Przygotowanie mysich embrionalnych komórek fibroblastów odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Jakość mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) jest podyktowana przez odpowiedni szczep myszy, taki jak CF-1. Preparaty MEF wspomagające pluripotencję i kondycjonowane pożywki (CM) uzyskane z nich powinny zawierać optymalne stężenia aktywiny A, gremliny i Tgfβ1 potrzebne szlakom Activina/Węzł i FGF do wspólnego utrzymania samoodnowy i pluripotencji.

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie mysich fibroblastów embrionalnych odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez najpierw oddzielenie każdego zarodka i usunięcie głowy i czerwonych narządów. Następnie tkanka jest ostatecznie mielona i trawiona.

Następnie komórki są platerowane, trzy do czterech zarodków w kolbie i namnażane. Wreszcie, inaktywowane mity są wykorzystywane do przygotowania kondycjonowanej pożywki. Ostatecznie, e LSA jest używany do wykazania optymalnego stężenia substancji czynnej w kondycjonowanym pożywce wspierającej niezróżnicowany wzrost pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ procedura musi zostać ustandaryzowana, aby wyprodukować mysie fibroblasty Embry o wysokiej jakości, co umożliwi niezróżnicowany wzrost zarówno ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ izolacja i sekcja etapów zarodka są trudne do nauczenia, ponieważ obchodzenie się z zarodkiem myszy wymaga pewnych umiejętności manualnych. Procedurę zademonstruje dr Justina Suk, która jest doktorantką w moim laboratorium, a także doktorantką, Caterina Dres.

Po złożeniu w ofierze ciężarnej myszy w wieku 13 lub 14 dni, po wycięciu rogów macicy, krótko opłucz je w 70% etanolu i umieść w probówce Falcon zawierającej PBS w warunkach aseptycznych pod kapturem do hodowli tkankowej. Umieść rogi macicy na szalce Petriego i oddziel każdy zarodek od łożyska i worka embrionalnego. Usuń głowę i czerwone narządy, umyj pozostałe kawałki zarodka i PBS i umieść je na czystej szalce Petriego za pomocą sterylnej żyletki.

Na koniec zmielić tkankę, aż będzie można pipetować. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05% tripów w EDTA i 100 K jednostek na zarodek DNA. Następnie przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki Falcon i inkubuj ją przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po każdych pięciu minutach inkubacji należy rozdzielić komórki, dokładnie pipetując w górę iw dół. Dezaktywuj trypsynę, dodając około jednej objętości świeżo przygotowanej metamfetaminy. Średni. Odwirowywać komórki przez pięć minut na niskich obrotach.

Ostrożnie usunąć supinat i ponownie zawiesić osad w ciepłym podłożu metamfetaminy, przygotować 0,2% kolby pokryte żelatyną i inkubować przez co najmniej dwie godziny. W temperaturze pokojowej umieść komórki z około trzech do czterech zarodków w każdej 0,2% kolbie pokrytej żelatyną. Fibroblasty są jedynymi komórkami, które mają zdolność przyłączania się do kolb pokrytych żelatyną.

Po około 24 godzinach, gdy komórki osiągną płynność 80 do 90%, należy zamrozić niektóre komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do wykorzystania w przyszłości rozwiń pozostałe komórki do P trzy lub P cztery. Aby przygotować komórki zasilające przy użyciu matematyki P trzy P cztery, należy rozpocząć od pokrycia T one 50 kolb 0,2% żelatyną i inkubowanej temperatury pokojowej przez co najmniej dwie godziny.

Rozcieńczyć mitomycynę C w PBS i przefiltrować przez filtr strzykawkowy. Odessać pożywkę z metamfetaminy i przemyć je PBS bez wapnia i magnezu. Umieść 20 mililitrów pożywki zawierającej 10 mikrogramów na mililitr mitomycyny C na matematyce i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dwukrotnie umyj komórki PBS i wypróbuj je. Po inkubacji resus zawieś komórki w pożywce metamfetaminy, a następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś je w ciepłej metamfetaminie. Średni. Umieść komórki w gęstości 56 000 komórek na centymetr kwadratowy w kolbach T one 50 i inkubuj je przez noc następnego dnia po posianiu komórek metamfetaminy.

Zastąp pożywkę hodowlaną niekondycjonowaną pożywką HESC, uzupełnioną świeżymi czterema nanogramami na mililitr, FGF dwoma i inkubatorem 37 stopni Celsjusza. 24 godziny później zbierz kondycjonowaną pożywkę z kolb i zastąp ją świeżą pożywką HESC. Zebrane podłoże przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Powtarzaj pobieranie w sumie przez sześć dni po szóstym pobraniu. Połącz całe podłoże i przefiltruj je. Następnie przechowuj go w 50-mililitrowych porcjach w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby zmierzyć aktywność czynną w kondycjonowanym podłożu, doprowadź wszystkie próbki i odczynniki do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć substancję czynną w przeciwciałie w PBS za pomocą 1% BSA i dodać 100 mikrolitrów do studzienek mikropłytki. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.

Umyj studzienki trzykrotnie PBST. Następnie zablokuj studzienki na godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj aktywną krzywą wzorcową, obejmującą siedem rozcieńczeń i próbkę ślepą, używając zakresu roboczego od 0,25 do 32 nanogramów na mililitr.

Dodać duplikaty wzorców i próbek do studzienek i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki trzykrotnie PBST. Następnie dodaj biotynylowane przeciwciało drugorzędowe i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj studzienki trzykrotnie PBST i dodaj streptawidynę HRP. Po wymieszaniu i dodaniu podłoża owinąć ściany w celu ochrony przed światłem i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj.

Na koniec ustaw czytnik mikropłytek na cztery 50 nanometrów z korekcją długości fali na pięć 40 lub pięć 70 nanometrów i określ gęstość optyczną dla każdego pokazanego dołka. Oto typowa morfologia niezróżnicowanych h-komórek macierzystych, hodowanych w obecności komórek karmiących, kondycjonowanych, pożywki i zdefiniowanej pożywki. W tych przykładach PSC HI są hodowane w obecności komórek zasilających.

Obrazy te pokazują morfologię mitów i inaktywowanych komórek żywicielskich używanych do przygotowania kondycjonowanej pożywki. Ogólnie rzecz biorąc, komórki powinny zlewać się 24 godziny po izolacji i być gotowe do zamrożenia lub namnażania. Czasami jednak może minąć od dwóch do trzech dni, zanim uzyska się zlewające się kultury.

Kondycjonowaną pożywkę należy przygotować z komórek w czwartym pasażu, a nie później. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ komórki pierwotne mogą być ekspandowane tylko przez cztery do pięciu pasaży przed nadejściem starzenia. Cytokina aktywna w a jest uważana za jeden z najbardziej krytycznych czynników wydzielanych przez komórki żywicielskie w celu wspierania niezróżnicowanego wzrostu komórek pluripotencjalnych.

Pomiar poziomu aktywności w kondycjonowanym pożywce, jak pokazano tutaj, jest wygodnym testem ilościowym do monitorowania jakości mets Po opanowaniu izolację mysich fibroblastów zarodkowych można przeprowadzić w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wcześniejszym rozmnażaniu zwierząt oraz wcześniejszym przygotowaniu i autoklawowaniu wszystkich instrumentów.