Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie standaryzowanej obserwacji zachowania in vivo komórek macierzystych przeszczepionych do mózgu myszy. Osiąga się to poprzez pierwsze znakowanie komórek zrębu pochodzących ze szpiku kostnego, które wykazują współekspresję EGFP i lucyferazy z fluorescencyjnymi cząstkami tlenku żelaza o wielkości mikronów. Drugim krokiem jest odpowiednie wstrzyknięcie BMC znakowanych MPIO do tkanki mózgowej myszy.

Następnie przeżycie i lokalizacja przeszczepów komórkowych są śledzone nieinwazyjnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i rezonansu magnetycznego. Ostatnim krokiem jest walidacja wyników obrazowania in vivo za pomocą pośmiertnej analizy histologicznej. Metody te mogą zapewnić wgląd w zachowanie komórek macierzystych po przeszczepie do mózgu myszy, ale mogą być również stosowane do innych systemów, takich jak organizmy modelowe i badania nad chorobą.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy postępowania ze zwierzętami są trudne do nauczenia, ponieważ wstrzyknięcia dożylne i domózgowe są trudne do wykonania i wiążą się z pewnym ryzykiem dla przeżycia zwierząt. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 75 razy 10 do sześciu lodowatych niebieskich cząstek tlenku żelaza o wielkości mikronów do subkonfluencyjnej hodowli komórkowej. Inkubuj je przez kolejne 16 godzin, aby umożliwić wychwyt cząstek poprzez endocytozę, a następnie zmyj pozostałe cząstki.

Pozwól komórkom rosnąć przez dodatkowe 24 godziny, aby uzyskać płynność współkomórek i jednorodną dystrybucję G-B-M-P-I-O. Następnie użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby wizualnie zweryfikować wychwyt cząstek, obliczając stosunek komórek dodatnich EGFP i G-B-M-P-I-O dodatnich do całkowitej liczby komórek dodatnich EGFP. Następnie umyj komórki G-B-M-P-I-O, oznaczone lucyferazy BMSC EGFP dwukrotnie 10 mililitrami.

PBS traktuje komórki trypiną EDTA, a następnie je zbiera. Nagroda następnie umyj komórki i ponownie je zawieś w końcowym stężeniu 133 razy 10 do szóstych komórek na mililitr w PBS. Na koniec trzymaj komórki na lodzie do czasu przeszczepu.

W tej procedurze znieczulij mysz poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy w dawce 80 miligramów na kilogram i ksylazyny w dawce 16 miligramów na kilogram. Poczekaj pięć minut, aż mysz zaśnie, a następnie ogol jej głowę, aby umożliwić sterylne manipulacje. Następnie umieść mysz w ramce stereotaktycznej, zdezynfekuj skórę alkoholem.

Następnie nałóż maść na oczy, aby zapobiec odwodnieniu. Wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej, aby odsłonić czaszkę, aby celować w hipokamp. Wywierć otwór w czaszce na dwa milimetry z tyłu i dwa milimetry z boku za pomocą wiertła dentystycznego.

W tym momencie należy krótko wymieszać zawiesinę komórek, a następnie odessać zawiesinę komórkową do strzykawki. Następnie opuścić strzykawkę z igłą na głębokość 2,5 milimetra pod oponą twardą i odczekać, aby ciśnienie wyrównało się przez jedną minutę. Po minucie cofnij igłę do pozycji dwóch milimetrów pod oponą twardą.

Następnie wstrzyknąć trzy mikrolitry zawiesiny komórkowej za pomocą automatycznej pompy mikroiniekcyjnej z prędkością 0,70 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy odczekać dodatkowe pięć minut, aby zapobiec cofaniu się zawiesiny komórek, do której wstrzyknięto wstrzyknięte środki. Następnie powoli wycofaj igłę.

Następnie zdezynfekuj granice skóry, a następnie zszyj skórę. Wstrzyknąć podskórnie 300 mikrolitrów 0,9% roztworu chlorku sodu, aby zapobiec odwodnieniu. Na koniec umieść mysz pod lampą grzewczą, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu w celu wykonania obrazowania bioluminescencyjnego.

Znieczul mysz mieszaniną 3% izo, fluoru i tlenu. Następnie umieść mysz w imagerze fotonowym. Zmniejsz poziom znieczulenia, dostosowując zawartość fluoru do 1,5%Następnie wstrzyknij dożylnie d Lucyfer w ilości 150 miligramów na kilogram masy ciała.

Uzyskuj obraz przez pięć minut za pomocą oprogramowania do fotowizji. Następnie przeprowadź przetwarzanie obrazu za pomocą oprogramowania M three vision i określ ilościowo obserwowany sygnał za pomocą stałych obszarów zainteresowania. Aby wykonać rezonans magnetyczny, znieczul mysz 3% fluorem ISO w mieszaninie tlenu i tlenku azotu.

Następnie umieść mysz w ograniczniku poziomego systemu MR 9.4 Tesla. Zmniejsz poziom znieczulenia, dostosowując zawartość fluoru do 1%Następnie nałóż maść na oczy myszy, aby zapobiec odwodnieniu. Następnie użyj sondy doodbytniczej, aby monitorować temperaturę ciała.

Następnie umieść czujnik pod brzuchem myszy, aby monitorować częstość oddechów. Utrzymuj częstość oddechów na poziomie 110 plus minus 10 razy na minutę i utrzymuj stałą temperaturę ciała w wąskim zakresie 37 plus minus 0,5 stopnia Celsjusza. Następnie umieść powierzchniową cewkę RF na górze głowicy myszy.

Umieść mysz na środku magnesu. Następnie otwórz ParaVision 5.1 Ustaw parametry sekwencji zgodnie z dołączonym rękopisem. Następnie należy uzyskać zestaw 10 koronalnych T dwuważonych obrazów echa spinowego w celu uzyskania określonych informacji anatomicznych.

Dwugwiaździste obrazy echa gradientowego ważonego NT w celu zbadania migracji komórek macierzystych z rozdzielczością 70 mikrometrów do kwadratu. W tym kroku poświęć mysz i usuń mózg. Utrwal tkankę mózgową w temperaturze pokojowej w 4% paraldehydzie w PBS przez dwie godziny.

Po dwóch godzinach. Odwodnić tkankę mózgową, umieszczając ją w różnych gradientach sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zamroź tkankę mózgową za pomocą płynnego azotu i przechowuj tkankę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu cięcia, gdy będzie gotowa

Przeciąć tkankę mózgową na odcinki o grubości 10 mikrometrów za pomocą kriostatu. Następnie pod mikroskopem fluorescencyjnym przesiewa się niebarwione skrioskrawki pod kątem niebieskiej fluorescencji z cząstek G-B-M-P-I-O i zielonej fluorescencji z komórek eksprymujących EGFP. Następnie przesiewaj niezabarwione skrawki kriogeniczne pod kątem fluorescencji zielonego czerwonego tła z komórek zapalnych.

Opisana procedura znakowania MPIO w kolorze niebieskim lodowcowym skutkuje wysoce wydajnym znakowaniem komórek BMSC, lucyferazy EGFP, które można łatwo zwalidować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie, po przeszczepieniu komórek G-B-M-P-I-O, oznaczonych BMSC, lucyferazy EGFP w OUN myszy, przeżycie przeszczepu komórkowego można monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w oparciu o aktywność lucyferazy. Dodatkowo dokładna lokalizacja przeszczepionych komórek może być monitorowana za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo opartego na zawartości żelaza w MPIO błękitu lodowcowego.

Wreszcie, analiza histologiczna pokazuje walidację wyników uzyskanych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i rezonansu magnetycznego. Stabilne przeżycie zostało potwierdzone przez stabilną ekspresję EGFP w czasie po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem molekularnym do badania zdarzeń komórkowych i molekularnych po przeszczepie komórek macierzystych w różnych modelach zwierzęcych chorób neurodegeneracyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać obrazowanie molekularne, stosując bioluminescencję i rezonans magnetyczny, a także odpowiednio walidować wyniki in vivo za pomocą pośmiertnej oceny histologicznej.