Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie gąbki z alkoholu poliwinylowego do modelowania gojenia ran u myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie nawodnienie i załadowanie gąbki przed implantacją. Następnie gąbkę umieszcza się w kieszeni między mięśniami brzucha a skórą myszy.

Po implantacji każdą gąbkę można następnie zastrzyknąć preparatem leczniczym. Ostatnim krokiem jest usunięcie gąbek z myszy. W dalszej kolejności można przeprowadzić barwienie przekrojów i analizy ilościowe, aby zaobserwować zmiany i różnice w procesie gojenia ran.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat gojenia ran, może zostać ona zastosowana również w innych obszarach badań, takich jak angiogeneza nowotworowa, dostarczanie leków oraz przeżycie i przyżycie wszczepionych komórek. Należy rozpocząć od nawodnienia gąbek poprzez mieszanie przez noc w 0,9% wodnym roztworze chlorku sodu. Następnie 75 mililitrów zawiesiny nawodnionej gąbki należy poddać autoklawowaniu przez 25 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.

Aby wysterylizować gąbki, umieść roztwór z gąbkami po autoklawowaniu w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie za pomocą sterylnej pęsety wyjmij jedną gąbkę, wyciśnij ją pęsetą i użyj końcówki próżniowej, aby usunąć z gąbki jak największą ilość roztworu. Następnie umieść wyciśniętą gąbkę na płytce do hodowli tkanek, dbając o zachowanie odstępów między gąbkami, i pipetuj roztwór traktujący bezpośrednio na środek gąbki. Następnie delikatnie dociśnij gąbkę końcówką pipety, aby ułatwić wchłanianie roztworu.

Po załadowaniu wszystkich gąbek, przechowywać płytkę w lodzie do momentu implantacji gąbek do myszy. Po potwierdzeniu sedacji za pomocą testu odruchowego uciskania, należy umieścić mysz w pozycji grzbietowej w stożku nosowym. Następnie, używając golarki elektrycznej, należy usunąć sierść z obszaru o wymiarach jednej na jedną uncję w dolnej części brzusznej myszy, poniżej klatki piersiowej.

Po zakończeniu przemyć obszar, aby usunąć obcięte włosy. Zdezynfekować ogoloną powierzchnię Betadine, a następnie 70% alkoholem. Następnie należy mocno napiąć skórę.

Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie pionowe, o długości od półtora do dwóch średnic gąbek, które mają zostać wprowadzone. Należy uważać, aby nie przeciąć jamy ciała. Użyj pęsety, aby uchwycić krawędź skóry.

Następnie za pomocą nożyczek Metzenbauma powoli oddziel skórę od mięśni po obu stronach nacięcia. Rozszerz kieszeń na całą szerokość myszy, od klatki piersiowej aż do tylnych kończyn. Teraz, używając pęsety, chwyć pierwszą gąbkę przeznaczoną do umieszczenia w zwierzęciu, ściskając ją z boków.

Następnie przenieś gąbkę na parę pęset prostych w taki sposób, aby była trzymana od góry i od dołu. Następnie chwyć i unieś krawędź skóry drugą pęsetą i powoli wprowadź gąbkę, unikając dotykania skóry lub znajdującego się pod nią mięśnia. Po wprowadzeniu wszystkich gąbek użyj pęsety, aby złożyć obie strony nacięcia, a następnie przeprowadź szew przez obie warstwy skóry.

Zaciśnij pierwszy rzut na tyle, aby jedynie zbliżyć brzegi skóry, a następnie zakończ węzeł chirurgiczny kolejnym rzutem w przeciwnym kierunku, tym razem mocno zaciągając węzeł. Następnie zawiąż dwa kolejne węzły chirurgiczne, aby sfinalizować szew.

Nałóż dodatkowe szwy, aby zamknąć całe nacięcie. Na koniec wyjmij zwierzę z systemu anestezji i monitoruj je do momentu odzyskania przytomności. Mysz powinna szybko zacząć się poruszać i odzyskać sprawność ruchową sprzed operacji.

Zacznij od napełnienia strzykawki odpowiednim roztworem, a następnie załóż do niej igłę o rozmiarze 28 G. Po potwierdzeniu sedacji poprzez ucisk palca, wprowadź igłę w ciało zwierzęcia pod kątem 45 stopni, przechodząc przez skórę w centrum gąbek, aby upewnić się, że igła znajduje się w gąbce. Powoli wyciągnij igłę pionowo w górę.

Jeśli igła znajduje się w gąbce, gąbka przesunie się w górę wraz z igłą. Następnie powoli wstrzyknij substancję do gąbki i wyjmij igłę. Po uśmierceniu zwierzęcia przytrzymaj skórę pęsetą i wykonaj nacięcie w pobliżu wybranej gąbki.

Na koniec ostrożnie oddziel gąbki od otaczającej je kapsułki, unikając pobierania dodatkowej tkanki wokół usuniętej gąbki. Gąbki można przechowywać w różnych warunkach, w zależności od rodzaju planowanej analizy. W celu wykonania skrawków, pobrane gąbki można zatopić w medium mrożącym, takim jak OCT (optimal cutting temperature compound), lub umieścić w 10% formalinie w celu zatopienia i cięcia w blokach parafinowych, tak jak zrobiono w przypadku tych gąbek barwionych H&E.

W przypadku tych przekrojów gąbek barwionych trireme najlepsze wyniki cięcia uzyskuje się, gdy gąbkę przekroi się na pół wzdłuż średnicy, jak pokazano tutaj, a następnie zatopi cięciem skierowanym w dół. Jak tutaj zademonstrowano, przekroje gąbki powinny być wykonywane w taki sposób, aby na rysunku widoczna była cała szerokość gąbki. Gąbka po lewej stronie została niewłaściwie zatopiona lub przecięta, co świadczy przerwany brzeg tkanki wzdłuż prawej strony przekroju, podczas gdy nienaruszona gąbka po prawej została przetworzona prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotowywać, implantować, wstrzykiwać i usuwać gąbki z alkoholu poliwinylowego w celu badania gojenia ran u myszy.