Name: Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą ECIS/Taxis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Naucz się mierzyć chemotaksję komórkową w czasie rzeczywistym za pomocą systemu ECIS/Taxis z wykorzystaniem impedancji elektrycznej. Ta zautomatyzowana metoda pozwala precyzyjnie obserwować migrację komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (ES07408 i EB00208).

1. Przygotowanie elektrod ECIS/Taxis
<ol>
 <li>Złotą powierzchnię matrycy elektrod ECIS/taxis (składającej się z 8 komór na slajd) stabilizuje się wstępnie poprzez inkubację ze sterylną 10 mM cysteiną w wodzie dejonizowanej (dH2O) przez 15 min w temperaturze pokojowej w warunkach sterylnych.</li>
 <li>Odsysa się roztwór cysteiny z każdej komory elektrod i płucze ją 3 razy sterylną dH2</li><li><li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol><ol><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li></li><li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li></ol><ol><li><li><li></li><li></ol><img alt="Wykres znormalizowanej rezystancji w funkcji czasu; przedstawia wpływ RPMI 1640 i SDF1a na zachowanie komórek." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> <img alt="Schemat chipa mikroprzepływowego; kanały, wloty do analiz lab-on-chip, sortowania komórek lub diagnostyki." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> <img alt="Schemat chemotaksji z migracją komórek, szerokość 2mm, studzienki z chemoatraktantem i komórkami, elektroda docelowa." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> <img alt="Proces wiercenia w celu umieszczenia elektrody docelowej; schemat pokazuje odstęp 4,08mm dla konfiguracji elektrod." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> <img alt="Schemat konstrukcji elektrody z elektrodą docelową, złote punkty do analizy przewodnictwa elektrycznego." src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5">

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li>
<li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li>
<li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li>
<li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li>
<li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis%3A+an+evaluation+of+the+cortical+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li>
<li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li>
<li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells%3A+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li>
<li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li>
<li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li>
</ol>

David A Knecht i Michael A Lynes posiadają wydany patent na technologię ECIS/Taxis, która została licencjonowana przez University of Connecticut firmie Applied Biophysics, Inc.

Nowatorskie cechy testu ECIS/Taxis obejmują możliwość zautomatyzowanego gromadzenia danych w czasie rzeczywistym podczas reakcji komórek na chemoatraktant. Chociaż najpowszechniejszym zastosowaniem tej technologii jest pomiar odpowiedzi komórkowych na pojedyncze gradienty chemotaktyczne lub gradienty składające się z mieszanin agonistów i antagonistów chemotaksji, podejście ECIS/Taxis dopuszcza również modyfikacje tych konfiguracji, które mogą być bardzo pomocne w ocenie responsywności komórkowej. Istnieją przekonujące d...

<table><tbody><tr><td>ECIS Z&amp;#952;</td><td>Applied Biophysics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Macierz elektrod ECIS</td><td>Applied Biophysics</td><td>8W Chemotaxis</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biophysics.com/cultureware.php">www.biophysics.com/cultureware.php&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Agaroza Seakem GTG</td><td>BioWhittaker</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca HyClone</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300703</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td>Penicylina 5,000 IU/ml; Streptomycyna 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>1688449</td><td>roztwór 1M, stopień do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kanula ze stali nierdzewnej 14 Gauge (2) 4 cale</td><td>General Supply</td><td>5-8365-1</td><td>tępy koniec</td></tr></tbody></table>

pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ecis/taxis

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Ruch komórek w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne jest fundamentalny dla wielu procesów komórkowych, w tym dla gojenia ran, stanu zapalnego oraz odpowiedzi na infekcję. Powszechną metodą pomiaru chemotaksji jest test z wykorzystaniem komory Boydena, w której komórki i chemoatraktant są oddzielone porowatą membraną. W miarę jak komórki migrują przez membranę w kierunku chemoatraktanta, przywierają one do jej dolnej strony lub opadają do znajdującego się poniżej medium, a następnie zostają zabarwione i przeliczone wizualnie 1. W tej metodzie komórki są wystawione na działanie gwałtownego i przejściowego gradientu chemoatraktanta, co uważa się za słabe odwzorowanie gradientów występujących w tkankach 2.
Inny system analizy, test chemotaksji pod agarozą, 3, 4 mierzy ruch komórek po stałym podłożu w cienkim filmie wodnym, który tworzy się pod warstwą agarozy. Gradient powstający w agarozie jest łagodny i uważa się go za odpowiednią reprezentację gradientów występujących naturalnie. Chemotaksję można ocenić poprzez obrazowanie mikroskopowe przebytej odległości. Zarówno test z komorą Boydena, jak i test pod agarozą są zazwyczaj konfigurowane jako analizy punktu końcowego.
Zautomatyzowany system ECIS/Taxis łączy podejście z zastosowaniem warstwy agarozy z elektrycznym pomiarem impedancji między komórkami a podłożem (ECIS) 5, 6. W tym teście elektrody docelowe znajdują się w każdej z 8 komór. Duża elektroda pomocnicza przebiega przez każdą z 8 komór (Ryc. 2). Każda komora jest wypełniona agarozą, a w niej, po obu stronach elektrody docelowej, wycięto dwa małe otwory. Jeden otwór wypełnia się badaną populacją komórek, natomiast w drugim umieszcza się źródła dyfundującego chemoatraktanta (Ryc. 3). Prąd przepływający przez system pozwala określić zmianę rezystancji, która następuje w momencie, gdy komórki przechodzą nad elektrodą docelową. Komórki znajdujące się na elektrodzie docelowej zwiększają rezystancję systemu 6. Ponadto gwałtowne wahania rezystancji odzwierciedlają zmiany w oddziaływaniach komórek z powierzchnią elektrody i wskazują na zachodzące zmiany kształtu komórek. System ECIS/Taxis umożliwia pomiar ruchu populacji komórek w czasie rzeczywistym przez dłuższe okresy, a jednocześnie jest na tyle czuły, że pozwala wykryć dotarcie pojedynczej komórki do elektrody docelowej.
Dictyostelium discoidium wykazuje zdolność do migracji w obecności gradientu folianów 7, 8, a jego odpowiedź chemotaktyczną można precyzyjnie zmierzyć za pomocą ECIS/Taxis 9. Za pomocą ECIS/Taxis mierzono również chemotaksję leukocytów w odpowiedzi na SDF1α oraz na antagonisty chemotaksji 10, 11. Przykład odpowiedzi leukocytów na SDF1α przedstawiono na Rysunku 1.

System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Ruch komórkowy w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne jest kluczowy dla wielu procesów komórkowych, w tym dla gojenia ran, stanu zapalnego oraz odpowiedzi na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar chemotaksji w zautomatyzowanym teście w czasie rzeczywistym, wykorzystującym elektryczną pomiar impedancji podłoża komórkowego, czyli EIS. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie elektrod axxis poprzez wypełnienie każdej komory 0,5% agros w pełnej pożywce RPMI. Kolejnym krokiem jest jednoczesne wycięcie dwóch otworów w agros w każdej komorze za pomocą kaniuli o rozmiarze 14G oraz odessanie dwóch korków z agros z każdej komory.Jedną z dołków wypełnia się zawiesiną pojedynczych komórek, a drugą chemoatraktantem. Następnie elektrodę podłącza się do systemu ISIS theta za pomocą uchwytu matrycy, który umieszcza się w inkubatorze z parametrami atmosferycznymi dostosowanymi do badanego typu komórek. Ostatecznie chemotaksję komórkową można obserwować poprzez pomiar zmiany rezystancji w czasie rzeczywistym, gdy komórki docierają do elektrody docelowej znajdującej się pomiędzy dwoma dołkami.Główną zaletą testu axxis w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test w komorze Boydena czy konwencjonalne testy podagaroze oparte na mikroskopii, jest możliwość automatycznego pomiaru chemotaksji w czasie rzeczywistym bez konieczności ciągłej m

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą ECIS/Taxis

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Badania nad chemotaksją bakteryjną z wykorzystaniem mikroprzepływów – wywiad

Naucz się mierzyć chemotaksję komórkową w czasie rzeczywistym za pomocą systemu ECIS/Taxis z wykorzystaniem impedancji elektrycznej. Ta zautomatyzowana metoda pozwala precyzyjnie obserwować migrację komórek.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Przeglądaj więcej filmów