Name: Implantacja modelu gąbki z polialkoholu winylowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę implantacji gąbki PVA do badania gojenia ran u myszy. Technika umożliwia kontrolowane dostarczanie leków oraz analizę ilościową i histologiczną zmian w procesie regeneracji tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez grant R01-HL088424 z National Institutes of Health (NIH); nagroda merytoryczna Veterans Affairs dla PPY.

1. Przygotowanie gąbki
<ol>
	<li>Nawilż gąbki, mieszając je przez noc w 0.9% (w/v) wodnym roztworze chlorku sodu.</li>
	<li>Sterylizuj nawilżone gąbki w autoklawie. W przypadku objętości 75 mL autoklawuj przez 25 minut w temperaturze 121 °C.</li>
</ol>
Uwaga: Nasączanie gąbek preparatem zgodnie z opisem poniżej jest opcjonalne.
<ol start="3">
	<li>W sterylnej komorze z użyciem sterylnych narzędzi, wyjmij jedną gąbkę z roztworu za pomocą pęsety. Ściśnij gąbkę pęsetą i użyj końcówki do odsysania, aby usunąć z niej jak najwięcej roztworu. Umieść wyciśniętą gąbkę w naczyniu do hodowli tkankowej, dbając o zachowanie odstępów między gąbkami. Do rozdzielenia różnych grup badawczych można użyć wielodołkowych płytek.</li>
	<li>Pipetuj roztwór do badania bezpośrednio na środek gąbki. Po naniesieniu roztworu delikatnie dociśnij gąbkę końcówką pipety, co ułatwi jej wchłanianie płynu. Uwaga: stosowane przez nas gąbki o średnicy 6 mm i grubości 2,75 mm mogą pomieścić maksymalnie 25 μL.</li>
	<li>Po nasączeniu wszystkich gąbek, płytkę można przechowywać w lodzie do momentu ich implantacji u myszy.</li>
</ol>
2. Procedura chirurgiczna
<ol>
	<li>Odpowiednio znieczulić zwierzę i podać lek przeciwbólowy profilaktycznie. Cała procedura trwa około 20 minut na jedno zwierzę. W przypadku myszy o masie 30 g do indukcji i utrzymania znieczulenia stosuje się 1,5 litra tlenu na minutę z 1,5% izofluranem. Gdy zwierzę przestanie reagować na test odruchowy (uszczypnięcie), umieść je w pozycji grzbietnej w masce nosowej. Za pomocą maszynki elektrycznej ogolić obszar o wymiarach 1 cal na 1 cal w dolnej części brzucha, poniżej klatki piersiowej. Przetrzeć skórę, aby usunąć odcięte włosy.</li>
	<li>Zdezynfekować ogolony obszar, oczyszczając go betadyną, a następnie 70% alkoholem. Powtórzyć to oczyszczanie betadyną i alkoholem trzykrotnie.</li>
	<li>Naciągając skórę, wykonać skalpelem nacięcie pionowe o długości 1,5-2 razy większej od średnicy gąbek przeznaczonych do implantacji, uważając, aby nie przeciąć jamy ciała.</li>
	<li>Za pomocą pęsety przytrzymać krawędź skóry i powoli rozpocząć oddzielanie skóry od mięśni po obu stronach nacięcia, używając nożyczek Metzenbauma. Kieszeń powinna obejmować całą szerokość myszy, od klatki piersiowej aż do tylnych kończyn.</li>
	<li>Za pomocą pęsety chwycić pierwszą gąbkę do implantacji, ściskając ją z boków. Przenieść gąbkę na pęsetę prostą w taki sposób, aby była trzymana od góry i od dołu.</li>
	<li>Używając pęsety, unieść krawędź skóry, aby umożliwić wprowadzenie gąbki. Powoli wprowadzić gąbkę, starając się nie dotykać skóry ani znajdujących się pod nią mięśni, ponieważ gąbka będzie trudna do przesunięcia po zetknięciu z tkanką. Powtórzyć czynność dla wszystkich gąbek.</li>
	<li>Po wprowadzeniu wszystkich gąbek nałożyć dwa lub trzy szwy w celu zamknięcia nacięcia. Użyć pęsety, aby złączyć obie strony nacięcia, i przeciągnąć nić szwu przez obie warstwy skóry. Pierwszy splot zacisnąć tylko na tyle, aby zbliżyć brzegi skóry. Zakończyć węzeł kwadratowy kolejnym splotem z przeciwnej strony, tym razem mocno zaciągając węzeł. Następnie zawiązać dwa kolejne węzły kwadratowe, aby sfinalizować szew (Rycina 2). Nałożyć dodatkowe szwy, aby zamknąć całe nacięcie. Można zastosować inne metody zamykania rany, takie jak klej skórny (dermabond), klipsy chirurgiczne lub zszywki.</li>
	<li>Wyjąć zwierzę z systemu znieczulającego i monitorować je do czasu odzyskania przytomności. Zwierzę powinno szybko zacząć się poruszać i odzyskać sprawność sprzed operacji. Upewnić się, że zwierzę ma swobodny dostęp do pokarmu i wody. Na dnie klatki można umieścić nieco nawilżonego pokarmu, aby wspomóc rekonwalescencję. Kontynuować codzienne monitorowanie zwierzęcia pod kątem oznak stresu lub dyskomfortu oraz sprawdzać miejsce nacięcia pod kątem infekcji, stanu zapalnego i rozstępu rany. Podjąć odpowiednie działania w przypadku wystąpienia jakichkolwiek powikłań w procesie powrotu do zdrowia.</li>
</ol>
3. Opcjonalna iniekcja
Uwaga: Po zaimplantowaniu gąbek do organizmu zwierzęcia można wstrzyknąć do nich roztwór komórek, leków, czynników wzrostu itp. Pozwala to na analizę efektów wstrzykniętej substancji przy różnych czasach dostarczania i schematach podawania. W przypadku wykonywania iniekcji należy zawsze zastosować grupę kontrolną.
<ol>
	<li>Aby wstrzyknąć do gąbki pożądany roztwór, należy najpierw określić ilość substancji do podania myszy. Substancja musi być skoncentrowana w taki sposób, aby objętość iniekcji stanowiła mniej niż połowę całkowitej objętości, jaką może pomieścić gąbka.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę do iniekcji (dla myszy stosuje się igłę 28 G).</li>
	<li>Zznieczulić zwierzę, któremu mają być wykonane iniekcje.</li>
	<li>Iniekcję można podać, gdy zwierzę przestanie reagować na test uszczypnięcia.</li>
	<li>Aby wykonać iniekcję, należy wprowadzić igłę pod kątem 45° przez skórę w centrum gąbki. Następnie należy wprowadzić igłę w gąbkę tylko do połowy jej grubości. Celem jest wykonanie wstrzyknięcia dokładnie w centrum gąbki.</li>
	<li>Aby upewnić się, że igła znajduje się w gąbce, należy powoli unieść igłę pionowo. Jeśli igła jest w gąbce, gąbka powinna unieść się wraz z nią.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć roztwór do gąbki i wyjąć igłę. W przypadku wielu gąbek wymagających iniekcji możliwe jest, że część wstrzykniętego płynu zostanie wypchnięta przez poprzednie miejsca wkłucia.</li>
</ol>
4. Usuwanie gąbki
Uwaga: Podczas usuwania gąbki należy obchodzić się z nią z nadzwyczajną ostrożnością. Należy unikać przebijania gąbki instrumentami chirurgicznymi oraz zapobiegać nadmiernemu krwawieniu do gąbki poprzez omijanie głównych tętnic w tkankach otaczających.
<ol>
	<li>Po eutanazji zwierzęcia należy usunąć gąbkę, odchylając skórę pęsetą i wykonując nacięcie w bezpośrednim sąsiedztwie gąbki.</li>
	<li>Należy ostrożnie oddzielić gąbki od otaczającej je torebki, unikając pobierania nadmiaru tkanki wokół gąbki. W przypadku analiz takich jak dostarczanie leków czy morfometria, wycięcie nie musi być tak precyzyjne.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Usunięte gąbczaki można przechowywać w różnych warunkach, w zależności od rodzaju planowanej analizy. W celu wykonania skrawków, pobrane gąbczaki można zatopić w medium do mrożenia, takim jak związek Optimal Cutting Temperature (O.C.T.), lub umieścić w 10% formalinie w celu zatopienia i cięcia w blokach parafinowych (Rysunek 3A i B). Najlepsze wyniki przy przygotowywaniu skrawków uzyskuje się, gdy gąbczak zostanie przecięty na pół wzdłuż średnicy i zatopiony powierzchnią cięcia skierowaną w dół (Rysunek 4A i B). Skrawki gąbczaka należy pobierać w taki sposób, aby objęły one całą szerokość tkanki. Na Rysunku 3A przedstawiono dwa gąbczaki; gąbczak po lewej został zatopiony/pocięty nieprawidłowo, natomiast gąbczak po prawej został przetworzony prawidłowo.
Do analizy gąbki można umieścić w probówce Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia obróbki. Do analizy RNA oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym gąbki należy umieścić w probówce Eppendorfa, zamrozić szokowo i przechowywać w temperaturze -80 °C. Dodatkowo, w celu stabilizacji RNA dla bezpiecznego przechowywania w wyższych temperaturach, można zastosować konserwant RNA, taki jak RNAlater firmy QIAGEN. Płyn z rany można zebrać poprzez wyciskanie gąbek nad probówką i łączenie płynów z wielu gąbek w celu uzyskania reprezentatywnej próbki. Z gąbek można również wyizolować żywe komórki, takie jak fibroblasty, makrofagi i limfocyty. Po wyjęciu z organizmu zwierzęcia gąbki można umieścić w odpowiednim medium dla pożądanego typu komórek. Gąbki można poddać obróbce w celu uwolnienia komórek metodami fizycznymi (np. poprzez rozdrabnianie) lub enzymatycznymi (np. przy użyciu kolagenazy).
<img alt="Analiza porowatości; Próbki materiałów w stopniowanych rozmiarach; Diagram porównawczy; Badanie struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/3885/3885fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Odwodnione dyski z gąbki PVA w trzech różnych rozmiarach.
<img alt="Zanarkotyzowany szczur z przygotowaniem chirurgicznym, miejsca nacięć skóry zaznaczone strzałkami." src="/files/ftp_upload/3885/3885fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Obraz modelu gojenia ran u myszy pokazujący położenie rany bocznej oraz czterech gąbek PVA.
<img alt="Analiza histologiczna; barwione przekroje tkanek; badanie porównawcze; obraz mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/3885/3885fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3."> 
Rysunek 3. (A) Barwienie H &amp; E przy powiększeniu 4x oraz (B) barwienie trychromowe przy powiększeniu 10x przekrojów gąbek zatopionych w parafinie.
<img alt="Eksperyment z rusztowaniem wydrukowanym w 3D, przygotowanie hydrożelu, manipulacja materiałem pęsetą do analizy." src="/files/ftp_upload/3885/3885fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4."> 
Rysunek 4. (A) Obraz gąbki przekrojonej na pół wzdłuż średnicy. (B) Połowa gąbki PVA, zatopiona stroną przekroju do dołu w OCT.

<ol><li>Efron, D. T., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+sponge+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous sponge models.</a> Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).</li>
<li>Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+use+in+wound+healing+research%3A+a+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair. 8, 83-96 (2000).</li>
<li>Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+growth+factors+in+vivo.+I.+Cell+ingrowth+into+porous+subcutaneous+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers.</a> Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).</li>
<li>Alaish, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+polyvinyl+alcohol+sponge+and+expanded+polytetrafluoroethylene+subcutaneous+implants+as+models+to+evaluate+wound+healing+potential+in+human+beings%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings.</a> Wound Repair. 3, 292-298 (1995).</li>
<li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol.+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models for wound repair.</a> Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).</li>
<li>Alfaro, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sFRP2+suppression+of+bone+morphogenic+protein+%28BMP%29+and+Wnt+signaling+mediates+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+self-renewal+promoting+engraftment+and+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair.</a> J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).</li>
<li>Andrade, S. P., Ferreira, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sponge+implant+model+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sponge implant model of angiogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).</li>
<li>Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcutaneous+implant+for+wound+healing+studies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">A subcutaneous implant for wound healing studies in humans.</a> J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).</li>
<li>Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+studying+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel method of studying wound healing.</a> J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).</li>
<li>Lindblad, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+selecting+the+correct+animal+model+for+dermal+wound-healing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Model gojenia ran z użyciem gąbki posiada wiele wariantów; można go przeprowadzić u wielu różnych gatunków, w tym u ludzi, a gąbki mogą być również implantowane grzbietowo 1,2,8. W badaniach na ludziach i niektórych innych gatunkach gąbki mogą wymagać umieszczenia w porowatej rurce silikonowej, aby zapobiec ich enkapsulacji oraz ułatwić późniejsze usunięcie 4,8. Miejsce implantacji gąbki można zmieniać w zależności od pożądanych wyników i umiejętności technika. Implantacja grzbietowa dopuszcza przemieszczanie się gąbek pod skórą, podczas gdy implanty brzuszne są trudniejsze do wykonania ze względu na ryzyko przecięcia powłok i dostania się do jamy brzusznej. Gąbki można połączyć z cewnikiem, aby podawanie leku było stałe i kontrolowane, co eliminuje konieczność wielokrotnych iniekcji9. Mniejsze, rurkowate gąbki można nawet podać za pomocą igły8. Skład gąbek nie ogranicza się wyłącznie do alkoholu poliwinylowego. Mogą być one przygotowane z wielu materiałów, stosowanych pojedynczo lub w kombinacjach7.
 Kluczowe jest, aby przygotowanie gąbek i ich umieszczenie w organizmie zwierzęcia były spójne i odpowiednio zrozumiane. Jeśli gąbki są wycinane z arkuszy, muszą mieć zbliżoną masę w celu zapewnienia porównywalności. W przypadku ładowania gąbek komórkami lub preparatem terapeutycznym, ilość umieszczona w każdej gąbce musi być dokładna. Proces gojenia może różnić się w zależności od miejsca umieszczenia gąbki w organizmie zwierzęcia, a tempo gojenia spada wraz ze wzrostem odległości od głowy 1,10.

<table><tbody><tr><td>Gąbka PVA</td><td>Medtronic Inc.</td><td>CF120</td><td>Rozmiar i porowatość gąbki zależą od eksperymentu</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela rozmiar 15</td><td>BD Biosciences</td><td>371115</td><td></td></tr><tr><td>Nożyce Metzenbauma</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>79-211</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12004-16</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa nić chirurgiczna 5-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>698</td><td></td></tr><tr><td>Preparat O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Gojenie ran jest złożonym, wieloetapowym procesem angażującym wiele typów komórek, czynników wzrostu i związków chemicznych1-3. Ze względu na tę złożoność, badania nad gojeniem ran są najbardziej kompleksowe, gdy są prowadzone in vivo. Dostępnych jest wiele modeli in vivo do badania gojenia ran ostrych, w tym modele nacięć, wycięcia, martwej przestrzeni oraz oparzeń. Modele martwej przestrzeni to sztuczne, porowate implanty wykorzystywane do badania tworzenia tkanek oraz wpływu substancji na ranę. Do najczęściej stosowanych modeli martwej przestrzeni należą gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA), stalowe cylindry z siatki drucianej, materiał z rozszerzonego politetrafluoroetylenu (ePTFE) oraz Cellstick1,2.
Każdy model martwej przestrzeni ma swoje ograniczenia wynikające ze składu materiału oraz metod implantacji. Model z cylindra z stalowej siatki drucianej wykazuje fazę opóźnienia infiltracji po implantacji i wymaga długiego czasu przed rozpoczęciem formowania się tkanki ziarninowej1. Późniejsze etapy gojenia ran najlepiej analizować przy użyciu modelu ePTFE1,4. Cellstick to model z gąbki celulozowej wewnątrz rurki silikonowej, zazwyczaj stosowany do badania ran pooperacyjnych u ludzi oraz płynu z rany2. Zastosowanie gąbki PVA ogranicza się do badań ostrych, ponieważ z czasem zaczyna ona wywoływać reakcję na ciało obce, co prowadzi do reakcji komórek olbrzymich u zwierzęcia5. W przeciwieństwie do innych materiałów, gąbki PVA są łatwe do wprowadzenia i usunięcia, wykonane z materiałów obojętnych i niebiodegradowalnych, a jednocześnie na tyle miękkie, że można je pociąć do analizy histologicznej2,5.
W procesie gojenia ran gąbka z PVA jest bardzo użyteczna do analizy tworzenia się tkanki ziarnistej, odkładania kolagenu, składu wysięku z rany oraz wpływu substancji na proces gojenia1,2,5. Poza zastosowaniem w badaniu szerokiego spektrum cech gojenia ran, gąbka z PVA była wykorzystywana w wielu innych rodzajach badań. Stosowano ją do badania angiogenezy nowotworowej, dostarczania leków oraz przeżywalności i engraftmentu komórek macierzystych1,2,6,7. Dzięki swojej dużej modyfikowalności, wcześniejszemu szerokiemu zastosowaniu i powtarzalnym wynikom, gąbka z PVA stanowi idealny model dla wielu badań1,2.
W niniejszej pracy przedstawimy przygotowanie, implantację oraz odzysk i analizę dysków z gąbki PVA (Rysunek 1) w mysim modelu gojenia ran.

Opisano przydatne narzędzie do analizy wpływu leków, czynników wzrostu i/lub zmodyfikowanych komórek w modelu zwierzęcym gojenia ran. Technika ta wykorzystuje właściwości gąbki z alkoholu poliwinylowego (PVA) do dostarczania i utrzymywania pożądanego preparatu, a także stanowi platformę, którą można wyciąć i poddać analizie.

Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

Gojenie ran to skomplikowany, wieloetapowy proces z udziałem wielu typów komórek, czynników wzrostu i związków 1-3. Ze względu na tę złożoność, gojenie ran ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie gąbki z alkoholu poliwinylowego do modelowania gojenia ran u myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie nawodnienie i załadowanie gąbki przed implantacją. Następnie gąbkę wprowadza się do kieszeni pomiędzy mięśniem brzusznym a skórą myszy.Po implantacji do każdej gąbki można wstrzyknąć preparat leczniczy. Ostatnim krokiem jest usunięcie gąbek z organizmu myszy. W dalszej kolejności można przeprowadzić cięcie na przekroje, barwienie oraz analizy ilościowe, aby zaobserwować zmiany i warianty w procesie gojenia ran.Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w proces gojenia ran, można ją również zastosować w innych obszarach badań, takich jak angiogeneza nowotworowa, dostarczanie leków oraz przeżywalność i przyjmowanie się wszczepionych komórek. Należy rozpocząć od nawodnienia gąbek poprzez mieszanie ich przez noc w 0,9% wodnym roztworze chlorku sodu. Następnie 75 ml zawiesiny nawodnionych gąbek należy autoklawować przez 25 minut w temperaturze 121°C.Aby wysterylizować gąbki, umieść roztwór z gąbkami po autoklawowaniu w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie za pomocą sterylnej pęsety wyjmij jedną gąbkę, wyciśnij ją pęsetą i użyj końcówki próżniowej, aby usunąć z gąbki jak najwięcej roztworu. Następnie umieść wyciśniętą gąbkę w płytce do hodowli tkankowej, dbając o zachowanie odstępów między gąbkami, i nanieś pipetą roztwór do traktowania bezpośrednio na środek gąbki. Następnie delikatnie dociśnij gąbkę końcówką pipety, aby ułatwić wchłanianie roztworu.Po załadowaniu wszystkich gąbek, przechowywać płytkę w lodzie do momentu implantacji gąbek do myszy. Po potwierdzeniu sedacji za pomocą testu odruchowego (uszczypnięcie), umieścić mysz w pozycji grzbietowej, stosując stożek nosowy. Następnie, używając golarki elektrycznej, usunąć sierść z obszaru o wymiarach jeden na jeden cal w dolnej części brzusznej myszy, poniżej klatki piersiowej.Następnie przetrzeć obszar, aby usunąć odcięte włosy. Zdezynfekować ogoloną skórę Betadyną, a następnie 70% alkoholem. W kolejnym kroku naciągnąć skórę.Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie pionowe o długości od półtora do dwóch razy większej niż średnica wkładanych gąbek. Należy uważać, aby nie przeciąć jamy ciała. Użyj pęsety, aby uchwycić krawędź skóry.Następnie za pomocą nożyczek Metzenbauma powoli oddzielić skórę od mięśni po obu stronach nacięcia. Rozszerzyć kieszeń na szerokość ciała myszy, od klatki piersiowej aż do tylnych kończyn. Teraz, używając pęsety, chwycić pierwszą gąbkę przeznaczoną do umieszczenia w organizmie zwierzęcia, ściskając ją z boków.Następnie przenieś gąbkę na parę pęset prostych w taki sposób, aby była utrzymywana od góry i od dołu. Następnie chwyć i unieś krawędź skóry drugą pęsetą i powoli wprowadź gąbkę, unikając dotykania skóry lub leżącego pod nią mięśnia. Po wprowadzeniu wszystkich gąbek użyj pęsety, aby zbliżyć do siebie oba brzegi nacięcia, a następnie przeprowadź nici chirurgiczne przez obie warstwy skóry.Zaciśnij pierwszy splot wystarczająco mocno, aby zbliżyć brzegi skóry, a następnie zakończ węzeł kwadratowy kolejnym splotem w przeciwnym kierunku, tym razem mocno dociągając węzeł. Następnie zawiąż dwa kolejne węzły kwadratowe, aby zakończyć szycie.Nałóż dodatkowe szwy, aby zamknąć całe nacięcie. Na koniec wyjmij zwierzę z systemu anestezji i monitoruj je, aż odzyska przytomność. Mysz powinna szybko zacząć się poruszać i powrócić do sprawności sprzed operacji.Zacznij od napełnienia strzykawki odpowiednim roztworem i przymocuj do niej igłę o rozmiarze 28 G. Następnie, po potwierdzeniu sedacji poprzez uciśnięcie palca u stopy, wprowadź igłę w ciało zwierzęcia pod kątem 45 stopni przez skórę w centrum gąbek, aby upewnić się, że igła znajduje się w gąbce. Powoli podnieś igłę w pionie.Jeśli igła znajduje się w gąbce, gąbka przesunie się w górę wraz z igłą. Następnie powoli wstrzyknij substancję do gąbki i wyjmij igłę. Po uśmierceniu zwierzęcia przytrzymaj skórę pęsetą i wykonaj nacięcie w pobliżu wybranej gąbki.Na koniec ostrożnie oddziel gąbczaki od otaczającej kapsuły, unikając pobierania dodatkowej tkanki wokół usuwanego gąbczaka. Gąbczaki można przechowywać w różnych warunkach, w zależności od rodzaju analizy, która zostanie przeprowadzona. Do przygotowania skrawków pobrane gąbczaki można zatopić w medium mrożącym, takim jak optimal cutting temperature compound, lub umieścić w 10% formalinie w celu zatopienia i krojenia w blokach parafinowych, tak jak zrobiono to w przypadku tych gąbczaków barwionych H&E.W przypadku tych przekrojów barwionych gąbek trireme najlepsze wyniki sekcjonowania uzyskuje się, gdy gąbka zostanie przecięta na pół wzdłuż średnicy, jak pokazano tutaj, a następnie zatopiona ciętą powierzchnią do dołu. Jak zademonstrowano tutaj, przekroje gąbki powinny być wykonywane w taki sposób, aby na rysunku widoczna była cała szerokość gąbki. Gąbka po lewej stronie została niewłaściwie zatopiona lub zsekcjonowana, o czym świadczy przerwana krawędź tkanki wzdłuż prawej strony przekroju, podczas gdy nienaruszona gąbka po prawej została przetworzona prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować, implantować, wstrzyknąć i usunąć gąbki z alkoholu poliwinylowego w celu badania gojenia ran u myszy.

the-polyvinyl-alcohol-sponge-model-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wszczepienie modelu gąbki z poli(alkoholu winylowym)

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Źródło:Ocean E. Clarke1, Romy A. Dop1, Tom Hasell1, Joanne L. Fothergill1, Daniel R. Neill21Uniwersytet w Liverpoolu, 2 Uniwersytet w DundeeTen film demonstruje użycie wydrukowanego w 3D, pokrytego silikonem urządzenia, które naśladuje wewnętrzną powierzchnię cewników moczowych w celu symulacji infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem.

Wydrukowane w 3D urządzenie pokryte silikonem do modelowania infekcji dróg moczowych związanych z cewnikiem

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Interesujące są rusztowania zdolne do dopasowania się do ubytków kostnych czaszkowo-szczękowo-twarzowych (CMF), wykazując jednocześnie osteoprzewodnictwo i bioaktywność. Protokół ten opisuje przygotowanie rusztowania z pamięcią kształtu na bazie dikrylanu polikaprolaktonu (PCL-DA) przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnikiem i ługowania cząstek stałych (SCPL) z wykorzystaniem stopionej matrycy solnej i nałożeniu bioaktywnej powłoki polidopaminowej .

Produkcja bioaktywnego, opartego na PCL "samodopasowanego" rusztowania polimerowego z pamięcią kształtu

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Opisana poniżej jest metoda implantacji wielu układów elektrod polimerowych w anatomicznie odległych obszarach mózgu w celu przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie poruszających się szczurów. Przygotowanie i implantacja chirurgiczna są szczegółowo opisane, z naciskiem na zasady projektowania, które mają pomóc w adaptacji tych metod do stosowania u innych gatunków.

Przewlekła implantacja wielu elastycznych matryc elektrod polimerowych

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Infekcja stawu okołoprotezowego (PJI) spowodowana przez niebezpieczne patogeny jest powszechna w ortopedii klinicznej. Istniejące modele zwierzęce nie są w stanie dokładnie symulować rzeczywistej sytuacji PJI. W tym miejscu stworzyliśmy mysi model PJI związany z biofilmem Candida albicans, aby badać i opracowywać nowe terapie PJI.

Model zakażenia Candida albicans stawu okołoprotezowego u myszy

Poznaj metodę implantacji gąbki PVA do badania gojenia ran u myszy. Technika umożliwia kontrolowane dostarczanie leków oraz analizę ilościową i histologiczną zmian w procesie regeneracji tkanek.

Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

Przeglądaj więcej filmów