Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie przesiewowe badanie dużej liczby substancji lotnych roślin żywicielskich pod kątem potencjalnej aktywności biologicznej. Jest to realizowane poprzez wstępne zebranie i analizę za pomocą GC-MS interesujących substancji lotnych roślin żywicielskich, a następnie identyfikację i weryfikację ich składników chemicznych.

Trzecim krokiem jest przesiewowe badanie poszczególnych składników w dostatecznej liczbie powtórzeń pod kątem bioaktywności za pomocą analizy elektrograficznej. Ostatnim etapem jest opracowanie i ocena mieszanin aktywnych składników. W efekcie wyniki mogą dostarczyć skróconej serii składników lub mieszanin gotowych do dalszych badań behawioralnych z wybranym gatunkiem owada.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak czasochłonne badania behawioralne, jest to, że szybki screening za pomocą analizy elektrograficznej znacząco zmniejsza liczbę związków, które muszą zostać poddane innym badaniom w celu zademonstrowania procedury. Czy MR Wage jest technikiem w moim laboratorium? Po zidentyfikowaniu odpowiednich substancji lotnych za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii mas, możliwe jest przeprowadzenie w pierwszej kolejności analizy elektroikongraficznej lub EAG dla każdej dostępnej substancji lotnej.

Należy jednak przygotować dostępne substancje lotne. W szczelnym pojemniku, przechowywanym w temperaturze 4 °C, należy przygotować roztwór każdej substancji lotnej w pentanie o stężeniu 5 mg/mL. Następnie należy przygotować pipety do stymulacji.

Oznacz 10 pipet Pasteura dla każdego związku lotnego i owiń ich końcówki małym kawałkiem parafiny. 10 pipet wystarczy do podania związku lotnego każdej płci w wstępnym przesiewie z niską liczbą powtórzeń. Następnie ustaw pozostały zestaw pięciu pipet w statywie i umieść dysk do bioassayu w otwartym końcu każdej pipety.

Za pomocą pęsety delikatnie zgnij krążek i umieść go częściowo w szerokim wylocie pipety w taki sposób, aby dwa do trzech milimetrów krążka pozostały wystawione. Używając pipetora lub strzykawki, nanieś 10 µl lotnego roztworu na każdy krążek. Niezwykle ważne jest prawidłowe obliczenie, sporządzenie i przygotowanie roztworów, aby zapewnić powtarzalność wyników.

Odczekać dwie minuty, a następnie w pełni wsunąć dyski do pipet. Po załadowaniu niezwłocznie uszczelnić każdą pipetę za pomocą param. Powtórzyć przygotowanie pipet dla pożądanej liczby powtórzeń.

Stosując ten sam protokół, przygotuj kontrolę negatywną składającą się z samych pentanów oraz kontrole pozytywne, którymi w tym przypadku są acetofenon i hormon płciowy. Następnie przystąp do przygotowania czułków owadów.

W tym doświadczeniu przedwzmacniacz przesyła sygnał z elektrody widełkowej do instrumentu akwizycyjnego EAG. Oprogramowanie dostarczone z instrumentem EAG musi zostać odpowiednio skonfigurowane. Skonfiguruj ustawienia, ustawiając w pierwszej kolejności częstotliwość próbkowania na 106.7.

W zakładce filtra ustaw przełącznik prostowania (rectify) na „know”, a filtr w zakresie od 0 do 42 Hz. Włącz filtr EAG i ustaw dolną granicę odcięcia na 0,1 Hz. Następnie zapisz ustawienia w pliku konfiguracyjnym do późniejszego wykorzystania.

Obsługa programu jest następnie tak prosta, jak otwarcie nowego pliku projektu, zapisanie go pod określoną nazwą i przystąpienie do rejestracji. Ikona czerwonego trójkąta rozpoczyna proces rejestracji i pozostaje aktywna przez określony czas dla każdego pojedynczego podmuchu. Po wykonaniu wszystkich podmuchów dla czułków, ikona czarnego X zatrzymuje rejestrację, aby ułatwić dokładny odczyt odpowiedzi EAG.

Małą linijkę można przykleić taśmą do ekranu komputera na poziomie linii bazowej sygnału. Odpowiedź zapisuje się w milimetrach, a następnie przelicza na amplitudę w mikrowoltach. W razie potrzeby nagrania można odtworzyć w celu dalszej oceny.

W tym przykładzie wykorzystano trzydniowe lub czterodniowe samce oraz zapłodnione samice pomarańczówki nawalnej. Protokół ten można jednak dostosować do innych owadów. Przenieś każdy owad do małego plastikowego pojemnika z pokrywką.

W dniu analizy, bezpośrednio przed bioanalizą, umieść owada w szerokim otworze końcówki pipety, która posiada mniejszy otwór, na tyle wąski, by mieściła się w nim jedynie głowa owada. Następnie, używając mniejszej końcówki pipety, ostrożnie przesuń owada w stronę mniejszego otworu, aż jego głowa stanie się widoczna pod stereomikroskopem. Upewnij się, że czułki są stabilnie osadzone w rurce mocującej, a ich nasady są odsłonięte w celu ich wycięcia.

Następnie umieść uchwyt widelca z cienką warstwą żelu elektrodowego w bezpośrednim sąsiedztwie anteny; za pomocą mikro-nożyczek odseparuj, a następnie wytnij obie anteny i uruchom stoper, aby zarejestrować czas między tym zdarzeniem a następującymi po nim bodźcami. Używając narzędzia z drutowym zakończeniem z odrobiną żelu na końcówce, chwyć jedną antenę i umieść ją na widelcu. Upewnij się, że podstawa anteny spoczywa na nieczerwonej, obojętnej elektrodzie uziemiającej widelca.

Powtórz tę czynność dla drugiej anteny. Umieść podstawę anteny po tej samej stronie widelca, w odstępie dwóch do trzech milimetrów od pierwszej, ustawiając antenę w odpowiedniej pozycji. W razie potrzeby przytnij końcówki anteny.

Nanieś żel elektrodowy za pomocą pędzla, upewniając się, że podstawa i końcówka elektrod są zanurzone w żelu i nie ma w nim pęcherzyków powietrza. Unikaj pokrywania żelem środkowej części anteny, aby zmaksymalizować powierzchnię anteny wystawioną na działanie impulsu substancji lotnych. Po prawidłowym żelowaniu preparatu podłącz widelec do przedwzmacniacza sondy.

Następnie skieruj strumień nawilżonego powietrza nad preparat, aby utrzymać żywotność preparatu czułka. Po 10 minutach od momentu wycięcia przystąp do podania pierwszych bodźców. Kolejność operacji stymulacji preparatu rozpoczyna się i kończy kontrolą pozytywną, a pomiędzy nimi stosuje się zrandomizowaną sekwencję związków, w której nie występują dwa identyczne związki pod rząd, oraz przynajmniej jedną kontrolę negatywną; liczba związków podawanych na czułek różni się w zależności od gatunku.

Preparat ćmienia pomarańczowego może pozostawać aktywny przez ponad 30 minut, co pozwala na szybką analizę do 10 substancji lotnych przy niskiej liczbie powtórzeń. Ta sama zasada dostarczania próbek ma zastosowanie do kolejnych przesiewów mieszanin związków, które wywołały reakcje w badaniu wstępnym. Pierwszą pipetę ze stymulantem należy przygotować 30 sekund przed podaniem podmuchu; należy odblokować pipetę i umieścić ją w uchwycie w taki sposób, aby strumień powietrza był skierowany 2–3 mm od anten, 10 minut po ich wycięciu.

Podaj pierwszą dawkę bodźca w czasie od jednej do dwóch sekund z przepływem 300 milliliters per minute. Następnie szybko wymień pipetę, aby drugą dawkę podać dokładnie jedną minutę po pierwszej. Zachowanie spójności między próbkami zminimalizuje zmienność ilości podawanych substancji lotnych.

Po podaniu ostatniego podmuchu kontroli pozytywnej należy zdjąć antenę i wyczyścić widełki. Za pomocą chusteczki nasączonej etanolem należy doprowadzić do ich całkowitego wyschnięcia przed kolejnym użyciem. Aby zwiększyć przepustowość analiz, asystent powinien przygotować następną antenę z czystymi widełkami na 10 minut przed zakończeniem poprzednich przygotowań.

Sekwencja testowa; do tej metody niezbędne jest więcej niż jedno rozwidlenie. Po każdym eksperymencie uśmierć testowane ćmy w środowisku suchego lodu i przeprowadź sekcję samic w celu sprawdzenia statusu kopulacji. Przyjmij, że współbytujące samce musiały kopulować. Preparaty anten ćmy pomarańczowej (naval orange worm) stymulowano dwusekundowymi podmuchami, a zapisy przeprowadzono przez dziesięć sekund w dziesięciosekundowym oknie w skali 5 mV.

Typową odpowiedzią było ujemne wychylenie. Niemniej jednak zarejestrowano wartości bezwzględne. Wszystkie preparaty żeńskie z słabą odpowiedzią na kontrolę pozytywną zostały odrzucone.

Średnia odpowiedź pozostałych preparatów wynosiła 2 600 microvolts. Podobnie średnia odpowiedź samców na kontrolne pH płci wynosiła zazwyczaj 3000 microvolts. Z tego powodu odrzucono osobniki o odpowiedzi poniżej standardu; odrzucono również dane z czułków, które wykazały osłabienie odpowiedzi w trakcie próby.

Degradację stwierdzano, jeśli odpowiedź układu Anton na wdmuchnięcie ostatniej kontroli pozytywnej była mniejsza niż 75% odpowiedzi na pierwsze wdmuchnięcie kontroli przedtestowej (pre-con) lub mniejsza niż odpowiedź na drugie wdmuchnięcie kontroli przedtestowej w pozostałych seriach eksperymentalnych. Wartości odpowiedzi analizowano poprzez pobranie surowych pomiarów z każdej serii i odjęcie od każdej wartości w danej serii odpowiedzi kontroli negatywnej z tej samej serii. Następnie wyznaczono średnią dla wszystkich kontroli pozytywnych w każdej serii i skorygowano ją do wartości 1000 Microvolts, odnotowując współczynnik korekcji do 1000 microvolts dla każdej serii.

Wartości dla badanych związków pomnożono następnie przez współczynnik korekcji kontroli pozytywnej. Na koniec porównano średnią skorygowaną odpowiedź każdego badanego związku ze wszystkich serii pomiarowych, aby ocenić przydatność każdego związku do dalszych badań. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować odpowiednie środki ostrożności.