Name: Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą ECIS/Taxis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Naucz się mierzyć chemotaksję komórkową w czasie rzeczywistym za pomocą systemu ECIS/Taxis z wykorzystaniem impedancji elektrycznej. Ta zautomatyzowana metoda pozwala precyzyjnie obserwować migrację komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (ES07408 i EB00208).

1. Przygotowanie elektrod ECIS/Taxis
<ol>
 <li>Złotą powierzchnię matrycy elektrod ECIS/taxis (składającej się z 8 komór na slajd) stabilizuje się wstępnie poprzez inkubację ze sterylną 10 mM cysteiną w wodzie dejonizowanej (dH2O) przez 15 min w temperaturze pokojowej w warunkach sterylnych.</li>
 <li>Odsysa się roztwór cysteiny z każdej komory elektrod i płucze ją 3 razy sterylną dH2</li><li><li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol><ol><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li></li><li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li></ol><ol><li><li><li></li><li></ol><img alt="Wykres znormalizowanej rezystancji w funkcji czasu; przedstawia wpływ RPMI 1640 i SDF1a na zachowanie komórek." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> <img alt="Schemat chipa mikroprzepływowego; kanały, wloty do analiz lab-on-chip, sortowania komórek lub diagnostyki." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> <img alt="Schemat chemotaksji z migracją komórek, szerokość 2mm, studzienki z chemoatraktantem i komórkami, elektroda docelowa." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> <img alt="Proces wiercenia w celu umieszczenia elektrody docelowej; schemat pokazuje odstęp 4,08mm dla konfiguracji elektrod." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> <img alt="Schemat konstrukcji elektrody z elektrodą docelową, złote punkty do analizy przewodnictwa elektrycznego." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5">

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li>
<li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li>
<li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li>
<li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li>
<li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis%3A+an+evaluation+of+the+cortical+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li>
<li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li>
<li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells%3A+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li>
<li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li>
<li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li>
</ol>

David A Knecht i Michael A Lynes posiadają wydany patent na technologię ECIS/Taxis, która została licencjonowana przez University of Connecticut firmie Applied Biophysics, Inc.

Nowatorskie cechy testu ECIS/Taxis obejmują możliwość zautomatyzowanego gromadzenia danych w czasie rzeczywistym podczas reakcji komórek na chemoatraktant. Chociaż najpowszechniejszym zastosowaniem tej technologii jest pomiar odpowiedzi komórkowych na pojedyncze gradienty chemotaktyczne lub gradienty składające się z mieszanin agonistów i antagonistów chemotaksji, podejście ECIS/Taxis dopuszcza również modyfikacje tych konfiguracji, które mogą być bardzo pomocne w ocenie responsywności komórkowej. Istnieją przekonujące d...

<table><tbody><tr><td>ECIS Z&amp;#952;</td><td>Applied Biophysics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Macierz elektrod ECIS</td><td>Applied Biophysics</td><td>8W Chemotaxis</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biophysics.com/cultureware.php">www.biophysics.com/cultureware.php&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Agaroza Seakem GTG</td><td>BioWhittaker</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca HyClone</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300703</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td>Penicylina 5,000 IU/ml; Streptomycyna 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>1688449</td><td>roztwór 1M, stopień do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kanula ze stali nierdzewnej 14 Gauge (2) 4 cale</td><td>General Supply</td><td>5-8365-1</td><td>tępy koniec</td></tr></tbody></table>

pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ecis/taxis

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Ruch komórek w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne jest fundamentalny dla wielu procesów komórkowych, w tym dla gojenia ran, stanu zapalnego oraz odpowiedzi na infekcję. Powszechną metodą pomiaru chemotaksji jest test z wykorzystaniem komory Boydena, w której komórki i chemoatraktant są oddzielone porowatą membraną. W miarę jak komórki migrują przez membranę w kierunku chemoatraktanta, przywierają one do jej dolnej strony lub opadają do znajdującego się poniżej medium, a następnie zostają zabarwione i przeliczone wizualnie 1. W tej metodzie komórki są wystawione na działanie gwałtownego i przejściowego gradientu chemoatraktanta, co uważa się za słabe odwzorowanie gradientów występujących w tkankach 2.
Inny system analizy, test chemotaksji pod agarozą, 3, 4 mierzy ruch komórek po stałym podłożu w cienkim filmie wodnym, który tworzy się pod warstwą agarozy. Gradient powstający w agarozie jest łagodny i uważa się go za odpowiednią reprezentację gradientów występujących naturalnie. Chemotaksję można ocenić poprzez obrazowanie mikroskopowe przebytej odległości. Zarówno test z komorą Boydena, jak i test pod agarozą są zazwyczaj konfigurowane jako analizy punktu końcowego.
Zautomatyzowany system ECIS/Taxis łączy podejście z zastosowaniem warstwy agarozy z elektrycznym pomiarem impedancji między komórkami a podłożem (ECIS) 5, 6. W tym teście elektrody docelowe znajdują się w każdej z 8 komór. Duża elektroda pomocnicza przebiega przez każdą z 8 komór (Ryc. 2). Każda komora jest wypełniona agarozą, a w niej, po obu stronach elektrody docelowej, wycięto dwa małe otwory. Jeden otwór wypełnia się badaną populacją komórek, natomiast w drugim umieszcza się źródła dyfundującego chemoatraktanta (Ryc. 3). Prąd przepływający przez system pozwala określić zmianę rezystancji, która następuje w momencie, gdy komórki przechodzą nad elektrodą docelową. Komórki znajdujące się na elektrodzie docelowej zwiększają rezystancję systemu 6. Ponadto gwałtowne wahania rezystancji odzwierciedlają zmiany w oddziaływaniach komórek z powierzchnią elektrody i wskazują na zachodzące zmiany kształtu komórek. System ECIS/Taxis umożliwia pomiar ruchu populacji komórek w czasie rzeczywistym przez dłuższe okresy, a jednocześnie jest na tyle czuły, że pozwala wykryć dotarcie pojedynczej komórki do elektrody docelowej.
Dictyostelium discoidium wykazuje zdolność do migracji w obecności gradientu folianów 7, 8, a jego odpowiedź chemotaktyczną można precyzyjnie zmierzyć za pomocą ECIS/Taxis 9. Za pomocą ECIS/Taxis mierzono również chemotaksję leukocytów w odpowiedzi na SDF1α oraz na antagonisty chemotaksji 10, 11. Przykład odpowiedzi leukocytów na SDF1α przedstawiono na Rysunku 1.

System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Ruch komórkowy w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne jest kluczowy dla wielu procesów komórkowych, w tym dla gojenia ran, stanu zapalnego oraz odpowiedzi na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar chemotaksji w zautomatyzowanym teście w czasie rzeczywistym, wykorzystującym elektryczną pomiar impedancji podłoża komórkowego, czyli EIS. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie elektrod axxis poprzez wypełnienie każdej komory 0,5% agros w pełnej pożywce RPMI. Kolejnym krokiem jest jednoczesne wycięcie dwóch otworów w agros w każdej komorze za pomocą kaniuli o rozmiarze 14G oraz odessanie dwóch korków z agros z każdej komory.Jedną z dołków wypełnia się zawiesiną pojedynczych komórek, a drugą chemoatraktantem. Następnie elektrodę podłącza się do systemu ISIS theta za pomocą uchwytu matrycy, który umieszcza się w inkubatorze z parametrami atmosferycznymi dostosowanymi do badanego typu komórek. Ostatecznie chemotaksję komórkową można obserwować poprzez pomiar zmiany rezystancji w czasie rzeczywistym, gdy komórki docierają do elektrody docelowej znajdującej się pomiędzy dwoma dołkami.Główną zaletą testu axxis w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test w komorze Boydena czy konwencjonalne testy podagaroze oparte na mikroskopii, jest możliwość automatycznego pomiaru chemotaksji w czasie rzeczywistym bez konieczności ciągłej manipulacji systemem. Aby rozpocząć przygotowanie elektrod, należy ustabilizować złotą powierzchnię macierzy elektrod ISIS Texas poprzez wstępne potraktowanie sterylnym roztworem cysteiny o stężeniu 10 mM w wodzie dejonizowanej przez 15 minut w temperaturze pokojowej w warunkach sterylnych. Po wstępnej obróbce należy odessać roztwór cysteiny z każdej komory elektrody.Przepłucz trzy razy sterylną wodą dejonizowaną i zastąp ją 250 µL pożywki kompletnej. Następnie podłącz macierz elektrod do pinów kontaktowych w uchwycie macierzy instrumentu, aby przeprowadzić kontrolę elektrod. Komory podłączone prawidłowo zostaną podświetlone na zielono na ekranie komputera.Jeśli komory są podświetlone na czerwono, oznacza to, że nie są one połączone i elektrodę należy ponownie ustawić w uchwycie matrycy, aby ustanowić połączenia dla wszystkich komór. Gdy wszystkie komory zostaną połączone, należy kliknąć przycisk sprawdzania w kontrolerze oprogramowania ISYS Theta, aby określić początkowe wartości rezystancji i pojemności dla każdej komory; w przypadku matrycy ośmiokomorowej wartości rezystancji powinny mieścić się w zakresie od 1600 do 2000 ohmów, a wartości pojemności od pięciu do sześciu nanosów. Jeśli pojedyncza komora nie mieści się w tych dopuszczalnych parametrach, nie powinna być ona wykorzystywana do gromadzenia danych.Następnie odłącz elektrodę od uchwytu macierzy, aby przygotować poszczególne komory aros. Odssij medium z komór i przemyj każdą z nich trzykrotnie sterylną wodą dejonizowaną. Aby rozpocząć konfigurację komór aros, przygotuj roztwór aros zawierający medium RPMI, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Pipetuj 300 µL roztopionego medium agros do każdej komory, a pozostałe medium agros pipetuj do zakrętki probówki o pojemności 15 mL. Aby ocenić żelowanie agros, załóż pokrywkę matrycy ISIS axxis i pozostaw do zżelowania w temperaturze pokojowej w celu utworzenia wielokrotnego użytku kaniuli. Narzędzie do wycinania dołków naostrzyło dwie kaniule tępokoniec o rozmiarze 14G.Używając wiertła o średnicy 5/64 cala, należy obrócić końcówkę wiertła w każdym otworze kaniuli za pomocą wiertarki pracującej z niską prędkością, upewniając się, że wiertło nacięło całą wewnętrzną krawędź każdego otworu kaniuli. Aby stworzyć ostrą krawędź tnącą, należy wywiercić dwa otwory w pleksiglasie wiertłem o średnicy 5/64 cala. Używając wiertarki stołowej, należy włożyć każdą zaostrzoną kaniulę o rozmiarze 14G do jednego z otworów w taki sposób, aby każda z nich wystawała z pleksiglasu na taką samą odległość.Sterylizuj narzędzie z kaniulą o rozmiarze 14 G, lekko opalając końcówki kaniuli przed wycinaniem otworów w komorze EIS. Schłodź kaniulę, dotykając agrosu w zakrętce probówki o pojemności 15 ml. Jeśli kaniula nie zostanie schłodzona, agros stopi się podczas wycinania otworów w komorze, co spowoduje ich zniekształcenie i powstanie wad.Wycinanie otworów bez naruszenia integralności agros jest najtrudniejszym elementem tej procedury. Wymaga to precyzyjnego ustawienia kaniuli oraz bardzo niskiego ciśnienia próżniowego. Ustaw parę kaniuli nad dwiema złotymi kropkami otaczającymi docelową elektrodę w każdej komorze.Wprowadź kaniulę pionowo, bez żadnych ruchów poziomych, zatrzymując ją w momencie delikatnego kontaktu kaniuli z powierzchnią elektrody. Ostrożnie wyjmij kaniulę, ponownie unikając ruchów poziomych, używając sterylnej pięciocalowej pipety Pasteura podłączonej do niskiego podciśnienia z pułapką próżniową. Aby usunąć odpady agros, delikatnie odessać korki aros pozostawione przez narzędzie kaniulowe.Następnie dodaj 300 µL kompletnego medium RPMI na powierzchnię każdej komory w temperaturze 37 °C przez dwie minuty, aby nasycić arosy. Po dwóch minutach delikatnie odessij medium z powierzchni i z otworów, nie naruszając arosów. Każdy otwór może pomieścić objętość 7 µL w jednym otworze w każdej komorze oraz 7 µL zawiesiny komórkowej.W tej demonstracji komórki jca T są wykorzystywane w stężeniu 2×10⁷ komórek/ml. Następnie należy nanieść 7 µL chemoatraktanta do drugiej studni komór. W przypadku komórek JCA T zastosowano 200 ng/ml sdf-1α rozcieńczonego w medium niepełnym.Do obciążenia kontroli negatywnej jako chemoatraktanta wykorzystuje się pożywkę RPMI. Do drugiej studni wprowadza się siedem mikrolitrów 7 µL samej pełnej pożywki. Po napełnieniu studni każdą komorę matrycy należy obejrzeć pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że wszystkie studnie zostały prawidłowo wycięte i wypełnione.Komórki powinny znajdować się w obrębie granic studni. Jeśli komórki są widoczne w obu studniach lub rozprzestrzeniają się poza granicę studni z komórkami, oznacza to powstanie szczeliny pod arosami. Należy pamiętać, że dane z nieprawidłowo przygotowanych studni nie mogą być wiarygodnie zinterpretowane.Aby rozpocząć zbieranie danych, umieść elektrodę w uchwycie matrycy. Połącz ponownie złote pola na matrycy elektrod z podstemplowanymi pinami pogo uchwytu, klikając opcję set up w oprogramowaniu ISIS theta. Studzienki, które zostały prawidłowo połączone, zostaną podświetlone na zielono.Jeśli studzienki są czerwone, oznacza to, że nie ma połączenia, a elektrodę należy ponownie ustawić w uchwycie matrycy za pomocą menu rozwijanego. W panelu oprogramowania wybierz eight W one semicolon. Oznacza to konfigurację matrycy. Eight.W panelu sterowania oprogramowania zaznacz opcję sprawdzania pojedynczej studni, aby określić początkowe wartości rezystancji i pojemności. Dla każdej studni wybierz wiele częstotliwości, aby zmierzyć rezystancję w kilku zakresach częstotliwości. Gromadzenie danych z wielu częstotliwości umożliwia analizę pojemności, impedancji i rezystancji.Można wybrać dostosowanie częstotliwości do własnych potrzeb lub skorzystać z zestawu zalecanych częstotliwości. Standardowe ustawienia akwizycji wieloczęstotliwościowej pozwalają na rejestrację danych przy 11 predefiniowanych częstotliwościach z szybkością ośmiu studzienek na minutę. Można również dostosować odstęp czasu między pomiarami.Całkowity czas trwania eksperymentu można ustawić w panelu po prawej stronie. Alternatywnie eksperyment można zatrzymać ręcznie, klikając przycisk finish. Gdy komórki wykażą oporność wskazującą na dotarcie do elektrody, kliknij start, aby rozpocząć zbieranie danych.Mimo że dane można eksportować do programu Excel, oprogramowanie EISs 1600 R dołączone do systemu EISs theta jest najskuteczniejszą metodą analizy danych z EISs taxes. Pasek narzędzi do analizy danych w oprogramowaniu zawiera przyciski opcji Z, R oraz C. Określają one odpowiednio, czy na osi pionowej względem osi X, która reprezentuje upływ czasu, naniesiona zostanie impedancja, rezystancja czy pojemność. Dane z EISs taxes najefektywniej wyświetla się jako rezystancję w funkcji czasu przy częstotliwości 4 000 Hz.Szybkie wahania rezystancji lub mikroprzejścia są dowodem na ruch komórki nad elektrodą, co powoduje spiętrzenie lub wygięcie punktów danych; dlatego nie zaleca się stosowania osi esys, ponieważ uśredni ona mikroprzejścia w danych. Po utworzeniu wykresu w oprogramowaniu ISIS 1600 R, można go wyeksportować, wybierając opcję eksportuj wykres z menu plik i zapisać go jako plik JPEG.Ludzkie limfocyty T Jurkat zostały poddane działaniu gradientu SDF-1α w celu stymulacji ruchu lub pożywki RPMI 1640 jako kontroli negatywnej. Znormalizowaną rezystancję przy 4 000 Hz przedstawiono na wykresie. Chemotaksja komórkowa objawia się wzrostem rezystancji przy 4 000 Hz w miarę przemieszczania się ludzkich limfocytów T Jurkat w odpowiedzi na SDF-1α.Dotarcie komórek do elektrody docelowej sygnalizowane jest pojawieniem się szybkich wahań rezystancji, zwanych mikrotransjentami. Wzrost rezystancji jest bezpośrednio proporcjonalny do liczby komórek przechodzących przez elektrodę. Wynik negatywny wskazuje stabilna rezystancja lub niewielki spadek rezystancji przy częstotliwości 4 000 hertz.Obserwuje się to, gdy komórki są wystawione na działanie pożywki RPMI 1640. Brak mikroprzejściowych prądów jest również sygnałem braku ruchu komórek przy elektrodzie. Oprócz tej podstawowej procedury można wprowadzić inne modyfikacje, aby wykorzystać system Esys, Texas do monitorowania ruchu komórkowego w obecności przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla chemoatraktanta, modyfikatorów farmakologicznych lub toksyn.

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą ECIS/Taxis

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Badania nad chemotaksją bakteryjną z wykorzystaniem mikroprzepływów – wywiad

Naucz się mierzyć chemotaksję komórkową w czasie rzeczywistym za pomocą systemu ECIS/Taxis z wykorzystaniem impedancji elektrycznej. Ta zautomatyzowana metoda pozwala precyzyjnie obserwować migrację komórek.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Przeglądaj więcej filmów