Name: Wykorzystanie nieutrwalonych, zamrożonych tkanek do badania naturalnej dystrybucji mucyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę zachowania naturalnej dystrybucji glikozylacji w nieutrwalonych, zamrożonych tkankach z użyciem medium OCT. Technika umożliwia dokładną analizę struktur glikanów i mucyn bez specjalistycznych utrwalaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Nicole M. Nemeth (University of Georgia) oraz Jeanne M. Fair (LANL) za pomoc w pobieraniu tkanek kurczaka, a Stevenowi A. Springerowi za pomoc podczas filmowania. Opieka nad wszystkimi ptakami w niniejszym badaniu była zgodna z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt laboratoryjnych, a wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committees w Los Alamos National Security, LLC, operatorze Los Alamos National Laboratory na mocy kontraktu nr DE-AC52-06NA25396 z Departamentem Energii USA. Opieka nad myszami w niniejszym badaniu jest zgodna z zatwierdzonym protokołem ds. zwierząt UCSD. Tkanki ludzkie pozyskano w ramach zatwierdzonego przez UCSD protokołu IRB. Praca ta była finansowana z grantu 118645 z University of California Lab Fee President Program (P.G.) oraz grantu NS047101 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Neuroscience Microscopy Shared Facility, UC San Diego).

<ol><li>Slayter, H. S., Wold, J. K., Midtvedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucin+of+germ-free+rats.+Biochemical+and+electron-microscopic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucin of germ-free rats. Biochemical and electron-microscopic characterization.</a> Carbohydr. Res. 222, 1-9 (1991).</li>
<li>Lamblin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate+diversity+of+human+respiratory+mucins%3A+a+protection+of+the+underlying+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate diversity of human respiratory mucins: a protection of the underlying mucosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 144, S19-S24 (1991).</li>
<li>Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+gastrointestinal+tract+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease.</a> Front. Biosci. 6, D1321-D1357 (2001).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+front+line+of+enteric+host+defense+against+unwelcome+intrusion+of+harmful+microorganisms%3A+mucins%2C+antimicrobial+peptides%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota.</a> Clin. Microbiol. Rev. 19, 315-337 (2006).</li>
<li>Kim, Y. S., Ho, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+goblet+cells+and+mucins+in+health+and+disease%3A+recent+insights+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 12, 319-330 (2010).</li>
<li>Nochi, T., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+mucosal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the mucosal immune system.</a> Curr. Pharm. Des. 12, 4203-4213 (2006).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol. Rev. 24, 210-229 (2011).</li>
<li>McGuckin, M. A., Linden, S. K., Sutton, P., Florin, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin+dynamics+and+enteric+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mucin dynamics and enteric pathogens.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 265-278 (2011).</li>
<li>Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+clearance+as+a+primary+innate+defense+mechanism+for+mammalian+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mucus clearance as a primary innate defense mechanism for mammalian airways.</a> J. Clin. Invest. 109, 571-577 (2002).</li>
<li>Johansson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+of+the+two+Muc2+mucin-dependent+mucus+layers+in+colon+is+devoid+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15064-15069 (2008).</li>
<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Microscopy%2C+Immunohistochemistry%2C+and+Antigen+Retrieval+Methods%3A+For+Light+and+Electron+Microscopy%22">Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy</a>. Hayat, M. A. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, NY. 53-70 (2002).</li>
<li>Cohen, M., Hurtado-Ziola, N., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABO+blood+group+glycans+modulate+sialic+acid+recognition+on+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes.</a> Blood. 114, 3668-3676 (2009).</li>
<li>Cohen, M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sialome--far+more+than+the+sum+of+its+parts%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">The sialome--far more than the sum of its parts.</a> OMICS. 14, 455-464 (2010).</li>
<li>Ota, H., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+laminated+array+of+two+types+of+mucin+in+the+human+gastric+surface+mucous+later%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+J%22%5BJournal%5D)">Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later.</a> Histochemical J. 24, 86-92 (1992).</li>
<li>Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+of+the+surface+mucous+gel+layer+of+the+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon.</a> Gut. 40, 782-789 (1997).</li>
<li>Boyde, A., Maconnachie, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+lithium+salts+reduces+ethanol+dehydration+shrinkage+of+glutaraldehyde+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue.</a> Histochemistry. 66, 181-187 (1980).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Zachowanie śluzu i epitopów glikanowych w tkankach mrożonych jest lepsze niż w tkankach zatopionych w parafinie. Wykazaliśmy zachowanie wydzielonej warstwy śluzu (Ryciny 1 i 3) oraz rozkład trzech struktur glikanowych (Rycina 3) w tkankach mrożonych w porównaniu z tkankami zatopionymi w parafinie. Do optymalnego utrwalenia warstwy śluzu w próbkach tkankowych opracowano specjalistyczne utrwalacze, takie jak roztwór Carnoya (60% etanolu, 30% chloroformu, 10% kwasu octowego)17. Optymalnie roztwór ten należy stosować do pobierania próbek tkanek przeznaczonych do badań nad śluzem; wykazano, że pozwala on zachować gładką strukturę warstwy śluzu16-17. Warstwa śluzu w nieutrwalonych próbkach mrożonych zatopionych w OCT wydaje się nierównomierna i w niektórych obszarach może oddzielać się od tkanki, jednak całkowita grubość warstwy jest zgodna z obserwowaną w tkankach utrwalonych roztworem Carnoya i zatopionych w parafinie16-17. Na przykład warstwa śluzu w mrożonym przekroju tkanki jelita grubego człowieka wynosi ~100 μm (Rycina 1), co mieści się w zakresie zgłaszanym dla próbek jelita grubego człowieka utrwalonych metodą Carnoya: 55,4±2,5 μm (zakres 7,7 - 204,8 μm) 16.
Od dziesięcioleci wiadomo, że odwodnienie etanolem powoduje ok. 30% skurcz próbek biologicznych18, a rozpuszczalniki organiczne, takie jak ksylen, Citrisolv i chloroform, ekstrahują z tkanek lipidy, glikolipidy, a w pewnym stopniu również białka13. Obróbka tkanek do zatopienia w parafinie obejmuje następujące etapy: utrwalanie (10% buforowana formalina), odwodnienie (rosnące stężenie etanolu) oraz klarowanie (Citrisolv lub ksylen). Naśladując te etapy na nieutrwalonych, zamrożonych skrawkach tkanek, wykazaliśmy, że Citrisolv ekstrahuje śluz z zamrożonych skrawków tkanek, co prowadzi do uzyskania morfologii tkanki podobnej do tej w tkankach zatopionych w parafinie (Rysunek 2, panel prawy). W przeciwieństwie do tego, warstwa śluzu nie uległa zmianie podczas inkubacji z formaliną lub etanolem (Rysunek 2, panele lewy i środkowy). Sugeruje to, że etap klarowania w standardowej procedurze zatapiania w parafinie, wymagający przedłużonej inkubacji w Citrisolv/ksylenie, prowadzi do zapadnięcia się warstwy śluzu. Utrwalanie formaliną nie uszkadza warstwy śluzu, a zamrożone skrawki tkanek utrwalone formaliną mogą być łatwo barwione lektynami oraz przeciwciałami przeciwko glikanom, glikolipidom i białkom (Rysunki 2, 3 i 6). Efekty te mogą być pomijalne w badaniach białek błonowych i patologii tkanek, lecz są niszczycielskie dla struktur silnie uwodnionych, takich jak wydzielana warstwa śluzu. Niemniej jednak badania histologiczne mucyn są nadal prowadzone głównie na próbkach zatopionych w parafinie, w których zachowanie warstwy śluzu jest nieoptymalne. Pogłębione analizy składu warstwy śluzu, takie jak precyzyjna identyfikacja kombinacji glikoprotein MUC wydzielanych lub związanych z błoną, wymagają specyficznych przeciwciał oraz spektrometrii mas w celu identyfikacji szkieletów białkowych. Zachowanie warstwy śluzu jest jedynie wstępnym wymogiem dla takich badań.
Wiele laboratoriów posiada próbki tkanek zamrożone w OCT, które zostały pobrane w przeszłości na potrzeby różnych projektów; tkanki te mogą być bez problemu wykorzystane do badania mucyn, glikolipidów i rozmieszczenia glikanów, co eliminuje konieczność pobierania tkanek do specjalnych utrwalaczy zaprojektowanych wyłącznie w celu zachowania śluzu. Zamrożone tkanki poddawane są minimalnej obróbce, dzięki czemu zachowany zostaje naturalny rozkład glikanów, które z natury są hydratowane. Jest to szczególnie istotne w obszarze interakcji między mikroorganizmami a gospodarzem. Wiedza o naturalistycznym rozkładzie i obfitości wydzielanych mucyn oraz o wielu strukturach glikanowych zdobiących te cząsteczki „bariery” będzie kluczowa dla zrozumienia obrony gospodarza, eksploatacji mikrobowej oraz patogenezy.

<table><tbody><tr><td>2-metylbutan</td><td>Fisher Scientific</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>zestaw substratu peroksydazy AEC</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>Błękit Alciana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CA 19-9</td><td>Calbiochem</td><td>CA1003</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-MUC5AC</td><td>Millipore</td><td>MAB2011</td><td></td></tr><tr><td>zestaw blokujący awidyna-biotyna</td><td>Vector Labs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowane przeciwciało osiołkowe anty-mysie</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>90863</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowana SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>hydrolizat chityny</td><td>Vector Labs</td><td>SP-0090</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom kriostatyczny</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica CM 1800</td><td></td></tr><tr><td>hematoksylina</td><td>Surgipath Medical Ind.</td><td>3801570</td><td></td></tr><tr><td>nadtlenek wodoru 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td></td></tr><tr><td>Jacalin-FITC</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1151</td><td></td></tr><tr><td>hematoksylina Mayera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>melibioza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5500</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red</td><td>Vector Labs</td><td>H-3403</td><td></td></tr><tr><td>związek OCT</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>streptawidyna koniugowana z peroksydazą</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>94638</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik Schiffa</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>26052</td><td></td></tr><tr><td>sWGA-Rodamina</td><td>Vector Labs</td><td>RL1022S</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne TKH2</td><td>ATCC</td><td>HB-9654</td><td></td></tr><tr><td>wodny nośnik do zamykania preparatów VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>formy Peel-A Way</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18646A-1</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie niefiksowanych, zamrożonych tkanek do badania naturalnego rozkładu mucyn

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Mucyny to złożone i silnie glikozylathed O-glikoproteiny, które zawierają ponad 70% węglowodanów w przeliczeniu na masę1-3. Mucyny wydzielnicze, produkowane przez komórki kubkowe i błonę śluzową żołądka, stanowią rusztowanie dla warstwy śluzu o grubości wielu mikrometrów, która wyścieła nabłonki jelit i dróg oddechowych3,4. Oprócz mucyn, warstwy śluzu zawierają również peptydy przeciwdrobnoustrojowe, cytokiny i immunoglobuliny5-9. Warstwa śluzu jest istotnym elementem wrodzonej odporności gospodarza i stanowi pierwszą linię obrony przed naciekającymi mikroorganizmami8,10-12. W związku z tym śluz podlega licznym oddziaływaniom z mikroorganizmami, zarówno patogenami, jak i symbiontami, a wydzielane mucyny tworzą ważny interfejs dla tych interakcji. Badanie takich oddziaływań biologicznych zazwyczaj wiąże się z zastosowaniem metod histologicznych do pobierania i barwienia tkanek. Dwie najczęściej stosowane w klinice i laboratoriach badawczych metody pobierania i utrwalania tkanek to: fiksacja w formalinie z następującym po niej zatapianiem w parafinie oraz zamrażanie tkanek z następującym po nim zatapianiem w mediach krioprotekcyjnych.
Próbki tkanek zatopione w parafinie pozwalają na uzyskanie skrawków o optymalnych właściwościach do wizualizacji histologicznej, w tym wysokiej przejrzystości i dobrze zdefiniowanej morfologii. Jednak w procesie zatapiania w parafinie szereg epitopów ulega modyfikacji, a w celu ich zbadania skrawki tkanek muszą zostać poddane dalszej obróbce przy użyciu jednej z wielu metod odzyskiwania epitopów13. Wydzielane mucyny i lipidy są usuwane z tkanki podczas etapu klarowania w procesie zatapiania w parafinie, co wymaga długotrwałej inkubacji w rozpuszczalnikach organicznych (ksylenie lub Citrisolv). W związku z tym podejście to jest nieoptymalne dla badań koncentrujących się na naturze i rozmieszczeniu mucyn oraz śluzu in vivo.
Z drugiej strony mrożenie tkanek w medium zatapiającym Optimal Cutting Temperature (OCT) pozwala uniknąć odwodnienia i przejrzyszczania próbki, zapewniając utrzymanie jej nawodnienia. Umożliwia to lepszą konserwację nawodnionej warstwy śluzu, a tym samym pozwala na badanie licznych funkcji mucyn w biologii nabłonka. Ponieważ metoda ta wymaga minimalnego opracowania tkanki, zostaje ona zachowana w stanie bardziej zbliżonym do naturalnego. W związku z tym mrożone przekroje tkanek nie wymagają żadnej dodatkowej obróbki przed barwieniem i mogą być łatwo analizowane przy użyciu metod immunohistochemicznych.
Prezentujemy metodę zachowania wydzielonej warstwy śluzu o grubości kilku mikrometrów w zamrożonych próbkach jelita grubego. Warstwa ta ulega drastycznemu zmniejszeniu, gdy te same tkanki zostaną zatopione w parafinie. Wykazujemy również barwienie immunofluorescencyjne epitopów glikanowych obecnych w mucynach z wykorzystaniem lektyn roślinnych. Zaletą tego podejścia jest brak konieczności stosowania specjalnych utrwalaczy oraz możliwość wykorzystania tkanek zamrożonych, które mogą być już przechowywane w laboratorium.

Niefiksowane mrożone próbki tkanek zatopione w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) mogą być wykorzystane do badania naturalnego rozkładu i glikozylacji wydzielonego śluzu. W tym podejściu przetwarzanie tkanek jest minimalne, co pozwala na zachowanie naturalnej postaci glikolipidów, mucyn i epitopów glikanowych. Przekroje tkankowe można analizować za pomocą immunohistochemii z wykorzystaniem detekcji fluorescencyjnej lub chromogennej.

Wykorzystanie niefiksowanych, zamrożonych tkanek do badania naturalnego rozkładu mucyn

Mucyny to złożone i silnie glikozylowane glikoproteiny typu O, w których węglowodany stanowią ponad 70% masy1-3. Mucyny wydzielnicze, produkowane przez...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zachowanie naturalnego rozkładu glikozylacji wydzielonego śluzu w próbkach tkanek. Osiąga się to poprzez wstępne zatopienie tkanek w optymalnym medium do cięcia w niskiej temperaturze (OCT), aby zminimalizować procesy przetwarzania tkanki, a następnie umożliwienie detekcji struktur glikanów, mucyn i śluzu. Przetoki są inkubowane z lektynami, przeciwciałami i barwnikami histochemicznymi.Wiązanie lektyn można dodatkowo zweryfikować poprzez inhibicję konkurencyjną lub enzymatyczne rozszczepienie epitopów glikanowych, aby potwierdzić swoistość wiązania lektyn. Ostatecznie, stopień zachowania śluzu i zamrożonych próbek tkanek można porównać z zachowaniem śluzu w próbkach zatopionych w parafinie za pomocą analizy chemicznej. Głównymi zaletami stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zatapianie tkanek w parafinie i utrwalanie roztworem Carnoya, są fakt, że metoda ta nie wymaga stosowania specjalistycznych utrwalaczy oraz umożliwia wykorzystanie zamrożonych tkanek, które mogą już znajdować się w laboratorium.Na początek należy pozwolić, aby tkanka zamrożona błyskawicznie ogrzała się do temperatury -20 °C, umieszczając ją w komorze kriomikrotomu. W tym czasie należy przygotować kąpiel mrożącą, wlewając metylobutan do płytkiego pudełka styropianowego, a następnie dodając do niego suchy lód. Następnie należy dodać taką ilość OCT, aby pokryła dno odrywanego modelu do mrożenia, a następnie umieścić tkankę w modelu.Upewnij się, że tkanka spoczywa na dnie formy w pożądanej orientacji. Przykryj tkankę dodatkowym OCT, a następnie umieść formę w kąpieli mrożącej. Związek OCT zmieni kolor na biały w miarę zamrażania tkanki. Po zamrożeniu zdejmij formę z zamrożonego bloku i umieść blok w opisanym woreczku do zamrażarki.Przechowywać zamrożone bloczki w temperaturze -80 °C do momentu ich sekcjonowania. Umieścić wybrane zamrożone bloczki w komorze kriomikrotomu na około 30 minut, aby osiągnęły temperaturę -20 °C. Po odpowiednim schłodzeniu bloczków wykonać skrawki o grubości od 3 do 5 µm, a następnie położyć na skrawku naładowaną dodatnio szkiełko przedmiotowe.Tkanka przylgnie do szkiełka po suszeniu preparatów na powietrzu przez 30 do 60 minut. Utkwić preparaty w 10% buforowanej formalinie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć szkiełka trzykrotnie w buforze PBS, wykonując 10 szybkich zanurzeń w 250 mililitrach buforu. Przed barwieniem tkanek błękitem aluminiowym, opłukać szkiełka w wodzie, a następnie inkubować w 3% kwasie octowym przez trzy minuty.Następnie inkubuj tkanki w roztworze AUM blue. Po 30 minutach płucz preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut, a następnie wypłucz w wodzie DI. Przebarw jądra komórkowe za pomocą nuclear fast red przez pięć minut, a następnie trzykrotnie przemyj preparaty wodą DI. Teraz odwodnij i przejaśnij preparaty, inkubując je przez jedną minutę w 95% etanolu, następnie wykonaj trzy szybkie wymiany w 100% etanolu, a na koniec trzy wymiany w citrus resolve po dwie minuty każda.Na koniec nałóż na szkiełko przykrywkę, używając medium do montażu, takiego jak cyto seal 60, aby zabarwić tkanki za pomocą kwasu okresowego. Najpierw opłucz szkiełka w wodzie, a następnie inkubuj je w świeżo przygotowanym 1% kwasie okresowym przez pięć minut. Następnie przemyj szkiełka trzykrotnie w wodzie destylowanej.Zanurz preparaty raz w wodzie Milli Q, a następnie zabarw tkanki odczynnikiem Schiffa. Po 15 minutach płucz preparaty w bieżącej wodzie kranowej przez kolejne 10 minut, a następnie zanurz raz w wodzie destylowanej. Wykonaj przeciwbarwienie jąder hematoksyliną przez 30 sekund, a następnie trzy razy wypłucz preparaty w wodzie destylowanej.Na koniec inkubuj preparaty przez 30 s. Po zastosowaniu odczynnika do niebiesienia w wodzie wodociągowej Scot's, wypłucz preparaty trzy razy w wodzie DI, a następnie odwodnij tkanki w sposób przedstawiony wcześniej dla barwienia calcium blue. Przykryj preparaty szkiełkami podstawowymi w celu detekcji fluorescencyjnej epitopów glikanów przy użyciu lektyn.Najpierw zablokuj slajd za pomocą BSA w PBS przez 10 do 30 minut. Następnie zablokuj endogenną biotynę, inkubując slajd przez 15 minut z avadonem, po czym przemyj go w PBS, a następnie inkubuj przez 15 minut z 0,01% biotyną po kolejnym płukaniu w PBS. Umieść slajd w kasecie do barwienia, nanieś świeżo przygotowaną mieszaninę wybranych lektyn na każdy przekrój tkanki, a następnie delikatnie przykryj mieszaninę lektyn parfumem.Następnie inkubuj preparat w ciemności przez jedną godzinę. Delikatnie usuń perfum i przemyj preparat trzy razy za pomocą PBS. Następnie pokryj preparat strep avid w sprzężonym SCI five i ponownie inkubuj w ciemności przez 30 minut, przemyj preparaty trzy razy za pomocą PBS, a następnie przeprowadź barwienie przeciwstawną jąder DAPI.Na koniec zamknij preparat na szkiełku podstawowym za pomocą szkiełka nakrywkowego, używając medium wodnego, takiego jak Vector Mount, dla kontroli enzymu sase. Rozpocznij od wlania wody na dno pustego pudełka na końcówki, aby stworzyć komorę wilgotną. Umieść szkiełka z kontrolą negatywną stroną górą na górnej tacy pudełka na końcówki.Nanieś 150 do 200 µL roztworu US na przekroje tkanek, a następnie przykryj każde szkło podstawowe szkiełkiem cover slip, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Zamknij pokrywę pudełka i inkubuj pudełko w temperaturze 37 °C przez dwie i pół godziny. Przemyj preparaty trzykrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć wolne kwasy slic.Następnie inkubuj preparaty na szkiełkach z SNA przez godzinę w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia konkurencyjnego hamowania. Podziel kontrolną porcję 200 µL mieszaniny lektyn do dwóch probówek typu Eppendorf. Do jednej z probówek dodaj 200 mM inhibitora Jacqueline Meli bios, a do drugiej dodaj inhibitor SWGA – hydrolizat chityny w rozcieńczeniu 1:10.Następnie inkubuj preparaty z mieszaninami zawierającymi inhibitor przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na pierwszej rycinie tkankowej przekroje jelita grubego myszy lub kurczaka, zamrożone w OCT lub zatopione w parafinie, zostały zabarwione różowym barwnikiem Periodic Acid Schiff lub niebieskim Calcium Blue. Porównanie próbek tkanek zatopionych w parafinie z tkankami zamrożonymi w medium krioprotekcyjnym OCT wykazało uderzające różnice w zachowaniu i jakości barwienia glikoprotein mucyn w tkankach zamrożonych.Oprócz mucyny w komórkach kubkowych, w tkankach zatopionych w parafinie widoczny był również wydzielony śluz, na co wskazują strzałki. Barwienie śluzu ograniczało się do komórek kubkowych. Na tej rycinie można zaobserwować znaczną utratę mucyny w tkankach inkubowanych w preparacie citrus resolve.Seryjne przekroje zamrożonych próbek jelita krętego kurczaka utrwalono w 10% buforowanym formalinie i utrzymano w stanie uwodnienia, odwodniono w etanolu poprzez sekwencyjną inkubację w etanolu 70%, 90% i 100% przez 20 minut każda, lub odwodniono w etanolu, a następnie przejrzystowano za pomocą citrus all przez jedną godzinę. Sama dehydratacja etanolem oraz dehydratacja etanolem wraz z przejrzystowaniem citrus all poprawiły morfologię tkanki. Dalsza sama dehydratacja etanolem nie miała istotnego wpływu na barwienie niebieskie.W przeciwieństwie do tego, inkubacja cytrusowa ograniczyła i zredukowała niebieskie barwienie do komórek kubkowe w wzorcu podobnym do tego, który zaobserwowano w tkankach zatopionych w parafinie na poprzedniej figurze. Ramki wskazują obszary o większym powiększeniu w przekrojach tkankowych barwionych niebiesko allium. W następnej serii obrazów przedstawiono próbki jelita cienkiego kurczaka mrożone w OCT lub zatopione w parafinie, a następnie znakowane Jacqueline w kolorze niebieskim, SWG w zielonym i SNA w czerwonym w tkankach mrożonych.Wiązanie lektyny Jacqueline z glikanami olink ujawniło struktury, które wydawały się wypływać z komórek kubkowych do światła jelita, co wskazują strzałki na zamrożonym w OCT przekroju tkanki. W przeciwieństwie do tego, wiązanie Jacqueline w tkankach zatopionych w parafinie ograniczało się do komórek kubkowych oraz do rąbka szczoteczkowego kosmków, co wskazują te strzałki. Barwienie SWGA dla beta one four GL częściowo kolokalizuje z wiązaniem lektyny Jacqueline zarówno w tkankach zamrożonych, jak i zatopionych w parafinie, co wskazują strzałki.W przeciwieństwie do tego, lektyna SNA (kolor czerwony, zaznaczona grotami strzałek) wiąże się wewnątrzkomórkowo z kwasami sjalowym z wiązaniem alfa 2-6 i nie kolokalizuje z Jacqueline (kolor niebieski, zaznaczona przerywanymi strzałkami na tej rycinie). Epitopy kwasu sjalowego zostały usunięte z próbek jelita cienkiego kurczaka poprzez trawienie przekroju tkanki enzymem neuraminidazą lub pozostawiono nienaruszone poprzez inkubację w buforze octanu sodu, jak pokazano tutaj. Obróbka neuraminidazą zniosła barwienie biotynilowaną lektyną SNA obserwowane w tkance niepoddanej obróbce, co potwierdza specyficzność wiązania SNA z kwasami sjalowymi.Specyficzność lektyny można również potwierdzić poprzez dodanie inhibitora konkurencyjnego, takiego jak melibios dla barwienia Jacqueliną lub hydrolizat chityny dla barwienia SWGA. Próbki jelita cienkiego kurczaka ponownie inkubowano z mieszaniną lektyn Jacquelina i SWGA. Tym razem przeprowadzono inkubację również w obecności specyficznych inhibitorów lektynowych: melibiosu lub hydrolizatu chityny. Barwienie Jacqueliną zostało zahamowane przez melibios, ale nie przez hydrolizat chityny. Odwrotnie, barwienie SWGA zostało zahamowane przez hydrolizat chityny, ale nie przez melibios.Ta ostatnia seria obrazów demonstruje, że próbki tkanek szybkomrożonych, rutynowo pobierane w klinikach i laboratoriach badawczych, mogą być następnie zatapiane w OCT i wykorzystywane do badania glikanów na mucynach, glikoproteinach, glikolipidach oraz samych glikanów. Te biopsje raka jelita grubego z tkanek raka kosmkowatego i raka śluzowego zostały szybkomrożone w ciekłym azocie, zatopione w OCT i pomyślnie wybarwione pod kątem różnych wskazanych epitopów mucyn i glikanów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zatapiać tkanki w OCT oraz jak analizować glikozylację śluzu i tkanek przy użyciu metod immunochemicznych.

using-unfixed-frozen-tissues-to-study-natural-mucin-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie nieutrwalonego, zamrożonego tkanki do badania naturalnego rozkładu mukozy

Międzytkankowe komórki Cajala (ICC) są komórkami rozrusznikowymi przewodu pokarmowego. Tworzą one złożone sieci pomiędzy komórkami mięśni gładkich a powypierścienicowymi włóknami neuronalnymi, aby regulować kurczliwość przewodu pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiamy metody immunofluorescencji do wizualizacji sieci ICC u myszy w przekrojach poprzecznych oraz w preparatach całych (whole-mount).

Wizualizacja sieci komórek Cajala (ICC) u myszy

Ten film demonstruje technikę lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) do badania biodystrybucji przeciwciał skierowanych przeciwko nowotworowi w mysim modelu raka piersi. Po dożylnym wstrzyknięciu przeciwciała specyficznego dla nowotworu myszy, guz jest izolowany chirurgicznie, a lokalizacja przeciwciała w tkance nowotworowej jest potwierdzana za pomocą barwienia immunologicznego ex vivo.

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo do badania biodystrybucji przeciwciał

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Kuga i in. odkryli, że przeciwciała specyficzne dla statusu fosforylacji przeciwko białku wiążącemu aktynę, które fosforyluje się w tyrozynie 1798 (pY1798), mogą być używane do znakowania komórek kępek (TC). Protokół ten umożliwia solidną wizualizację TC przy użyciu barwienia immunofluorescencyjnego swobodnie pływających kriosekcji jelita czczego z przeciwciałami pY1798.

Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Badanie to przedstawia metodę obrazowania 3D z wykorzystaniem tkanek jelitowych w całości oraz mikroskopii wielofotonowej do ilościowego określenia wydzielanego śluzu, umożliwiając precyzyjną analizę objętościową i wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na bodźce takie jak chlorek karbamoilocholiny.

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Poznaj metodę zachowania naturalnej dystrybucji glikozylacji w nieutrwalonych, zamrożonych tkankach z użyciem medium OCT. Technika umożliwia dokładną analizę struktur glikanów i mucyn bez specjalistycznych utrwalaczy.

Wykorzystanie niefiksowanych, zamrożonych tkanek do badania naturalnego rozkładu mucyn

Przeglądaj więcej filmów