Name: Szybki test przyłóżkowy skuteczności przeciwzakrzepowej enoksaparyny we krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj szybki test przyłóżkowy oceny skuteczności przeciwzakrzepowej enoksaparyny we krwi pełnej. Metoda wykorzystuje heparynazę do określenia czasu krzepnięcia i pozwala szybko ocenić poziom leku u pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały przeprowadzone wyłącznie przy wsparciu zasobów wydziałowych i instytucjonalnych. Aparatura do badania krzepliwości (Hemochron 801) została udostępniona przez producenta w formie nieodpłatnej wypożyczalni. Kasety testowe zostały zakupione w cenach detalicznych. Rysunek wprowadzający w filmie został zmodyfikowany na podstawie pracy Sanderink, et al.12 Drugi rysunek w filmie (harmonogram trawienia heparynazą) został odtworzony za zgodą Inchiosa et al.1

1. Rekonstytucja heparynazy
<ol>
 <li>Liofilizowana heparynaza I jest pozyskiwana komercyjnie (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) w fiolkach zawierających 1 μg oczyszczonego białka. Białko rozpuszcza się w 0,25 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl).</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek krwi
<ol>
 <li>Pobiera się dwie próbki krwi próżniowo do probówek Vacutainer (Becton-Dickinson; Franklin Lakes, NJ) z buforem cytrynianu sodu (0,3 ml 0,109M; 3,2%); obie probówki są uprzednio wzbogacone znanym stężeniem enoksaparyny; pobierana objętość krwi wynosi 2,7 ml. Całkowita objętość zawartości wynosi wówczas 3,0 ml.</li>
</ol>
3. Trawienie heparynazą
<ol>
 <li>Całą zawartość fiolki z heparynazą, którą można pobrać do strzykawki (około 0.2 ml; 80% zawartości fiolki; 0.8 μg białka), przenosi się do jednej probówki Vacutainer; do drugiej probówki dodaje się 0.2 ml soli fizjologicznej (0.9% NaCl), która służy jako stan bazowy przed zniesieniem efektu enoksaparyny.</li>
 <li>Obie probówki Vacutainer umieszcza się w termostatowanych gniazdach aparatu Hemochron na 5 min. (Odpowiedniość 5 min czasu trawienia heparynazą została potwierdzona w naszej wcześniej opublikowanej pracy.1)</li>
</ol>
4. Testy krzepliwości
<ol>
 <li>Po zakończeniu inkubacji z heparynazą 2,0 ml krwi przenosi się do kartridża pomiarowego. W przypadku probówki MAA jest ona uprzednio wypełniona 0,1 ml 250 mM CaCl2 w celu zainicjowania krzepnięcia. Komercyjny kartridż do oznaczeń aPTT (A104) jest zaprojektowany tak, aby inicjować krzepnięcie w pełnej krwi pobranej do probówek Vacutainer zawierających cytrynian sodu jako antykoagulant.</li>
 <li>Aparat Hemochron sygnalizuje zakończenie krzepnięcia krwi i zapisuje czas krzepnięcia w sekundach. Różnica w czasie krzepnięcia między próbką traktowaną heparynazą a próbką wyjściową, podzielona przez czas krzepnięcia próbki wyjściowej, pozwala obliczyć procentowy spadek wynikający z eliminacji enoksaparyny. Jak omówiono poniżej, uzyskano silne korelacje liniowe dla zależności między procentowym spadkiem czasu krzepnięcia a stężeniem enoksaparyny w próbkach pełnej krwi z dodatkiem analitytu, a także korelację z pomiarami stężeń enoksaparyny wykonanymi za pomocą chromogennego testu aktywności anty-Xa. Oznaczanie stężenia enoksaparyny testami anty-Xa przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu do dwuetapowego testu chromogennego (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH).</li>
</ol>

<ol><li>Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+development+of+a+point-of-care+assay+of+enoxaparin+anticoagulant+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).</li>
<li>Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aprotinin+prolongs+activated+and+nonactivated+whole+blood+clotting+time+and+potentiates+the+effect+of+heparin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro.</a> Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).</li>
<li>Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+protamine+excess+on+blood+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays.</a> Anesth Analg. 96, SCA39(2010).</li>
<li>Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+low+plasma+levels+of+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin.</a> Anesth Analg. 102, SCA10(2010).</li>
<li>Gogarten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+new+antithrombotic+drugs+on+regional+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Anaesthesiol%22%5BJournal%5D)">The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia.</a> Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).</li>
<li>Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+of+different+low-molecular+weight+heparins+used+at+therapeutic+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose.</a> Drug Saf. 28, 333-349 (2005).</li>
<li>Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+of+enoxaparin+among+obese+and+renal+impairment+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients.</a> Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).</li>
<li>El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+HEMOCHRON+JR.+HEMONOXTM+point+of+care+test+in+monitoring+the+anticoagulant+effect+of+enoxaparin+during+interventional+coronary+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).</li>
<li>Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+anticoagulant+activities+of+the+low+molecular+weight+heparin+fractions+and+fragments+with+flavobacterial+heparinase%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase.</a> Thromb Res. 44, 599-610 (1986).</li>
<li>Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+individuality+of+commercially+available+low-molecular-weight+heparins+and+their+generic+versions%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).</li>
<li>Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anticoagulant+heparinoids+by+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling.</a> Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).</li>
<li>Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+the+prophylactic+dose+of+enoxaparin+once+daily+over+4+days+in+patients+with+renal+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment.</a> Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy test skuteczności enoksaparyny może stanowić istotną opcję w ocenie względnego bezpieczeństwa wykonania procedury inwazyjnej, która wiąże się z ryzykiem krwawienia lub powstania krwiaka. Ma to szczególne znaczenie w przypadku rozważania znieczulenia zewnątrzoponniczego. Większość wytycznych zaleca okres oczekiwania wynoszący 12 godzin między podaniem enoksaparyny a rozpoczęciem procedury inwazyjnej.5 Zaburzenia czynności nerek, otyłość oraz ciąża mogą wpływać na wymagania dotyczące dawkowania enoksaparyny.6,7 Ponieważ badanie można przeprowadzić w ciągu 10 min, może ono być stosowane w klinikach lub gabinetach lekarskich, dostarczając informacji o stopniu przeciwkrzepliwości u pacjentów zagrożonych zakrzepicą żył głębokich i zatorowości płucnej. W razie potrzeby można wówczas niezwłocznie wprowadzić korekty dawkowania.
Stężenie enoxaparyny w osoczu można zmierzyć za pomocą testu chromogennego określającego stopień hamowania czynnika krzepnięcia Xa. Pozwala to jednak na oznaczenie jedynie jej stężenia, a nie konkretnie przeciwzakrzepowej skuteczności, która znacznie różni się u poszczególnych pacjentów.6-8
Nasze badania przeprowadzono wyłącznie z użyciem enoksaparyny. Można jednak przypuszczać, że analizę tę można zastosować do każdej LMWH ulegającej degradacji przez heparynazę I. Wiadomo już, że dotyczy to dalteparyny, nadroparyny i tinzaparyny.9-11 Analizę zaprojektowano w odniesieniu do funkcji urządzenia Hemochron do pomiaru czasu krzepnięcia. Urządzenie jest stosunkowo tanie; ponadto koszt jednorazowych probówek do pobierania krwi, ampułki z heparynazą oraz kartridży analitycznych niezbędnych do przeprowadzenia analizy jednego pacjenta wynosi około 15 USD. W związku z tym można oczekiwać, że metoda ta będzie odpowiednia do monitorowania stanu przeciwkrzepliwego w różnych warunkach klinicznych.

<table><tbody><tr><td>Hepzyme</td><td>Siemens AG</td><td>B4240</td><td>heparynaza I</td></tr><tr><td>&quot;MAA&quot; wkład</td><td>Technidyne</td><td>FTK-ACT</td><td>zmodyfikowany poprzez usunięcie kaolinu</td></tr><tr><td>wkład aPTT</td><td>Technidyne</td><td>A104</td><td> </td></tr></tbody></table>

szybki test przy łóżku pacjenta (point-of-care) do oceny skuteczności przeciwkrzepliwej enoxaparyny w krwi pełnej

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Istnieje potrzeba opracowania testu klinicznego do określania stopnia, w jakim krew pacjenta jest skutecznie przeciwkrzepliwa dzięki zastosowaniu heparyny drobnocząsteczkowej (LMWH), enoksaparyny. Istnieją również pilne sytuacje kliniczne, w których istotne byłoby szybkie ustalenie tego parametru. Niniejszy test został zaprojektowany w celu osiągnięcia tego celu. Analizowano wyłącznie próbki ludzkiej krwi wzbogacone znanymi stężeniami enoksaparyny. Kluczową cechą niniejszego testu jest ilościowe określenie skuteczności enoksaparyny w próbce krwi pacjenta poprzez jej degradację do całkowitej nieaktywności za pomocą heparynazy. Dwie próbki krwi pobrano do probówek Vacutainer (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) wzbogaconych enoksaparyną; jedną próbkę trawiono heparynazą przez 5 min w 37 °C, natomiast druga próbka reprezentowała bazowy stan przeciwkrzepliwości pacjenta. Procentowe skrócenie czasu krzepnięcia w próbce traktowanej heparynazą, w porównaniu ze stanem bazowym, pozwoliło określić wkład przeciwkrzepliwy enoksaparyny. Do pomiarów czasu krzepnięcia wykorzystano przenośne, zasilane bateryjnie urządzenie Hemochron 801 (International Technidyne Corp., Edison, NJ). Urządzenie posiada dwa gniazda na probówki testowe z termostatyczną kontrolą temperatury (37 °C). Testy przeprowadzano przy użyciu dwóch typów wkładów testowych dostępnych u producenta urządzenia. Jeden wkład został zmodyfikowany w celu zwiększenia jego czułości. Usunięto kaolin z wkładu FTK-ACT poprzez intensywne płukanie wodą destylowaną, pozostawiając w charakterze aktywatorów jedynie szklaną powierzchnię probówki oraz prawdopodobnie magnes detekcyjny. Metodę tę określono jako test o minimalnej aktywacji (MAA). Zastosowanie testu o minimalnej aktywacji było badane przez nas i innych autorów. 2-4 Drugim badanym wkładem był test aktywowanego czasu częścicznego protrombiny (aPTT) (A104). Został on wykorzystany w formie dostarczonej przez producenta. Termostatowane gniazda urządzenia służyły zarówno do trawienia heparynazą, jak i do testów krzepliwości. Test można ukończyć w ciągu 10 min. Test MAA wykazał wyraźne zmiany czasu krzepnięcia po trawieniu enoksaparyny heparynazą w typowym klinicznym zakresie stężeń. Przy stężeniu 0,2 anti-Xa I.U. enoksaparyny na ml próbki krwi, trawienie heparynazą spowodowało średni spadek czasu krzepnięcia o 9,8% (20,4 sec); przy 1,0 I.U. na ml enoksaparyny spadek ten wyniósł 41,4% (148,8 sec). Niniejszy raport przedstawia jedynie eksperymentalne zastosowanie testu; jego wartość w warunkach klinicznych wymaga jeszcze ustalenia.

Rysunek 1 przedstawia wyniki zależności między procentowym spadkiem czasu krzepnięcia po usunięciu enoksaparyny za pomocą heparynazy dla szeregu stężeń enoksaparyny z dodatkiem (0,2, 0,4 i 1,0 anti-Xa IU per ml). Wyniki przedstawiono dla kartridży do analiz MAA oraz aPTT. Na osi odciętych każdego wykresu uwzględniono również zmierzone stężenia enoksaparyny z chromogennego testu aktywności anti-Xa.
Rysunek 2 przedstawia wykresy tych samych danych jako procentowy spadek czasu krzepnięcia w funkcji chromogennego pomiaru aktywności anty-Xa.
W przypadku wszystkich czterech zależności stwierdzono silne korelacje liniowe o wysokiej istotności statystycznej.
<img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig1.jpg" alt="Czas krzepnięcia krwi w zależności od stężenia enoksaparyny; wyniki MAA i wykres testu aPTT; analiza danych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Wyznaczenia w punkcie opieki (point-of-care) wpływu enoksaparyny na czasy krzepnięcia wzbogaconej krwi pełnej w oparciu o procentową zmianę (skrócenie) czasu krzepnięcia po inkubacji z heparynazą. Na osi odpcinnych każdego wykresu naniesiono stężenia enoksaparyny dodane do krwi pełnej oraz zmierzone stężenia przeciw-Xa w osoczu (średnia ± S.E., w nawiasach). Wszystkie procentowe zmiany czasów krzepnięcia przedstawiono jako średnie i S.E., wraz ze średnim skróceniem czasu krzepnięcia w sekundach. Dane pochodzące od tego samego pacjenta połączono liniami przerywanymi. Dane dla czterech pacjentów oznaczonych gwiazdkami na wykresie A (wyniki MAA) są tożsame z danymi czterech pacjentów na wykresie B (testy aPTT). Wszystkie wyniki reprezentują pojedyncze wyznaczenia. Współczynniki korelacji Pearsona wyniosły odpowiednio r = 0.869 (p = 1.9 x 10-5) dla zależności w MAA oraz r = 0.916 (p = 2.8 x 10-5) dla testu aPTT. Reprodukowano za zgodą Inchiosa et al.1 
<img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig2.jpg" alt="Trawienie heparynazą a aktywność anty-Xa, skrócenie czasu krzepnięcia, wykresy korelacji, testy MAA i aPTT." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Wyniki procentowych zmian czasu krzepnięcia w testach przy łóżku pacjenta (point-of-care) przedstawionych na Rysunkach 1A i B naniesiono w funkcji stężeń anty-czynnika Xa w osoczu. A, wyniki MAA; B, testy aPTT. Wszystkie wyniki pochodzą z pojedynczych pomiarów czasu krzepnięcia i pojedynczych oznaczeń stężeń anty-czynnika Xa. Współczynniki korelacji Pearsona wyniosły odpowiednio r = 0.910 (p = 2.5 x 10-6) dla zależności w teście MAA oraz r = 0.922 (p = 2.0 x 10-5) dla testu aPTT. Reprodukowano za zgodą Inchiosa et al.1

Prezentacja szybkiego testu ilościowego hamowania krzepnięcia krwi przez enoksaparynę, będącą heparyną o niskiej masie cząsteczkowej. Wkład enoksaparyny jest oceniany poprzez usunięcie jej wpływu za pomocą trawienia heparynazą. Pełniejszy opis testu szczegółowo przedstawiono w naszej opublikowanej pracy.1 Test ten wymaga nadal potwierdzenia klinicznego.

Szybki test przy łóżku pacjenta (point-of-care) do oceny skuteczności przeciwkrzepliwej enoxaparyny w krwi pełnej

Istnieje potrzeba opracowania testu klinicznego do określenia stopnia, w jakim krew pacjenta jest skutecznie przeciwkrzepliwie opracowana za pomocą...

W ramach wprowadzenia odwołujemy się tutaj do opublikowanych prac dotyczących przebiegu czasowego poziomów w osoczu heparyny drobnocząsteczkowej Enoxaparin u ludzi. Prezentujemy dzisiaj nasze wyniki uzyskane za pomocą szybkiego testu typu point-of-care dla heparyny drobnocząsteczkowej. W tym przypadku badaną substancją jest Enoxaparin.Wyniki przedstawione na tym slajdzie obrazują stężenie w osoczu u pacjentów przyjmujących lek przewlekle raz na dobę w dawce 40 mg na dobę oraz czas od ostatniego podania do dalszego zaniku; widać wówczas, że około cztery godziny po podaniu osiągane jest stężenie szczytowe wynoszące 0,4 jm/ml, a poziom ten mieści się w zakresie terapeutycznym leku. Punktem szczególniego zainteresowania jest jednak również to, ile leku pozostaje 12 godzin po podaniu, ponieważ istnieje klinicznie uznana wytyczna, zgodnie z którą przed wykonaniem niektórych szczególnie inwazyjnych procedur, które mogą wiązać się z ryzykiem krwawienia, należy odczekać co najmniej 12 godzin po podaniu heparyny drobnocząsteczkowej, w tym przypadku enoxaparyny. Interesujące dla nas jest to, że w tym czasie wciąż obecna jest wyraźnie wykrywalna ilość leku, na czym skupiliśmy się w niektórych z naszych badań, co będziemy demonstrować.W niniejszej pracy autorzy wskazują również na fakt, że u osób z niewydolnością nerek poziomy leku są znacznie wyższe w całym przebiegu czasowym, co sugeruje, że wytyczne dotyczące dawkowania co 12 godzin mogą być wysoce niewystarczające w przypadku pacjentów z niewydolnością nerek, a także, jak wiadomo, u kobiet w ciąży oraz u pacjentów z otyłością. Chciałbym przedstawić badaczy z New York Medical College, którzy byli zaangażowani w ten projekt. Nazywam się Mario Osa.Jestem tutaj profesorem farmakologii. Jestem dr Suryą Patulą, adiunktem w dziedzinie anestezjologii klinicznej w New York Medical College. Nazywam się Keshar Kal.Jestem studentem trzeciego roku medycyny. To jest aparatura, której używamy do tych analiz. Aparatura ta została wyprodukowana przez firmę Omicron Corporation.Urządzenie może być zasilane bezpośrednio z sieci lub za pomocą baterii, co sprawia, że w tym sensie jest to prawdziwe urządzenie typu point-of-care. Aparatura posiada dwie komory z termostatyczną kontrolą temperatury, których używamy do wstępnej inkubacji próbek w ramach przygotowania do właściwego oznaczenia, a także do samego testu krzepliwości. Kluczową cechą tego oznaczenia jest zastosowanie wysoce oczyszczonego, dostępnego w handlu preparatu heparynazy.Produkt ten zakupiliśmy od korporacji Siemens. Jest on dostarczany w bardzo stabilnej formie i łatwo rozpuszcza się w soli fizjologicznej lub dowolnym roztworze wodnym. Zastosowanie heparyny ACE jest szczególnie wartościowe w naszym podejściu, ponieważ pozwala nam na wyznaczenie wyjściowej wartości krzepliwości u pacjenta.W przypadku braku wpływu heparyny, heparynaza ACE jest zdolna do całkowitej degradacji heparyny niskocząsteczkowej oraz heparyny niefrakcjonowanej, jednak naszym szczególnym celem jest tutaj heparyna niskocząsteczkowa i jej degradacja do stanu nieaktywności, aby uzyskać wartość czasu krzepnięcia w przypadku braku wpływu heparyny. Przedstawiamy tutaj przebieg czasowy degradacji heparyny niskocząsteczkowej, w tym przypadku enoksaparyny, przez heparynazę. Dane przedstawiono jako procent czasu krzepnięcia bazowego, zatem widzimy tutaj, że dodana enoksaparyna w ilości jednej jednostki anty 10.Stężenie 1 jmi/ml powoduje około 50% wydłużenie czasu krzepnięcia krwi. Następnie, po różnych okresach inkubacji z heparynazą w temperaturze 37 °C, obserwujemy czas potrzebny na powrót do bazowych czasów krzepnięcia. Innymi słowy, całkowitą degradację enoksaparyny do stanu nieaktywnego.W odniesieniu do efektu przeciwzakrzepowego zauważamy go już po półtorej minucie. Następuje wówczas w zasadzie 100% powrót do bazowego czasu krzepnięcia. Po analizie tego przebiegu czasowego zdecydowaliśmy, że standardowy czas wstępnej inkubacji krwi przed pomiarem czasu krzepnięcia wyniesie pięć minut.Probówki do testu w punkcie opieki (point of care) zostały lekko zmodyfikowane w stosunku do wersji otrzymywanej od producenta. Probówki te pierwotnie zawierały aktywator kaolin, który służy do pomiaru czasu krzepnięcia aktywowanego. Stwierdziliśmy, że zastosowanie probówki bez aktywatora znacząco zwiększa jej czułość.Nazwaliśmy ten test testem z minimalną aktywacją, ponieważ uważamy, że jedynym możliwym źródłem aktywacji jest teraz szklana powierzchnia probówki, a być może także magnes. Magnes jest kluczowym elementem zautomatyzowanego testu. Probówki te obracają się w gniazdach, a gdy magnes zostanie unieruchomiony przez skrzep o odpowiedniej gęstości, co spowoduje utratę jego ruchu, zostaje to wykryte i sygnalizuje zakończenie krzepnięcia.Przeprowadziliśmy również badanie testu z wykorzystaniem kasety do pomiaru częściowego czasu zakrzepania z aktywacją omikronową. Test ten wykonuje się w identyczny sposób. W tym systemie występuje nieco silniejsza aktywacja.Pierwszym krokiem jest reconstitution heparynazy z lilii w formie, w jakiej otrzymujemy ją w fiolce. Do fiolki dodajemy 0,25 ml soli fizjologicznej, a następnie odczekujemy około 20 sekund do całkowitego rozpuszczenia. Następnie pobieramy całą zawartość fiolki do strzykawki tuberkulinowej, odzyskując w tym kroku zazwyczaj około 0,2 ml.Dodatki do preinkubacji dodaje się do świeżo pobranych próbek krwi zawierających enoksaparinę w trzymililitrowych probówkach typu vacutainer. Pierwsza porcja to heparynaza, która jest mieszana w tym momencie. Następnie do probówki zawierającej enoksaparinę, ale bez heparynazy, dodaje się 0,2 ml soli fizjologicznej w celu uzyskania porównawej całkowitej objętości.Do odliczania 300 sekund wykorzystujemy wbudowany w urządzenie timer. Odpowiada to pięciu minutom preinkubacji. Po zakończeniu preinkubacji wyjmujemy probówki próżniowe.Ostatnim krokiem jest przeniesienie 2 ml preinkubowanych próbek do naszych minimalnie aktywowanych probówek testowych. Probówki te są wypełnione 100 µl 0,25 M chlorku wapnia w celu zainicjowania krzepnięcia. Pierwszą probówką jest ta, która była preinkubowana z heparynazą.Drugą próbką jest ta zawierająca enoksaparynę, ale bez heparynazy. Liczniki wskazują czas, który upłynął od dodania chlorku wapnia, i widzimy teraz, że pierwsza próbka jest gotowa. Jest to górna probówka, dla której czas wymagany do zakończenia krzepnięcia wyniósł 200 sekund.Próbka, która nie zawierała heparynazy, krzepnie dłużej i właśnie zakończyła ten proces. Jest to symulacja naszego typowego wyniku dla krwi wzbogaconej o 0,4 jednostki międzynarodowej enoksaparyny na ml. Przy tym stężeniu enoksaparyny czas krzepnięcia skraca się o około 45 sekund, co stanowi 18% skrócenia czasu krzepnięcia.Jak widać, detekcja krzepnięcia jest zautomatyzowana, a czasy są zapisywane w urządzeniu do momentu zakończenia inspekcji. Należy wspomnieć, że przetestowaliśmy ten test przy stężeniu tak niskim jak 0,1 jednostki międzynarodowej Enoxaparinu na ml. Jak zaznaczyliśmy we wstępie, jest to stężenie, które może występować 12 godzin po typowej dawce terapeutycznej Enoxaparinu.Byliśmy w stanie niezawodnie wykryć sygnał również przy tym stężeniu.

rapid-point-care-assay-enoxaparin-anticoagulant-efficacy-whole

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Szybki test punktowy skuteczności leku przeciwzakrzepowego enoksapariny we krwi pełnej

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Niniejszym przedstawiamy protokół do pomiaru przy łóżku pacjenta aktywności endotoksyn w próbkach ludzkiej krwi pełnej. Test aktywności endotoksyn jest prostym do wykonania testem i może być użytecznym biomarkerem u krytycznie chorych pacjentów z sepsą.

Test aktywności endotoksyn w celu wykrycia endotoksemii krwi pełnej u pacjentów w stanie krytycznym

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Ten protokół bada użycie osocza bogatego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) jako wskaźnika zdolności krzepnięcia EV. Osocze bogate w EV uzyskuje się w procesie wirowania różnicowego, a następnie ponownego zwapnienia.

Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)

Prezentujemy protokół laboratoryjny do wywoływania zakrzepicy w urządzeniach wspomagających komorowe (VAD) w ramach recyrkulacyjnej platformy testowej. Metoda ta służy do identyfikacji zakrzepowych punktów zapalnych na ścieżce przepływu krwi i może pomóc w poprawie trombooporności przed badaniami przedklinicznymi na modelach zwierzęcych.

In vitro Test na zakrzepicę dla urządzeń wspomagających pracę komór

Protokół ten opisuje test hemostazy Nijmegen, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazminy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Celem testu jest poprawa charakterystyki równowagi hemostatycznej w badaniach i środowiskach klinicznych wykraczających poza zakresu konwencjonalnych testów hemostatycznych.

Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Protokół pomiaru leukocytów krwi obwodowej za pomocą analizatora leukocytów opartego na karcie POCT jest przedstawiony tutaj. Te same próbki krwi zostały przebadane przez dwa automatyczne analizatory hematologiczne w celu oceny spójności i dokładności wyników. Wyniki pokazały, że oceniany analizator miał dobrą korelację z układem referencyjnym.

Ocena analizatora przyłóżkowego do pomiaru leukocytów krwi obwodowej

Poznaj szybki test przyłóżkowy oceny skuteczności przeciwzakrzepowej enoksaparyny we krwi pełnej. Metoda wykorzystuje heparynazę do określenia czasu krzepnięcia i pozwala szybko ocenić poziom leku u pacjentów.

Szybki test przy łóżku pacjenta (point-of-care) do oceny skuteczności przeciwkrzepliwej enoxaparyny w krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów