Name: Urządzenie typu zrób to sam do odzyskiwania próbek kriokonserwowanych przypadkowo wrzuconych do kriogenicznych zbiorników magazynowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Dowiedz się, jak odzyskiwać próbki z ciekłego azotu za pomocą niedrogiego urządzenia typu DIY. Ta metoda zapewnia bezpieczne i szybkie pobieranie próbek przy zachowaniu ich integralności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Samodzielnie wykonane urządzenie do kriogenicznego odzyskiwania próbek zostało przetestowane w ramach projektów „Modeling bacterial protein prenylation in eukaryotic cells using bioinformatics and molecular approaches” sponsorowanego przez program Mary Louise Andrews Award for Cancer Research, Virginia Academy of Science, oraz „Physiological Meaning of RNA Editing in Plasma Dendritic Cells” sponsorowanego przez The Thomas F. Jeffress and Kate Miller Jeffress Memorial Trust oraz kontrakt państwowy 16.740.11.0364 (Ministerstwo Nauki i Edukacji, Rosja). Chcielibyśmy podziękować Beth Eom za pomoc przy eksperymencie dotyczącym integralności RNA.

1. Montaż urządzenia kriotolerancyjnego do wyjmowania kriopudełek
<ol>
 <li>Za pomocą szczypiec wyprostować jedną stronę trójkątnego kątownika (Rysunek 1A), aby utworzyć kątownik w kształcie litery L, jak pokazano na Rysunku 1B. Uwaga: Wymiary kątownika można dobrać w zależności od średnicy szyjki naczynia Dewara.</li>
 <li>Przymocować dwa takie kątowniki za pomocą poprzeczki w kształcie litery T (Rysunek 2), używając nakrętki, podkładki i śruby Crown, aby stworzyć podstawę Cryoscoop, jak pokazano na Rysunku 3(A-B). Uwaga: Zastosowanie dwóch kątowników umożliwia wyciąganie cryoboxów o wymiarach 5 ½ in. X 5 ½ in.</li>
 <li>Używając płyty z otworami (Rysunek 4), dopasować otwory w poprzeczce w kształcie litery T do otworów na jednym końcu płyty i połączyć oba elementy za pomocą nakrętek i śrub Hillman (Rysunek 5). Uwaga: Jeśli płyta z otworami i kątowniki nie posiadają fabrycznych otworów, należy je wywiercić za pomocą wiertła z węglika spiekanego.</li>
 <li>Zagiąć drugi koniec płyty z otworami za pomocą szczypiec, jak pokazano na Rysunku 6. (Krok ten jest opcjonalny).</li>
 <li>Owinąć uchwyt pianką, aby ułatwić chwytanie urządzenia w ciekłym azocie, jak pokazano na Rysunku 6. (opcjonalnie) Uwaga: Przed autoklawowaniem należy usunąć piankę.</li>
</ol>
2. Montaż urządzenia kriotolerancyjnego do wyjmowania krioprowetek
Urządzenie do odzyskiwania Cryotolerant DIY można również przystosować do wyjmowania krioprobówek. Wiąże się to z zastąpieniem płaskiej podstawy sitkiem ze stali nierdzewnej, zmodyfikowanym w celu wyławiania probówek z ciekłego azotu (Rysunek 7).
<ol>
 <li>Odkręć nakrętki i śruby Crown mocujące pas T strong-tie do płyty z otworami.</li>
 <li>Przed przymocowaniem sita ze stali nierdzewnej do płyty z otworami, delikatnie wygnij szyjkę sita za pomocą szczypiec, aby ustawić podstawę pod kątem, nadając jej kształt przypominający chochlę (Rycina 8). Uwaga: Jeśli sito posiada rantu, użyj szczypiec, aby zgiąć go w dół; ułatwi to manewrowanie urządzeniem.</li>
 <li>W wyrównaj otwór w uchwycie sita z otworami w płycie i zabezpiecz sito za pomocą nakrętek i śrub Hillman, jak pokazano na Rycynie 8. Uwaga: Jeśli sito nie posiada fabrycznie wywierconych otworów, należy je wywiercić przy użyciu wiertła z węglika spiekanego.</li>
</ol>
3. Wyjmowanie kriopudełek i krioprowetek z naczynia Dewara
<ol>
 <li>Na początek należy założyć rękawice kriogeniczne i wyjąć z naczynia Dewara 1 lub 2 regały zamrażarki, aby zapewnić miejsce do manewrowania.</li>
 <li>Należy delikatnie przesunąć po dnie naczynia Dewara pionowo ustawione urządzenie DIY do odzyskiwania próbek, odporne na niskie temperatury, wyposażone w podstawę z mocnego paska T (Rysunek 5), i zebrać pudełko, które wpadło na dno zbiornika Dewara. Uwaga: ciekły azot wrze natychmiast po kontakcie z cieplejszym obiektem, otaczając go izolującym gazem azotowym (efekt Leidenfrosta). Aby schłodzić urządzenie przed odzyskaniem próbek, należy powoli zanurzyć je w naczyniu Dewara i pozwolić, aby ciekły azot wystarczająco je schłodził przed przystąpieniem do powyższego kroku.</li>
 <li>Należy wyciągnąć urządzenie pionowo wzdłuż ścianek naczynia Dewara, aby wyłowić pudełko zamrażarki ze zbiornika.</li>
 <li>Należy chwycić pudełko odzyskane z dna naczynia Dewara.</li>
 <li>W celu odzyskania krioprobówek należy delikatnie przesunąć po dnie naczynia Dewara krioczerpak wyposażony w sito (Rysunek 9).</li>
 <li>Podobnie jak w przypadku odzyskiwania kriopudełek, należy wyciągnąć urządzenie pionowo i chwycić probówki zebrane w sicie.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Głównym wyzwaniem w badaniach nad ekspresją genów jest fakt, że jakość RNA zależy od warunków przechowywania zarówno zamrożonych próbek tkanek, jak i wyekstrahowanego RNA4. Rysunek 10 przedstawia wpływ sposobu postępowania z próbkami na integralność całkowitego RNA. Całkowite RNA z tego samego źródła tkankowego (tłuszczowa tkanka ludzka) poddano różnym procedurom obsługi. Przed rozpoczęciem eksperymentu nienaruszony preparat całkowitego RNA wykazuje wyraźne prążki rRNA 28S i 18S, przy czym prążek rRNA 28S jest około dwukrotnie intensywniejszy niż prążek rRNA 18S (Rysunek 10, ścieżka 1). Ten stosunek 2:1 (28S:18S) świadczy o tym, że RNA jest nienaruszone, podczas gdy częściowo zdegradowane RNA pojawia się w formie rozmycia (smear) lub jego stosunek intensywności 28S:18S odbiega od 2:15. Ścieżki 3-4 przedstawiają próbki RNA z istotną degradacją. Próbki te były poddawane wielokrotnemu częściowemu rozmrażaniu poprzez krótkotrwałe wyjmowanie z naczynia Dewara (Metoda A), co modelowało długoterminowe przechowywanie z okresowym przelewaniem zawartości wynikającym z konieczności wyjęcia upadłych probówek i pudełek (Rysunek 10, ścieżki 3-4). Natomiast próbki przechowywane w naczyniu Dewara obsługiwanym za pomocą urządzenia DIY (Metoda B), a zatem bez częściowego rozmrażania, zawierają nienaruszone RNA (Rysunek 10, ścieżka 2).
<img alt="Schemat wymiarów metalowego wspornika; przedstawia pomiary strukturalne do analizy konstrukcyjnej." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A) Podstawa składa się z dwóch trójściennych kątowników o pokazanych wymiarach. Każdy kątownik posiada jeden duży, nawiercony otwór (pełna strzałka) oraz kilka mniejszych otworów (mała strzałka) na każdej ściance. Umożliwia to mocowanie za pomocą nakrętek i śrub. Mniejsze otwory zapewniają również szybki odpływ ciekłego azotu podczas wyjmowania próbek. B) Jedna strona każdego kątownika zostaje wyprostowana za pomocą szczypiec w celu uzyskania kształtu litery L.
<img alt="Schemat belki T, analiza równowagi statycznej, równowaga momentów sił, pomiar 6 cali, projekt strukturalny." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Taśma T do mocnych połączeń (Strong-tie T strap) służy do zabezpieczenia mocnych połączeń razem. Podobnie jak element mocujący, taśma T posiada jeden duży otwór nawiercony fabrycznie (pełna strzałka) oraz dwa mniejsze otwory (mała strzałka) w każdym narożniku. Pozwala to na zabezpieczenie mocnych połączeń wzdłuż długości taśmy T za pomocą nakrętek i śrub. Umożliwia to również przymocowanie taśmy T do płyty szczelinowej.
<img alt="Konstrukcja połączenia z paskiem w kształcie T i mocnymi wiązaniami do analizy równowagi statycznej." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. A) Każde mocne wiązanie jest przymocowane do jednego narożnika paska w kształcie T wzdłuż jego długości za pomocą nakrętek koronowych, śrub i podkładek. B) Dwa mocne wiązania są zamocowane obok siebie, aby ułatwić wyjmowanie cryoboxów o wymiarach 5 ½ in. X 5 ½ in. W przypadku mniejszych cryoboxów, takich jak 2 in. X 2 in., pojedyncze mocne wiązanie może zostać przymocowane bezpośrednio do płyty z otworami bez użycia paska w kształcie T.
<img alt="Metalowy pręt wspierający z równomiernie rozmieszczonymi otworami, komponent wzmacniający strukturę, schemat." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Jako uchwyt zastosowano szczelinową płytkę płaską. Długość płytki szczelinowej zależy od głębokości naczynia Dewara. W tym przypadku użyto 4 stóp płytki szczelinowej. Grubość płytki szczelinowej jest krytyczna, ponieważ cienkie płytki (&lt;14 gauge) sprawiają, że urządzenie staje się niestabilne podczas wyjmowania próbek z naczynia Dewara wypełnionego ciekłym azotem.
<img alt="Linijka w równowadze statycznej, ΣFx=0, schemat obrazujący równowagę i rozkład sił w układzie." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Płaska podstawa składająca się z mocnych wiązań i paska w kształcie litery T zostaje następnie przymocowana do jednego końca szczelinowej płytki. Większy otwór w pozostałym narożniku paska w kształcie litery T zostaje wyrównany ze szczeliną w płaskiej płytce i przymocowany za pomocą śruby imbusowej i nakrętki. Urządzenie to może być teraz wykorzystane do wyjmowania cryoboxów z naczynia Dewara.
<img alt="Schemat równowagi statycznej; ramię dźwigni w układzie mechanicznym; zasady ΣFx=0, MA=0." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Jeden koniec naciętej płaskiej płytki jest zgięty za pomocą szczypiec i pokryty pianką w celu zapewnienia lepszego uchwytu, szczególnie w przypadku głębokich naczyń Dewara, jak pokazano w tym przypadku.
<img alt="Schemat sitka kuchennego z opisanymi częściami: krawędź, szyjka, uchwyt; ilustracja edukacyjna." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Sitko z drucianą siatką i uchwytem ze stali nierdzewnej służy do wyjmowania krio probówek z naczynia Dewara. Jeśli uchwyt nie posiada otworu, konieczne będzie użycie wiertła z węglika do wywiercenia otworu.
<img alt="Konfiguracja układu dynamicznego z płytą szczelinową, szyjką, krawędzią; schemat rozkładu sił, analiza statyczna." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Aby ułatwić wyjmowanie krioprobówek, sitko jest wyginane wzdłuż szyjki za pomocą szczypiec, aby uzyskać kształt czerpaka. Jeśli sitko posiada krawędź, jak w tym przypadku, do jego wygięcia można użyć szczypiec. Zapewnia to, że sitko nie zablokuje się wewnątrz naczynia Dewara.
<img alt="Schemat ruchu wahadła, demonstrujący zasady oscylacji harmonicznych i siły grawitacji." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Cedzak jest przymocowany jednym końcem do szczelinowej płaskiej płyty za pomocą nakrętki sześciokątnej i śruby.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej, prążki DNA, ścieżki M-1-4, marker molekularny, proces rozdziału DNA." src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Integralność próbek całkowitego RNA poddanych różnym warunkom manipulacji. Aby zbadać, w jaki sposób warunki manipulacji próbkami wpływają na jakość RNA, zestaw próbek RNA z tego samego źródła poddano dwóm metodom postępowania. Metoda A polegała na przechowywaniu RNA w naczyniu Dewara i wyjmowaniu próbek za pomocą urządzenia DIY, co zapobiegało częściowemu rozmrożeniu. Metoda B polegała na przechowywaniu RNA w naczyniu Dewara i wielokrotnym częściowym rozmrażaniu poprzez krótkotrwałe wyjmowanie próbek z naczynia, co modelowało długotrwałe przechowywanie z okresowym zlewanie w celu odzyskania opadłych próbek. Integralność całkowitego RNA analizowano następnie za pomocą elektroforezy żelowej. Ścieżka 1: Próbka przed przechowywaniem w naczyniu Dewara; Ścieżka 2: Próbka z naczynia Dewara wyjęta metodą A; Ścieżki 3, 4: Próbki z naczynia Dewara wyjęte metodą B; M: drabinka 100 bp.

<ol><li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKittel%2C+P+%22Advances+in+Cryogenic+Engineering%22">Advances in Cryogenic Engineering</a>. , Springer. 41(1996).</li>
<li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdeskuty%2C+FJ+%22Stewart+Safety+in+the+handling+of+cryogenic+fluids%22">Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids</a>. , Plenum Press. New York. (1996).</li>
<li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouncil%2C+NR+%22Prudent+Practices+in+the+Laboratory%3A+Handling+and+Management+of+Chemical+Hazards%22">Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards</a>. , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues%3A+checkpoint+towards+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li>
<li>Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLynch%2C+PT+%22Encyclopedia+of+Rose+Science%22">Encyclopedia of Rose Science</a>. , 106-111 (2003).</li>
<li>Crawford, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawford%2C+RJ+%22Plastics+Engineering%22">Plastics Engineering</a>. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).</li>
<li>Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGorenc%2C+B+%22Steel+designers%27+handbook%22">Steel designers' handbook</a>. , University of New South Wales Press. (1996).</li>
<li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastics+materials+and+processes%3A+a+concise+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley-Interscience%22%5BJournal%5D)">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Jedną z najczęstszych metod wyjmowania kriopudełek i kriosprobek z dna naczynia Dewara jest przelewanie ciekłego azotu do zapasowego pojemnika i wyciąganie próbek pozostałych w kolbie lub pływających w odlanym ciekłym azocie. Jest to jednak niebezpieczna praktyka, która może prowadzić do oparzeń kriogenicznych lub uduszenia w wyniku przedłużonej ekspozycji na opary ciekłego azotu2. Innym powszechnym sposobem odzyskiwania upuszczonych kriosprobek jest stosowanie szczypiec do kriosprobek3. Jednak ogra...

urządzenie typu diy do odzyskiwania kriokonserwowanych próbek przypadkowo upuszczonych do kriogenicznych zbiorników magazynowych

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks 

Azot ciekły to bezbarwna, bezwonna, ekstremalnie zimna (-196 °C) ciecz przechowywana pod ciśnieniem. Jest on powszechnie stosowany jako czynnik kriogeniczny do długoterminowego przechowywania materiałów biologicznych, takich jak krew, komórki i tkanki 1,2. Kriogeniczne właściwości azotu ciekłego, choć idealne do konserwacji próbek, mogą powodować gwałtowne zamrażanie żywych tkanek w momencie kontaktu – znane jako „oparzenie kriogeniczne”2, co może prowadzić do poważnych odmrożeń u osób bezpośrednio zaangażowanych w przechowywanie i wyjmowanie próbek z naczyń Dewara. Ponadto, podczas parowania azot ciekły obniża stężenie tlenu w powietrzu, co może doprowadzić do uduszenia, szczególnie w zamkniętych pomieszczeniach2.
W laboratoriach próbki biologiczne są często przechowywane w krioprobowkach lub krioszalkach, ułożonych w stalowych regałach wewnątrz naczyń typu Dewar1. Regały do przechowywania te są wyposażone w długi trzpień, który ma zapobiegać wysunięciu się szalek z regałów i ich wpadnięciu na dno naczyń Dewar podczas rutynowej obsługi. Niestety, bardzo często zdarza się, że szalki lub probówki z cennymi próbkami wysuwają się i opadają na dno zbiornika wypełnionego ciekłym azotem. W takich przypadkach próbki można mozolnie odzyskać po przelaniu ciekłego azotu do zapasowego pojemnika lub jego wylaniu. Wtedy szalki i probówki można stosunkowo bezpiecznie wyłowić z opróżnionego naczynia Dewar. Jednak kriogeniczna natura ciekłego azotu oraz stopień jego rozprężania sprawiają, że odzyskiwanie zatopionych próbek jest niebezpieczne. Biura Bezpieczeństwa zazwyczaj zalecają, aby odzyskiwanie próbek nigdy nie było przeprowadzane przez jedną osobę. Alternatywą jest użycie dostępnych w handlu chwytaków kriogenicznych lub szczypiec do wyciągania probówek3. Jednak ograniczona widoczność w ciemnych, wypełnionych cieczą naczyniach Dewar stanowi główną przeszkodę w ich zastosowaniu.
W niniejszym artykule opisujemy konstrukcję niskokosztowego (DIY) urządzenia do wyciągania próbek odpornego na niskie temperatury, które sprawia, że wyjmowanie próbek z naczynia Dewar z płynami kriogenicznymi jest bezpieczne i łatwe.

Przedstawiamy niskokosztowe, trwałe i kriotolerancyjne urządzenie do pobierania próbek z nioy Dewar wypełnionych ciekłym azotem. Prostota konstrukcji oraz modułowa budowa urządzenia sprawiają, że proces wyjmowania próbek z zbiorników kriogenicznych jest bezpieczny i łatwy.

Urządzenie typu DIY do odzyskiwania kriokonserwowanych próbek przypadkowo upuszczonych do kriogenicznych zbiorników magazynowych

Azot ciekły to bezbarwna, bezwonna, ekstremalnie zimna (-196 °C) ciecz przechowywana pod ciśnieniem. Jest on powszechnie stosowany jako ciecz kriogeniczna do długoterminowego...

Celem niniejszej procedury jest ułatwienie wyjmowania próbek z pojemników kriogenicznych i probówek kriogenicznych z tanków typu duo wypełnionych ciekłym azotem przy użyciu urządzenia łatwego w konstrukcji. Jest to osiągane poprzez najpierw usunięcie jednego lub dwóch statywów zamrażalniczych z tanku, aby zapewnić miejsce do manewrowania, a następnie pionowe wprowadzenie urządzenia do tanku. Drugim krokiem jest delikatne przesuwanie urządzenia wzdłuż dna tanku.Następnie wyciągnij urządzenie pionowo wzdłuż ścianek pojemnika. Aby wyjąć pudełko mroźnicze ze zbiornika, ostatnim krokiem jest wyjęcie pudełka z dna pojemnika i ponowne umieszczenie usuniętych kasetek mroźniczych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przelewanie czy użycie pręta z ciekłym azotem, jest zapewnienie łatwej, bezpiecznej i szybkiej alternatywy, która zachowuje integralność próbek i może być wykonana przez jednego operatora. Aby rozpocząć montaż urządzenia odpornego na niskie temperatury, użyj szczypiec do wyprostowania jednego boku trójstronnej opaski zaciskowej, aby stworzyć opaskę w kształcie litery L.Jak widać tutaj, wymiary mocnego wiązania można dobrać w zależności od średnicy szyjki elementu wykonawczego. Należy przygotować dwa takie wiązania, aby urządzenie mogło wyciągać kriopudełka o wymiarach 5,5 na 5,5 cala. Należy je przymocować za pomocą pasa TST do mocnego wiązania, używając śruby z łbem, nakrętki, podkładki i wkręta, aby utworzyć podstawę czerpaka do kriopróbek.Urządzenie powinno teraz wyglądać tak, jak pokazano tutaj. Następnie, używając płyty szczelinowej, dopasuj otwory w kształtowym wzmocnieniu typu T do otworów na jednym z końców płyty szczelinowej. Następnie zabezpiecz oba elementy za pomocą nakrętek i śrub Hillman.Wywierć otwory do mocowania, jeśli płytka szczelinowa i mocne opaski nie posiadają fabrycznie wywierconych otworów. W razie potrzeby można utworzyć uchwyt, zginając drugi koniec płytki szczelinowej i owijając go pianką. Aby ułatwić chwyt urządzenia, należy pamiętać o usunięciu pianki przed myciem wodą.Urządzenie do samodzielnego wykonania (DIY) do wyjmowania próbek odporne na niskie temperatury może być również przystosowane do wyjmowania fiolek kriogenicznych. Polega to na zastąpieniu płaskiej podstawy sitkiem ze stali nierdzewnej zmodyfikowanym w sposób umożliwiający wyławianie fiolek z cieczy. Aby rozpocząć montaż, należy najpierw odkręcić nakrętki i śruby, a następnie przymocować wytrzymały pasek z gumy oponowej do płytki z otworami.Następnie, przed przymocowaniem stalowego sitka do płytki z otworami, należy delikatnie wygiąć szyjkę sitka za pomocą szczypiec tak, aby podstawa była ustawiona pod kątem przypominającym chochlę. Jeśli użyte sitko posiada kołnierz, należy go wygiąć w dół za pomocą szczypiec. Ułatwi to manewrowanie urządzeniem.Dopasuj otwór w uchwycie sita do otworów w płycie szczelinowej i przymocuj sito za pomocą nakrętek i śrub Hillmana. Wywierć otwory, jeśli sito nie posiada fabrycznie nawierconych otworów. Przed rozpoczęciem wyjmowania kriopudełek z urządzenia, należy obowiązkowo założyć rękawice kriogeniczne.Następnie wyjmij jedną lub dwie półki z zamrażarki, aby zapewnić miejsce do manewrowania urządzeniem. Następnie za pomocą pionowego, odpornego na niskie temperatury, samodzielnie wykonanego urządzenia do odzyskiwania, wyposażonego w podstawę z mocnej opaski, delikatnie przesuń urządzeniem wzdłuż dna zamrażarki, aby zebrać pudełko, które wpadło na dno zbiornika. Następnie przesuwaj urządzenie pionowo wzdłuż ścianek zamrażarki, aby wyłowić pudełko z zamrażarki ze zbiornika.Należy pamiętać, że urządzenie powinno być trzymane pionowo i wyciągane prosto w górę, aby zapobiec zsunięciu się pojemnika z powrotem do doera. Aby wyłowić probówki kriogeniczne, należy użyć czerpaka kriogenicznego z zamontowanym sitkiem i delikatnie zebrać zawartość z dna doera, podobnie jak przy wyjmowaniu pojemnika kriogenicznego, a następnie unieść urządzenie pionowo i pobrać probówki zgromadzone w sitku. Głównym wyzwaniem w badaniach nad ekspresją genów jest fakt, że jakość RNA zależy od warunków przechowywania zarówno w przypadku zamrożonych próbek tkanek, jak i wyizolowanego RNA.Rycina ta przedstawia wpływ sposobu obchodzenia się z próbkami na integralność całkowitego RNA. Całkowite RNA pochodzące z tego samego źródła tkankowego poddano różnym procedurom przygotowawczym przed eksperymentem. Preparat nienaruszonego całkowitego RNA wykazuje wyraźne prążki rybosomalnego RNA 28 s i 18 s, przy czym prążek rybosomalnego RNA 28 s jest około dwukrotnie bardziej intensywny niż prążek rybosomalnego RNA 18 s. Świadczy to o tym, że RNA jest nienaruszone. Ścieżki trzecia i czwarta przedstawiają próbki z istotną degradacją spowodowaną wielokrotnym częściowym rozmrażaniem podczas krótkotrwałego wyjmowania z zamrażarki, co modeluje długoterminowe przechowywanie z okresowym wyjmowaniem ze względu na konieczność wydobycia pojedynczych fiolek z pudełek.Niemniej jednak, próbki przechowywane w serwisie doer z wykorzystaniem urządzenia DIY, a zatem bez częściowego rozmrażania, zawierają nienaruszone RNA w ścieżce drugiej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wyjmować próbki z wypełnionego ciekłym azotem naczynia typu dvar bez konieczności jego opróżniania.

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Urządzenie do samodzielnego odzyskiwania krioprzechowywanych próbek przypadkowo upuszczonych do zbiorników kriogenicznych

W tym filmie demonstrujemy ultraszybką metodę kriowitryfikacji do konserwacji próbek biologicznych. Metoda polega na zastosowaniu kombinacji krioprotektantów w celu ochrony tkanki biologicznej przed uszkodzeniem przez zamarzanie poprzez zapobieganie tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.

Kriokonserwacja oparta na witryfikacji: ultraszybka technika chłodzenia służąca do przechowywania próbek biologicznych w bardzo niskich temperaturach w celu długotrwałego przechowywania

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje procedurę zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzanie ich bezpośrednio w ciekłym azocie. Protokół ten podkreśla również nowy kriowial, który może uniknąć "ogólnego efektu" gazowego azotu, gdy ciekły azot styka się z powierzchnią tkanki próbki.

Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Ten manuskrypt opisuje metodę kriokonserwacji bez lodu dla dużych ilości hepatocytów szczurów, dzięki której komórki pierwotne są wstępnie inkubowane środkami krioprotrotacyjnymi o niskim stężeniu i zeszklone w dużych kropelkach.

Witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Ten protokół przedstawia działanie i zasady działania cylindrycznych i planarnych strumieni cieczy kriogenicznych w skali mikronowej. Do tej pory system ten był używany jako cel o wysokiej częstotliwości powtarzania w eksperymentach laserowo-plazmowych. Przewidywane zastosowania interdyscyplinarne obejmują astrofizykę laboratoryjną, materiałoznawstwo, a ostatecznie akceleratory cząstek nowej generacji.

Kriogeniczne dysze cieczy do odkrywania nauki o wysokiej powtarzalności

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Ten protokół opisuje półautomatyczną ścieżkę mającą na celu poprawę wydajności i zdolności przetwarzania oraz kriokonserwacji plemników zagrożonych gatunków koralowców, mającą na celu zabezpieczenie różnorodności genetycznej i wsparcie wysiłków na rzecz odbudowy rafy.

Półautomatyczny przepływ pracy do krioprezerwacji nasienia koralowców w celu wsparcia biobankowania i akwakultury

Dowiedz się, jak odzyskiwać próbki z ciekłego azotu za pomocą niedrogiego urządzenia typu DIY. Ta metoda zapewnia bezpieczne i szybkie pobieranie próbek przy zachowaniu ich integralności.

Urządzenie typu zrób to sam do odzyskiwania próbek kriokonserwowanych przypadkowo wrzuconych do kriogenicznych zbiorników magazynowych (Wideo) | JoVE Journal

Urządzenie typu DIY do odzyskiwania kriokonserwowanych próbek przypadkowo upuszczonych do kriogenicznych zbiorników magazynowych

Przeglądaj więcej filmów