Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyekstrahowanie LPS z bakterii Gram-ujemnych. Jest to realizowane poprzez uprzednie wyhodowanie pięciomililitrowej nocnej kultury bakterii w odpowiednim medium i dostosowanie gęstości optycznej kultury do wartości 0,5 przy 600 nanometrach. Następnie bakterie są osadzane w wirówce mikrocentryfugalnej, a komórki resuspensowane w buforze Tris zawierającym SDS i beam lub capto etanol.

Następnie lizaty komórkowe są gotowane i traktowane proteazą oraz nukleazą. Na koniec przeprowadza się dwie sekwencyjne ekstrakcje gorącym wodnym fenolem i eterem diizopropylowym, ostrożnie usuwając i zachowując wodną niebieską warstwę. Ostatecznie można uzyskać wyniki wskazujące na ilość oraz obecność lub brak LPS i szczepów bakterii, a także modalność długości łańcucha antygenu O poprzez rozdział metodą SDS-PAGE i analizy western blot z użyciem przeciwciał specyficznych dla LPS lub bezpośrednie barwienie polisacharydów w żelu.

Zaletą tej techniki w porównaniu z metodą traktowania proteazami opracowaną przez Hitchcocka i Browna jest to, że pozwala ona na uzyskanie czystych próbek LPS, które mogą zostać lepiej rozdzielone za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i western blottingu. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat syntezy i regulacji lipopolisacharydu w VIR w praktycznie każdej bakterii gram-ujemnej, w tym E. coli i Salmonella, a także w patogenach związanych z obroną biologiczną i patogenach wschodzących, odpowiednio Ella i Acetobacter. Aby wyhodować bakterie do ekstrakcji LPS, należy przygotować nocną kulturę bakterii gram-ujemnych w 5 ml pożywki LB z dodatkiem antybiotyków.

W razie potrzeby hodowlę należy inkubować przez noc w inkubatorze wytrząsowym przy 200 RPM i 37 °C. Użyć pożywki LB do rozcieńczenia hodowli w stosunku 1:10, a następnie zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm. Przygotować 1,5 ml zawiesiny bakterii o końcowej gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej 0,5.

Odwiruj bakterie w mikrocentryfudze przy 10 600 ×g przez 10 minut w celu uzyskania osadu. Następnie usuń i odrzuć nadsącz. Do ekstrakcji LPS przygotuj następujące roztwory: bufor SDS 1X, 4% beta-merkaptoetanolu lub BME 4% SDS oraz 20% glicerolu w 0,1 M Tris-HCl pH 6.8 z dodatkiem szczypty błękitu bromofenolowego, a także roztwory DNazy I, RNazy i proteinazy K w stężeniu 10 mg/mL w sterylnej wodzie destylowanej, a następnie resuspenduj osad.

Osad bakterii w 200 µL buforu 1X SDS należy całkowicie zawiesić poprzez wielokrotne pipetowanie roztworu. Zawiesinę bakterii należy powoli gotować w łaźni wodnej przez 15 minut. Następnie należy pozostawić roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

W ramach kroku opcjonalnego należy dodać po 5 µL każdego z roztworów DNA oraz RNA i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie dodaje się 10 µL roztworu proteazy K i inkubuje próbki w temperaturze 59 °C przez trzy godziny. Do każdej próbki dodaje się 200 µL lodowatego roztworu Tris-fenol nasycony.

Mocno zakręć nakrętki i wymieszaj każdą probówkę w vorteksie przez 5 do 10 sekund. Inkubuj próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Schładzając je okresowo do temperatury pokojowej, wymieszaj je w vorteksie.

Następnie w dygestorium dodaj jeden mililitr eteru etylowego o temperaturze pokojowej do każdej próbki i mieszaj w wirówce typu vortex od 5 do 10 sekund. Wirować próbki z prędkością 20 600 ×g przez 10 minut, a następnie ostrożnie wyjąć je z wirówki. Odpipekuj dolną niebieską warstwę z każdej próbki, unikając górnej przezroczystej warstwy.

Do każdej probówki dodać kolejne 200 µL lodowatego buforu Tris oraz fenolu nasyconego i powtórzyć ekstrakcję. Dodać 200 µL dwukrotnego buforu SDS. Odseparować od 5 do 15 µL każdej próbki LPS na żelach poliakrylamidowych SDS o stężeniu od 8 do 15%.

Przedstawiono tutaj żel SDS-PAGE (12%), na którym naniesiono próbki LPS przygotowane z różnych szczepów Pseudomonas aeruginosa z zimnych obszarów, wyizolowanych z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą. Różne wzory prążków odzwierciedlają różną liczbę jednostek powtarzalnych antygenu O przyłączonych do oligosacharydów rdzenia. Podobna liczba jednostek powtarzalnych jest widoczna w próbkach pierwszej i szóstej.

Należy pamiętać, że praca z eterem difenylowym może być niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej, w tym fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów ochronnych, a eksperymenty te powinny być przeprowadzane w dygestorium. Ważne jest, aby ekstrakcje przeprowadzać szybko, aby nie dopuścić do utraty próbek podczas przetwarzania. Po wykonaniu tej procedury należy zastosować Western blotting lub metody wizualizacji lipopolisacharydów za pomocą barwienia srebrem lub innych metod, aby zobrazować pokrewieństwo między szczepami.