Name: Przygotowanie mysich embrionalnych komórek fibroblastów odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę izolacji mysich embrionalnych fibroblastów do hodowli ludzkich komórek macierzystych. Procedura obejmuje przygotowanie zarodków, trawienie tkanek i ekspansję komórek w żelatynowych kolbach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Szczególne podziękowania kierujemy do dr. Borisa Grebera za opracowanie protokołu ELISA dla aktywiny A, zgodnie z opisem w pracy Greber et al. 2007. Jesteśmy szczególnie wdzięczni pani Monice Shevack za przygotowanie przeglądu graficznego. Wyrażamy ogromną wdzięczność dr. Heiko Fuchsowi za wszelką pomoc i cenne sugestie przed oraz w trakcie filmowania. Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Adjaye, a w szczególności Elisabeth Socha za zapewnienie stałych dostaw MEF i CM. Dziękujemy również naszym współpracownikom z jednostki doświadczalnej zwierząt MPIMG za nieustanne wsparcie. Praca ta była częściowo finansowana przez Towarzystwo Maxa Plancka oraz [BMBF; numer grantu 0315717A], partnerów inicjatywy ERASysBio+ wspieranej w ramach programu EU ERA-NET Plus w FP7.

1. Izolacja embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs)
Następujące dwa kroki są wykonywane w warunkach nieaseptycznych.
<ol>
	<li>Poddać eutanazji ciężarną mysz (CF1, Harlan, USA) w 13. lub 14. dniu po zapłodnieniu (d.p.c.) poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.</li>
	<li>Wypreparować rogi macicy, krótko opłukać w 70% (v/v) etanolu i umieścić w probówce typu falcon zawierającej PBS bez Ca2+Mg2+ (Gibco, Invitrogen).</li>
</ol>
Kolejne kroki są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, w warunkach aseptycznych i przy użyciu sterylnych narzędzi.
<ol start="3">
	<li>Umieścić rogi macicy w płytce Petriego i oddzielić każdy embrion od łożyska i pęcherzyka zarodkowego.</li>
	<li>Wypreparować głowę i narządy czerwone, przemyć w PBS i umieścić wszystkie embriony w czystej płytce Petriego. Tkankę drobno posiekać za pomocą sterylnej żyletki, aż stanie się możliwa do pobrania pipetą.</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA (Gibco, Invitrogen), zawierającej 100 jednostek Kunitza DNazy I (USB), na każdego embriona.</li>
	<li>Przenieść tkankę do probówki typu Falcon 50 ml i inkubować przez 15 min w 37 °C. Po każdych 5 min inkubacji dysocjować komórki poprzez dokładne pipetowanie w górę i w dół.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę, dodając około 1 objętości świeżo przygotowanej pożywki MEF. 
	Pożywka hodowlana MEF (składniki do przygotowania 500 ml pożywki, wymieszać wszystkie składniki i przefiltrować): 
	450 ml DMEM, 50 ml FBS (10% (v/v)), 5 ml 200 mM L-glutaminy (1/100 (v/v)), 5 ml penicyliny-streptomycyny (1/100 (v/v)).</li>
	<li>Odwirować komórki z niską prędkością (300 x g) przez 5 min, ostrożnie usunąć nadosad i resuspendować pellet komórkowy w ciepłej pożywce MEF.</li>
	<li>Przesiać liczbę komórek odpowiadającą około 3-4 embrionom do każdej kolby T150 (TPP) pokrytej 0,2% żelatyną (Gelatine from bovine skin, Type B, Sigma) na 2 h. Fibroblasty (P0, pasaż 0) są jedynymi komórkami, które mają zdolność do przylegania do kolb pokrytych żelatyną.</li>
	<li>W idealnych warunkach komórki osiągają 80-90% konfluencji po 24 h i na tym etapie większość komórek P0 jest mrożona do późniejszego użycia.</li>
	<li>Namnażać pozostałe kolby T150 z komórkami P0 do pasażu P3 lub P4, a następnie inaktywować i wykorzystać jako komórki feeder do ponownego wysiewania hESC lub do produkcji pożywki warunkowanej (CM).</li>
</ol>
2. Inaktywacja i wysiew MEF (Przygotowanie komórek karmicieli)
Wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Pokryć kolby T150 0,2% żelatyną i inkubować w RT przez co najmniej 2 h.</li>
	<li>Rozcieńczyć mitomycynę C w PBS (1 mg/ml) i przefiltrować.</li>
	<li>Odssać pożywkę z MEF i przemyć PBS bez Ca2+Mg2+.</li>
	<li>Nanieść 20 ml pożywki zawierającej 10 μg/ml mitomycyny C na MEF.</li>
	<li>Inkubować przez 2 h w 37 °C w pożywce z mitomycyną C, następnie przemyć dwukrotnie PBS, poddać trypsynizacji, odwirować (przez 5 min przy 300 x g) i resuspenderować komórki w ciepłej pożywce.</li>
	<li>Policzyć komórki i wysiać w kolbach T150 z gęstością 56.000 komórek/cm2, a następnie wykorzystać do produkcji CM przez kolejne 6 dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki warunkowanej (CM)
Wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach aseptycznych.
<ol>
	<li>Dzień po wysianiu inaktywowanych MEF z gęstością 56.000 komórek/cm2 należy zastąpić podłoże MEF podłożem hESC (UM, podłoże nieuwarunkowane) (0.5 ml/cm2) świeżo uzupełnionym o 4 ng/ml FGF2.</li>
	<li>Po 24 h inkubacji należy zebrać CM z kolb z warstwą karmidła i dodać do karmidła świeże podłoże hESC zawierające 4 ng/ml FGF2.</li>
	<li>Procedurę tę należy powtarzać przez kolejne 6 dni. Każdego dnia zebrane CM należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Po 6 dniach należy wymieszać wszystkie alikwoty podłoża i przefiltrować (Corning, 0.22 μm, PAS). Należy przygotować alikwoty po 50 ml i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przed dodaniem do hESC hodowanych na Matrigelu, CM należy uzupełnić o dodatkowe 4 ng/ml FGF2.</li>
</ol>
4. Pomiar zawartości aktywiny A w pożywce warunkującej (ELISA)15
<ol>
	<li>Doprowadzić wszystkie próbki i odczynniki do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało przechwytujące (Human\Mouse\Rat Activin A MAb, R&amp;D Systems) w PBS z 1% BSA, dodać do mikropłytki (100 μl/dołek) i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 24 h przemyć dołki trzykrotnie PBST (PBS z 0,05% Tween 20) (300 μl/dołek), a następnie zablokować (1% BSA/PBS, 300 μl/dołek) przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W tym czasie przygotować krzywą standardową dla Activin A (R&amp;D Systems), obejmującą 7 rozcieńczeń (stężenie poniżej 30 ng/ml) oraz próbkę ślepą. Liniowy zakres roboczy dla Activin A wynosi od 0,25 do 32 ng/ml.</li>
	<li>Dodać dublety standardów i próbek do dołków (100 μl/dołek) i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć dołki trzykrotnie (300 μl PBST).</li>
	<li>Dodać przeciwciało wtórne (biotynilowane) (Human/Mouse/Rat Biotinylated Activin A MAb, R&amp;D Systems) (0,25 μg/ml w 1% BSA/PBS) i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć dołki trzykrotnie (300 μl PBST), dodać Streptawidynę-HRP (rozcieńczoną w 1% BSA/PBS, R&amp;D Systems) i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć dołki trzykrotnie (300 μl PBST), dodać 100 μl roztworu substratu (Quantikine, R&amp;D Systems) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu stopującego (Quantikine, R&amp;D Systems) do każdego dołka i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Ustawić czytnik mikropłytek (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) na 450 nm, z korekcją długości fali przy 540 lub 570 nm, aby wyznaczyć gęstość optyczną każdego dołka.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Ogólny schemat procedury izolacji przedstawiono na Rysunku 1. Typowa morfologia hESC i hiPSC hodowanych w różnych warunkach przedstawiona jest na Rysunku 2. Morfologia MEF oraz nieaktywnych komórek karmiacych użytych do przygotowania CM przedstawiona jest na Rysunku 3. Generalnie komórki powinny osiągnąć konfluencję 24 godziny po izolacji i być gotowe do zamrożenia lub namnożenia. Czasami jednak uzyskanie konfluencyjnych kultur może zająć od 2 do 3 dni. CM należy przygotować z komórek na 4. pasażu lub wcześniej. Jest to kluczowe, ponieważ komórki pierwotne można namnażać jedynie przez 4-5 pasaży przed wystąpieniem starzenia się komórek.
Cytokina aktywina A jest uważana za najważniejszy czynnik wydzielany przez komórki zasilające w celu wsparcia niezróżnicowanego wzrostu komórek pluripotencjalnych14. Pomiar poziomu aktywiny A w CM (Rycina 4) jest bardzo wygodnym testem ilościowym służącym do monitorowania jakości MEF.
<img alt="Schemat sekcji ciężarnej myszy; przygotowanie komórek embrionalnych, obejmuje użycie trypsyny, płukanie w PBS." src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja procedury izolacji MEF.
<img alt="Porównanie wzrostu hESC i iPSC w mikroskopii; nieaktywne MEF, medium warunkowane, medium zdefiniowane." src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Typowa morfologia niezróżnicowanych hESC hodowanych w obecności (A) komórek karmicieli, (B) medium warunkowanego oraz (C) medium zdefiniowanego. Typowa morfologia hiPSC hodowanych w obecności (D, E) komórek karmicieli.
<img alt="Porównanie kultur komórek MEF, aktywnych i inaktywowanych, obraz mikroskopowy, analiza morfologii komórkowej." src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Typowa morfologia zarodkowych fibroblastów mysich (MEFs). (A) Pasaż 0 (P0) dwa dni po wysianiu/izolacji, (B) inaktywowana warstwa feederów przy gęstości 56.000 komórek/cm.2
<img alt='Wykres słupkowy przedstawiający poziomy Aktywiny A w UM, CM"1"(CF1) i CM"2"(CF1); wyniki analizy białek.' src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Pomiary stężenia Aktywiny A w pożywce warunkującej (CM) przygotowanej z zarodkowych fibroblastów mysich pochodzących z linii myszy CF1, wykonane za pomocą testu ELISA. CM była zbierana przez 6 dni, a następnie połączona. CM"1" i CM"2" odnoszą się do różnych partii pożywek, a UM do pożywki niewarunkowanej. Ponieważ funkcją procesu warunkowania jest sekrecja Aktywiny A do pożywki przez MEF, Aktywina A jest niemal niewykrywalna w UM.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Ludwig, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Yao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+and+directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).</li>
<li>Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+conditions+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Defined culture conditions of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).</li>
<li>Skottman, H., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132, 691-698 (2006).</li>
<li>Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Richards, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+various+human+feeders+for+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 21, 546-556 (2003).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+layers+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Human feeder layers for human embryonic stem cells.</a> Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).</li>
<li>Inzunza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Human+Amniotic+Mesenchymal+Cells+as+Feeder+Layers+to+Sustain+Propagation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+the+Undifferentiated+State%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State.</a> Cell Reprogram. , (2011).</li>
<li>Eiselleova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+%28hESCs%29+to+support+hESC+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li>
<li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FNodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj procedura izolacji MEF umożliwia ustanowienie zestandaryzowanych warunków hodowli dla hESC i hiPSC. Ponadto system oparty na metodzie ELISA, wykorzystywany do oceny produkcji cytokin przez komórki dokarmiające, jest użytecznym wskaźnikiem jakości pożywki kondycjonowanej pochodzącej z MEF. Rutynowe utrzymywanie szczepu myszy (CF1) dostarczającego fibroblastów wspierających jest niezbędne, aby uniknąć różnic między partiami pożywek hodowlanych. Ponadto zaleca się jednoczesną izolację embrionów z kilku myszy w celu uzyskania spójnej jakości komórek. Świeżo izolowane MEF mogą być oczywiście przechowywane w zamrożeniu na etapach P0 i P1. Również inaktywowane MEF mogą być przechowywane w zamrożonych alikwotach o odpowiednich ilościach, w zależności od wymagań hodowli komórkowej. Zazwyczaj do hodowli hESC i komórek iPS w pojedynczej studience płytki 6-dołkowej należy wysiać około 250.000 komórek. Ustanowiona i zoptymalizowana metoda może być rutynowo stosowana w celu zminimalizowania zmienności pomiędzy różnymi eksperymentami.

<table><tbody><tr><td>DMEM (wysoka zawartość glukozy)</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Próżniowy system filtracji</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>500 ml, 0.22 &amp;mu;m, PAS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy Knockout</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Nieessentialne aminokwasy</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało anty-aktywina A (człowiek/mysz/szczur)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BAM3381</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>MAb przeciwko aktywinie A (człowiek/mysz/szczur)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB3381</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki tęczówkowe ekstra cienkie</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Graefe ekstra precyzyjna</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Pierse do fiksacji</td><td>FST</td><td>18155-13</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Ogólnie rzecz biorąc, ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) oraz ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)1 mogą być hodowane w zmiennych warunkach. Niemniej jednak stworzenie skutecznego systemu hodowli tych komórek nie jest łatwe. Ponieważ warunki hodowli mogą wpływać na ekspresję genów nadających pluripotencjalność hESCs i hiPSCs, optymalizacja i standaryzacja metody hodowli są kluczowe.
Ustanowienie linii hESC zostało po raz pierwszy opisane z wykorzystaniem MEF jako komórek zasilających oraz pożywki hodowlanej zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS)2. Następnie FBS zastąpiono zamiennikiem surowicy knockout (KSR) oraz FGF2, co zwiększyło proliferację hESC3. W końcu systemy hodowli bezkomórkowych (feeder-free) umożliwiły hodowlę komórek na płytkach pokrytych Matrigelem w warunkowanej pożywce zawierającej KSR (pożywka warunkowana przez MEF)4. W kolejnym etapie warunki hodowli hESC ewoluowały w stronę hodowli bezkomórkowej w warunkach chemicznie zdefiniowanych5-7. Ponadto, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia patogenami i białkami zwierzęcymi, opracowano metody hodowli z wykorzystaniem komponentów wolnych od produktów pochodzenia zwierzęcego (xeno-free)8.
Aby uzyskać lepsze warunki, komórki karmące myszy zastąpiono ludzkimi liniami komórkowymi (np. płodowymi komórkami mięśniowymi i skórnymi9, dorosłymi komórkami skóry10, fibroblastami napletka11-12, mezenchymalnymi komórkami błony płodowej13). Jednakże wydajność utrzymywania niezróżnicowanych hESC z wykorzystaniem warstw karmących pochodzących z ludzkich fibroblastów napletka nie jest tak wysoka, jak w przypadku mysich komórek karmących, co wynika z niższego poziomu wydzielania aktywiny A14. Oczywiście istnieje wyraźna różnica w produkcji czynników wzrostu przez mysie i ludzkie komórki karmące.
Analizy transkryptomów komórek karmicieli mysich i ludzkich ujawniły istotne różnice między komórkami wspierającymi a niewspierającymi. Egzogenny FGF2 jest kluczowy dla utrzymania zdolności do samoodnowy hESC i hiPSC i został zidentyfikowany jako kluczowy czynnik regulujący ekspresję Tgfβ1, aktywiny A oraz gremliny (antagonisty BMP) w komórkach karmicielach. Wykazano, że aktywina A indukuje ekspresję OCT4, SOX2 i NANOG w hESC15-16.
W przypadku hodowli długoterminowej, hESC i hiPSC można hodować na mitotycznie inaktywowanych MEF lub w warunkach bezfeederowych w MEF-CM (medium warunkowanym przez MEF) na płytkach pokrytych Matrigelem, aby utrzymać ich niezróżnicowany stan. Sukces obu warunków hodowli w pełni zależy od jakości komórek feederowych, ponieważ bezpośrednio wpływają one na wzrost hESC.
W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowaną metodę izolacji i hodowli embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs), przygotowania pożywki warunkowanej (CM) oraz testu immunoenzymatycznego (ELISA) w celu oceny poziomu aktywiny A w pożywkach.

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnie rzecz biorąc, ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) oraz ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC)1 mogą być hodowane w zmiennych warunkach. Jednakże, ono ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie embrionalnych fibroblastów mysich odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiąga się to najpierw poprzez oddzielenie każdego embrionu i usunięcie głowy oraz narządów czerwonych. Następnie tkanka zostaje posiekana i poddana trawieniu.Następnie komórki są wysiewane, po trzy do czterech embrionów na kolbę, i namnażane. Na koniec nieaktywne mity są wykorzystywane do przygotowania pożywki warunkującej. Ostatecznie e LSA jest stosowane w celu wykazania optymalnego stężenia substancji aktywnej w pożywce warunkującej, która wspiera wzrost niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ procedura musi być zestandaryzowana, aby uzyskać wysokiej jakości fibroblasty embrionalne myszy, które umożliwią niezróżnicowany wzrost zarówno ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy izolacji i sekcji embrionu są trudne do opanowania, gdyż manipulacja embrionem myszy wymaga określonych umiejętności manualnych. Procedurę zaprezentuje dr Justina Suk, postdoc w moim laboratorium, oraz doktorantka Caterina Dres.Po uśmierceniu ciężarnej myszy w 13. lub 14. dniu po kopulacji i wycięciu rogów macicy, należy je krótko opłukać w 70% etanolu, a następnie w warunkach aseptycznych, pod dygestorium do hodowli tkankowych, umieścić w probówce Falcon zawierającej PBS. Rogi macicy należy przełożyć do szalki Petriego i oddzielić każdy embrion od łożyska oraz pęcherzyka zarodkowego. Za pomocą sterylnej żyletki należy usunąć głowę i organy czerwone, a pozostałe części embrionu przemyć PBS i przełożyć do czystej szalki Petriego.Na koniec rozdrobnij tkankę do momentu, w którym będzie można ją pobrać pipetą. Następnie dodaj 1 mL 0,05% trypsyny w EDTA oraz 100 K jednostek DNazy na embrion. Potem przenieś tkankę do probówki Falcon o pojemności 50 mL i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.Po każdych pięciu minutach inkubacji dysocjuj komórki, wielokrotnie pipetując zawiesinę w górę i w dół. Inaktywuj trypsynę, dodając objętość świeżo przygotowanego meth.Medium równą objętości zawiesiny. Odwiruj komórki przez pięć minut przy niskiej prędkości.Ostrożnie usuń nadsącz i przesuspenduj osad w ciepłym medium meth. Przygotuj kolby pokryte 0,2% żelatyną i inkubuj przez co najmniej dwie godziny. W temperaturze pokojowej wysiej komórki z około trzech do czterech embrionów do każdej kolby pokrytej 0,2% żelatyną. Fibroblasty są jedynymi komórkami zdolnymi do przywierania do kolb pokrytych żelatyną.Po około 24 godzinach, gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji, część z nich zamrozić w temperaturze minus 80 °C. Pozostałe komórki do późniejszego wykorzystania namnożyć do pasażu P3 lub P4. Aby przygotować komórki karmione (feeder cells) z linii P3 lub P4, najpierw pokryć kolby T150 0,2% żelatyną i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny.Rozcieńczyć mitomycynę C w PBS i przefiltrować przez filtr strzykawkowy. Odessać pożywkę z tkanek i przemyć je PBS bez jonów wapnia i magnezu. Nanieść na tkanki 20 ml pożywki zawierającej 10 µg/ml mitomycyny C i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie PBS i poddać trypsynizacji. Po inkubacji zawiesić komórki w pożywce Meth, a następnie odwirkować je i ponownie zawiesić w ogrzanej pożywce Meth. Wysiać komórki z zagęszczeniem 56 000 komórek na centymetr kwadratowy w kolbach T150 i inkubować przez noc; dzień po wysianiu komórek Meth.Wymień pożywkę hodowlaną na niekondycjonowaną pożywkę HESC, uzupełnioną o świeże 4 ng/mL FGF2, i inkubuj w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach zbierz pożywkę kondycjonowaną z kolb i zastąp ją świeżą pożywką HESC. Zebraną pożywkę przechowuj w temperaturze -20 °C.Powtarzać pobieranie przez łącznie sześć dni po szóstej kolekcji. Połączyć całą pożywkę i przefiltrować ją. Następnie przechowywać w aliquotach 50 ml w temperaturze -80°C.Aby zmierzyć poziom aktywnego in a w medium warunkującym, doprowadzić wszystkie próbki i odczynniki do temperatury pokojowej. Przeciwociało przeciwko aktywnemu in a rozcieńczyć w PBS z 1% BSA i dodać 100 µL do dołków mikropłytki. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.Przemyj dołki trzykrotnie za pomocą PBST. Następnie zablokuj dołki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj aktywną krzywą wzorcową, obejmującą siedem rozcieńczeń oraz próbkę ślepą, stosując zakres roboczy od 0,25 do 32 ng/mL.Nanieść standardy i próbki w dubletach do dołków i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć dołki trzykrotnie buforem PBST. Następnie dodać znakomione biotyną przeciwciało wtórne i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Następnie należy trzy razy przemyć dołki roztworem PBST i dodać streptawidynę HRP. Po wymieszaniu i dodaniu substratu, należy osłonić ścianki przed światłem i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Do każdego dołka należy dodać 100 µL roztworu stopującego i delikatnie wymieszać.Na koniec ustaw czytnik mikropłytek na 540 nm z korekcją długości fali przy 540 lub 570 nm i wyznacz gęstość optyczną dla każdego z pokazanych dołków. Oto typowa morfologia niezróżnicowanych hESC hodowanych w obecności komórek feeder, w pożywce kondycjonowanej oraz w pożywce zdefiniowanej. W tych przykładach HI PSC są hodowane w obecności komórek feeder.Obrazy te przedstawiają morfologię komórek myths oraz inaktywowanych komórek karmicielek wykorzystywanych do przygotowania pożywki warunkowanej. Generalnie komórki powinny osiągnąć konfluencję 24 godziny po izolacji i być gotowe do zamrożenia lub ekspansji. Jednakże czasami uzyskanie konfluencyjnych kultur może zająć od dwóch do trzech dni.Pożywkę warunkowaną należy przygotować z komórek na czwartym pasażu, nie później. Jest to kluczowe, ponieważ pierwotne komórki można namnażać jedynie przez cztery do pięciu pasaży przed wystąpieniem starzenia komórkowego. Cytokina aktywna w a jest uważana za jeden z najważniejszych czynników wydzielanych przez komórki karmione w celu wspierania niezróżnicowanego wzrostu komórek pluripotencjalnych.Pomiar poziomu aktywności w pożywce kondycjonowanej, jak pokazano tutaj, jest wygodnym testem ilościowym służącym do monitorowania jakości metabolitów. Po opanowaniu techniki, izolacja embrionalnych fibroblastów mysich może zostać przeprowadzona w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby z wyprzedzeniem przeprowadzić hodowlę zwierząt oraz przygotować i wysterylizować w autoklawie wszystkie instrumenty.

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych mysich nadających się do hodowli ludzkich zarodkowych i indukowanych komórek macierzystych wielopotencjalnych

Ten film demonstruje sposób hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) na warstwie komórek karmicielskich z embrionalnych fibroblastów mysich (MEF). Część 1 z 3.

Od MEF do Matrigelu I: Pasażowanie hESC w obecności MEF

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film przedstawia metodę generowania prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Protokół zakłada hodowlę komórek macierzystych w pożywkach zawierających specyficzne inhibitory małocząsteczkowe, które ułatwiają proliferację i agregację komórek macierzystych w ciała zarodkowe (EB). Następnie EB są dysocjowane z enzymami i siane na płytkach hodowlanych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby promować ich różnicowanie w prekursory interneuronów korowych.

Generowanie prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Poznaj metodę izolacji mysich embrionalnych fibroblastów do hodowli ludzkich komórek macierzystych. Procedura obejmuje przygotowanie zarodków, trawienie tkanek i ekspansję komórek w żelatynowych kolbach.

Przygotowanie mysich embrionalnych komórek fibroblastów odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów