Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku przy użyciu estru sukcynimidylu karboksylowego fluoresceiny (CFSE)

Ten protokół wideo demonstruje identyfikację i izolację wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku przy użyciu karboksyfluoresceiny SDI eter, CFSE. Komórki nowotworowe glejaka są najpierw hodowane przy użyciu testu sfery nerwowej. Następnie powstałe kule są dysocjowane na pojedyncze komórki i barwione CFSE.

Ogniwa załadowane CFSE są ponownie powlekane. W hodowli sfery nerwowej powstałe kule są dysocjowane na pojedyncze komórki i przechodzą przez maszynę do cytometrii przepływowej. Wolno i szybko dzielące się komórki są identyfikowane i sortowane na podstawie intensywności fluorescencji w funkcji podziału komórki.

Niejednorodność częstotliwości jest istotną cechą raka. Ta niejednorodność wspiera odporność guza i stanowi dużą przeszkodę w opracowaniu w pełni skutecznego leczenia. Dlatego tak ważne jest opracowanie narzędzi i testów do badania i zrozumienia tej niejednorodności, która jest definiowana genetycznie fenotypowo i funkcjonalnie.

W tym protokole wideo opisujemy metodę stojącą z wykorzystaniem przewodów kominowych i I-C-F-S-C. Technika ta umożliwia identyfikację i separację za pomocą cytometrii przepływowej poszczególnych subpopulacji w hodowli ludzkich komórek pochodzących z glejaka o różnych cechach funkcjonalnych. Użyliśmy tej techniki do wyizolowania i scharakteryzowania populacji komórek guza wykazujących powolne tempo podziału, co jest właściwością funkcjonalną, która, jak wykazano, jest związana z inicjacją guza Ins rak Sfera glejaków Hodowla jest ustalana i utrzymywana za pomocą testu sfery nerwowej, który jest opisany w osobnym filmie pod adresem na ekranie.

Gdy kulki glejaka osiągną rozmiar od 150 do 200 mikronów średnicy, pożywkę zawierającą kulki usuwa się i umieszcza w sterylnej probówce do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości i odwirowuje z prędkością 800 obr./min lub 110 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie supernatant jest odrzucany, a pelle kulek jest ponownie zawieszany w jednym mili przedwojennych tripów w EDTA i inkubowany w temperaturze 37 stopni w łaźni wodnej przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaje się równą objętość inhibitorów trypsyny, delikatnie pipetując w górę iw dół, aby oddzielić kulki.

Zawiesina komórkowa jest ponownie wirowana. Natyna SUP jest usuwana, a komórki są ponownie zawieszane w jednym mili komórek macierzystych nerwicy. Pożywka podstawowa, 10 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki dobrze miesza się z 90 mikrolitrami błękitu triamowego i przeprowadza się zliczanie komórek na każdy 1 milion komórek, które mają być wybarwione.

Jeden mil odczynnika barwiącego przygotowuje się przez dodanie jednego mikrolitra pięciomilimolowego barwnika CFSE do jednego mililitra podłoża bazowego komórek macierzystych układu nerwowego, aby uzyskać końcowe stężenie barwienia wynoszące pięć mikromolów. Następnie roztwór barwiący jest odpowiednio mieszany. Żądana liczba komórek jest następnie przenoszona do oddzielnej probówki, odwirowywana, a nadnatyna jest usuwana

Roztwór barwiący CFSE jest następnie dodawany do osadu i delikatnie mieszany do uzyskania jednorodności i inkubowany w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zatrzymać proces barwienia. Pięć do 10 objętości lodowatego podłoża podstawowego neuro komórek macierzystych dodaje się do komórek obciążonych CFSE i dobrze miesza. Zawiesina komórkowa jest następnie odwirowywana, a nadnatyna jest odrzucana.

W tym momencie. Na dnie probówki powinna pojawić się grupa komórek z zielonym odcieniem wskazującym, że barwienie się powiodło. Aby usunąć nadmiar barwnika CFSE, wykonuje się dwa do trzech płukań za pomocą resus, zawieszając osad w jednym mililu podłoża podstawowego z komórek macierzystych neuro, odwirowując i odrzucając supinat.

Po trzecim płukaniu komórki są ponownie zawieszane w jednym mililu podłoża bazowego komórek macierzystych układu nerwowego i przeprowadza się zliczanie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem w celu płytki komórek. Kompletne podłoże z komórek macierzystych nerwic jest uzupełniane EGF w końcowym stężeniu 20 nanogramów na ml. Następnie komórki z grup załadowanych i odciążonych CFSE są dodawane do odpowiednich probówek, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 000 komórek na ml.

Następnie zawiesiny komórkowe są dokładnie mieszane i umieszczane w sterylnych kolbach do hodowli tkankowych. Kolby są następnie oznaczane. Komórki można monitorować pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu sprawdzenia barwienia CFSE, a następnie umieścić w inkubatorze z wilgotnością 37 stopni i 5% CO2 na pięć do 10 dni.

Aby zweryfikować barwienie CFSE za pomocą cytometrii przepływowej, 500 000 komórek z załadowanych i niezaładowanych ujemnych grup kontrolnych CFSE przenosi się do oddzielnych probówek faksowych. Cytometr przepływowy jest regulowany na podstawie instrukcji obsługi dla powiązanych parametrów. Najpierw uruchamiane są nieobciążone komórki kontrolne, a zdarzenia są rejestrowane na podstawie właściwości rozpraszania do przodu i bocznego, a następnie na wykresie histogramu opartym na częstotliwości komórek w funkcji intensywności CFSE, główna populacja komórek jest następnie bramkowana w celu sprawdzenia poziomu intensywności fluorescencji CFSE.

Następnie komórki załadowane CFSE są analizowane przy użyciu tych samych parametrów, które są używane dla komórek kontrolnych, co jest oczywiste. Komórki CFSE dodatnie wykazują intensywność fluorescencji o rzędy wielkości wyższą niż komórki kontrolne. Gdy kulki glejaka osiągną średnią wielkość około 150 do 200 mikronów średnicy.

Kule są przepuszczane i przygotowywana jest zawiesina pojedynczej komórki zarówno z grup załadowanych, jak i nieobciążonych CFSE, jak opisano wcześniej. Następnie komórki są ponownie zawieszane w odpowiedniej objętości sterylnego jednorazowego PBS i przeprowadza się zliczanie komórek w celu wykluczenia martwych lub uszkodzonych komórek. Podczas sortowania za pomocą cytometrii przepływowej dodaje się jodek propidyny w stężeniu jednego mikrolitra na ml zawiesiny komórkowej w celu zebrania komórek wolno dzielących się i szybko dzielących się.

Podczas sortowania przygotowuje się dwie sterylne probówki do hodowli tkankowych o wielkości 15 mil, z których każda zawiera jeden milion kompletnej pożywki z komórek macierzystych układu nerwowego. Następnie komórki umieszcza się na lodzie podczas transferu do urządzenia do cytometrii przepływowej. Najpierw zawiesinę komórek z nieobciążonej grupy komórek przepuszcza się przez cytometr przepływowy.

Zdarzenia są wykreślane na podstawie rozproszenia do przodu w porównaniu z rozproszeniem bocznym, aby wykluczyć martwe lub uszkodzone komórki. Komórki są wykreślane na podstawie rozrzutu bocznego w stosunku do reaktywności PI, a pojedyncza żywa populacja komórek jest bramkowana jako populacja pierwsza. Następnie jednorodna populacja komórek z populacji pierwszej jest wybierana na podstawie właściwości rozproszonych do przodu i bocznych i bramkowana jako populacja Druga A populacja druga jest następnie wykreślana na histogramie na podstawie częstości komórek w funkcji intensywności CFSE ustawionej na skali logarytmicznej przy użyciu tych samych parametrów i strategii bramkowania.

Komórki znakowane CFSE są przepuszczane przez cytometr przepływowy i analizowane. Następnie dolne 85% komórek jest bramkowanych jako szybko dzielące się, a górne 5% jest bramkowanych jako wolno dzielące się komórki. Te różne populacje komórek będące przedmiotem zainteresowania są wybierane i sortowane do oddzielnych 15 mil sterylnych probówek do hodowli tkankowych zawierających jeden milion kompletnej pożywki dla komórek macierzystych układu nerwowego.

Szybkość progu sortowania powinna być dostosowana tak, aby nie przekraczała 2 500 zdarzeń na sekundę. Po zakończeniu sortowania komórki są odwirowywane, sup natin jest odrzucany, a osad jest ponownie zawieszany w odpowiedniej objętości pożywki i przeprowadza się zliczanie komórek. Następnie komórki z różnych posortowanych populacji są siane z gęstością 50 000 komórek na ml.

W kompletnym pożywce z komórek macierzystych układu nerwowego, uzupełnionej o 20 nanogramów na ml komórek EGF, inkubuje się następnie przez pięć do 10 dni, aby wyhodować kulki. To jest przykład komórek. Wkrótce po załadowaniu barwnikiem CFSE wszystkie komórki wykazują intensywną zieloną fluorescencję, co zostało uwidocznione pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Jest to obraz reprezentatywnej kuli glejaka pochodzącej z komórki obciążonej A-C-F-S-E sześć dni po posiewie. Zauważ, że niektóre komórki nadal mają bardzo jasne zabarwienie CFSE. Jest to przykład histogramu cytometrii przepływowej, który pokazuje, że intensywność CFSE zanika w czasie.

Kolor niebieski reprezentuje komórki świeżo załadowane CFSE wykazujące intensywność fluorescencji. Jest to o rzędy wielkości więcej niż niezaładowane komórki przedstawione na czerwono. Kolor zielony oznacza intensywność fluorescencji, która zanikła w ciągu sześciu dni po obciążeniu CFSE z powodu podziału komórek.

Są to reprezentatywne sfery, wyhodowane siedem dni po wyizolowaniu szybko i wolno dzielących się populacji. Częstotliwości tworzenia kul nie różnią się między tymi dwiema grupami, ale komórki zatrzymujące CFSC rosną wolniej i powodują mniejsze kule w porównaniu z komórkami rozcieńczającymi CFSC. Wykorzystanie CFSC do identyfikacji i izolacji subpopulacji komórek na podstawie szybkości podziału komórek jest punktem wyjścia do dalszego eksperymentu i dalszej charakterystyki.

Protokół ten posłużył jako przykład do identyfikacji wolno dzielących się komórek w hodowli pochodzącej z ludzkiego glejaka, ale może być również stosowany do innych typów komórek nowotworowych lub do systemów nienowotworowych. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że ten protokół okazał się pomocny w Twoich badaniach.