Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

Niniejszy protokół wideo demonstruje identyfikację i izolację wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym przy użyciu karboksyfluoresceiny diestry etylowego, CFSE. Komórki nowotworowe glejaka wielopostaciowego są najpierw hodowane z wykorzystaniem testu neurosferowego. Następnie otrzymane sfery są dysocjowane do pojedynczych komórek i barwione CFSE.

Komórki obciążone CFSE są ponownie wysiewane. W hodowli neurosfer powstałe sfery są dysocjowane do pojedynczych komórek i analizowane za pomocą cytometru przepływowego. Komórki dzielące się wolno i szybko są identyfikowane oraz sortowane na podstawie intensywności fluorescencji jako funkcji podziałów komórkowych.

Heterogeniczność częstotliwości jest kluczową cechą nowotworów. Heterogeniczność ta wspiera odporność guza i stanowi ogromną przeszkodę w opracowaniu w pełni skutecznych metod leczenia. Dlatego krytyczne jest opracowanie narzędzi i testów do badania i zrozumienia tej heterogeniczności, która jest definiowana genetycznie, fenotypowo i funkcjonalnie.

W niniejszym protokole wideo opisujemy metodę opartą na flues i I-C-F-S-C. Technika ta umożliwia identyfikację i separację za pomocą cytometrii przepływowej poszczególnych subpopulacji w obrębie hodowli komórek pochodzących z ludzkiego glejaka wielopostaciowego, które wykazują różne charakterystyki funkcjonalne. Wykorzystaliśmy tę technikę do izolacji i charakterystyki populacji komórek nowotworowych wykazujących powolną szybkość podziałów, co jest cechą funkcjonalną, którą wykazano, że wiąże się z inicjacją nowotworu w glejakach. Hodowla sfery nowotworowej jest tworzona i utrzymywana przy użyciu testu neurosfer, który opisano w osobnym filmie pod adresem wyświetlonym na ekranie.

Gdy sferoidy glejaków osiągną rozmiar od 150 do 200 µm średnicy, medium zawierające sferoidy należy usunąć i przelać do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości, a następnie wirować z prędkością 800 RPM lub 110 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odrzuca się nadsącz, a osad ze sferoidów resuspenduje w 1 ml uprzednio ogrzanej trypsyny z EDTA i inkubuje w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaje się równą objętość inhibitorów trypsyny, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół w celu dysocjacji sferoidów.

Zawiesinę komórek ponownie odwirowuje się w wirówce. Nadsącz zostaje usunięty, a komórki są resuspendowane w 1 ml pożywki bazowej dla neuronalnych komórek macierzystych. 10 µL zawiesiny pojedynczych komórek miesza się dokładnie z 90 µL barwnika Trypan Blue, a następnie wykonuje zliczenie komórek, aby przygotować barwienie dla każdego 1 miliona komórek.

1 ml odczynnika barwiącego przygotowuje się poprzez dodanie 1 µL barwnika CFSE o stężeniu 5 mM do 1 ml pożywki podstawowej dla neuroblastycznych komórek macierzystych, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika wynoszące 5 µM. Następnie roztwór barwiący należy odpowiednio wymieszać. Pożączaną liczbę komórek przenosi się do osobnej probówki, odwirowuje, a następnie usuwa nadsącz.

Następnie do osadu dodaje się roztwór barwiący CFSE, delikatnie miesza aż do uzyskania homogeniczności i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zatrzymać proces barwienia. Do komórek obciążonych CFSE dodaje się od pięciu do 10 objętości lodowatego podstawowego medium dla neuronowych komórek macierzystych i dokładnie miesza. Zawiesinę komórkową wiruje się, a następnie odrzuca nadsącz.

Na tym etapie na dnie probówki powinna pojawić się warstwa komórek o zielonym zabarwieniu, co wskazuje na pomyślne przeprowadzenie barwienia. Aby usunąć nadmiar barwnika CFSE, należy przeprowadzić od dwóch do trzech etapów przemywania poprzez resuspensję osadu w 1 ml podstawowego pożywki dla neuronowych komórek macierzystych, wirowanie i odlanie nadsączu.

Po trzecim przemyciu komórki resuspensuje się w 1 ml podstawowej pożywki dla neuroblastów, a następnie wykonuje zliczenie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem w celu ich wysiania. Pełna pożywka dla neuroblastów jest suplementowana EGF do stężenia końcowego 20 ng/ml. Następnie komórki z grup obciążonych i nieobciążonych CFSE dodaje się do odpowiednich probówek, aby uzyskać stężenie końcowe 50 000 komórek/ml.

Następnie zawiesiny komórkowe są dokładnie mieszane i wysiewane do sterylnych kolb do hodowli tkanek. Kolby są następnie etykietowane. Komórki można monitorować pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu weryfikacji barwienia CFSE, a następnie umieścić je w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na okres od pięciu do 10 dni.

Aby zweryfikować barwienie CFSE za pomocą cytometrii przepływowej, 500 000 komórek z grup kontrolnych ujemnych (obciążonych i nieobciążonych CFSE) przenosi się do oddzielnych probówek do cytometrii. Cytometr przepływowy konfiguruje się zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi urządzenia w odniesieniu do odpowiednich parametrów. Najpierw analizuje się komórki z grupy kontrolnej nieobciążonej i rejestruje zdarzenia na podstawie właściwości rozproszenia światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter), a następnie na wykresie histogramu częstotliwości komórek w funkcji intensywności CFSE wyznacza się bramkę dla głównej populacji komórek, aby zweryfikować poziom intensywności fluorescencji CFSE.

Następnie komórki obciążone CFSE analizuje się przy użyciu tych samych parametrów, które zastosowano dla komórek kontrolnych, co jest wyraźnie widoczne. Komórki pozytywne pod kątem CFSE wykazują intensywność fluorescencji o rzędy wielkości wyższą niż komórki kontrolne. Proces ten trwa, aż sferoidy glejaka osiągną średnią wielkość około 150 do 200 mikronów średnicy.

Sferoidy są pasażowane, a z grup obciążonych i nieobciążonych CFSE przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie komórki są resuspendowane w odpowiedniej objętości sterylnego 1× PBS i wykonuje się zliczanie komórek w celu wykluczenia komórek martwych lub uszkodzonych. Podczas sortowania metodą cytometrii przepływowej dodaje się jodek propidyny w stężeniu 1 µL na ml zawiesiny komórkowej, aby zebrać komórki dzielące się wolno i szybko.

Do sortowania przygotowuje się dwie sterylne probówki do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, do których wlewa się po 1 ml pełnej pożywki do neuroblastów. Następnie komórki umieszcza się w lodzie podczas transportu do pracowni cytometrii przepływowej. W pierwszej kolejności przez cytometr przepływowy analizuje się zawiesinę komórkową z grupy nieobciążonej.

Zdarzenia są przedstawione na wykresie rozproszenia przedniego w funkcji rozproszenia bocznego w celu wykluczenia martwych lub uszkodzonych komórek. Następnie komórki są przedstawione na wykresie rozproszenia bocznego w funkcji reaktywności z PI, a pojedyncza populacja żywych komórek jest wyznaczana jako populacja pierwsza. Z populacji pierwszej wybierana jest jednorodna populacja komórek na podstawie właściwości rozproszenia przedniego i bocznego, która jest wyznaczana jako populacja druga. Populacja druga jest następnie przedstawiona na histogramie częstości występowania komórek w funkcji intensywności CFSE w skali logarytmicznej, z zastosowaniem tych samych parametrów i strategii bramkowania.

Komórki znakowane CFSE poddaje się analizie w cytometrze przepływowym. Następnie dolne 85% komórek bramkuje się jako szybko dzielące się, a górne 5% jako komórki wolno dzielące się. Te wybrane populacje komórek są sortowane do oddzielnych, sterylnych probówek do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, zawierających 1 ml kompletnej pożywki do neuroblastów.

Próg szybkości sortowania należy dostosować tak, aby nie przekraczał 2, 500 zdarzeń na sekundę. Po zakończeniu sortowania komórki poddaje się wirowaniu, odrzuca nadsącz, a osad resuspenduje w odpowiedniej objętości medium i wykonuje pomiar liczby komórek. Następnie komórki z poszczególnych posortowanych populacji wysiewa się z gęstością 50, 000 komórek na ml.

W pełnej pożywce dla neuronalnych komórek macierzystych, uzupełnionej o 20 ng/mL EGF, komórki inkubuje się następnie od 5 do 10 dni w celu wyhodowania sfer. Jest to przykład komórek. Wkrótce po obciążeniu barwnikiem CFSE wszystkie komórki wykazują intensywną zieloną fluorescencję, co jest widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Na obrazku przedstawiono reprezentatywną sferę glejaka pochodzącą z komórek obciążonych A-C-F-S-E sześć dni po wysianiu. Należy zauważyć, że niektóre komórki nadal wykazują bardzo intensywne barwienie CFSE. Jest to przykład histogramu z cytometrii przepływowej, który pokazuje, że intensywność sygnału CFSE maleje w czasie.

Kolor niebieski reprezentuje komórki świeżo obciążone CFSE, wykazujące intensywność fluorescencji. Jest ona o rzędy wielkości wyższa niż w przypadku komórek nieobciążonych, reprezentowanych kolorem czerwonym. Kolor zielony reprezentuje intensywność fluorescencji, która spadła w ciągu sześciu dni po obciążeniu CFSE w wyniku podziałów komórkowych.

Są to reprezentatywne sferoidy wyhodowane siedem dni po wyizolowaniu populacji szybko i wolno dzielących się. Częstość tworzenia sferoidów nie różni się między obiema grupami, jednak komórki zachowujące CFSC rosną wolniej i tworzą mniejsze sferoidy w porównaniu do komórek rozcieńczających CFSC. Wykorzystanie CFSC do identyfikacji i izolacji subpopulacji komórek na podstawie tempa podziałów komórkowych stanowi punkt wyjścia do dalszych eksperymentów i szczegółowej charakterystyki.

Niniejszy protokół przedstawia przykład identyfikacji wolno dzielących się komórek w hodowli pochodzącej z glejaka u ludzi, jednak można go również zastosować do innych typów komórek nowotworowych lub do układów nienowotworowych. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że protokół ten okaże się pomocny w Państwa badaniach.