Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK
24 kwietnia 2012
Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym do identyfikacji leków, które oddziałują z kanałami prostownika wewnętrznego K+ (GIRK) bramkowanym białkiem G. Test wykorzystuje barwniki fluorescencyjne wrażliwe na potencjał błony do pomiaru aktywności kanału GIRK. Technikę tę można dostosować do stosowania na wielu liniach komórkowych.
Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych leków, które modulują kanały grk. Osiąga się to poprzez uprzednie posiew komórek A TT 20 w płytce 96-dołkowej. Drugim krokiem jest rozcieńczenie badanych związków za pomocą systemu obsługi płytek płynnych Verset.
Następnie rozcieńczone związki testowe nakłada się na komórki za pomocą wersetu. Ostatnim krokiem jest włożenie 96-dołkowej płytki do czytnika dwóch płytek fluorescencyjnych Synergy i wstrzyknięcie roztworów kontrolnych i somatostatyny do studzienek. Ostatecznie czytnik płytek fluorescencyjnych służy do pokazania związków, które zmieniają sygnał fluorescencyjny indukowany somatostatyną, a tym samym modulują kanały Grk.
Przewagą tej procedury nad istniejącymi metodami, takimi jak nagrywanie patch clamp, jest to, że dużą liczbę związków można szybko przesiać w celu określenia, czy modulują one kanały gerk. Implikacje tej techniki rozciągają się na leczenie bólu, ponieważ można zidentyfikować związki, które aktywują kanał Gerk, co prowadzi do zahamowania transmisji nocyceptywnej FI, demonstrując procedurę powlekania. 96-dołkowe płytki i posiew komórek to Maribel Vasquez.
Student w moim laboratorium Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania komórek przysadki A TT 20 w DMEM uzupełnionym 10% surowicą końską w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Utrzymuj kulturę, hodując komórki co pięć do siedmiu dni przy użyciu standardowej procedury. Następnie pokryj dołki czarnego lakieru.
Dolna 96-dołkowa płytka z 50 mikrolitrami poli L lizyny. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na 30 minut w inkubatorze. Następnie usuń nadmiar płytki z poli L lizyny komórek w 96-dołkowej płytce zawierającej 200 mikrolitrów pożywki o gęstości 30 000 komórek na dołek.
Następnie przechowuj komórki w inkubatorze przez trzy do czterech dni. Użyj zestawu do aspiracji, aby powoli zasysać pożywkę hodowlaną z monowarstwy komórek, a następnie umyj komórki 200 mikrolitrami normalnego roztworu buforowego. Następnie do każdego z nich dodaj 200 mikrolitrów roztworu buforowego zawierającego barwnik wrażliwy na potencjał membranowy.
Dobrze inkubuj komórki przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 40 minutach wyjąć komórki A TT 20 z inkubatora i pozostawić je do powrotu do temperatury pokojowej, odessać stary bufor. Następnie nałóż świeży roztwór buforowy zawierający MPD na komórki.
Następnie użyj systemu obsługi cieczy, aby nałożyć różne stężenia badanych związków i roztworów kontrolnych na komórki. Na 96-dołkowej płytce inkubować komórki przez pięć minut ze związkami testowymi do pomiarów fluorescencyjnych. W tej procedurze włóż 96-dołkową płytkę do czytnika dwóch fluorescencyjnych z synergią biotechnologiczną.
Uzyskaj fluorescencyjny sygnał tła o długości fali wysięku 520 nanometrów i długości fali misji 560 nanometrów. Następnie nałóż ligandy G PCR R lub roztwór kontrolny do studzienek, aby aktywować kanały za pomocą systemu dwóch iniektorów Synergy. Następnie zbierz punkty danych w dziesięciosekundowych odstępach czasu przez 302. okres próbkowania.
Na długościach fal wzbudzenia i emisji. Obliczyć współczynnik Z w celu określenia wiarygodności testu. Współczynniki Z.Factor w zakresie od 0,5 do 1,0 wskazują, że jakość testu jest doskonała.
Wykluczane są tabliczki o współczynniku Z poniżej 0,5. Z analizy wynika, że związki, które modulują sygnał fluorescencyjny, są ponownie badane w obecności dwóch milimolowych chlorków baru lub 500 nanomolowych terapiny Q w celu potwierdzenia specyficzności kanału potasowego prostownika wewnętrznego, pokazano tutaj reprezentatywny sygnał fluorescencyjny HLB 0 2 1 1 15 2 mierzony w czasie w komórkach A TT 20 z dodatkiem somatostatyny lub roztworu kontrolnego. Stosunek intensywności fluorescencji w osi Y obliczono, dzieląc sygnał w obecności somatostatyny lub roztworu kontrolnego przez sygnał podstawowy mierzony przed dodaniem somatostatyny lub roztworu kontrolnego.
Pokazano tutaj leczenie komórek A TT 20 za pomocą 500 nano zębów trzonowych. Terapina Q hamuje spadek sygnału fluorescencyjnego, w którym pośredniczy somatostatyna, wiążąc dwa kanały i blokując kanały G. Pokazano tutaj traktowanie komórek A TT 20 propafenonem o masie 20 mikromolów, który hamuje również spadek sygnału fluorescencyjnego za pośrednictwem somatostatyny Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować leki, które modulują kanały grk za pomocą czytnika fluorescencyjnych płytek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę przesiewowego badania w czasie rzeczywistym, służącą do identyfikacji leków, które wchodzą w interakcje z kanałymi potasowymi wewnętrznie prostującymi zależnymi od białka G (GIRK). W badaniu stosuje się fluorescujące barwniki wrażliwe na potencjał błonowy, aby zmierzyć aktywność kanałów GIRK, co sprawia, że jest ono przystosowane do różnych linii komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
Tło
- Kanały GIRK odgrywają kluczową rolę w przekaźnictwie neuronowym.
- Identyfikowanie modulatorów kanałów GIRK może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych.
- Badania w czasie rzeczywistym zwiększają efektywność przesiewowych badań leków.
- Fluorescencyjne barwniki zapewniają wrażliwe pomiary aktywności kanałów.
Cel badania
- Opracowanie procedury przesiewowego badania leków, które modulują kanały GIRK.
- Wykorzystanie formatu o wysokiej wydajności do testowania wielu związków.
- Ulepszenie rozumienia farmakologii kanałów GIRK.
Zastosowanie metod
- Nasadzenie komórek TT 20 na 96-dołkowej płytce.
- Wykorzystanie systemu obsługi płynów Verset do rozcieńczania testowanych związków.
- Aplikowanie rozcieńczonych związków do komórek za pomocą Verset.
- Użycie dwukolorowego czytnika płytowego Synergy do pomiaru reakcji.
Główne wyniki
- Identyfikacja związków, które zmieniają sygnały indukowane somatostatyną.
- Demonstracja przystosowania badania do różnych linii komórkowych.
- Skuteczna modulacja aktywności kanałów GIRK przez testowane związki.
- Walidacja efektywności dwukolorowego czytnika płytowego w przesiewowym badaniu.
Wnioski
- Opracowany test jest cennym narzędziem do odkrywania leków ukierunkowanych na kanały GIRK.
- Badanie w czasie rzeczywistym może przyspieszyć identyfikację potencjalnych leków terapeutycznych.
- Wymagane są dalsze badania, aby zbadać kliniczne implikacje zidentyfikowanych związków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput identification of GIRK channel modulators, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By providing real-time, quantitative fluorescence readouts, it reduces reliance on low-throughput electrophysiology and accelerates hit-to-lead progression. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking compound effects to functional channel activity in a physiologically relevant cellular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional GIRK channel modulation in response to GPCR ligands.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify activators or inhibitors with mechanistic specificity.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming on-target activity through fluorescence signal changes correlated with K+ efflux.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses membrane potential-sensitive dyes (DiBAC4(3) or HLB 021-152) to generate quantifiable, real-time signals upon GIRK activation.
- Reproducibility: Z-factor calculation (excellent range: 0.5–1.0) ensures assay robustness for hit selection and campaign reproducibility.
- Scalability: Compatible with 96-well format and liquid handling systems (e.g., Verset) for automated compound dispensing and screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Modulators identified may inform therapeutic strategies for neuropathic pain, addiction, and cardiac arrhythmias via GIRK-mediated neuronal inhibition.
- Translational Continuity: Fluorescent readouts provide a bridge from target engagement to functional output, supporting preclinical phenotype anchoring.
- Mechanistic De-risking: Specificity confirmed using inhibitors like barium chloride or Terapin Q to distinguish GIRK-mediated effects from off-target activity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling functional screening of GIRK modulators prior to downstream optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GPCR activation to GIRK-dependent fluorescence changes, clarifying pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized dye loading, compound application, and kinetic fluorescence measurement over 300 seconds.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity ratios) enabling comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying compounds that alter neuronal excitability via GIRK, relevant to pain and addiction models.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable across cell lines and GPCR ligands, promoting reuse across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation by reducing mechanistic ambiguity in ion channel drug screening.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and real-time kinetic data unattainable with endpoint assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional validation, reducing late-stage failure risk due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds with confirmed GIRK activity for advancement to lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture (AT T20 cells), fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation.
- Dependent on fluorescence plate reader with injection capability (e.g., Synergy 2) and compatible excitation/emission settings (520 nm/560 nm).
- Necessitates standardization of dye loading, incubation times, and buffer conditions across wells and plates.
- Adaptation to other cell lines requires validation of GIRK expression and dye loading efficiency.
- Practical limitation: Assay specificity must be confirmed using orthogonal inhibitors (e.g., Ba2+, Terapin Q) to exclude non-GIRK-mediated fluorescence changes.
