Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą ECIS/Taxis

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar chemotaksji w zautomatyzowanym teście w czasie rzeczywistym, który wykorzystuje wykrywanie impedancji substratu ogniwa elektrycznego lub EIS. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie elektrod axxis poprzez wypełnienie każdej komory 0,5%agros w kompletnym medium RPMI. Następnym krokiem jest jednoczesne wycięcie dwóch studzienek w agros każdej komory za pomocą przyrządu do kaniuli o rozmiarze 14 i odessanie dwóch zatyczek agros w każdej komorze.

Jedna studzienka jest wypełniona zawiesiną jednokomórkową, podczas gdy druga jest wypełniona atraktantem chemioterapii. Następnie elektroda jest podłączana do systemu theta ISIS poprzez uchwyt matrycy, który umieszcza się w inkubatorze nastawionym na parametry atmosferyczne odpowiednie dla badanego typu ogniwa. Ostatecznie chemotaksję komórkową można zaobserwować poprzez pomiar zmiany rezystancji w czasie rzeczywistym, gdy komórki docierają do elektrody docelowej między dwoma studzienkami.

Główną przewagą testu axxis nad istniejącymi metodami, takimi jak test komorowy Boydena lub konwencjonalny mikroskop oparty na testach agros, jest to, że pozwala on na automatyczne pomiary chemotaksji w czasie rzeczywistym bez konieczności ciągłej manipulacji systemem. Aby rozpocząć przygotowanie elektrody, ustabilizuj złotą powierzchnię matrycy elektrod ISIS Texas poprzez wstępne potraktowanie sterylną 10-milimolową cysteiną w dejonizowanej wodzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach. Po obróbce wstępnej odessać roztwór cystyny z każdej komory elektrody.

Spłucz trzykrotnie sterylną wodą dejonizowaną i zastąp 250 mikrolitrami kompletnego podłoża. Następnie podłącz zestaw elektrod do styków w uchwycie tablicy przyrządów, aby przeprowadzić kontrolę elektrody. Komory, które są prawidłowo podłączone, zostaną podświetlone na zielono na ekranie komputera.

Jeśli komory są podświetlone na czerwono, nie są połączone, a elektroda powinna zostać przemieszczona w uchwycie matrycy, aby ustanowić styki dla wszystkich komór. Po podłączeniu wszystkich komór kliknij przycisk wyboru w sterowniku oprogramowania ISYS Theta, aby określić początkowe wartości rezystancji i pojemności dla każdej komory, wartości rezystancji powinny wynosić od 1600 do 2000 omów, a wartości pojemności powinny wynosić od pięciu do sześciu nanosów dla układu ośmiokomorowego. Jeśli pojedyncza komora nie mieści się w tych dopuszczalnych parametrach, nie powinna być wykorzystywana do zbierania danych.

Następnie odłącz elektrodę od uchwytu matrycy, aby przygotować poszczególne komory aros. Odessać pożywkę z komór i umyć każdą komorę trzykrotnie sterylną wodą dejonizowaną. Aby rozpocząć konfigurację komór aros, przygotuj roztwór aros zawierający pożywkę RPMI, jak omówiono w pisemnym protokole.

Odpipetować 300 mikrolitrów stopionej pożywki aros do każdej komory, pozostałe agros odpipetować do nakrętki 15-mililitrowej probówki. Aby ocenić działanie agresu, załóż osłonę matrycy ISIS axxis i pozostaw do zżelowania w temperaturze pokojowej, aby zbudować kaniulę wielokrotnego użytku. Dobrze narzędzie tnące ostrzy dwie kaniule z końcem o grubości 14 mm.

Używając pięciu 64-calowych wierteł, obróć końcówkę wiertła w każdym otworze kaniuli za pomocą wiertła o niskiej prędkości, upewniając się, że wiertło przecina całą wewnętrzną krawędź każdego otworu kaniuli. Aby utworzyć ostrą krawędź tnącą, wywierć dwa otwory przez pleksi za pomocą pięciu 64-calowych wierteł. Za pomocą wiertarki włóż każdą zaostrzoną kaniulę o rozmiarze 14 do jednego z otworów tak, aby każda z nich wystawała w równej odległości od pleksi.

Wysterylizuj narzędzie do kaniuli o rozmiarze 14, lekko podpalając końcówki kaniuli przed wycięciem studzienek w komorze EIS. Schłodzić kaniulę, dotykając agros w nasadce 15-mililitrowej tubki. Jeśli temperatura kaniuli nie zostanie schłodzona, aros stopi się podczas cięcia studzienek komory, co spowoduje zniekształcenie i uszkodzenie studzienek.

Cięcie studni bez naruszania integralności agros jest najtrudniejszym aspektem tej procedury. Wymaga to starannego ustawienia kaniuli i bardzo niskiego podciśnienia. Ustaw parę kaniul nad dwiema złotymi kropkami otaczającymi elektrodę docelową w każdej komorze.

Włożyć kaniulę pionowo, bez zatrzymywania się w poziomie po delikatnym kontakcie kaniuli z powierzchnią elektrody. Ostrożnie wyjmij kaniulę ponownie bez żadnych ruchów poziomych za pomocą sterylnej pięciocalowej pipety pastwiskowej podłączonej do niskiego podciśnienia z pułapką próżniową. Aby złapać odpady agros, delikatnie zassaj korki aros pozostawione przez narzędzie do kaniuli.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów kompletnego podłoża RPMI do powierzchni każdej komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby nasycić aros. Po dwóch minutach delikatnie zassaj pożywkę z powierzchni i studzienek, nie naruszając aros. Każda studzienka jest w stanie pomieścić objętość siedmiu mikrolitrów do jednego dołka w każdej komorze i siedem mikrolitrów zawiesiny komórek.

W tej demonstracji limfocyty T jca są używane dwa razy od 10 do siedmiu komórek na mililitr. Następnie załaduj siedem mikrolitrów atraktantu chemioterapii do drugiej studzienki komór. W przypadku limfocytów T JCA 200 nanogramów na mililitr sdf jedna alfa rozcieńczona w niekompletnym.

RPMI jest stosowany jako atraktant chemioterapii dla ujemnego obciążenia kontrolnego. Siedem mikrolitrów kompletnej pożywki tylko do drugiego dołka. Po załadowaniu studzienek obejrzyj każdą komorę matrycy za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że wszystkie studzienki zostały prawidłowo wycięte i wypełnione.

Komórki powinny znajdować się w granicach studzienek. Jeśli komórki są widoczne w obu studzienkach lub rozprzestrzeniają się poza granicę studzienki komórkowej, wówczas pod aros tworzy się szczelina. Należy pamiętać, że nieprawidłowo ustawione studnie nie mogą być wiarygodnie zinterpretowane dane z tych komór.

Aby rozpocząć zbieranie danych, umieść elektrodę w uchwycie matrycy. Podłącz ponownie złote pady na matrycy elektrod do sprężynowych pinów pogo uchwytu skonfigurowanego w oprogramowaniu theta ISIS. Studnie, które są prawidłowo podłączone, zostaną podświetlone na zielono.

Jeśli studzienki są czerwone, nie są połączone, a elektroda powinna zostać przemieszczona w uchwycie macierzy z menu rozwijanego. W panelu oprogramowania wybierz osiem W, jeden średnik. Wskazuje to konfigurację macierzy. Osiem.

Cóż, jedna elektroda w panelu sterowania oprogramowania wybierz sprawdź, aby określić początkowe wartości rezystancji i pojemności. Dla każdego z nich dobrze wybierz wiele częstotliwości, aby zmierzyć rezystancję przy kilku częstotliwościach. Zbieranie danych o wielu częstotliwościach pozwala na analizę pojemności, impedancji i rezystancji.

Istnieje możliwość dostosowania częstotliwości lub użycia zestawu zalecanych częstotliwości. Standardowe ustawienia akwizycji wielu częstotliwości będą rejestrować dane na 11 wstępnie ustawionych częstotliwościach z szybkością ośmiu dołków na minutę. Przedział czasowy między pomiarami można również dostosować.

Całkowity czas trwania eksperymentu można ustawić w panelu po prawej stronie. Alternatywnie eksperyment można zatrzymać ręcznie, klikając przycisk Zakończ. Gdy ogniwa wytworzą rezystancję, która wskazuje na dotarcie do elektrody, kliknij start, aby rozpocząć zbieranie danych.

Chociaż dane można wyeksportować do programu Excel, oprogramowanie EISs 1600 R, które towarzyszy systemowi theta EIS, jest najbardziej wydajną metodą analizy danych podatkowych EIS. Pasek narzędzi analizy danych oprogramowania zawiera przyciski radiowe Z, R i C. Określają one, czy rezystancja impedancji lub pojemność są wykreślane odpowiednio na osi pionowej w stosunku do osi X, która jest czasem, który upłynął. Dane podatkowe EISs są najefektywniej wyświetlane jako opór w czasie przy 4 000 herców.

Gwałtowne wahania rezystancji lub mikrostany przejściowe są dowodem na ruch komórek nad elektrodą, kompilację lub zginanie punktów danych tak, że nie wszystkie punkty są przeszczepione, nie jest zalecane dla osi esys, ponieważ uśredni mikrostan przejściowy z danych. Po utworzeniu wykresu. Dzięki oprogramowaniu ISIS 1600 R można go wyeksportować, wybierając opcję eksportuj wykres z menu plik i zapisać jako plik lub plik JPEG.

Ludzkie limfocyty T CAT szarpnięte wystawiono na działanie gradientu SDF jeden alfa w celu stymulacji ruchu lub na RPMI 1640 jako kontrolę negatywną. Znormalizowana rezystancja na poziomie 4 000 Hz została tutaj przeszczepiona. Chemotaksja komórkowa jest wskazywana przez wzrost oporności przy 4 000 herców, gdy ludzkie limfocyty T J CAT poruszają się w odpowiedzi na SDF jeden alfa.

Pojawienie się ogniw na elektrodzie docelowej jest sygnalizowane pojawieniem się gwałtownych wahań rezystancji zwanych mikrostanami nieustalonymi. Wzrost rezystancji jest wprost proporcjonalny do liczby ogniw, które przechodzą przez elektrodę. Na wynik ujemny wskazuje stabilna rezystancja lub niewielki spadek rezystancji przy 4 000 herców.

Obserwuje się to, gdy ogniwa były wystawione na działanie RPMI 1640. Brak mikrostanu przejściowego jest również oznaką braku ruchu komórki na elektrodzie. Oprócz tej podstawowej procedury można wprowadzić inne modyfikacje, aby wykorzystać Esys w Teksasie do monitorowania ruchu komórek w obecności przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla atraktantu chemioterapii, modyfikatorów farmaceutycznych lub toksyn.