Wykorzystanie niefiksowanych, zamrożonych tkanek do badania naturalnego rozkładu mucyn

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zachowanie naturalnego rozkładu glikozylacji wydzielonego śluzu w próbkach tkanek. Osiąga się to poprzez wstępne zatopienie tkanek w optymalnym medium do cięcia w niskiej temperaturze (OCT), aby zminimalizować procesy przetwarzania tkanki, a następnie umożliwienie detekcji struktur glikanów, mucyn i śluzu. Przetoki są inkubowane z lektynami, przeciwciałami i barwnikami histochemicznymi.

Wiązanie lektyn można dodatkowo zweryfikować poprzez inhibicję konkurencyjną lub enzymatyczne rozszczepienie epitopów glikanowych, aby potwierdzić swoistość wiązania lektyn. Ostatecznie, stopień zachowania śluzu i zamrożonych próbek tkanek można porównać z zachowaniem śluzu w próbkach zatopionych w parafinie za pomocą analizy chemicznej. Głównymi zaletami stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zatapianie tkanek w parafinie i utrwalanie roztworem Carnoya, są fakt, że metoda ta nie wymaga stosowania specjalistycznych utrwalaczy oraz umożliwia wykorzystanie zamrożonych tkanek, które mogą już znajdować się w laboratorium.

Na początek należy pozwolić, aby tkanka zamrożona błyskawicznie ogrzała się do temperatury -20 °C, umieszczając ją w komorze kriomikrotomu. W tym czasie należy przygotować kąpiel mrożącą, wlewając metylobutan do płytkiego pudełka styropianowego, a następnie dodając do niego suchy lód. Następnie należy dodać taką ilość OCT, aby pokryła dno odrywanego modelu do mrożenia, a następnie umieścić tkankę w modelu.

Upewnij się, że tkanka spoczywa na dnie formy w pożądanej orientacji. Przykryj tkankę dodatkowym OCT, a następnie umieść formę w kąpieli mrożącej. Związek OCT zmieni kolor na biały w miarę zamrażania tkanki. Po zamrożeniu zdejmij formę z zamrożonego bloku i umieść blok w opisanym woreczku do zamrażarki.

Przechowywać zamrożone bloczki w temperaturze -80 °C do momentu ich sekcjonowania. Umieścić wybrane zamrożone bloczki w komorze kriomikrotomu na około 30 minut, aby osiągnęły temperaturę -20 °C. Po odpowiednim schłodzeniu bloczków wykonać skrawki o grubości od 3 do 5 µm, a następnie położyć na skrawku naładowaną dodatnio szkiełko przedmiotowe.

Tkanka przylgnie do szkiełka po suszeniu preparatów na powietrzu przez 30 do 60 minut. Utkwić preparaty w 10% buforowanej formalinie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć szkiełka trzykrotnie w buforze PBS, wykonując 10 szybkich zanurzeń w 250 mililitrach buforu. Przed barwieniem tkanek błękitem aluminiowym, opłukać szkiełka w wodzie, a następnie inkubować w 3% kwasie octowym przez trzy minuty.

Następnie inkubuj tkanki w roztworze AUM blue. Po 30 minutach płucz preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut, a następnie wypłucz w wodzie DI. Przebarw jądra komórkowe za pomocą nuclear fast red przez pięć minut, a następnie trzykrotnie przemyj preparaty wodą DI. Teraz odwodnij i przejaśnij preparaty, inkubując je przez jedną minutę w 95% etanolu, następnie wykonaj trzy szybkie wymiany w 100% etanolu, a na koniec trzy wymiany w citrus resolve po dwie minuty każda.

Na koniec nałóż na szkiełko przykrywkę, używając medium do montażu, takiego jak cyto seal 60, aby zabarwić tkanki za pomocą kwasu okresowego. Najpierw opłucz szkiełka w wodzie, a następnie inkubuj je w świeżo przygotowanym 1% kwasie okresowym przez pięć minut. Następnie przemyj szkiełka trzykrotnie w wodzie destylowanej.

Zanurz preparaty raz w wodzie Milli Q, a następnie zabarw tkanki odczynnikiem Schiffa. Po 15 minutach płucz preparaty w bieżącej wodzie kranowej przez kolejne 10 minut, a następnie zanurz raz w wodzie destylowanej. Wykonaj przeciwbarwienie jąder hematoksyliną przez 30 sekund, a następnie trzy razy wypłucz preparaty w wodzie destylowanej.

Na koniec inkubuj preparaty przez 30 s. Po zastosowaniu odczynnika do niebiesienia w wodzie wodociągowej Scot's, wypłucz preparaty trzy razy w wodzie DI, a następnie odwodnij tkanki w sposób przedstawiony wcześniej dla barwienia calcium blue. Przykryj preparaty szkiełkami podstawowymi w celu detekcji fluorescencyjnej epitopów glikanów przy użyciu lektyn.

Najpierw zablokuj slajd za pomocą BSA w PBS przez 10 do 30 minut. Następnie zablokuj endogenną biotynę, inkubując slajd przez 15 minut z avadonem, po czym przemyj go w PBS, a następnie inkubuj przez 15 minut z 0,01% biotyną po kolejnym płukaniu w PBS. Umieść slajd w kasecie do barwienia, nanieś świeżo przygotowaną mieszaninę wybranych lektyn na każdy przekrój tkanki, a następnie delikatnie przykryj mieszaninę lektyn parfumem.

Następnie inkubuj preparat w ciemności przez jedną godzinę. Delikatnie usuń perfum i przemyj preparat trzy razy za pomocą PBS. Następnie pokryj preparat strep avid w sprzężonym SCI five i ponownie inkubuj w ciemności przez 30 minut, przemyj preparaty trzy razy za pomocą PBS, a następnie przeprowadź barwienie przeciwstawną jąder DAPI.

Na koniec zamknij preparat na szkiełku podstawowym za pomocą szkiełka nakrywkowego, używając medium wodnego, takiego jak Vector Mount, dla kontroli enzymu sase. Rozpocznij od wlania wody na dno pustego pudełka na końcówki, aby stworzyć komorę wilgotną. Umieść szkiełka z kontrolą negatywną stroną górą na górnej tacy pudełka na końcówki.

Nanieś 150 do 200 µL roztworu US na przekroje tkanek, a następnie przykryj każde szkło podstawowe szkiełkiem cover slip, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Zamknij pokrywę pudełka i inkubuj pudełko w temperaturze 37 °C przez dwie i pół godziny. Przemyj preparaty trzykrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć wolne kwasy slic.

Następnie inkubuj preparaty na szkiełkach z SNA przez godzinę w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia konkurencyjnego hamowania. Podziel kontrolną porcję 200 µL mieszaniny lektyn do dwóch probówek typu Eppendorf. Do jednej z probówek dodaj 200 mM inhibitora Jacqueline Meli bios, a do drugiej dodaj inhibitor SWGA – hydrolizat chityny w rozcieńczeniu 1:10.

Następnie inkubuj preparaty z mieszaninami zawierającymi inhibitor przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na pierwszej rycinie tkankowej przekroje jelita grubego myszy lub kurczaka, zamrożone w OCT lub zatopione w parafinie, zostały zabarwione różowym barwnikiem Periodic Acid Schiff lub niebieskim Calcium Blue. Porównanie próbek tkanek zatopionych w parafinie z tkankami zamrożonymi w medium krioprotekcyjnym OCT wykazało uderzające różnice w zachowaniu i jakości barwienia glikoprotein mucyn w tkankach zamrożonych.

Oprócz mucyny w komórkach kubkowych, w tkankach zatopionych w parafinie widoczny był również wydzielony śluz, na co wskazują strzałki. Barwienie śluzu ograniczało się do komórek kubkowych. Na tej rycinie można zaobserwować znaczną utratę mucyny w tkankach inkubowanych w preparacie citrus resolve.

Seryjne przekroje zamrożonych próbek jelita krętego kurczaka utrwalono w 10% buforowanym formalinie i utrzymano w stanie uwodnienia, odwodniono w etanolu poprzez sekwencyjną inkubację w etanolu 70%, 90% i 100% przez 20 minut każda, lub odwodniono w etanolu, a następnie przejrzystowano za pomocą citrus all przez jedną godzinę. Sama dehydratacja etanolem oraz dehydratacja etanolem wraz z przejrzystowaniem citrus all poprawiły morfologię tkanki. Dalsza sama dehydratacja etanolem nie miała istotnego wpływu na barwienie niebieskie.

W przeciwieństwie do tego, inkubacja cytrusowa ograniczyła i zredukowała niebieskie barwienie do komórek kubkowe w wzorcu podobnym do tego, który zaobserwowano w tkankach zatopionych w parafinie na poprzedniej figurze. Ramki wskazują obszary o większym powiększeniu w przekrojach tkankowych barwionych niebiesko allium. W następnej serii obrazów przedstawiono próbki jelita cienkiego kurczaka mrożone w OCT lub zatopione w parafinie, a następnie znakowane Jacqueline w kolorze niebieskim, SWG w zielonym i SNA w czerwonym w tkankach mrożonych.

Wiązanie lektyny Jacqueline z glikanami olink ujawniło struktury, które wydawały się wypływać z komórek kubkowych do światła jelita, co wskazują strzałki na zamrożonym w OCT przekroju tkanki. W przeciwieństwie do tego, wiązanie Jacqueline w tkankach zatopionych w parafinie ograniczało się do komórek kubkowych oraz do rąbka szczoteczkowego kosmków, co wskazują te strzałki. Barwienie SWGA dla beta one four GL częściowo kolokalizuje z wiązaniem lektyny Jacqueline zarówno w tkankach zamrożonych, jak i zatopionych w parafinie, co wskazują strzałki.

W przeciwieństwie do tego, lektyna SNA (kolor czerwony, zaznaczona grotami strzałek) wiąże się wewnątrzkomórkowo z kwasami sjalowym z wiązaniem alfa 2-6 i nie kolokalizuje z Jacqueline (kolor niebieski, zaznaczona przerywanymi strzałkami na tej rycinie). Epitopy kwasu sjalowego zostały usunięte z próbek jelita cienkiego kurczaka poprzez trawienie przekroju tkanki enzymem neuraminidazą lub pozostawiono nienaruszone poprzez inkubację w buforze octanu sodu, jak pokazano tutaj. Obróbka neuraminidazą zniosła barwienie biotynilowaną lektyną SNA obserwowane w tkance niepoddanej obróbce, co potwierdza specyficzność wiązania SNA z kwasami sjalowymi.

Specyficzność lektyny można również potwierdzić poprzez dodanie inhibitora konkurencyjnego, takiego jak melibios dla barwienia Jacqueliną lub hydrolizat chityny dla barwienia SWGA. Próbki jelita cienkiego kurczaka ponownie inkubowano z mieszaniną lektyn Jacquelina i SWGA. Tym razem przeprowadzono inkubację również w obecności specyficznych inhibitorów lektynowych: melibiosu lub hydrolizatu chityny. Barwienie Jacqueliną zostało zahamowane przez melibios, ale nie przez hydrolizat chityny. Odwrotnie, barwienie SWGA zostało zahamowane przez hydrolizat chityny, ale nie przez melibios.

Ta ostatnia seria obrazów demonstruje, że próbki tkanek szybkomrożonych, rutynowo pobierane w klinikach i laboratoriach badawczych, mogą być następnie zatapiane w OCT i wykorzystywane do badania glikanów na mucynach, glikoproteinach, glikolipidach oraz samych glikanów. Te biopsje raka jelita grubego z tkanek raka kosmkowatego i raka śluzowego zostały szybkomrożone w ciekłym azocie, zatopione w OCT i pomyślnie wybarwione pod kątem różnych wskazanych epitopów mucyn i glikanów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zatapiać tkanki w OCT oraz jak analizować glikozylację śluzu i tkanek przy użyciu metod immunochemicznych.