Name: Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj multimodalne obrazowanie bioluminescencyjne i rezonansu magnetycznego do śledzenia komórek macierzystych w mózgu myszy. Ta metoda umożliwia nieinwazyjną ocenę przeżycia i lokalizacji przeszczepów komórkowych z walidacją histologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace autorów były wspierane przez grant badawczy ID-BOF 2006 Uniwersytetu w Antwerpii (przyznany PPo i AVdL), granty badawcze G.0136.11 oraz G.0130.11 (przyznane AVdL, ZB i PPo) oraz grant 1.5.021.09.N.00 (przyznany PPo) z Funduszu Badań Naukowych Flandrii (FWO-Vlaanderen, Belgia), grant badawczy SBO IWT-60838: BRAINSTIM z Flandryjskiego Instytutu Nauki i Technologii (przyznany ZB i AVDL), częściowo przez grant badawczy Methusalem z rządu flandryjskiego (przyznany ZB), częściowo przez EC-FP6-NoE DiMI (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) oraz przez Międzyuczelniane Bieguny Przyciągania IUAP-NIMI-P6/38 (przyznane AVDL). Nathalie De Vocht posiada stypendium doktoranckie z FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts jest stypendystą postdoktorskim FWO-Vlaanderen.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Eksperymenty należy rozpocząć z wykorzystaniem populacji komórek macierzystych hodowanych ex vivo, zmodyfikowanych genetycznie w celu ekspresji białek reporterowych Lucyferazy oraz eGFP. W tym przypadku wykorzystano mysie komórki zrębowe pochodzące z szpiku kostnego exprimujące Lucyferazę/eGFP (BMSC-Luc/eGFP), zgodnie z wcześniejszym opisem Bergwerf et al.2, 5.</li>
	<li>Na dwa dni przed znakowaniem komórek, wysiać komórki BMSC-Luc/eGFP w gęstości 8 x 105 komórek na kolbę hodowlaną T75 w 15 ml pełnej pożywki ekspansyjnej (CEM) uzupełnionej o 1 μg/ml Puromyciny.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 48 hr w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Do rosnącej kultury komórek dodać 5 x 106 mikrometrycznych cząsteczek tlenku żelaza Glacial Blue (GB MPIO) na ml pożywki hodowlanej (łącznie: 75 x 106 cząsteczek na 15 ml pożywki w kolbie T75).</li>
	<li>Inkubować przez 16 hr, aby umożliwić pobranie cząsteczek drogą endocytozy.</li>
	<li>Wypłukać pozostałe cząsteczki i pozostawić komórki do wzrostu przez kolejne 24 hr, aby uzyskać konfluencję komórek i jednorodny rozkład GB MPIO.</li>
	<li>Zweryfikować pobranie cząsteczek wizualnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, obliczając stosunek komórek eGFP+ i GB MPIO+ do całkowitej liczby komórek eGFP+.</li>
	<li>Znakowane GB MPIO komórki BMSC-Luc/eGFP wypłukać dwukrotnie 10 ml PBS i zebrać komórki po traktowaniu trypsyną-EDTA (5 ml na kolbę T75 przez 5 minut).</li>
	<li>Wypłukać zebrane komórki i resuspendować do końcowego stężenia 133 x 106 komórek/ml w PBS.</li>
	<li>Przechowywać komórki w lodzie do momentu transplantacji.</li>
</ol>
2. Implantacja komórek do OUN myszy
<ol>
	<li>Zanurzyć myszy w znieczuleniu poprzez doszpikowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (16 mg/kg).</li>
	<li>Odczekać 5 minut, aż myszy zapadną w sen.</li>
	<li>Wygolić głowę myszy, aby umożliwić sterylne manipulacje.</li>
	<li>Umieścić mysz w ramie stereotaktycznej.</li>
	<li>Zdezynfekować skórę i zwilżyć oczy myszy, aby zapobiec ich odwodnieniu.</li>
	<li>Wykonać nacięcie skóry głowy w linii pośrodkowej, aby odsłonić czaszkę, a następnie wywiercić otwór w czaszce za pomocą wiertła stomatologicznego we wskazanych współrzędnych: 2 mm tylnie i 2 mm bocznie od Bregma.</li>
	<li>Krótko wymieszać zawiesinę komórkową w vortexie i pobrać ją do strzykawki.</li>
	<li>Wprowadzić igłę strzykawki na głębokość 2,5 mm pod oponę twardą i odczekać 1 minutę w celu wyrównania ciśnienia.</li>
	<li>Wstrzyknąć 3 μl zawiesiny komórkowej (4 x 105 komórek) na głębokość 2 mm pod oponę twardą z prędkością 0,70 μl/min, korzystając z automatycznej pompy do mikroiniekcji.</li>
	<li>Odczekać dodatkowe 5 minut, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętej zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Powoli wycofać igłę i zdezynfekować brzegi skóry przed jej zszyciem.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 300 μl 0,9% roztworu NaCl, aby zapobiec odwodnieniu, a następnie umieścić mysz pod lampą grzewczą do czasu wybudzenia z narkozy. Podać pooperacyjne leki przeciwbólowe zgodnie ze standardami instytucjonalnymi.</li>
</ol>
3. Bioluminescencja in vivo
<ol>
	<li>Zanurz myszy w narkozie, stosując mieszaninę 3% izofluranu i tlenu.</li>
	<li>Umieść myszy w urządzeniu Photon Imager i zmniejsz poziom narkozy do 1,5% izofluranu i tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknij dożylnie 150 mg D-lucyferyny na kg masy ciała.</li>
	<li>Pozyskaj obraz przez 5 minut, korzystając z oprogramowania Photo Vision.</li>
	<li>Przeprowadź przetwarzanie obrazu za pomocą oprogramowania M3vision. Ilościowo określ obserwowany sygnał, wykorzystując ustalone obszary zainteresowania (ROI).</li>
</ol>
4. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego in vivo
<ol>
	<li>Zanurz myszy w narkozie z użyciem 3% izofluranu w mieszaninie O2:N2O (3:7).</li>
	<li>Umieść myszy w stabilizatorze poziomego systemu MR 9.4T i zmniejsz poziom narkozy do 1% izofluranu w mieszaninie O2:N2O (3:7).</li>
	<li>Nawilż oczy myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu, wprowadź sondę rektalną do monitorowania temperatury ciała oraz monitoruj częstotliwość oddechów, umieszczając czujnik pod brzuchem myszy.</li>
	<li>Utrzymuj częstotliwość oddechów na poziomie 110 ± 10 oddechów na minutę i zachowaj stałą temperaturę ciała w wąskim zakresie 37 ± 0.5 °C.</li>
	<li>Umieść powierzchniową cewkę RF na głowie myszy i ustaw mysz w centrum magnesu.</li>
	<li>Nabyj zestaw 10 obrazów w płaszczyźnie czołowej ważonych T2 w sekwencji spin-echo (SE) w celu uzyskania szczegółowych informacji anatomicznych oraz obrazy ważone T2* w sekwencji gradient-echo (GE) do badania migracji komórek macierzystych z rozdzielczością w płaszczyźnie 70 μm2. Ustaw parametry sekwencji w następujący sposób: czas repetycji (TR): 500 ms, czas echa (TE): 8 ms (sekwencja GE) oraz czas repetycji (TR): 4200 ms, czas echa (TE): 12.16 ms (sekwencja SE); pole widzenia (FOV): 18x18 mm2, macierz: 256x256, grubość warstwy 1 mm i odstęp między warstwami 1 mm (oprogramowanie Paravision 5.1).</li>
	<li>Przeprowadź przetwarzanie danych przy użyciu oprogramowania Amira 4.0.</li>
</ol>
5. Histologia pośmiertna
<ol>
	<li>Mysz głęboko uprzednio znieczulić poprzez inhalację mieszaniny izofluranu (4%), tlenu (0,5 L/min) i azotu (1 L/min) przez 2 minuty. Uśmiercić myszy poprzez zwichnięcie stawów szyjnych.</li>
	<li>Wyjąć mózg myszy z czaszki i utrwalić tkankę mózgową w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 2 godziny.</li>
	<li>Odwodnić tkankę mózgową, umieszczając mózg kolejno w roztworach sacharozy o różnych stężeniach: przez 2 h w 5% sacharozy w PBS, 2 h w 10% sacharozy w PBS oraz przez noc w 20% sacharozy w PBS.</li>
	<li>Zamrozić tkankę mózgową w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu krojenia.</li>
	<li>Przygotować skrawki tkanki mózgowej o grubości 10 μm przy użyciu kriotomu.</li>
	<li>Przesiewowo ocenić niebarwione skrawki kriotomiczne pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wykrycia niebieskiej fluorescencji cząsteczek GB MPIO oraz zielonej fluorescencji komórek wykazujących ekspresję eGFP.</li>
	<li>Przesiewowo ocenić niebarwione skrawki kriotomiczne pod kątem zielonej/czerwonej fluorescencji tła pochodzącej z komórek zapalnych.</li>
	<li>Przeprowadzić dalsze barwienia immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne w celu zidentyfikowania endogennych populacji komórek (np. mikrogleju, astrocytów, limfocytów T itd.) oddziałujących z przeszczepami komórkowymi.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
W niniejszym materiale przedstawiliśmy w formie wizualnej zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla skutecznego obrazowania multimodalnego populacji (komórek) macierzystych exprimujących lucyferazę/eGFP w OUN myszy. W pierwszej kolejności opisana procedura znakowania GB MPIO skutkuje wysoce wydajnym znakowaniem komórek BMSC-Luc/eGFP, co można łatwo zweryfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Ryc. 2A). Następnie, po przeszczepieniu znakowanych GB MPIO komórek BMSC-Luc/eGFP do OUN myszy, przeżywalność przeszczepu komórkowego może być monitorowana za pomocą in vivo BLI w oparciu o aktywność lucyferazy (Ryc. 2B). Dodatkowo dokładna lokalizacja przeszczepionych komórek może być monitorowana za pomocą in vivo MRI w oparciu o zawartość żelaza w GB MPIO (Ryc. 2C). Na koniec analiza histologiczna pozwala na walidację wyników uzyskanych za pomocą BLI i MRI. Stabilne przeżycie potwierdzono poprzez stabilną w czasie ekspresję eGFP (Ryc. 2D). W tym celu kolokalizacja komórek exprimujących eGFP z niebiesko fluorescencyjnymi MPIO pozwala na dokładne określenie lokalizacji i przeżywalności przeszczepionych komórek. Ponadto to podwójne znakowanie fluorescencyjne komórek macierzystych zmniejsza możliwość wystąpienia wyników fałszywie dodatnich wynikających z fluorescencji tła generowanej przez komórki zapalne5.
<img alt="Proces znakowania i implantacji komórek. Schemat przedstawia BLI in vivo, MRI oraz histologię pośmiertną." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Przegląd sekwencji postępowania
<ol class="lroman">
	<li>Znakowanie komórek: BMSC-Luc/eGFP są znakowane cząsteczkami GB MPIO w stężeniu 5 x 106 na ml pożywki hodowlanej. Po 16 h inkubacji i następującym po niej 24-godzinnym okresie odpoczynku, komórki są zbierane do implantacji wewnątrzczaszkowej.</li>
	<li>Implantacja komórek: Znakowane GB MPIO komórki BMSC-Luc/eGFP są przeszczepiane do mózgu myszy w następujących współrzędnych: bregma -2 mm, 2 mm na prawo od linii środkowej i 2 mm pod twardówką.</li>
	<li>In vivo BLI: Po dożylnym podaniu 150 mg D-lucyferyny/kg masy ciała, generowane światło było rejestrowane przez 5 minut przy użyciu urządzenia Photon Imager.</li>
	<li>In vivo MRI: Wykonano zestaw 10 obrazów w płaszczyźnie czołowej w sekwencji spin echo (SE) ważonej T2 oraz obrazów gradient echo (GE) ważonych T2* z rozdzielczością w płaszczyźnie 70 μm2. Parametry sekwencji były następujące: czas repetycji (TR): 500 ms, czas echa (TE): 8 ms (sekwencja GE) oraz czas repetycji (TR): 4200 ms, czas echa (TE): 12,16 ms (sekwencja SE); pole widzenia (FOV): 18x18 mm2, macierz: 256x256, grubość warstwy 1 mm i odstęp między warstwami 1 mm.</li>
	<li>Histologia pośmiertna: Przekroje mrożone o grubości 10 μm były analizowane pod kątem obecności BMSC wykazujących ekspresję eGFP oraz znakowanych niebieską fluorescencją przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
<img alt="Znakowanie komórek in vitro, obrazowanie in vivo, skany MRI, histologia pośmiertna ukazująca rozkład komórek." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Multimodalne obrazowanie przeszczepów komórek macierzystych
<ol class="ualpha">
	<li>Mikroskopia z bezpośrednią immunofluorescencją komórek BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO (Glacial blue).</li>
	<li>Obrazowanie BLI in vivo myszy po wstrzyknięciu 4x105 komórek BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO w 1. i 2. tygodniu po implantacji. Analiza statystyczna wykrytych sygnałów BLI w 1. i 2. tygodniu po implantacji. Dane przedstawiono jako średnią liczbę fotonów na sekundę na steradian na centymetr kwadratowy (ph/s/sr/cm2) w okresie 5 minut +/- błąd standardowy obliczony dla stałego obszaru zainteresowania (ROI) u myszy wykazujących wyraźny sygnał BLI w miejscu wstrzyknięcia.</li>
	<li>Koronalny dwuwymiarowy obraz MRI przeszczepów BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO (panel lewy: (i) obraz spin-echo ważony w czasie T2 oraz (ii) obraz echo gradientowe ważony w czasie T2*) oraz nieznakowanych BMSC-Luc/eGFP (panel prawy: (iii) obraz spin-echo ważony w czasie T2 oraz (vi) obraz echo gradientowe ważony w czasie T2*) w mózgu myszy.</li>
	<li>Analiza histologiczna implantów BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO w 2. tygodniu po implantacji. (i) Analiza z bezpośrednią immunofluorescencją w celu lokalizacji przeszczepów BMSC-Luc/eGFP wykazujących ekspresję eGFP i znakowanych GB MPIO. (ii) Szczegół powiększenia (i). (iii) Barwienie immunofluorescencyjne na antygen GFAP, wskazujące na rozwój astrocytycznej blizny w otoczeniu BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO. (vi) Barwienie immunofluorescencyjne na antygen Iba-1, wskazujące na naciekanie i otaczanie BMSC-Luc/eGFP znakowanych GB MPIO przez mikroglej.</li>
</ol>

<ol><li>Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodriguez-Porcel%2C+M+%22Molecular+imaging+of+stem+cells%22">Molecular imaging of stem cells</a>. , (2008).</li>
<li>Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene-expressing+bone+marrow-derived+stromal+cells+are+immune-tolerated+following+implantation+in+the+central+nervous+system+of+syngeneic+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice.</a> BMC Biotechnol. 9, 1(2009).</li>
<li>Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+cellular+implants+by+the+brain%27s+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).</li>
<li>Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+bioluminescence+imaging+of+human+ES+cell+progeny+in+the+rodent+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS.</a> J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).</li>
<li>De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Luciferase%2FeGFP-Expressing+Bone+Marrow-Derived+Stromal+Cells+with+Fluorescent+Micron-Sized+Iron+Oxide+Particles+Improves+Quantitative+and+Qualitative+Multimodal+Imaging+of+Cellular+Grafts+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo.</a> Mol Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Challenges+for+the+Advancement+of+Neural+Stem+Cell+Biology+and+Transplantation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li>
<li>Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+potential+of+intravenous+neural+stem+cell+delivery+for+treatment+of+neuroinflammatory+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice.</a> Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).</li>
<li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR+tracking+of+stem+cells+in+living+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MR tracking of stem cells in living recipients.</a> Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).</li>
<li>Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+magnetic+resonance+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cell+grafts+in+ischemic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat.</a> 17, 1282-1291 (2009).</li>
<li>Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+of+cancer+cell+fate+at+the+single-cell+level+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain.</a> Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).</li>
<li>Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo%3A+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).</li>
<li>Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+fate+of+implanted+bone+marrow+stromal+cells+labeled+with+superparamagnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).</li>
<li>Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transplanted+stem+cell+migration+after+a+stroke%3A+a+serial%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study.</a> Neuroimage. 21, 311-317 (2004).</li>
<li>Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+labeling+of+non-phagocytic+adherent+cells+with+iron+oxide+nanoparticles%3A+a+comprehensive+study%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).</li>
<li>Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylated+superparamagnetic+iron+oxide+particles+label+cells+intracellularly+without+transfection+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents.</a> Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).</li>
<li>Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Cellular MR imaging.</a> Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).</li>
<li>Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endosomal+labeling+of+progenitor+and+stem+cells+with+large+magnetic+particles+allows+magnetic+resonance+imaging+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells.</a> Blood. 102, 867-872 (2003).</li>
<li>Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+single+cells+by+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of single cells by MRI.</a> Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).</li>
<li>Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+detection+of+single+particles+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MRI detection of single particles for cellular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).</li>
<li>Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+MRI+contrast+agents+on+the+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype.</a> Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).</li>
<li>Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+firefly+luciferase+inhibition+by+general+anesthetics%3A+Gaussian+and+anisotropic+network+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses.</a> Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).</li>
<li>Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+protein+binding+of+luciferase+substrates+influences+sensitivity+and+accuracy+of+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging.</a> Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).</li>
<li>Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+bioluminescence+imaging+for+quantitative+tumour+burden+assessment+using+IV+or+IP+administration+of+D%3A+-luciferin%3A+effect+on+intensity%2C+time+kinetics+and+repeatability+of+photon+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2%2FBCRP+expression+modulates+D-Luciferin+based+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging.</a> Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).</li>
<li>Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-dependent+and+cell+cycle-dependent+expression+from+a+cytomegalovirus-based+mammalian+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector.</a> Gene. 194, 115-123 (1997).</li>
<li>Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+DNA+methylation+and+histone+deacetylation+activate+cytomegalovirus+promoter-controlled+reporter+gene+expression+in+human+glioblastoma+cell+line+U87%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87.</a> Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).</li>
<li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression%3A+implications+for+stem+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li>
<li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter%3A+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li>
</ol>

Autorzy declare, że nie stwierdzono konfliktu interesów.

W niniejszym raporcie opisujemy zoptymalizowany protokół łączący trzy komplementarne metody obrazowania (BLI, MRI i histologię) w celu szczegółowej charakterystyki implantów komórkowych w ośrodkowym układzie nerwowym kompetentnych immunologicznie myszy. Połączenie znakowania komórek za pomocą genów reporterowych, opartych na modyfikacji genetycznej z wykorzystaniem genów lucyferazy świetlika i eGFP, oraz bezpośredniego znakowania komórek za pomocą GB MPIO, pozwala na dokładną ocenę przeszczepów komórek macierzystych ...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Lonza Inc.</td><td>BE12-722F</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM</td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>1605-122</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15290-018</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek CEM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>GB MPIO</td><td>Bangs Laboratories</td><td>ME04F/7833</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Promega Corp.</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Ketalar)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rompun)</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Isoflo</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>0.9% roztwór NaCl</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Applichem</td><td>A1125</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do mikroiniekcji</td><td>KD scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik fotonowy</td><td>Biospace Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner MR 9.4T</td><td>Bruker Corporation</td><td>Biospec 94/20 USR</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop BX51</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat Mycrom HM</td><td>Prosan</td><td>HM525</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>Hamilton Co</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>igła 30 G</td><td>Hamilton Co</td><td>7762-03</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Photo Vision</td><td>Biospace Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie M3vision</td><td>Biospace Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Paravision 5.1</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Amira 4.0</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

W ciągu ostatniej dekady transplantacja komórek macierzystych zyskała coraz większe zainteresowanie jako główna lub pomocnicza metoda terapeutyczna w leczeniu wielu chorób, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Jednak do tej pory wyniki dotyczące efektów funkcjonalnych i/lub regeneracji tkanek po transplantacji komórek macierzystych są bardzo zróżnicowane. Zazwyczaj korzyść kliniczna jest obserwowana bez głębokiego zrozumienia podstawowych mechanizmów1. W związku z tym podjęto liczne wysiłki w celu opracowania różnych metod obrazowania molekularnego do monitorowania przyjmowania się przeszczepów komórek macierzystych, z nadrzędnym celem dokładnej oceny przeżywalności, losów i fizjologii przeszczepionych komórek macierzystych i/lub ich mikrośrodowiska. Zmiany obserwowane w jednym lub większej liczbie parametrów określonych przez obrazowanie molekularne mogą być powiązane z obserwowanym efektem klinicznym. W tym kontekście nasze badania koncentrują się na połączonym zastosowaniu obrazowania bioluminescencyjnego (BLI), obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz analizy histologicznej w celu oceny przyjmowania się przeszczepów komórek macierzystych.
BLI jest powszechnie stosowane do nieinwazyjnego śledzenia komórek oraz monitorowania ich przeżywalności w czasie po transplantacji2-7, w oparciu o reakcję biochemiczną, w której komórki wykazujące ekspresję genu reporterowego lucyferazy są zdolne do emisji światła po oddziaływaniu z jej substratem (np. D-lucyferyną)8, 9. MRI z kolei jest nieinwazyjną techniką o zastosowaniu klinicznym10, która może być wykorzystywana do precyzyjnej lokalizacji przeszczepów komórkowych z bardzo wysoką rozdzielczością11-15, choć jej czułość w dużym stopniu zależy od kontrastu uzyskanego po oznakowaniu komórek środkiem kontrastowym do MRI. Ostatecznie, pośmiertna analiza histologiczna jest preferowaną metodą walidacji wyników badań uzyskanych za pomocą technik nieinwazyjnych, zapewniającą najwyższą rozdzielczość i czułość. Ponadto końcowa analiza histologiczna pozwala na przeprowadzenie szczegółowej analizy fenotypowej przeszczepionych komórek i/lub otaczającej je tkanki, w oparciu o zastosowanie fluorescencyjnych białek reporterowych i/lub bezpośrednie znakowanie komórek specyficznymi przeciwciałami.
Podsumowując, prezentujemy tutaj wizualnie komplementarność BLI, MRI oraz histologii w celu odkrycia różnych cech związanych z komórkami macierzystymi i/lub ich środowiskiem po przeszczepieniu komórek macierzystych do OUN myszy. Przykładowo, komórki zrębowe pochodzące z szpiku kostnego, zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) i lucyferazy świetlika (fLuc) oraz znakowane niebieskimi fluorescencyjnymi mikrocząsteczkami tlenku żelaza (MPIOs), zostaną przeszczepione do OUN myszy immunokompetentnych, a wyniki będą monitorowane za pomocą BLI, MRI oraz histologii (Rycina 1).

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

W ciągu ostatniej dekady transplantacja komórek macierzystych zyskała coraz większe zainteresowanie jako pierwotna lub wtórna metoda terapeutyczna w leczeniu wielu schorzeń, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie standaryzowanego monitorowania zachowania in vivo komórek macierzystych przeszczepionych do mózgu myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie pochodzących z szpiku kostnego komórek stropowych, wykazujących koekspresję EGFP i lucyferazy, fluorescencyjnymi cząstkami tlenku żelaza o rozmiarach mikronowych. Drugim krokiem jest odpowiednie wstrzyknięcie znakowanych MPIO komórek BMC do tkanki mózgowej myszy.Następnie, przeżywalność i lokalizacja przeszczepów komórkowych są monitorowane nieinwazyjnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym. Ostatnim krokiem jest walidacja wyników obrazowania in vivo przy użyciu pośmiertnej analizy histologicznej. Metody te mogą dostarczyć informacji na temat zachowania komórek macierzystych po transplantacji do mózgu myszy, ale mogą być one również zastosowane w innych układach, takich jak organizmy modelowe oraz badania nad chorobami.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy postępowania ze zwierzętami są trudne do opanowania ze względu na trudność wykonania wstrzyknięć dożylnych i wewnątrzczaszkowych oraz związane z nimi ryzyka dla

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wielomodalne obrazowanie wszczepienia komórek macierzystych w centralny układ nerwowy myszy

Źródło: Daynac, M., et. al. Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje obrazowanie poklatkowe nerwowych komórek macierzystych (NSC) z mózgu transgenicznej myszy przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. NSC fluoryzują na czerwono podczas fazy G1 i są niefluorescencyjne w innych fazach cyklu komórkowego. Przylegającą...

Obrazowanie poklatkowe podziału nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Poznaj multimodalne obrazowanie bioluminescencyjne i rezonansu magnetycznego do śledzenia komórek macierzystych w mózgu myszy. Ta metoda umożliwia nieinwazyjną ocenę przeżycia i lokalizacji przeszczepów komórkowych z walidacją histologiczną.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Przeglądaj więcej filmów