Name: Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Poznaj fluorescencyjną metodę przesiewową do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK w komórkach ATT20. Ta technika umożliwia szybkie badanie związków farmakologicznych z zastosowaniem barwników wrażliwych na potencjał błonowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant US Public Health Service nr NS-071530.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Hodować komórki przysadki AtT20 w podłożu Eagle'a zmodyfikowanym przez Dulbecco (DMEM) uzupełnionym o 10% surowicy konia; kultury utrzymywać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2.</li>
 <li>Utrzymywać kulturę poprzez pasażowanie komórek co 5 do 7 dni przy użyciu standardowej procedury trypsynizacji.</li>
 <li>Pokryć dołki czarnych płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem 50 μL poli-l-lizyny. Pozostawić dołki do wyschnięcia na 30 min w inkubatorze.</li>
 <li>Wysiać komórki na płytki 96-dołkowe zawierające 200 μL podłoża w gęstości 30 000 komórek na dołek i przechowywać komórki w inkubatorze przez 3-4 dni.</li>
 <li>Użyć zestawu do aspiracji, składającego się z zamkniętego słoika o pojemności 4 litrów podłączonego z jednej strony do pompy próżniowej, a z drugiej do końcówki pipety 200 μL, aby powoli odessać podłoże hodowlane z monowarstwy komórek.</li>
 <li>Przemyć komórki 200 μL normalnego roztworu buforowego (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM dekstrozy, 5 mM HEPES, pH 7.4 dostrojone NaOH).</li>
 <li>Do każdego dołka dodać 200 μL roztworu buforowego zawierającego barwnik wrażliwy na potencjał błonowy (MPD) DiBAC4(3) lub HLB 021-152 (5 μM) i inkubować komórki przez 40 min w temperaturze 37 °C.</li> 
</ol>
2. Przygotowanie związków testowych i traktowanie komórek
<ol>
 <li>Przygotować rozcieńczenia szeregowe związków testowych (stężenie zapasu = 10 mM w DMSO) z biblioteki związków (w formacie 96-dołkowym) przy użyciu zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy Versette (ThermoFisher).</li>
 <li>Wyjąć płytkę 96-dołkową zawierającą komórki AtT20 z inkubatora i odczekać, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową. Odessać stary bufor i nanieść na komórki świeży roztwór buforowy zawierający MPD.</li>
 <li>Przy użyciu systemu do obsługi cieczy nanieść na płytkę 96-dołkową z komórkami różne stężenia (od 10 nM do 10 μM) związków testowych (od 2 do 20 μL) oraz roztwory kontrolne (0,1% DMSO) (w roztworze buforowym zawierającym MPD).</li>
 <li>Inkubować komórki z związkami testowymi przez 5 min przed wykonaniem pomiarów fluorescencji.</li>
</ol>
3. Aktywacja kanałów GIRK, pomiar fluorescencyjny i analiza
<ol>
 <li>Włóż płytkę 96-dołkową do fluorescencyjnego czytnika płytek Biotek Synergy2 i zmierz fluorescencyjny sygnał tła przy długościach fali wzbudzenia 520 nm i emisji 560 nm.</li>
 <li>Za pomocą systemu wtryskiwania Synergy2 dodaj do dołków (objętość całkowita = 220 μL) ligandy GPCR (somatostatyna = 200 nM lub karbachol = 10 μM) lub roztwór kontrolny (sam bufor) (20 μL), aby aktywować kanały GIRK. Rejestruj punkty danych w odstępach 10 s przez 300 s przy długościach fali wzbudzenia 520 nm i emisji 560 nm.</li>
 <li>Wyznacz przebieg czasowy i amplitudę szczytową zmiany fluorescencji przy użyciu oprogramowania Biotek Gen5, a następnie wyeksportuj dane do programu Excel w celu dalszej analizy.</li>
 <li>Oblicz czynnik Z', aby określić wiarygodność testu. Płytki użyte do wyznaczenia czynnika Z' zawierały po 2 rzędy kontroli pozytywnych (ligand GPCR) i negatywnych (sam bufor). Czynnik Z' definiuje się jako: Z' = 1 - (3σP + 3σN) / | μP - μN |, gdzie μP i μN to średnie sygnałów kontroli pozytywnej i negatywnej, a σP i σN to odpowiednio odchylenia standardowe sygnałów kontroli pozytywnej i negatywnej 6. Wartości czynnika Z' w zakresie od 0,5 do 1,0 wskazują na doskonałą jakość testu 6. Płytki z czynnikami Z' poniżej 0,5 są wykluczane z analizy.</li>
 <li>Związki modulujące sygnał fluorescencyjny są poddawane ponownym testom w obecności Ba2+ lub tertiapiny-Q w celu potwierdzenia specyficzności wobec kanałów K+ prostownika do wewnątrz.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład sygnału fluorescencji zmierzonego przy użyciu testu kanałów GIRK przedstawiono na Rysunku 2. Dodanie liganda GPCR, somatostatyny (200 nM), do komórek AtT20 spowodowało szybki, zależny od czasu spadek sygnału fluorescencji HLB 021-152 (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego, dodanie roztworu kontrolnego spowodowało niewielki, chwilowy wzrost fluorescencji, która z czasem powróciła do poziomu bazowego (Rysunek 2). Porównanie szczytowych wartości fluorescencji w płytkach 96-dołkowych po iniekcji roztworów kontrolnych i somatostatyny dało wartości czynnika Z' w zakresie od 0,5 do 0,7. W celu dalszej kwantyfikacji, zapis kontrolny odjęto od zapisu dla somatostatyny, a następnie przeanalizowano wynikający z tego sygnał wrażliwy na somatostatynę (Rysunek 2).
Analiza ta zapewnia metodę szybkiej identyfikacji leków modulujących kanały GIRK. Na przykład leki hamujące kanał GIRK powinny zmniejszać indukowany przez ligand GPCR spadek fluorescencji poprzez zapobieganie odpływowi K+ z komórek. Jak pokazano na Rysunku 3, traktowanie komórek tertiapiną-Q, toksyną blokującą kanały GIRK7, spowodowało zahamowanie indukowanej somatostatyną zmiany fluorescencji. Propafenon, lek przeciwarytmiczny blokujący kanały GIRK w sercu8, również zahamował zmianę fluorescencji (Rysunek 4). Analiza ta może być również przydatna do identyfikacji aktywatorów kanału GIRK. Jednakże zastosowanie etanolu (100 &amp; 200 mM), aktywatora kanału GIRK2,3, nie wywołało istotnej zmiany sygnału fluorescencyjnego w porównaniu z roztworem kontrolnym (p &gt; 0,5).
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="Schemat sygnalizacji GPCR, interakcja białka G, przepływ jonów potasu, zmiana potencjału błonowego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat eksperymentalny fluorescencyjnego testu kanałów GIRK. Komórki AtT20 inkubuje się w buforze zawierającym barwnik fluorescencyjny wrażliwy na potencjał błonowy (D). Cząsteczki barwnika wnikają do komórek i stają się fluorescencyjne po związaniu się z białkami wewnątrzkomórkowymi (panel górny). Wiązanie somatostatyny (Som) do jej receptora GPCR stymuluje inhibicyjne białko G (Gi), co powoduje aktywację kanału GIRK (panel dolny). Następujący po tym odpływ K+ z komórek powoduje, że potencjał błonowy staje się bardziej ujemny, a cząsteczki barwnika opuszczają komórki. W rezultacie sygnał fluorescencyjny maleje (panel dolny).
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="wykres równowagi statycznej, porównanie efektu somatostatyny, F/F0 w funkcji czasu, analiza danych, markery kontrolne" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny sygnał fluorescencyjny HLB 021-152 mierzony w czasie w komórkach AtT20 podczas dodawania somatostatyny lub roztworu kontrolnego. Stosunek intensywności fluorescencji (F/FO) obliczono poprzez podzielenie sygnału w obecności (F) somatostatyny (lub roztworu kontrolnego) przez sygnał bazowy zmierzony przed (FO) dodaniem somatostatyny (lub roztworu kontrolnego). Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną z 5-6 studni. Somatostatynę lub roztwór kontrolny dodano w czasie zero (↓). Dodanie roztworu kontrolnego spowodowało niewielki, przejściowy wzrost sygnału fluorescencyjnego. Wynikało to ze zmiany temperatury spowodowanej wstrzyknięciem roztworu. 
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="Wykres równowagi statycznej, efekty somatostatyny, odjęto kontrolę, analiza fluorescencji, czas vs. F/F₀." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Leczenie komórek AtT20 tertiapiną-Q (500 nM) hamuje indukowany somatostatyną spadek sygnału fluorescencyjnego poprzez wiązanie i blokowanie kanałów GIRK. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną w 4-6 studzienkach. Somatostatynę dodano w czasie zero (↓).
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="Wykres hamowania somatostatyną; efekt czasowo-odpowiedziowy; wykres; badanie farmakologiczne; analiza." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Leczenie komórek AtT20 propafenonem (20 μM) również hamuje zależny od somatostatyny spadek sygnału fluorescencyjnego. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SE uzyskaną z 5-6 studni. Somatostatynę dodano w czasie zero (↓).

<ol><li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+potassium+channels%3A+their+structure%2C+function+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li>
<li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+%28GIRK%29+channels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li>
<li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li>
<li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li>
<li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay%3A+an+old+assay+with+a+new+look%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li>
<li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li>
<li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li>
<li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li>
<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Choć barwniki fluorescencyjne wrażliwe na potencjał błony były stosowane do identyfikacji leków modulujących kanały jonowe9,10, niniejsza praca jest pierwszym doniesieniem o ich zastosowaniu w poszukiwaniu leków wpływających na neuronalne kanały GIRK. Przedstawiony tutaj fluorescencyjny test kanałów GIRK zapewnia szybką, niezawodną i monitorowaną w czasie rzeczywistym metodę przesiewową dla kanałów K+ sterowanych ligandami. Test ten można modyfikować w celu zastosowania go w szerokim zakresie komóre...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Invitrogen</td><td>16050-114</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Somatostatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9129</td><td></td></tr><tr><td>Karbachol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>HLB 021-152</td><td>AnaSpec</td><td>89300</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system pipetujący Versette</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>650-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny czytnik płytek Synergy2</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Wykaz specyficznych odczynników i sprzętu.</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów girk

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

K potasowy wewnątrzprostujący sterowany białkiem G+ Kanały (GIRK) pełnią funkcję komórkowych mediatorów szerokiego spektrum hormonów i neurotransmiterów oraz są eksprimowane w mózgu, sercu, mięśniach szkieletowych i tkance endokrynnej1,2Kanały GIRK ulegają aktywacji po związaniu ligandów (neuroprzekaźników, hormonów, leków itp.) z ich receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR), które są związane z błoną plazmatyczną. Wiązanie to powoduje stymulację białek G (Gi oraz Go), które następnie wiążą się z kanałem GIRK i aktywują go. Po otwarciu kanał GIRK umożliwia ruch K+ z komórki, co powoduje, że potencjał spoczynkowy błony staje się bardziej ujemny. W konsekwencji aktywacja kanałów GIRK w neuronach zmniejsza częstotliwość spontanicznego powstawania potencjałów czynnościowych i hamuje uwalnianie pobudzających neuroprzekaźników. W sercu aktywacja kanałów GIRK hamuje aktywność rozrusznikową, spowalniając tym samym częstotliwość akcji serca.
Kanały GIRK stanowią nowe cele dla opracowania nowych środków terapeutycznych w leczeniu bólu neuropatycznego, uzależnień od leków, arytmii serca i innych zaburzeń3. Jednak farmakologia tych kanałów pozostaje w dużej mierze nieznana. Chociaż szereg leków, w tym środki przeciwarytmiczne, leki przeciwpsychotyczne i przeciwdepresyjne, blokuje kanał GIRK, hamowanie to nie jest selektywne i występuje przy stosunkowo wysokich stężeniach leków3.
W niniejszej pracy opisujemy test przesiewowy w czasie rzeczywistym służący do identyfikacji nowych modulatorów kanałów GIRK. W tym teście neuronalne komórki AtT20, wykazujące ekspresję kanałów GIRK, są obciążane fluorescencyjnymi barwnikami wrażliwymi na potencjał błonowy, takimi jak bis-(1,3-dibutylobarbiturowy kwas) trimetynowy oksonol [DiBAC4(3)] lub HLB 021-152 (Rysunek 1). Cząsteczki barwnika stają się silnie fluorescencyjne po wniknięciu do wnętrza komórek (Rysunek 1). Traktowanie komórek ligandami GPCR stymuluje otwarcie kanałów GIRK. Wynikający z tego odpływ jonów K+ z komórki powoduje, że potencjał błonowy staje się bardziej ujemny, a sygnał fluorescencji ulega zmniejszeniu (Rysunek 1). W ten sposób leki modulujące odpływ K+ przez kanał GIRK mogą być analizowane przy użyciu płytkowego czytnika fluorescencji. W przeciwieństwie do innych testów przesiewowych kanałów jonowych, takich jak spektrometria absorpcyjna z atomizacji4 czy analiza z użyciem znaczników radioaktywnych5, fluorescencyjny test kanałów GIRK zapewnia szybką, niedrogą procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym.

Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.

Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Kanały potasowe wprostnie prostujące sterowane białkami G (GIRK) pełnią funkcję komórkowych mediatorów szerokiego spektrum hormonów i neuroprzekaźników i są ekspresjonowane w ...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych leków modulujących kanały grk. Jest to realizowane poprzez najpierw wysianie komórek A TT 20 na płytkę 96-dołkową. Drugim krokiem jest rozcieńczenie badanych związków przy użyciu systemu obsługi płytek płynnych Verset.Następnie, za pomocą dozownika, nanosi się rozcieńczone związki testowe na komórki. Ostatnim krokiem jest umieszczenie płytki 96-dołkowej w fluorescencyjnym czytniku płytek Synergy two oraz wstrzyknięcie do dołków roztworów kontrolnych i somatostatyny. W końcowym etapie czytnik fluorescencyjny służy do wykazania związków, które zmieniają indukowany somatostatyną sygnał fluorescencyjny, a tym samym modulują kanały Grk.Przewagą tej procedury nad istniejącymi metodami, takimi jak rejestracja metodą patch-clamp, jest możliwość szybkiego przesiewu dużej liczby związków w celu ustalenia, czy modulują one kanały Gerk. Znaczenie tej techniki rozciąga się na leczenie bólu, ponieważ pozwala ona na identyfikację związków aktywujących kanał Gerk, co prowadzi do zahamowania nocyceptywnej transmisji FI. Procedurę powlekania płytek 96-dołkowych oraz wysiewania komórek demonstruje Maribel Vasquez.Student w moim laboratorium rozpoczął tę procedurę od hodowli komórek przysadki A TT 20 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% surowicy konia w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2. Kulturę utrzymywano poprzez pasażowanie komórek co pięć do siedmiu dni zgodnie ze standardową procedurą. Następnie pokryto dno dołków czarnej przezroczystej płytki.Dno płytki 96-dołkowej pokryć 50 µL poli-L-lizyny. Pozostawić do wyschnięcia dołków przez 30 minut w inkubatorze. Następnie usunąć nadmiar poli-L-lizyny i wysiać komórki do płytki 96-dołkowej zawierającej 200 µL medium w gęstości 30 000 komórek na dołek.Następnie inkubować komórki przez trzy do czterech dni. Za pomocą zestawu do aspiracji powoli odessać pożywkę hodowlaną z monowarstwy komórek, a następnie przemyć komórki 200 µL zwykłego roztworu buforowego. Następnie do każdej z nich dodać 200 µL roztworu buforowego zawierającego barwnik wrażliwy na potencjał błonowy.Inkubuj komórki przez 40 minut w temperaturze 37°C. Po 40 minutach wyjmij komórki A TT 20 z inkubatora, odstaw je do osiągnięcia temperatury pokojowej i odessaj stary bufor. Następnie nanieś na komórki świeży roztwór buforowy zawierający MPD.Następnie, przy użyciu systemu do obsługi cieczy, nanieś na komórki różne stężenia związków testowych i roztworów kontrolnych. Komórki na płytce 96-dołkowej inkubuj przez pięć minut ze związkami testowymi przed wykonaniem pomiarów fluorescencji. W tej procedurze umieść płytkę 96-dołkową w czytniku płytek fluorescencyjnych Biotech Synergy Two.Wyznacz sygnał tła fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 520 nanometrów i długości fali emisji 560 nanometrów. Następnie, za pomocą systemu injektora Synergy two, dodaj do dołków ligandy G PCR R lub roztwór kontrolny, aby aktywować kanały GIR. Następnie zbierz punkty danych w odstępach dziesięciosekundowych przez 302-sekundowy okres próbkowania.Przy długościach fal wzbudzenia i emisji. Oblicz współczynnik Z, aby określić wiarygodność testu. Współczynniki Z w zakresie od 0,5 do 1,0 wskazują na doskonałą jakość testu.Płytki z czynnikami Z poniżej 0,5 są wykluczane. Z analizy wyodrębniono związki modulujące sygnał fluorescencyjny, które poddano ponownym testom w obecności 2 mM chlorku baru lub 500 nM terapiny Q, aby potwierdzić specyficzność wobec wewnątrzsterownych kanałów potasowych; przedstawiono tutaj reprezentatywny sygnał fluorescencyjny HLB 0 2 1 1 15 2 mierzony w czasie w komórkach A TT 20 po dodaniu somatostatyny lub roztworu kontrolnego. Stosunek intensywności fluorescencji na osi Y obliczono poprzez podzielenie sygnału w obecności somatostatyny lub roztworu kontrolnego przez sygnał bazowy zmierzony przed dodaniem somatostatyny lub roztworu kontrolnego.Przedstawiono tutaj traktowanie komórek A TT 20 stężeniem 500 nM Terapin Q, który hamuje indukowany somatostatyną spadek sygnału fluorescencyjnego poprzez wiązanie i blokowanie kanałów G. Przedstawiono również traktowanie komórek A TT 20 stężeniem 20 µM propafenonu, który także hamuje indukowany somatostatyną spadek sygnału fluorescencyjnego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje dwie godziny.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu identyfikacji leków modulujących kanały grk z wykorzystaniem fluorescencyjnego czytnika płytek.

a-fluorescent-screening-assay-for-identifying-modulators-girk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test przesiewowy fluorescencyjny do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Przedstawiamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość gaszenia fluorescencji jako miarę aktywności kanałów gramicydynowych. Kanały gramicydynowe są wykorzystywane jako molekularne przetworniki siły do monitorowania zmian w właściwościach dwuwarstwy lipidowej wyczuwanych przez białka przebiegające przez dwuwarstwę.

Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Źródło: Rugjee, K. N., et al. Opracowanie wysokoprzepustowego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film przedstawia badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych bakterii, które eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora wrażliwego na c-di-GMP. Fluorescencję mierzy się na płytce wielodołkowej zawierającej różne badane...

Badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP z wykorzystaniem bakterii wyrażających fluorescencyjne białko reporterowe 

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Ten film ilustruje test komórkowy z udziałem komórek glejaka wyrażających receptory chemokiny CXCR4. Test wykorzystuje barwnik wrażliwy na wapń do pomiaru zmian fluorescencji po interakcji z czynnikiem, oferując wgląd w dynamikę sygnalizacji komórkowej.

Test komórkowy do identyfikacji czynników oddziałujących z CXCR4

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiego testu komunikacji międzykomórkowej z połączeniem szczelinowym, przeznaczonego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych modulujących złącze szczelinowe w celu odkrycia leków i oceny toksykologicznej.

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Poznaj fluorescencyjną metodę przesiewową do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK w komórkach ATT20. Ta technika umożliwia szybkie badanie związków farmakologicznych z zastosowaniem barwników wrażliwych na potencjał błonowy.

Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Przeglądaj więcej filmów