Name: Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku przy użyciu estru sukcynimidylu karboksylowego fluoresceiny (CFSE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji i izolacji wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku przy użyciu barwnika CFSE i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Florida Center for Brain Tumor Research, Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy oraz National Institutes of Health (1R21CA141020-01).

1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek glejaka wielopostaciowego
<ol>
 <li>Kulturę gliomasfery tworzy się i utrzymuje przy użyciu testu neurosfer (NSA), zgodnie z wcześniejszymi opisami2,11,12.</li>
 <li>W odpowiednim czasie do pasażowania gliomasfer, medium zawierające sfery usuwa się, przenosi do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej pojemności i wiruje przy 800 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Nadosad usuwa się, a pellet sfer resuspendsuje w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuje w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.</li>
 <li>Następnie stosuje się taką samą objętość inhibitora trypsyny sojowej, aby zatrzymać aktywność trypsyny.</li>
 <li>Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby zapewnić homogeniczność oraz całkowitą neutralizację aktywności trypsyny.</li>
 <li>Zawiesinę komórkową ponownie wiruje się przy 800 rpm przez 5 min. Nadosad usuwa się, a komórki resuspendsuje w 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium.</li>
 <li>W celu przeprowadzenia odliczania komórek, 10 μl zawiesiny pojedynczych komórek miesza się z 90 μl błękitu trypanu.</li>
</ol>
2. Barwienie zielonym barwnikiem fluorescencyjnym Cell Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
<ol>
 <li>Na każdy milion komórek przeznaczonych do barwienia przygotowuje się 1 ml odczynnika barwiącego, dodając 1 μl barwnika Cell Trace CFSE 5 mM (Molecular Probes, Invitrogen) do 1 ml pożywki NeuroCult NSC Basal Medium, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 5 μM.</li>
 <li>Odczynnik barwiący zawierający komórki miesza się dokładnie do uzyskania homogeniczności i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
 <li>Podczas inkubacji przygotowuje się lodowatą pożywkę NeuroCult NSC Basal Medium, która posłuży jako roztwór przerywający reakcję.</li>
 <li>Aby zatrzymać proces barwienia, do komórek obciążonych CFSE dodaje się około 5-10 objętości lodowatego roztworu przerywającego.</li>
 <li>Następnie roztwór wirowano z prędkością 800 rpm przez 5 min i odrzuca się nadsącz.</li>
 <li>Na tym etapie na dnie probówki powinien pojawić się osad komórek o jasnozielonej barwie, co wskazuje na pomyślne przeprowadzenie barwienia.</li>
 <li>Komórki przemywa się, resuspendując osad w 1-2 ml świeżej pożywki NeuroCult NSC Basal Medium, wirowując z prędkością 800 rpm przez 5 min i odrzucając nadsącz. Procedurę tę powtarza się łącznie trzy razy.</li>
 <li>Po trzecim przemyciu komórki resuspenduje się w 1 ml pożywki NeuroCult NSC Basal Medium i wykonuje zliczenie komórek.</li>
 <li>Komórki zabarwione CFSE wysiewa się następnie do sterylnych kolb hodowlanych z odpowiednią gęstością [50 000 komórek/ml] i umieszcza w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
3. Weryfikacja ładowania CFSE
<ol>
 <li>Komórki wysiane w kulturze NSA można monitorować pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zweryfikować barwienie CFSE. Na tym etapie wszystkie komórki wykazują intensywny zielony kolor (Rycina 1). Alternatywnie, kroplę zawiesiny komórek zabarwionych CFSE można umieścić na szkiełku mikroskopowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby zwizualizować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
 <li>Prawidłowe znakowanie CFSE potwierdza się następnie za pomocą cytometrii przepływowej. Do weryfikacji barwienia CFSE wystarczy od 1-5 x 105 komórek z każdej grupy. Komórki obciążone CFSE oraz komórki kontrolne negatywne, nieobciążone, resuspensuje się odpowiednio w 1 x -PBS lub NeuroCult NSC Basal Medium do całkowitej objętości 500 μl i umieszcza w osobnych probówkach do FACS.</li>
 <li>Cytometr przepływowy dostraja się zgodnie z instrukcją obsługi dla odpowiednich parametrów. CFSE posiada maksimum wzbudzenia przy długości fali 492 nm i maksimum emisji przy 517 nm.</li>
 <li>W pierwszej kolejności analizuje się nieobciążone komórki kontrolne, a zarejestrowane zdarzenia zapisuje się na wykresach rozpraszania światła w przód i w bok (FSC vs. SSC) oraz na histogramach, a następnie wyznacza bramkę dla głównej populacji komórek (Rycina 2A).</li>
 <li>Analogicznie analizuje się komórki obciążone CFSE, stosując te same parametry, które zastosowano dla komórek kontrolnych (Rycina 2B).</li>
</ol>
4. Izolacja populacji komórek wolno dzielących się [tj. zatrzymujących CFSE] przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanego laserem (FACS)
<ol>
 <li>Po podziale intensywność CFSE maleje, a komórki hGBM tworzą gliomasfery składające się z komórek wykazujących różny poziom intensywności fluorescencji zielonej (Rycina 3). Gdy gliomasfery osiągną średnią wielkość około 150-200 μm średnicy (około 5 do 10 dni po obciążeniu CFSE, w zależności od tempa wzrostu linii komórkowej), medium zawierające sfery jest usuwane, przenoszone do sterylnej probówki do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości i wirowane przy 800 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zawiesinę jednokomórkową przygotowuje się zgodnie z opisem w poprzednich krokach, a komórki resuspendsuje się w PBS w celu wykonania odliczania komórek, aby przygotować zawiesinę o gęstości do 107 komórek na mililitr.</li>
 <li>Po resuspensji komórek w odpowiedniej objętości PBS, dodaje się jodek propidyny (PI, Sigma, 500 μg/ml) w stężeniu 1 μl/ml zawiesiny komórkowej, aby wykluczyć martwe komórki podczas sortowania/analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
 <li>Do zebrania posortowanych komórek wolno dzielących się (komórek zatrzymujących CFSE) oraz komórek szybko dzielących się (komórek rozcieńczających CFSE) wykorzystuje się dwie sterylne probówki do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 1 ml kompletnego medium NeuroCult NSC.</li>
 <li>W pierwszej kolejności zawiesinę komórkową z grupy komórek nieobciążonych przepuszcza się przez cytometr przepływowy.</li>
 <li>Komórki (zdarzenia) są przedstawiane na wykresie rozrzutu w funkcji rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC), a parametry napięcia dla obu tych wartości są dostosowywane tak, aby większość komórek znalazła się w obrębie wykresu przepływu.</li>
 <li>W celu wykluczenia komórek martwych lub uszkodzonych, komórki są przedstawiane na wykresie SSC względem reaktywności na PI, a następnie bramkuje się pojedynczą populację żywych komórek (PI negatywnych).</li>
 <li>Następnie, na podstawie rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC), wybiera się jednorodną populację komórek.</li>
 <li>Jednorodna populacja pojedynczych żywych komórek jest następnie przedstawiana na histogramie częstotliwości komórek względem intensywności CFSE w skali logarytmicznej. Intensywność lasera CFSE jest dostosowywana tak, aby sygnał negatywny znajdował się w przedziale od 0 do 100.</li>
 <li>Przy użyciu tych samych parametrów i podobnej strategii bramkowania, komórki znakowane CFSE są przepuszczane przez cytometr przepływowy i analizowane (Rycina 4C).</li>
 <li>Następnie, na podstawie zdolności do zatrzymywania CFSE, identyfikuje się populację komórek wolno dzielących się oraz populację ogólną (komórki szybciej dzielące się) (odpowiednio CFSEhigh – górne 5% i CFSElow – dolne 85%).</li>
 <li>Te różne populacje komórek są następnie sortowane do osobnych sterylnych probówek do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml zawierających 1 ml kompletnego medium NSC.</li>
 <li>Posortowane komórki są następnie wirowane przy 800 rpm przez 5 min.</li>
 <li>Nadsącz jest usuwany, a osad resuspendsuje się w odpowiedniej objętości medium (w zależności od liczby wyizolowanych zdarzeń lub wielkości osadu) i wykonuje odliczanie komórek.</li>
 <li>Komórki z różnych posortowanych populacji są następnie wysiewane w gęstości 50 000 komórek na mililitr do odpowiedniej sterylnej kolby do hodowli tkankowej i umieszczane w inkubatorze z wilgotną atmosferą w temperaturze 37 °C / 5% CO2 na 5-10 dni przed pasażowaniem seryjnym lub wykorzystaniem w dalszych eksperymentach.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Po obciążeniu CFSE wszystkie komórki wykazują intensywną zieloną fluorescencję w obrazie mikroskopowym (Rysunek 1). Ten zielony odcień jest widoczny nawet gołym okiem (patrz wideo). Analiza tych komórek metodą cytometrii przepływowej również wykazuje bardzo intensywną zieloną fluorescencję w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rysunek 2). Po wysianiu komórek obciążonych CFSE w kulturze neurosfer, komórki te proliferują i w ciągu 5-10 dni tworzą gliomasfery o średnicy 150-200 μm. Wraz z proliferacją komórek, barwnik fluorescencyjny rozkłada się równomiernie między komórki potomne podczas podziałów, co prowadzi do zmniejszenia intensywności fluorescencji o połowę przy każdym podziale komórkowym. Glejaki są funkcjonalnie heterogenne i składają się z komórek proliferujących w różnym tempie. Metoda opisana w niniejszym protokole umożliwia identyfikację i izolację komórek dzielących się szybko i wolno dzięki ich zdolności do odpowiednio rozcieńczania lub zatrzymywania CFSE (Rysunek 3, patrz również wideo).
Analiza cytometryczna przepływowa dysocjowanych gliomasfer wygenerowanych z komórek obciążonych CFSE w porównaniu z komórkami nieobciążonymi wykazuje zróżnicowane właściwości retencji CFSE (Rysunek 4). Komórki szybko dzielące się (dolne 85%) lub komórki wolno dzielące się (górne 5% - CFSEhigh) wykazują zdolność do tworzenia gliomasfer podczas hodowli w warunkach testu neurosferowego (Rysunek 5).
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej CFSE; test proliferacji komórek; zielona fluorescencja; barwienie komórkowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rozdzielone komórki nowotworowe bezpośrednio po obciążeniu barwnikiem CFSE. Komórki wykazują jasny zielony kolor, co świadczy o pomyślnym znakowaniu. Powiększenie oryginalne; 10 x.
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej; analiza komórek; dane CFSE; porównanie wykresów; różnicowanie populacji komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Potwierdzenie obciążenia CFSE przy użyciu cytometrii przepływowej. A) komórki nieobciążone, B) komórki obciążone CFSE oraz C) porównanie intensywności fluorescencji CFSE w komórkach obciążonych i nieobciążonych. Należy zauważyć, że różnica w intensywności fluorescencji między komórkami znakowanymi a nieznakowanymi wynosi kilka rzędów wielkości.
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Proces podziału komórek, komórki barwione CFSE, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywna gliomasfera pochodząca z komórki obciążonej CFSE 6 dni po wysianiu. Niektóre komórki wykazują bardzo intensywne barwienie CFSE. Powiększenie oryginalne: 63 x.
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej; wykresy przedstawiają rozproszenie komórek, fluorescencję CFSE, kinetykę proliferacji komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywne wykresy/histogramy z cytometrii przepływowej dla izolacji komórek dzielących się szybko i wolno 6 dni po barwieniu CFSE. A) FSC vs. SSC w celu przedstawienia całej populacji komórek, B) SSC vs. reaktywność PI w celu wykluczenia komórek martwych lub uszkodzonych, C) FSC vs. SSC w celu wyznaczenia bramki dla jednorodnej populacji żywych komórek, D) Wykazuje obecność komórek zatrzymujących CFSE 6 dni po znakowaniu CFSE, co potwierdzono większą intensywnością fluorescencji w porównaniu z kontrolą negatywną. Histogram pokazuje również, że intensywność CFSE malała w czasie. E) Histogram przedstawiający strategię bramkowania w celu identyfikacji komórek zatrzymujących CFSE (górne 5%) i komórek z rozcieńczonym CFSE (dolne 85%).
<img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Analiza podziału komórek; obraz mikroskopowy sfer pochodzących z komórek; wykres słupkowy porównuje prędkość podziału." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywne gliomasfery wygenerowane z A) szybko dzielących się komórek (CFSElow) oraz B) wolno dzielących się komórek (CFSEhigh). Powiększenie oryginalne: odpowiednio 10x i 20x. C) Reprezentatyczna liczba komórek uzyskana z hodowli pochodzącej z szybko lub wolno dzielących się komórek w czasie pasażowania. P&lt;0.05, t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.

<ol><li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li>
<li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li>
<li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li>
<li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li>
<li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li>
<li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive%2C+quiescent%2C+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li>
<li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Coraz więcej badań wykazuje znaczenie wolno dzielącej się subpopulacji komórek w nowotworach, która przyczynia się do tworzenia guzów oraz oporności na leczenie2-8. Dlatego kluczowe jest opisanie i standaryzacja metod eksperymentalnych umożliwiających badanie tej specyficznej subpopulacji komórek lub, bardziej ogólnie, porównywanie subpopulacji o różnych tempach wzrostu. Wykorzystanie CFSE do identyfikacji i izolacji subfrakcji komórek na podstawie tempa ich podziałów stanowi punkt wyjścia do dalszej charakter...

<table><tbody><tr><td>Podłoże podstawowe NeuroCult NSC (ludzkie)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05750</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC (ludzkie)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05753</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z soi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T80</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (cfse)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Heterogeniczność nowotworu stanowi fundamentalną cechę wspierającą jego odporność i stanowi główną przeszkodę w opracowywaniu strategii terapeutycznych1. Aby rozwiązać problem heterogeniczności nowotworów, niezbędne jest opracowanie testów i narzędzi umożliwiających fenotypową, (epi)genetyczną i funkcjonalną identyfikację oraz charakterystykę subpopulacji nowotworowych, które napędzają specyficzne patologie choroby i stanowią istotne klinicznie cele. Obecnie wiadomo, że nowotwory wykazują wyraźne subfrakcje komórek o różnej częstotliwości podziałów, a funkcjonalne kryterium powolnego cyklu komórkowego jest dodatnio skorelowane ze zdolnością do tworzenia nowotworów w kilku typach raka, w tym w nowotworach mózgu, piersi, skóry i trzustki, a także w białaczkach2-8. Fluorescencyjny barwnik ester karboksyfluoresceiny suksynimidylowy (CFSE) jest wykorzystywany do śledzenia częstotliwości podziałów komórek in vitro oraz in vivo w nowotworach krwi oraz nowotworach litych, takich jak glejak wielopostaciowy2,7,8. Przenikający przez błony komórkowe, niefluorescencyjny prolek CFSE jest przekształcany przez wewnątrzkomórkowe esterazy w związek fluorescencyjny, który pozostaje w komórkach, wiążąc się kowalencyjnie z białkami poprzez reakcję grupy suksynimidylowej z wewnątrzkomórkowymi grupami aminowymi, tworząc trwałe wiązania amidowe9. Barwnik fluorescencyjny jest równomiernie rozdzielany między komórki potomne podczas podziałów, co prowadzi do zmniejszenia intensywności fluorescencji o połowę przy każdym podziale komórki. Umożliwia to śledzenie częstotliwości cyklu komórkowego do ośmiu-dziesięciu rund podziałów10. Zdolność do retencji CFSE została wykorzystana w komórkach nowotworu mózgu do identyfikacji i izolacji powoli dzielącej się subpopulacji (górne 5% komórek zatrzymujących barwnik), w której wykazano wzbogacenie w aktywność komórek macierzystych nowotworu2.
Niniejszy protokół opisuje technikę barwienia komórek barwnikiem CFSE oraz izolację poszczególnych populacji o różnym tempie podziałów w hodowli komórek pochodzących z glejaka wielopostaciowego (GBM) u ludzi z wykorzystaniem cytometrii przepływowej2. Technika ta posłużyła do identyfikacji i izolacji wolno dzielącej się populacji komórek guza mózgu dzięki ich zdolności do utrzymywania znakowania CFSE.

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie barwnika fluorescencyjnego estru succinimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) do identyfikacji i separacji różnych subpopulacji komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym na podstawie częstotliwości podziałów komórkowych.

Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

Heterogeniczność nowotworu stanowi fundamentalną cechę sprzyjającą odporności guza i jest główną przeszkodą w opracowywaniu terapii...

Niniejszy protokół wideo demonstruje identyfikację i izolację wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym przy użyciu karboksyfluoresceiny diestry etylowego, CFSE. Komórki nowotworowe glejaka wielopostaciowego są najpierw hodowane z wykorzystaniem testu neurosferowego. Następnie otrzymane sfery są dysocjowane do pojedynczych komórek i barwione CFSE.Komórki obciążone CFSE są ponownie wysiewane. W hodowli neurosfer powstałe sfery są dysocjowane do pojedynczych komórek i analizowane za pomocą cytometru przepływowego. Komórki dzielące się wolno i szybko są identyfikowane oraz sortowane na podstawie intensywności fluorescencji jako funkcji podziałów komórkowych.Heterogeniczność częstotliwości jest kluczową cechą nowotworów. Heterogeniczność ta wspiera odporność guza i stanowi ogromną przeszkodę w opracowaniu w pełni skutecznych metod leczenia. Dlatego krytyczne jest opracowanie narzędzi i testów do badania i zrozumienia tej heterogeniczności, która jest definiowana genetycznie, fenotypowo i funkcjonalnie.W niniejszym protokole wideo opisujemy metodę opartą na flues i I-C-F-S-C. Technika ta umożliwia identyfikację i separację za pomocą cytometrii przepływowej poszczególnych subpopulacji w obrębie hodowli komórek pochodzących z ludzkiego glejaka wielopostaciowego, które wykazują różne charakterystyki funkcjonalne. Wykorzystaliśmy tę technikę do izolacji i charakterystyki populacji komórek nowotworowych wykazujących powolną szybkość podziałów, co jest cechą funkcjonalną, którą wykazano, że wiąże się z inicjacją nowotworu w glejakach. Hodowla sfery nowotworowej jest tworzona i utrzymywana przy użyciu testu neurosfer, który opisano w osobnym filmie pod adresem wyświetlonym na ekranie.Gdy sferoidy glejaków osiągną rozmiar od 150 do 200 µm średnicy, medium zawierające sferoidy należy usunąć i przelać do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości, a następnie wirować z prędkością 800 RPM lub 110 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odrzuca się nadsącz, a osad ze sferoidów resuspenduje w 1 ml uprzednio ogrzanej trypsyny z EDTA i inkubuje w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaje się równą objętość inhibitorów trypsyny, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół w celu dysocjacji sferoidów. Zawiesinę komórek ponownie odwirowuje się w wirówce. Nadsącz zostaje usunięty, a komórki są resuspendowane w 1 ml pożywki bazowej dla neuronalnych komórek macierzystych. 10 µL zawiesiny pojedynczych komórek miesza się dokładnie z 90 µL barwnika Trypan Blue, a następnie wykonuje zliczenie komórek, aby przygotować barwienie dla każdego 1 miliona komórek.1 ml odczynnika barwiącego przygotowuje się poprzez dodanie 1 µL barwnika CFSE o stężeniu 5 mM do 1 ml pożywki podstawowej dla neuroblastycznych komórek macierzystych, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika wynoszące 5 µM. Następnie roztwór barwiący należy odpowiednio wymieszać. Pożączaną liczbę komórek przenosi się do osobnej probówki, odwirowuje, a następnie usuwa nadsącz.Następnie do osadu dodaje się roztwór barwiący CFSE, delikatnie miesza aż do uzyskania homogeniczności i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zatrzymać proces barwienia. Do komórek obciążonych CFSE dodaje się od pięciu do 10 objętości lodowatego podstawowego medium dla neuronowych komórek macierzystych i dokładnie miesza. Zawiesinę komórkową wiruje się, a następnie odrzuca nadsącz.Na tym etapie na dnie probówki powinna pojawić się warstwa komórek o zielonym zabarwieniu, co wskazuje na pomyślne przeprowadzenie barwienia. Aby usunąć nadmiar barwnika CFSE, należy przeprowadzić od dwóch do trzech etapów przemywania poprzez resuspensję osadu w 1 ml podstawowego pożywki dla neuronowych komórek macierzystych, wirowanie i odlanie nadsączu.Po trzecim przemyciu komórki resuspensuje się w 1 ml podstawowej pożywki dla neuroblastów, a następnie wykonuje zliczenie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem w celu ich wysiania. Pełna pożywka dla neuroblastów jest suplementowana EGF do stężenia końcowego 20 ng/ml. Następnie komórki z grup obciążonych i nieobciążonych CFSE dodaje się do odpowiednich probówek, aby uzyskać stężenie końcowe 50 000 komórek/ml.Następnie zawiesiny komórkowe są dokładnie mieszane i wysiewane do sterylnych kolb do hodowli tkanek. Kolby są następnie etykietowane. Komórki można monitorować pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu weryfikacji barwienia CFSE, a następnie umieścić je w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na okres od pięciu do 10 dni.Aby zweryfikować barwienie CFSE za pomocą cytometrii przepływowej, 500 000 komórek z grup kontrolnych ujemnych (obciążonych i nieobciążonych CFSE) przenosi się do oddzielnych probówek do cytometrii. Cytometr przepływowy konfiguruje się zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi urządzenia w odniesieniu do odpowiednich parametrów. Najpierw analizuje się komórki z grupy kontrolnej nieobciążonej i rejestruje zdarzenia na podstawie właściwości rozproszenia światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter), a następnie na wykresie histogramu częstotliwości komórek w funkcji intensywności CFSE wyznacza się bramkę dla głównej populacji komórek, aby zweryfikować poziom intensywności fluorescencji CFSE.Następnie komórki obciążone CFSE analizuje się przy użyciu tych samych parametrów, które zastosowano dla komórek kontrolnych, co jest wyraźnie widoczne. Komórki pozytywne pod kątem CFSE wykazują intensywność fluorescencji o rzędy wielkości wyższą niż komórki kontrolne. Proces ten trwa, aż sferoidy glejaka osiągną średnią wielkość około 150 do 200 mikronów średnicy.Sferoidy są pasażowane, a z grup obciążonych i nieobciążonych CFSE przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie komórki są resuspendowane w odpowiedniej objętości sterylnego 1× PBS i wykonuje się zliczanie komórek w celu wykluczenia komórek martwych lub uszkodzonych. Podczas sortowania metodą cytometrii przepływowej dodaje się jodek propidyny w stężeniu 1 µL na ml zawiesiny komórkowej, aby zebrać komórki dzielące się wolno i szybko.Do sortowania przygotowuje się dwie sterylne probówki do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, do których wlewa się po 1 ml pełnej pożywki do neuroblastów. Następnie komórki umieszcza się w lodzie podczas transportu do pracowni cytometrii przepływowej. W pierwszej kolejności przez cytometr przepływowy analizuje się zawiesinę komórkową z grupy nieobciążonej.Zdarzenia są przedstawione na wykresie rozproszenia przedniego w funkcji rozproszenia bocznego w celu wykluczenia martwych lub uszkodzonych komórek. Następnie komórki są przedstawione na wykresie rozproszenia bocznego w funkcji reaktywności z PI, a pojedyncza populacja żywych komórek jest wyznaczana jako populacja pierwsza. Z populacji pierwszej wybierana jest jednorodna populacja komórek na podstawie właściwości rozproszenia przedniego i bocznego, która jest wyznaczana jako populacja druga. Populacja druga jest następnie przedstawiona na histogramie częstości występowania komórek w funkcji intensywności CFSE w skali logarytmicznej, z zastosowaniem tych samych parametrów i strategii bramkowania.Komórki znakowane CFSE poddaje się analizie w cytometrze przepływowym. Następnie dolne 85% komórek bramkuje się jako szybko dzielące się, a górne 5% jako komórki wolno dzielące się. Te wybrane populacje komórek są sortowane do oddzielnych, sterylnych probówek do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, zawierających 1 ml kompletnej pożywki do neuroblastów.Próg szybkości sortowania należy dostosować tak, aby nie przekraczał 2, 500 zdarzeń na sekundę. Po zakończeniu sortowania komórki poddaje się wirowaniu, odrzuca nadsącz, a osad resuspenduje w odpowiedniej objętości medium i wykonuje pomiar liczby komórek. Następnie komórki z poszczególnych posortowanych populacji wysiewa się z gęstością 50, 000 komórek na ml.W pełnej pożywce dla neuronalnych komórek macierzystych, uzupełnionej o 20 ng/mL EGF, komórki inkubuje się następnie od 5 do 10 dni w celu wyhodowania sfer. Jest to przykład komórek. Wkrótce po obciążeniu barwnikiem CFSE wszystkie komórki wykazują intensywną zieloną fluorescencję, co jest widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym.Na obrazku przedstawiono reprezentatywną sferę glejaka pochodzącą z komórek obciążonych A-C-F-S-E sześć dni po wysianiu. Należy zauważyć, że niektóre komórki nadal wykazują bardzo intensywne barwienie CFSE. Jest to przykład histogramu z cytometrii przepływowej, który pokazuje, że intensywność sygnału CFSE maleje w czasie.Kolor niebieski reprezentuje komórki świeżo obciążone CFSE, wykazujące intensywność fluorescencji. Jest ona o rzędy wielkości wyższa niż w przypadku komórek nieobciążonych, reprezentowanych kolorem czerwonym. Kolor zielony reprezentuje intensywność fluorescencji, która spadła w ciągu sześciu dni po obciążeniu CFSE w wyniku podziałów komórkowych.Są to reprezentatywne sferoidy wyhodowane siedem dni po wyizolowaniu populacji szybko i wolno dzielących się. Częstość tworzenia sferoidów nie różni się między obiema grupami, jednak komórki zachowujące CFSC rosną wolniej i tworzą mniejsze sferoidy w porównaniu do komórek rozcieńczających CFSC. Wykorzystanie CFSC do identyfikacji i izolacji subpopulacji komórek na podstawie tempa podziałów komórkowych stanowi punkt wyjścia do dalszych eksperymentów i szczegółowej charakterystyki.Niniejszy protokół przedstawia przykład identyfikacji wolno dzielących się komórek w hodowli pochodzącej z glejaka u ludzi, jednak można go również zastosować do innych typów komórek nowotworowych lub do układów nienowotworowych. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że protokół ten okaże się pomocny w Państwa badaniach.

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Identyfikacja i izolacja komórek dzielących się powoli w ludzkim gliobie niskiego stopnia za pomocą karboksyfluoresceiny succinimidyl ester (CFSE)

CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo posiada połowę ilości fluorescencji, co może być wykorzystane do oceny podziałów komórkowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich przy użyciu CFSE.

Zastosowanie estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów

W tym filmie opisujemy protokół dla genetycznie modyfikowanych komórek glejaka do ekspresji białka fluorescencyjnego w podczerwieni lub iRFP. Te znakowane fluorescencyjnie komórki glejaka są przydatne w obrazowaniu tkanek głębokich w celu zrozumienia rozwoju guzów mózgu.

Znakowanie fluorescencyjne komórek glejaka: metoda transfekcji oparta na wektorze lentiwirusowym w celu uzyskania komórek glejaka wyrażających białko fluorescencyjne do obrazowania tkanek głębokich

Źródło: Parker, J. J., et al. Organtypowy model hodowli plastrów glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia obrazowanie wycinków tkanki glejaka wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w stałych odstępach czasu w celu śledzenia ruchu i kierunku komórek nowotworowych.

Obrazowanie migracji komórek nowotworowych w tkance glejaka za pomocą poklatkowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj metodę identyfikacji i izolacji wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku przy użyciu barwnika CFSE i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności nowotworowej.

Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku przy użyciu estru sukcynimidylu karboksylowego fluoresceiny (CFSE) (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

Przeglądaj więcej filmów