Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie embrionalnych fibroblastów mysich odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiąga się to najpierw poprzez oddzielenie każdego embrionu i usunięcie głowy oraz narządów czerwonych. Następnie tkanka zostaje posiekana i poddana trawieniu.

Następnie komórki są wysiewane, po trzy do czterech embrionów na kolbę, i namnażane. Na koniec nieaktywne mity są wykorzystywane do przygotowania pożywki warunkującej. Ostatecznie e LSA jest stosowane w celu wykazania optymalnego stężenia substancji aktywnej w pożywce warunkującej, która wspiera wzrost niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ procedura musi być zestandaryzowana, aby uzyskać wysokiej jakości fibroblasty embrionalne myszy, które umożliwią niezróżnicowany wzrost zarówno ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy izolacji i sekcji embrionu są trudne do opanowania, gdyż manipulacja embrionem myszy wymaga określonych umiejętności manualnych. Procedurę zaprezentuje dr Justina Suk, postdoc w moim laboratorium, oraz doktorantka Caterina Dres.

Po uśmierceniu ciężarnej myszy w 13. lub 14. dniu po kopulacji i wycięciu rogów macicy, należy je krótko opłukać w 70% etanolu, a następnie w warunkach aseptycznych, pod dygestorium do hodowli tkankowych, umieścić w probówce Falcon zawierającej PBS. Rogi macicy należy przełożyć do szalki Petriego i oddzielić każdy embrion od łożyska oraz pęcherzyka zarodkowego. Za pomocą sterylnej żyletki należy usunąć głowę i organy czerwone, a pozostałe części embrionu przemyć PBS i przełożyć do czystej szalki Petriego.

Na koniec rozdrobnij tkankę do momentu, w którym będzie można ją pobrać pipetą. Następnie dodaj 1 mL 0,05% trypsyny w EDTA oraz 100 K jednostek DNazy na embrion. Potem przenieś tkankę do probówki Falcon o pojemności 50 mL i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.

Po każdych pięciu minutach inkubacji dysocjuj komórki, wielokrotnie pipetując zawiesinę w górę i w dół. Inaktywuj trypsynę, dodając objętość świeżo przygotowanego meth.Medium równą objętości zawiesiny. Odwiruj komórki przez pięć minut przy niskiej prędkości.

Ostrożnie usuń nadsącz i przesuspenduj osad w ciepłym medium meth. Przygotuj kolby pokryte 0,2% żelatyną i inkubuj przez co najmniej dwie godziny. W temperaturze pokojowej wysiej komórki z około trzech do czterech embrionów do każdej kolby pokrytej 0,2% żelatyną. Fibroblasty są jedynymi komórkami zdolnymi do przywierania do kolb pokrytych żelatyną.

Po około 24 godzinach, gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji, część z nich zamrozić w temperaturze minus 80 °C. Pozostałe komórki do późniejszego wykorzystania namnożyć do pasażu P3 lub P4. Aby przygotować komórki karmione (feeder cells) z linii P3 lub P4, najpierw pokryć kolby T150 0,2% żelatyną i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny.

Rozcieńczyć mitomycynę C w PBS i przefiltrować przez filtr strzykawkowy. Odessać pożywkę z tkanek i przemyć je PBS bez jonów wapnia i magnezu. Nanieść na tkanki 20 ml pożywki zawierającej 10 µg/ml mitomycyny C i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.

Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie PBS i poddać trypsynizacji. Po inkubacji zawiesić komórki w pożywce Meth, a następnie odwirkować je i ponownie zawiesić w ogrzanej pożywce Meth. Wysiać komórki z zagęszczeniem 56 000 komórek na centymetr kwadratowy w kolbach T150 i inkubować przez noc; dzień po wysianiu komórek Meth.

Wymień pożywkę hodowlaną na niekondycjonowaną pożywkę HESC, uzupełnioną o świeże 4 ng/mL FGF2, i inkubuj w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach zbierz pożywkę kondycjonowaną z kolb i zastąp ją świeżą pożywką HESC. Zebraną pożywkę przechowuj w temperaturze -20 °C.

Powtarzać pobieranie przez łącznie sześć dni po szóstej kolekcji. Połączyć całą pożywkę i przefiltrować ją. Następnie przechowywać w aliquotach 50 ml w temperaturze -80°C.

Aby zmierzyć poziom aktywnego in a w medium warunkującym, doprowadzić wszystkie próbki i odczynniki do temperatury pokojowej. Przeciwociało przeciwko aktywnemu in a rozcieńczyć w PBS z 1% BSA i dodać 100 µL do dołków mikropłytki. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.

Przemyj dołki trzykrotnie za pomocą PBST. Następnie zablokuj dołki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj aktywną krzywą wzorcową, obejmującą siedem rozcieńczeń oraz próbkę ślepą, stosując zakres roboczy od 0,25 do 32 ng/mL.

Nanieść standardy i próbki w dubletach do dołków i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć dołki trzykrotnie buforem PBST. Następnie dodać znakomione biotyną przeciwciało wtórne i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie należy trzy razy przemyć dołki roztworem PBST i dodać streptawidynę HRP. Po wymieszaniu i dodaniu substratu, należy osłonić ścianki przed światłem i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Do każdego dołka należy dodać 100 µL roztworu stopującego i delikatnie wymieszać.

Na koniec ustaw czytnik mikropłytek na 540 nm z korekcją długości fali przy 540 lub 570 nm i wyznacz gęstość optyczną dla każdego z pokazanych dołków. Oto typowa morfologia niezróżnicowanych hESC hodowanych w obecności komórek feeder, w pożywce kondycjonowanej oraz w pożywce zdefiniowanej. W tych przykładach HI PSC są hodowane w obecności komórek feeder.

Obrazy te przedstawiają morfologię komórek myths oraz inaktywowanych komórek karmicielek wykorzystywanych do przygotowania pożywki warunkowanej. Generalnie komórki powinny osiągnąć konfluencję 24 godziny po izolacji i być gotowe do zamrożenia lub ekspansji. Jednakże czasami uzyskanie konfluencyjnych kultur może zająć od dwóch do trzech dni.

Pożywkę warunkowaną należy przygotować z komórek na czwartym pasażu, nie później. Jest to kluczowe, ponieważ pierwotne komórki można namnażać jedynie przez cztery do pięciu pasaży przed wystąpieniem starzenia komórkowego. Cytokina aktywna w a jest uważana za jeden z najważniejszych czynników wydzielanych przez komórki karmione w celu wspierania niezróżnicowanego wzrostu komórek pluripotencjalnych.

Pomiar poziomu aktywności w pożywce kondycjonowanej, jak pokazano tutaj, jest wygodnym testem ilościowym służącym do monitorowania jakości metabolitów. Po opanowaniu techniki, izolacja embrionalnych fibroblastów mysich może zostać przeprowadzona w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby z wyprzedzeniem przeprowadzić hodowlę zwierząt oraz przygotować i wysterylizować w autoklawie wszystkie instrumenty.