Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącym roztworem wodnego fenolu

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja LPS z bakterii Gram-ujemnych. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie pięciomililitrowej kultury bakterii przez noc w odpowiednim pożywce i dostosowanie kultury do gęstości optycznej przy 600 nanometrach 0,5. Następnie bakterie są granulowane przez mikrowirowanie, a komórki są ponownie zawieszane w buforze tris zawierającym SDS i wiązkę lub kaptto etanol.

Następnie lizaty komórkowe gotuje się i traktuje proteazą i nukleazą. Na koniec przeprowadza się dwie sekwencyjne ekstrakcje gorącym wodnym roztworem fenolu i eteru dylowego, ostrożnie usuwając i zatrzymując wodną niebieską warstwę. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ilość, a także obecność lub brak LPS i szczepów bakterii, a także modalność długości łańcucha antygenu O poprzez separację za pomocą strony SDS i zachodnie analizy krwi z przeciwciałami specyficznymi dla LPS lub bezpośrednie barwienie polisacharydów w żelu.

Zaletą tej techniki w porównaniu z leczeniem proteazą Hitchcocka i Browna jest to, że technika ta prowadzi do uzyskania czystych próbek LPS, które można lepiej rozpuścić za pomocą SDS page i western blot. Metoda ta może zapewnić wgląd w syntezę i regulację lipopolisacharydu w VIR w praktycznie wszystkie bakterie Gram-ujemne, w tym E. coli i salmonella, a także bioobronę i pojawiające się patogeny, takie jak odpowiednio Ella i Acetobacter Do hodowli bakterii. W przypadku ekstrakcji LPS należy ustawić nocną hodowlę bakterii Gram-ujemnych w pięciu mililitrach LB uzupełnionych antybiotykami.

W razie potrzeby hoduj kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Użyj LB, aby rozcieńczyć kulturę od 1 do 10, a następnie zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach na podstawie wyniku. Przygotuj 1,5 mililitrową zawiesinę bakterii o końcowej gęstości optycznej przy 600 nanometrach 0,5.

Granuluj bakterie w mikrowirówce pod ciśnieniem 10 600 razy G przez 10 minut. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Aby wyekstrahować LPS, przygotuj następujące roztwory, jeden bufor XSDS, 4% betta me capto etanol lub BME 4% SDS i 20% glicerol w 0,1 molowym tris HCL pH 6,8 ze szczyptą błękitu bromofenolowego i 10 miligramów na mililitr roztworów DNA jeden RNA i proteinazy K w sterylnej wodzie destylowanej ponownie zawiesić.

Granulowane bakterie w 200 mikrolitrach jednego buforu XSDS zapewniają, że osad jest całkowicie zawieszony poprzez pipetowanie roztworu w górę iw dół. Powoli gotuj zawieszone bakterie w łaźni wodnej przez 15 minut. Następnie pozostaw roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Jako opcjonalny krok dodaj pięć mikrolitrów każdego z roztworów DNA i RNA i inkubuj próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodać 10 mikrolitrów roztworu proteazy K i inkubować próbki w temperaturze 59 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Obok każdej próbki dodaj 200 mikrolitrów lodowatego trisu, nasyconego fenolu.

Zamknij szczelnie nakrętki i wiruj każdą probówkę przez pięć do 10 sekund. Próbki inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wirując, od czasu do czasu schładzaj je do temperatury pokojowej.

Następnie pod wyciągiem dodaj jeden mililitr eteru etylowego o temperaturze pokojowej do każdej próbki i wiruj przez pięć do 10 sekund. Odwirować próbki w temperaturze 20, 600 razy G przez 10 minut i ostrożnie wyjąć je z wirówki. Wyodrębnij dolną niebieską warstwę z każdej próbki, unikając górnej przezroczystej warstwy.

Dodaj dodatkowe 200 mikrolitrów lodowatego trisu, nasyconego fenolu i powtórz ekstrakcję do każdej probówki. Dodaj 200 mikrolitrów dwóch XSDS. Oddziel od pięciu do 15 mikrolitrów każdej próbki LPS na żelach poliakrylamidowych SDS o stężeniu od ośmiu do 15%.

Pokazano tutaj 12% żel na stronie SDS z próbkami LPS przygotowanymi z różnych szczepów bur cold area de losa, wyizolowanych z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą. Różne wzory prążków odzwierciedlają różną liczbę antygenu O, powtarzających się jednostek przyłączonych do podstawowych oligosacharydów. Podobną liczbę powtarzających się jednostek można zaobserwować w próbce pierwszej i szóstej.

Nie zapominaj, że praca z eterem fenolowo-datylowym może być niebezpieczna, jeśli należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochronnych, środków ochrony osobistej, takich jak fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary, a eksperymenty te należy wykonywać w dygestoria podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby przeprowadzić ekstrakcję szybko, aby nie stracić próbek podczas przetwarzania. Po tej procedurze należy zastosować zachodnie immunoblotting lub metody wizualizacji polisacharydu lipo za pomocą srebrnego STR lub inne metody w celu wizualizacji pokrewieństwa między szczepami.