Name: Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącym roztworem wodnego fenolu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Naucz się oczyszczania lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych metodą gorącego roztworu wodnego fenolu. Technika ta umożliwia analizę LPS za pomocą SDS-PAGE i Western blot z wysoką czystością próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health oraz Cystic Fibrosis Foundation.

1. Przygotowanie bakterii do ekstrakcji LPS
<ol>
	<li>Przygotować kulturę nocną w 5 mL pożywki Luria Broth (LB), uzupełnionej o antybiotyki, jeśli jest to konieczne. Hodować kulturę przez noc (12-18 godzin) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i przy 200 rpm.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę w pożywce LB w stosunku 1:10 i zmierzyć wartość OD600 za pomocą spektrofotometru. Na podstawie odczytu OD600 przygotować 1,5 mL zawiesiny bakterii o wartości OD600 wynoszącej 0,5.</li>
	<li>Odwirować bakterie w mikrowirówce przy 10 600x g przez 10 minut. Usunąć i odrzucić nadsącz. Osad można przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli ekstrakcja LPS nie będzie przeprowadzona natychmiast.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja LPS
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności należy przygotować 2x bufor SDS. Przygotować 50 mL roztworu zawierającego 4% β-merkaptoetanolu (BME), 4% SDS i 20% glicerolu w 0,1 M Tris-HCl, pH 6.8. Dodać szczyptę błękitu bromofenolowego w celu zabarwienia roztworu. Przygotować zapas 1x buforu SDS poprzez rozcieńczenie zapasu 2x w stosunku 1:1 w sterylnej wodzie destylowanej H2O. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować trzy oddzielne roztwory DNazy I, RNazy oraz proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL w sterylnej wodzie destylowanej H2O.</li>
	<li>Resuspender osad bakterii z kroku 1.3 w 200 μl 1x buforu SDS. Aby upewnić się, że osad został całkowicie resuspenderowany, powolnie pipetować roztwór w górę i w dół. Nie mieszać w wirówce typu vortex.</li>
	<li>Gotować zawiesinę bakterii w łaźni wodnej przez 15 minut. Pozostawić roztwór do ochłodzenia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać po 5 μl roztworów DNazy I i RNazy przygotowanych w kroku 2.2. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. *Krok ten jest opcjonalny; różnica w jakości LPS między próbkami traktowanymi nukleazami a nietraktowanymi jest minimalna.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu proteinazy K przygotowanego w kroku 2.2. Inkubować próbki w temperaturze 59 °C przez 3 godziny. W przypadku ograniczeń czasowych krok ten można przeprowadzić przez noc.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 200 μl lodowatego fenolu nasyconego Tris (jeśli fenol nasycony Tris nie jest dostępny, można zastosować fenol nasycony wodą). Upewnić się, że zakrętki probówek są szczelnie zamknięte, a następnie mieszać każdą próbkę w wirówce typu vortex przez około 5 do 10 sekund.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut, okazjonalnie mieszając w wirówce typu vortex. Po inkubacji ochłodzić do temperatury pokojowej, a następnie dodać 1 mL eteru dietylowego w temperaturze pokojowej do każdej próbki i mieszać w wirówce typu vortex przez 5 do 10 sekund. Eter należy obsługiwać w dygestorium, ponieważ jest on lotny.</li>
	<li>Wirować próbki z prędkością 20 600x g przez 10 minut. Ostrożnie wyjąć próbki z wirówki i pobrać dolną niebieską warstwę. Należy unikać kontaktu z górną, przezroczystą warstwą. Pozostawienie niewielkiej ilości niebieskiej warstwy jest lepsze niż zanieczyszczenie jej warstwą górną.</li>
	<li>Przeprowadzić ponowną ekstrakcję próbek, powtarzając kroki 2.7 – 2.9. Zazwyczaj wystarczające są dwie ekstrakcje. Jeśli próbki wydają się mętne, można przeprowadzić więcej ekstrakcji. Przed rozdzieleniem metodą SDS-PAGE dodać 200 μl 2x buforu SDS do każdej z ekstrahowanych próbek. Próbki można nanosić na 8%–15% żele poliakryloamidowe SDS. Do wizualizacji zazwyczaj wystarcza od pięciu do piętnastu μl LPS przygotowanego tą metodą.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Próbki LPS przygotowane w powyższy sposób można wizualizować poprzez bezpośrednie barwienie po rozdziale w metodzie SDS-PAGE, stosując standardowy protokół barwienia srebrem lub komercyjnie dostępny zestaw do barwienia LPS. Alternatywnie, LPS rozdzielony na żelu poliakrylamidowym można przenieść na membranę nitrocelulozową i poddać analizie Western blot przy użyciu swoistych dla LPS antyser. W tym protokole zastosowano zestaw Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit (Molecular Probes) zgodnie z instrukcjami producenta.
Na Rysunku 1 przedstawiono żel SDS-poliakryloamidowy o stężeniu 12% barwiony Pro-Q Emerald 300. Każda ścieżka zawiera 15 μl LPS przygotowanego z różnych szczepów Burkholderia dolosa wyizolowanych z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą. Przy użyciu tej metody widoczne są różne wzory drabin prążków LPS, odzwierciedlające różną liczbę jednostek powtarzalnych antygenu O przyłączonych do oligosacharydu rdzenia; na przykład próbki w ścieżkach 1 i 6 mają podobne do siebie wzory prążkowania (obramowane na czerwono).
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej wykazujący separację prążków DNA; analiza oczyszczania białek." src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. LPS z izolatów klinicznych Burkholderia dolosa barwione barwnikiem Pro-Q Emerald 300. LPS z siedmiu szczepów B. dolosa pochodzących z ogniska choroby u pacjentów z mukowiscydozą wyizolowano zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Ilość 15 μl rozdzielono na 12% żelu SDS-poliakryloamidowym, a następnie zabarwiono barwnikiem Pro-Q Emerald 300 zgodnie z instrukcją producenta. Rdzeń LPS jest zaznaczony strzałką, a LPS wykazujące podobne wzory prążkowania powtórzeń antygenu O zostały obramowane na czerwono. M = marker masy cząsteczkowej.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisaliśmy metodę oczyszczania LPS od innych składników komórkowych, w tym kwasów nukleinowych i białek. Metoda ta pozwala uzyskać wysokiej jakości LPS, który może być wykorzystany w wielu różnych metodach wizualizacji, w tym w barwieniu węglowodanów w żelach SDS-PAGE, jak pokazano na Rysunku 1. Metoda ta może być stosowana do serotypowania LPS z różnych szczepów przy użyciu specyficznych antyserów lub do wykazania pokrewieństwa między izolatami poprzez bezpośrednią wizualizację. Na przykład niedawny projekt sekwencjonow...

<table><tbody><tr><td>Rekombinowana DNaza I, wolna od RNaz</td><td>Roche Group</td><td>04716728001</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Roche Group</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td>Fenol nasycony Trisem</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1750-100</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Thomas Scientific</td><td>C313K31</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia żeli lipopolisacharydowych Pro-Q Emerald 300</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>P20495</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolisacharyd (LPS) jest głównym składnikiem błon zewnętrznych bakterii Gram-ujemnych. Jest to cząsteczka trójdzielna, składająca się z lipidu A, który jest osadzony w błonie zewnętrznej, rdzeniowego oligosacharydu oraz powtarzających się jednostek antygenu O, które wystają na zewnątrz z powierzchni komórki.1, 2LPS jest cząsteczką immunodominującą, która odgrywa istotną rolę w wirulencji i patogenezie wielu gatunków bakterii, w tym *Pseudomonas aeruginosa*, *Salmonella* gatunki, i Escherichia coli3-5, a różnice w składzie antygenu O LPS stanowią podstawę serotypowania szczepów. LPS bierze udział w przyleganiu do komórek gospodarza w początkowej fazie infekcji oraz zapewnia ochronę przed zabijaniem zależnym od dopełniacza; szczepy pozbawione LPS mogą wykazywać osłabioną wirulencję.6-8Z tych powodów istotna jest wizualizacja LPS, w szczególności pochodzącego z izolatów klinicznych. Wizualizacja wzorów prążkowania LPS oraz rozpoznawanie ich przez specyficzne przeciwciała mogą być użytecznymi narzędziami w identyfikacji linii szczepów oraz charakteryzacji różnych mutantów. 
W niniejszym raporcie opisujemy metodę wykorzystującą gorący fenol wodny do izolacji i oczyszczania LPS z komórek bakterii Gram-ujemnych. Protokół ten umożliwia ekstrakcję LPS z oddzieleniem kwasów nukleinowych i białek, które mogą utrudniać wizualizację LPS w przypadku stosowania krótszych i mniej intensywnych metod ekstrakcji9. LPS przygotowany w ten sposób można rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i barwić bezpośrednio przy użyciu barwników do węglowodanów/glikoprotein lub standardowych metod barwienia srebrem. Wiele antyser l LPS zawiera przeciwciała, które wykazują reakcję krzyżową z białkami błony zewnętrznej lub innymi antygenowymi celami, co może utrudniać analizę reaktywności obserwowaną po Western blottingu surowych lizatów komórkowych rozdzielonych metodą SDS-PAGE. Sama obróbka surowych lizatów komórkowych proteazami nie zawsze jest skutecznym sposobem usunięcia tego tła przy zastosowaniu tej lub innych metod wizualizacji. Co więcej, intensywna obróbka proteazami w celu usunięcia tego tła może prowadzić do uzyskania LPS słabej jakości, który nie jest dobrze rozdzielany żadną z wyżej wymienionych metod. Z tych względów uważamy, że poniższy protokół, zaadaptowany od Westpahl i Jann10, jest optymalny dla ekstrakcji LPS.

Opisujemy zmodyfikowaną metodę ekstrakcji gorącym wodnym fenolem w celu oczyszczania lipopolisacharydu (LPS) z bakterii Gram-ujemnych. Po ekstrakcji LPS można następnie poddać analizie za pomocą SDS-PAGE i zwizualizować poprzez bezpośrednie barwienie lub Western immunoblot.

Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Lipopolisacharyd (LPS) jest głównym składnikiem błon zewnętrznych bakterii Gram-ujemnych. Jest to cząsteczka trójskładnikowa, składająca się z lipidu A, który jest...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyekstrahowanie LPS z bakterii Gram-ujemnych. Jest to realizowane poprzez uprzednie wyhodowanie pięciomililitrowej nocnej kultury bakterii w odpowiednim medium i dostosowanie gęstości optycznej kultury do wartości 0,5 przy 600 nanometrach. Następnie bakterie są osadzane w wirówce mikrocentryfugalnej, a komórki resuspensowane w buforze Tris zawierającym SDS i beam lub capto etanol.Następnie lizaty komórkowe są gotowane i traktowane proteazą oraz nukleazą. Na koniec przeprowadza się dwie sekwencyjne ekstrakcje gorącym wodnym fenolem i eterem diizopropylowym, ostrożnie usuwając i zachowując wodną niebieską warstwę. Ostatecznie można uzyskać wyniki wskazujące na ilość oraz obecność lub brak LPS i szczepów bakterii, a także modalność długości łańcucha antygenu O poprzez rozdział metodą SDS-PAGE i analizy western blot z użyciem przeciwciał specyficznych dla LPS lub bezpośrednie barwienie polisacharydów w żelu.Zaletą tej techniki w porównaniu z metodą traktowania proteazami opracowaną przez Hitchcocka i Browna jest to, że pozwala ona na uzyskanie czystych próbek LPS, które mogą zostać lepiej rozdzielone za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i western blottingu. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat syntezy i regulacji lipopolisacharydu w VIR w praktycznie każdej bakterii gram-ujemnej, w tym E. coli i Salmonella, a także w patogenach związanych z obroną biologiczną i patogenach wschodzących, odpowiednio Ella i Acetobacter. Aby wyhodować bakterie do ekstrakcji LPS, należy przygotować nocną kulturę bakterii gram-ujemnych w 5 ml pożywki LB z dodatkiem antybiotyków.W razie potrzeby hodowlę należy inkubować przez noc w inkubatorze wytrząsowym przy 200 RPM i 37 °C. Użyć pożywki LB do rozcieńczenia hodowli w stosunku 1:10, a następnie zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm. Przygotować 1,5 ml zawiesiny bakterii o końcowej gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej 0,5.Odwiruj bakterie w mikrocentryfudze przy 10 600 ×g przez 10 minut w celu uzyskania osadu. Następnie usuń i odrzuć nadsącz. Do ekstrakcji LPS przygotuj następujące roztwory: bufor SDS 1X, 4% beta-merkaptoetanolu lub BME 4% SDS oraz 20% glicerolu w 0,1 M Tris-HCl pH 6.8 z dodatkiem szczypty błękitu bromofenolowego, a także roztwory DNazy I, RNazy i proteinazy K w stężeniu 10 mg/mL w sterylnej wodzie destylowanej, a następnie resuspenduj osad.Osad bakterii w 200 µL buforu 1X SDS należy całkowicie zawiesić poprzez wielokrotne pipetowanie roztworu. Zawiesinę bakterii należy powoli gotować w łaźni wodnej przez 15 minut. Następnie należy pozostawić roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.W ramach kroku opcjonalnego należy dodać po 5 µL każdego z roztworów DNA oraz RNA i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie dodaje się 10 µL roztworu proteazy K i inkubuje próbki w temperaturze 59 °C przez trzy godziny. Do każdej próbki dodaje się 200 µL lodowatego roztworu Tris-fenol nasycony.Mocno zakręć nakrętki i wymieszaj każdą probówkę w vorteksie przez 5 do 10 sekund. Inkubuj próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Schładzając je okresowo do temperatury pokojowej, wymieszaj je w vorteksie.Następnie w dygestorium dodaj jeden mililitr eteru etylowego o temperaturze pokojowej do każdej próbki i mieszaj w wirówce typu vortex od 5 do 10 sekund. Wirować próbki z prędkością 20 600 ×g przez 10 minut, a następnie ostrożnie wyjąć je z wirówki. Odpipekuj dolną niebieską warstwę z każdej próbki, unikając górnej przezroczystej warstwy.Do każdej probówki dodać kolejne 200 µL lodowatego buforu Tris oraz fenolu nasyconego i powtórzyć ekstrakcję. Dodać 200 µL dwukrotnego buforu SDS. Odseparować od 5 do 15 µL każdej próbki LPS na żelach poliakrylamidowych SDS o stężeniu od 8 do 15%.Przedstawiono tutaj żel SDS-PAGE (12%), na którym naniesiono próbki LPS przygotowane z różnych szczepów Pseudomonas aeruginosa z zimnych obszarów, wyizolowanych z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą. Różne wzory prążków odzwierciedlają różną liczbę jednostek powtarzalnych antygenu O przyłączonych do oligosacharydów rdzenia. Podobna liczba jednostek powtarzalnych jest widoczna w próbkach pierwszej i szóstej.Należy pamiętać, że praca z eterem difenylowym może być niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej, w tym fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów ochronnych, a eksperymenty te powinny być przeprowadzane w dygestorium. Ważne jest, aby ekstrakcje przeprowadzać szybko, aby nie dopuścić do utraty próbek podczas przetwarzania. Po wykonaniu tej procedury należy zastosować Western blotting lub metody wizualizacji lipopolisacharydów za pomocą barwienia srebrem lub innych metod, aby zobrazować pokrewieństwo między szczepami.

purification-visualization-lipopolysaccharide-from-gram-negative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Oczyszczanie i wizualizowanie lipopolisacharydów z bakterii Gram-ujemnych przez gorącą ekstrakcję wodno-fenolową

Źródło: Armbruster, KM, Meredith, TC Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego za pomocą spektrometrii mas. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą niejonowego detergentu, który po podgrzaniu ulega separacji faz. Poprzez sekwencyjne zmiany temperatury i etapy wirowania, lipoproteiny są selektywnie rozdzielane na fazę detergentu, podczas gdy zanieczyszczenia nielipoproteinowe są usuwane.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą niejonowej separacji faz detergentowych

Źródło: Hu, Y. i inni. Analiza interakcji między endobiotyką a ludzką mikrobiotą jelitową z wykorzystaniem systemów fermentacji w kąpielach in vitro. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) do oceny degradacji egzopolisacharydów (EPS) przez ludzką mikrobiotę kałową. Fragmenty EPS w supernatantach fermentacyjnych są rozdzielane na podstawie rozmiaru i polaryzacji za pomocą TLC, a następnie wizualizowane jako kolorowe pasy po barwieniu...

Wykonywanie chromatografii cienkowarstwowej w celu oceny degradacji egzopolisacharydów bakterii

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Fosfolipidowe kwasy tłuszczowe dostarczają informacji o strukturze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych. Przedstawiono metody ekstrakcji z próbek glebowych za pomocą jednofazowej mieszaniny chloroformu, frakcjonowania wyekstrahowanych lipidów za pomocą kolumn ekstrakcyjnych do fazy stałej oraz metalizy do produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są analizowane za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej.

Ekstrakcja i analiza mikrobiologicznych fosfolipidowych kwasów tłuszczowych w glebie

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Gangliozydy to glikosfingolipidy zawierające kwas sjalowy, których szczególnie dużo występuje w mózgu. Ich amfipatyczny charakter wymaga technik ekstrakcji i oczyszczania organicznego/wodnego, aby zapewnić optymalny odzysk i dokładne analizy. Ten artykuł zawiera omówienie ekstrakcji gangliozydów w skali analitycznej i preparatywnej, oczyszczania i analizy chromatografii cienkowarstwowej.

Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

Naucz się oczyszczania lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych metodą gorącego roztworu wodnego fenolu. Technika ta umożliwia analizę LPS za pomocą SDS-PAGE i Western blot z wysoką czystością próbek.

Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Przeglądaj więcej filmów