probówki do PCR zawierającej 4,5 µL buforu do lizy komórek.

Krótko wiruj próbkę w mikrowirówce, aby komórka została zanurzona w buforze do lizy. Wykonuj wirowanie po każdej piątej komórce, a następnie ponownie po zakończeniu procesu zbierania. Pamiętaj, aby przez cały czas izolacji pojedynczych komórek trzymać probówkę na lodzie i zebrać pojedyncze komórki w ciągu dwóch godzin po dysocjacji, aby uzyskać optymalne wyniki w tej procedurze; krótko wiruj próbkę w mikrowirówce, aby upewnić się, że pojedyncza komórka jest zanurzona w buforze do lizy komórek.

Aby wspomóc lizę komórek, inkubuj próbkę w temperaturze 70 °C przez 90 sekund w termocyklerze. Następnie natychmiast umieść probówkę z powrotem w lodzie na dwie minuty. Aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, dodaj 0,33 µL.

Superscript three w stężeniu 200 units per microliter, 0,05 microliters inhibitora w stężeniu 40 units per microliter oraz 0,07 microliters T four gene 32 protein do probówki. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 50 minutes w temperaturze 50 degrees Celsius w termocyklerze; po 50 minutes inaktywować enzym w temperaturze 70 degrees Celsius przez kolejne 15 minutes.

Po wykonaniu tej czynności należy ponownie umieścić probówkę w lodzie. Aby usunąć wolny primer, do probówki należy dodać 0,1 µL 10x buforu do egzonukleazy, 0,8 µL H₂O oraz 0,1 µL egzonukleazy One o stężeniu 20 jednostek na µL, a następnie inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Po 30 minutach należy inaktywować enzym, inkubując mieszaninę reakcyjną w temperaturze 80 °C przez 25 minut. Na koniec należy ponownie umieścić probówkę w lodzie. Następnie do próbki należy dodać 6 µL mieszaniny reakcyjnej do dobudowy ogona.

Inkubować w termocyklerze w temperaturze 37°C przez 20 minut, w 70°C przez 10 minut, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C. Następnie dodać 10 µL próbki z ogonem do mieszaniny reakcyjnej PCR. Przeprowadzić syntezę drugiej nici oraz amplifikację PCR w celu znakowania cDNA.

Aby uzyskać stabilną hybrydyzację na mikromacierzach iMatrix, najpierw należy poddać fragmentacji CD NA, dodając 10 do 20 µL CD NA z pojedynczej komórki do 8 µL buforu 1x 1-for-all. Następnie dodaj 1 µL tak rozcieńczonego DNA do 80 µL roztworu reakcyjnego. Dalej dodaj do niego 20 µL buforu 5x TDT, 2,5 µL biotynowanego dGTP oraz 1 µL rozcieńczonego TDT.

Następnie dodać do niej 20 µL buforu XTDT, 2,5 µL biotyny i 6 dDATP oraz 1 µL TDT. Mieszaninę inkubować przez 90 min w temperaturze 37 °C, a następnie przez 5 min w temperaturze 65 °C.

Następnie przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast przeprowadzić hybrydyzację z matrycą a iMatrix. Oto reprezentatywny przykład rozmazów cDNA z pojedynczych komórek oraz PCR specyficznych dla genów: ścieżki A-F-G-N-H zawierają wyraźne rozmazy cDNA, podczas gdy ścieżki B, C, D i E są znacznie słabsze. cDNA wyizolowano z fluorescencyjnych komórek zwojowych siatkówki, a następnie przetestowano przy użyciu starterów PCR specyficznych dla markerów komórek zwojowych siatkówki, BRN3B i PAX6, oraz PCR specyficznego dla genu markera fotoreceptorów.

Do określenia poziomu kontaminacji w pojedynczej komórce wykorzystano CRX. cDNA oraz podgrupy komórek zwojowych siatkówki zidentyfikowano poprzez przesiewowe badanie obecności genu tachykininy 1. Wyniki mikromacierzy dla wybranych genów ekspresowanych w 22 oddzielnych pojedynczych komórkach przedstawiono w formie mapy ciepła.

Intensywności sygnałów z mikromacierzy zostały przeskalowane tak, aby odpowiadały intensywności koloru czerwonego, natomiast kolor czarny oznacza brak sygnału na mikromacierzy. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać dodatkowe metody, takie jak QPCR, aby potwierdzić wzorzec ekspresji genów zaobserwowany w mikromacierzy. Wyniki hybrydyzacji w C mogą również służyć do odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji komórek wykazujących ekspresję konkretnych genów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dość dobre pojęcie o tym, jak dysocjować siatkówki, izolować pojedyncze komórki oraz generować cDNA z tych pojedynczych komórek do hybrydyzacji na mikromacierzy.